Name: 초파리를 이용한 헤테로크로마틴 촉진 약물의 식별을 위한 스크리닝 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: 배우세요 Drosophila를 이용한 헤테로크로마틴 촉진 약물 스크리닝 방법을 통해 눈 색깔 표현형으로 약물 효과를 평가하고 암 치료 연구에 활용할 수 있는 비용 효율적인 in vivo 시스템을 확인하세요.

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우리는 J. 버클러, E. 바흐와 다양한 초파리 균주에 대한 블루밍턴 드로 소필라 스톡 센터 감사합니다; 종양학을 위한 국립 암 학회 (NCI) 발달 치료 프로그램 세트 소분자 약 도서관; 에이미 장, 유, 제시카 싱방가, 레이첼 메자, 알렉스 차베스 등 UCSD 학부생들. 이 간행물에 보고된 연구는 J.L.에 미국 흉부 학회에서 연구 교부금및 NIH에서 자금 조달에 의해 지원되었습니다: R01GM131044 W.X.L.

1. 약품 도서관 준비
<ol><li>원하는 농도에서 적절한 용매를 사용하여 스크리밍될 약물 라이브러리를 식별하고 준비합니다(예를 들어, DMSO에서 10 mM). 참고: 약물 라이브러리에 대한 구체적인 예는 국립 암 연구소 (NCI) 발달 치료 프로그램 (DTP)에서 종양학 세트 III입니다. 이 세트의 화합물은 2개의 96웰 PP U-바닥 플레이트에서 100% DMSO에서 10 mM에서 20 μL로 제공되고 -20°C에서 보관된다. NCI 플레이트지도, 각 약물의 기본 화학 데이터는 다음 웹 사이트에서 찾을 수 있습니다: <a href="https://dtp.cancer.gov/dtpstandard/servlet/PlateMap?searchlist=4740&outputformat=html&searchtype=plate&Submit=Submit" target="_blank">NCI 플레이트 번호 4740</a> <a href="https://dtp.cancer.gov/dtpstandard/servlet/PlateMap?searchlist=4741&outputformat=html&searchtype=plate&Submit=Submit" target="_blank">NCI 플레이트 번호 4741</a>
</li>
</ol>2. 초파리를 이용한 헤테로크로마틴 촉진 약물 에 대한 화면
<ol><li>
초파리 사육 전략(그림 1A)<ol>
<li>일 1: 십자가 3 w1118/Y; DX1/CyO 수컷은 3개 이상의 처녀 w1118 암컷이 표준 드로소필라 식품 매체(블루밍턴 레시피)의 9mL를 가진 25mm x 95mm 식품 바이알로 날아간다. 각 약물에 대해 3개의 복제 바이알과 화면에 대한 하나의 컨트롤을 설정합니다. 참고 : DX1 파리는 친절 제임스 버클러 (미주리 대학)9,,13에의해 제공되었다 .</li>
		<li>2일차와 3일차: 파리가 실온(22°C)에서 2일 동안 알을 낳도록 합니다.</li>
		<li>4일차:CO2 가스를 짧게 터뜨려 부모 파리를 마취시키고 부모 파리를 "플라이 모그"(알코올 70%가 들어있는 병)로 폐기하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>스크리닝을 위해 초파리에 약물을 공급하십시오.<ol>
<li>원래 재고 (96 웰 PP U-bottom 플레이트에서 100 % DMSO에서 100 % DMSO에서 10 mM에서 20 μL)에서 물에서 33 % DMSO로 10 μM 최종 농도로 각 약물 화합물을 희석합니다. 대조군으로 어떤 약물도 없이 물에 33% DMSO를 사용하십시오. 참고 : 일부 약물은 물에 잘 용해되어 DMSO에 용해되었습니다. 100% DMSO는 파리에 독성이 있습니다. 33%는 견딜 수 있습니다.</li>
		<li>4일: 10 μM 약물 용액의 파이펫 60 μL 또는 플라이 푸드 의 상부에 대한 제어. 이 시점에서, 부모 파리가 제거되었는지 확인하고 음식에 첫 번째 별 애벌레를 기어 다니는 계란이 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>일 6: 식품 바이알에 동일한 10 μM 약물 용액의 60 μL을 반복피펫팅. 참고 : 약물이 플라이 푸드에 첨가되었기 때문에 상부 표면 식품에는 거의 10 μM 농도가 포함되어 있으며 바닥 식품은 완전히 침투 할 수 없습니다. 모든 파리는 음식 위에 알을 낳고 상단 표면 음식을 먹는다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>눈 색깔 변화를 관찰하고 점수를 매줄 수 있습니다.<ol>
<li>F1 파리가 나타난 후 이틀(약 14일째)에 파리를 검사합니다. 짧은 CO2 를 사용하여 F1 파리를 마취하고 유리병에서 필터 용지 아래에서 CO2를 홀짝인 다공성 해부 패드로 제거합니다.</li>
		<li>해부 현미경으로이 패드에 파리를 검사합니다. 전체 비행을 검사하고 모든 w1118/ Y를 식별; 그들의 부족으로 DX1/+ 헤테로지쿠스 남성은 CyO 지배적인 곱슬 날개 표현형이 결여되었다.</li>
		<li>w1118/Y각각의 눈 색깔을 점수; DX1/+ 헤테로지쿠스 수컷은 1에서 5까지의 척도로 날아갑니다(그림1B). 흰색 눈 색의 백분율은 다음과 같이 평가되었습니다. 1. 적색 산란 눈 총 표면적 5% 2. 6% - 25% 적색 반점 눈 의 총 표면적 3. 26% - 50% 적색 반점 눈 의 총 표면적 4. 51% - 75% 적색 반점 눈 의 총 표면적 5. >75% 적색 반점 눈 의 총 표면적 참고: 또는 100% 메탄올로 플라이 헤드를 균질화하고 분광계를 사용하여 OD 450 nm에서 눈 색소 침착을 측정합니다. PEV가 DX1 남성에서 더 발음되므로 남성만 선택하십시오. 각 유리병에 10 개 이상의 남성을 점수.</li>
		<li>득점한 각 바이알의 모든 남성의 평균 색인을 계산합니다. 각 화합물에 대해 삼중체를 수행합니다(그림1C). 참고: 아이 컬러는 연령에 따라 다르기 때문에 시간이 많이 민감한 단계입니다. 눈 색깔은 2 일 된 같은 나이에 계산해야합니다. 보통 >10 파리는 각 유리병에 점수를 매겨야 합니다.</li>
		<li>화합물이 실제로 헤테로크로마틴 형성을 촉진한다는 것을 확인하려면, 유효성을 검사하기 위해 서양 블로팅과 같은 다른 기술을 사용한다(도1G).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Morgan, M. A., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+signatures+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Development%22%5BJournal%5D)">Chromatin signatures of cancer.</a> Genes Development. 29 (3), 238-249 (2015).</li>
<li>Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+heterochromatin+formation+and+transcription+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 3(2015).</li>
<li>Allshire, R. C., Madhani, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+principles+of+heterochromatin+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ten principles of heterochromatin formation and function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 229-244 (2018).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Grewal, S. I., Moazed, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+and+epigenetic+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin and epigenetic control of gene expression.</a> Science. 301 (5634), 798-802 (2003).</li>
<li>Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delving+into+the+diversity+of+facultative+heterochromatin%3A+the+epigenetics+of+the+inactive+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 15 (5), 482-489 (2005).</li>
<li>Ci, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+Protein+1alpha+Mediates+Development+and+Aggressiveness+of+Neuroendocrine+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin Protein 1alpha Mediates Development and Aggressiveness of Neuroendocrine Prostate Cancer.</a> Cancer Research. 78 (10), 2691-2704 (2018).</li>
<li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin-Encoded+Satellite+RNAs+Induce+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin-Encoded Satellite RNAs Induce Breast Cancer.</a> Molecular Cell. 70 (5), 842-853 (2018).</li>
<li>Dorer, D. R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansions+of+transgene+repeats+cause+heterochromatin+formation+and+gene+silencing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila.</a> Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).</li>
<li>Fanti, L., Dorer, D. R., Berloco, M., Henikoff, S., Pimpinelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+protein+1+binds+transgene+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays.</a> Chromosoma. 107 (5), 286-292 (1998).</li>
<li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAK+signaling+globally+counteracts+heterochromatic+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">JAK signaling globally counteracts heterochromatic gene silencing.</a> Nature Genetics. 38 (9), 1071-1076 (2006).</li>
<li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+STAT+is+required+for+directly+maintaining+HP1+localization+and+heterochromatin+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability.</a> Nature Cell Biology. 10 (4), 489-496 (2008).</li>
<li>Ronsseray, S., Boivin, A., Anxolabehere, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-Element+repression+in+Drosophila+melanogaster+by+variegating+clusters+of+P-lacZ-white+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">P-Element repression in Drosophila melanogaster by variegating clusters of P-lacZ-white transgenes.</a> Genetics. 159 (4), 1631-1642 (2001).</li>
<li>Loyola, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+methotrexate+as+a+heterochromatin-promoting+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11673(2019).</li>
<li>Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+Heterochromatin+Protein+1+%28HP1%29+to+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression.</a> Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).</li>
<li>Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin%3A+Guardian+of+the+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin: Guardian of the Genome.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 265-288 (2018).</li>
<li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+tumour+suppression+occurs+via+heterochromatin-mediated+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing.</a> Nature. 477 (7363), 179-184 (2011).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unphosphorylated+STAT5A+stabilizes+heterochromatin+and+suppresses+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Unphosphorylated STAT5A stabilizes heterochromatin and suppresses tumor growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10213-10218 (2013).</li>
</ol>

저자는 공개할 이해상충이 없습니다.

헤테로크로마틴은 유전자 발현 조절에 중심적인 역할을 하는 응축된 형태의 DNA입니다. 암에서 점점 더 인식되고 있으며 암 치료15,,16,,17,,18에대한 잠재적인 표적으로 작용할 수 있다. 소분자 화합물은 인체의 제조, 보존 및 신진 대사의 장점으로 인해 약물 개발에 일반적으로 사용됩니다. 헤테로크로마틴 촉진 소분자 화합물을 확인하기 위해, 효율적인 방법은 DX1Drosophila 균주를 사용하여 설계 및 제시되었으며, 이는 헤테로크로마틴 의존적 방식으로 파리의 눈 색깔에 영향을 미치는 것으로 입증되었습니다(그림 1).
당사의 스크리닝 프로토콜은 약물 개발을 위한 ...

헤테로크로마틴은 유전자 발현, 세포 분열 시 염색체 분리 조절, 게놈불안정성으로부터 보호하는 데 핵심적인 역할을 하는 응축된 형태의 DNA입니다. 헤테로크로마틴은 유전자 억압 조절기로 간주되어 세포 유사분열 시 염색체 무결성을 보호하는22,3. 그것은 계보 약속 동안 히스톤 H3 리신 9 (H3K9me)의 디- 및 삼중 메틸화와 연관4,,5. 더욱이, 헤테로크로마틴 단백질 1(HP1) 크로모도메인 단백질의 모집은 또한 헤테로크로마틴 및 유전자 발현의 후생유전학적 억압과 관련이 있는 것으로 여겨진다6. 이 단백질은 헤테로크로마틴 형성의 필수 구성 요소및 마커입니다.
게놈 불안정성은 세포가 발암을 촉진하는 유전적 변화를 획득할 수 있게 하기 때문에, 헤테로크로마틴은 암 발병에서 더욱 인정받고 있으며 암 치료 대상으로 삼을 수 있다7,,8. 현재, 헤테로 크로 마틴 형성을 돕는 데 잘 확립 된 약물은 없습니다. 여기에서, 우리는 헤테로크로마틴 형성을 승진시키는 작은 분자 화합물을 검열을 위한 간단하고 빠르고 효율적인 방법을 제시합니다. 검열은 소분자 약의 도서관으로 Drosophila를 취급해서 행해않습니다. 이 방법은 헤테로크로마틴 수준에 의해 영향을 받는 DX1초도체 균주에서 다양한 눈 색깔 표현형을 이용합니다. DX1 파리는 7개의 P[lac-w] 트랜스유전자의 탠덤 배열을 포함하며, 이는 헤테로크로마틴화에 따라 다양한 발현/우울증을 가지며, 따라서 눈 색깔의 변이 정도는 헤테로크로마틴 수준을 반영한다. 특히, 이종으로마틴을 증가시키면 다양한 눈 색깔(흰 눈)의 비율이 증가하여 검출될 수 있다. 반대로, 감소하는 헤테로크로마틴은 P[lac-w] 이식유전자 발현(적목)의 상승 비율에 의해 검출될 것이다9,,10,,11,,12.
따라서, 우리는 그것의 표현이 존재하는 헤테로크로마틴의 양과 직접 상관되기 때문에 다양한 눈 색깔 표현형을 생성하는 이 Drosophila transgene 시스템을 이용합니다. 헤테로 크로 마틴 형성을 촉진 하는 것으로 의심 되는 화합물의 발견 시, 우리는 서쪽 얼룩 등 다른 방법을 사용 하 여이 의심을 확인할 수 있습니다. 이러한 헤테로크로마틴 촉진 물질은 향후 환자에서 임상 시험을 위해 추가로 개발될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>Drosophila</td><td></td><td>DX1 strain</td><td>DX1 파리는 James Birchler(University of Missouri)</td></tr><tr><td>Drosophila 식품 매체</td><td>UCSD 플라이 키친</td><td></td><td></td></tr><tr><td>메토트렉세이트</td><td>NCI 약물 라이브러리</td><td></td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td><td>시그마</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올</td><td>시그마</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr></tbody></table>

초파리를 이용한 헤테로크로마틴 촉진 약물의 식별을 위한 스크리닝 방법

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

초파리는 암 치료에 유용할 지도 모르는 화합물을 가리기 위하여 이용될 수 있는 우수한 모형 유기체입니다. 여기서 설명한 방법은 초파리를이용하여 헤테로크로마틴 촉진 화합물을 식별하는 비용 효율적인 생체내 방법이다. Drosophila의 DX1 긴장은, 헤테로크로마틴 형성의 넓이를 반영하는 다양한 눈 색깔 표현형을 갖는, 이함으로써 헤테로크로마틴 촉진 약물 스크린을 위한 공구를 제공한다. 이 스크리닝 방법에서, 눈의 변이는 눈의 일부를 차지하는 적색 색소침착의 표면적에 기초하여 정량화되고 1에서 5까지의 척도로 채점된다. 스크리닝 방법은 간단하고 민감하며 생체 내에서 화합물을 테스트 할 수 있습니다. 이 방법을 이용한 약물 스크리닝은 암 치료제에 유익한 효과를 가질 수 있는 헤테로크로마틴 촉진 약물을 식별하는 빠르고 저렴한 방법을 제공한다. 헤테로 크로 마틴의 형성을 촉진 하는 화합물을 식별 또한 암 개발의 후성 유전학 메커니즘의 발견으로 이어질 수 있습니다.

이 프로토콜은 성공적으로 약물 개발을위한 생체 내에서 효율적이고 저렴한 비용인 Drosophila에서헤테로 크로 마틴 형성을 촉진하는 화합물을 스크리킹하는 데 사용되었습니다(그림 1). 우리는 소분자 약물 라이브러리, 종양학 세트 III를 선별, 이는 97 FDA 공인 종양학 약물로 구성, Drosophila 멜라노가스터의 DX1 균주를 사용하여(그림 1B). 유의한 약물에 대한 결과는 막대그래프(도 1C,D)로나타내어 졌다. 선별 분석법에 따르면, 메토트렉세이트(4-aminopteroylglutamic acid)는 라이브러리에서 E7로 코딩되어 DX1 균주에서 가장 많은 변동을 일으켰으며, 이는 메토트렉세이트가 향후 암 표적 요법을 위한 가장 유...

초파리는 암 치료를 위한 잠재적인 적용을 가진 약물을 선별하기 위하여 적당히 널리 이용되는 실험적인 모형입니다. 여기에서, 우리는 헤테로크로마틴 형성을 촉진하는 소분자 화합물을 스크리닝하는 방법으로 서 드로소필라 의 사용 바리게이트 눈 색 표현형을 기술한다.

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

현재 이종로마타틴 형성을 촉진하는 데 잘 설정된 약물은 없습니다. 여기에서 우리는 이 과정을 승진시키는 작은 분자 화합물을 확인하기 위한 간단하고 효율적인 방법을 제시합니다. 당사의 선별 프로토콜은 이종로크로마틴 촉진 약물 식별을 위한 생체 내 시스템에서 간단하고 저렴하며 쉽게 따르기 쉬운 것을 제공합니다.이종로크로마틴 형성을 촉진하는 화합물을 식별하는 것은 수선및 암 치료암의 기계장치의 발견으로 이어질 수 있습니다. 이 비용 효과적인 드로소필라에서 이종로크로마틴 촉진 화합물을 식별하기 위해 측정된 것은 또한 세포 검열의 가장 높은 세포 풀에 대한 예방 조치이기 때문에 양식 안타를 계산하는 데 사용될 수 있었다. 이 Drosophila TranSheet 시스템은 즉석에서 존재하는 이종로크로마트틴의 양과 반비례하는 다양한 눈 색깔 표현형을 생성하기 때문에 우리의 선별 프로토콜은 빠른 파일럿 스크린에 유용 할 수 있습니다.절차를 입증하는 데 도움이 케니 다오, 우리의 실험실에서 학부 학생이 될 것입니다. 적절한 용매와 원하는 농도를 사용하여 스크리닝을 위한 약물 라이브러리를 식별하고 준비한 후, 3마리 이상의 처녀 암컷 파리를 25~95mm 식품 병용 유리병에 파리3개 이상의 처녀 암컷 파리로 교차한다. 표준 드로소필라 식품 배지의 9 밀리미터.각 약물에 대해 3개의 복제 바이알을 설정합니다. 화면에 컨트롤 바이알 하나를 추가합니다. 그리고 파리가 실온에서 이틀 동안 알을 낳을 수 있도록하십시오.십자가 둘째 날, 이산화탄소의 짧은 버스트와 파리를 마취. 그리고 70 %에탄올이 들어있는 병에 부모 파리를 폐기하십시오. 다음으로, 물 속에서 마이크로 어금니 최종 농도에 참석하기 위해 초기 주식에서 각 약물 화합물을 희석.그리고 플라이 푸드 위에 60 마이크로리터 또는 대조군 33%DMSO를 단독으로 추가합니다. 그런 다음 바이알 내에 부모 파리가 없는지 확인합니다. 그리고 적절한 바이알에 약물 용액을 추가합니다.F1 파리가 나타난 지 이틀 후, 한 번에 한 유리병에서 마취된 파리를 필터 용지 아래에서 이산화탄소가 여과하는 다공성 해부 패드로 이송합니다. 해부 현미경에서, 각 전체 비행을 검사, 곱슬 o 지배적 인 곱슬 날개 표현형의 부족에 의해 이종수 의 모든 남성을 식별. 1~5의 척도로 각 이종수 남성의 눈 색깔을 채점한다.1 점수가 5% 미만의 빨간색 으로 흩어져 있는 눈 총 표면적으로 할당됩니다. 6 ~25%의 적색 스팟 눈 총 표면적으로 두 점수를 추가하여 날아갑니다. 3대는 26~50%의 적색 스팟 눈 총 표면적을 가진 비행합니다.4대는 51~75%의 적색 스팟 눈 총 표면적을 가진 비행합니다. 그리고 75% 이상의 적점 눈 총 표면적을 가진 5개의 파리. 그런 다음 트리플리케이트에서 득점한 각 바이알의 모든 남성의 평균 색상 인덱스를 계산합니다.화합물이 실제로 이종로크로마틴 형성을 촉진한다는 것을 확인하기 위해, 서양 블로팅과 같은 다른 검증 기법을 수행할 수 있다. 본 대표적인 실험에서는, 작은 분자 약 라이브러리, 종양학 세트 3, 로소필라 멜라노가스터의 DX1 균주를 사용하여 97 개의 FDA 공인 종양학 약물로 구성된. 스크리닝 분석법에 따르면, 메토트렉세이트는 라이브러리에서 E7로 코딩되어 Dx1 균주 내에서 가장 많은 변화를 일으켰다.메토트렉세이트는 미래의 암 표적 요법을 위한 가장 유망한 이종로마타닌 촉진 약일 수 있다는 것을 건의합니다. 이 화합물이 이종변환을 촉진한다는 것을 추가로 확인하기 위해 서부 얼룩 데이터가 수행되었다. 이종로크로마티닌 포르포틴 관련 단백질, H3K9 트리메틸레이션의 최대 조절을 입증하고, 스크리닝 결과를 검증한다.중요한 단계는 미리 정해진 연구 경로에 따라 1~5의 규모로 날아가는 흰색 11-18 DX1 이종수남성의 눈색을 채점하는 것이다. 우리는 안타를 확인하기 위해 서양 얼룩이나 면역 스테인닝을 사용할 수 있습니다. 이종로크로마틴 형성을 촉진하는 것으로 의심되는 화합물의 발견은 또한 인간 적인 환자에 있는 암 발달 그리고 임상 시험의 IV 유전 기계장치의 발견으로 이끌어 낼 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

최근 높은 처리량 시퀀싱 기술은 크게 염색질 Immunoprecipitation (칩) 실험의 감도를 증가하고 정화 셀 또는 해부 조직을 사용하여 응용 프로그램을하라는 메시지가있다. 여기에 칩 기술을 사용하는 방법을 윤곽을...

사용 염색질 Immunoprecipitation (CHIP) Drosophila 조직

이 동영상은 CRISPR-Cas9을 사용하여 게놈이 변형된 형질전환 초파리 파리를 식별하는 스크리닝 방법을 설명합니다. CRISPR-Cas9은 과학자들이 유기체의 게놈을 조작하는 방식에 혁명을 일으킨 강력한 게놈 편집 도구입니다. 예제 프로토콜에서는 CRISPR 생성 돌연변이를 식별하는 방법을 확인할 수 있으며, 여기서 transactivation sequence의 삽입은 branchless(bnl) 유전자의 첫 번째 엑손을 대체하여 bnl 유전자 특이적 드라이버 라인인 bnl-LexA를 생성합니다.

유전체 변형 스크리닝: 초파리에서 CRISPR 생성 돌연변이를 식별하는 방법

개발 Drosophila의 배아에 작은 분자의 도입은 신규 화합물, 약물 및 독성 물질의 생물학적 활성의 특성뿐만 아니라 기본적인 발달 경로를 프로빙을위한 큰 잠재력을 제공합니다. 설명하는 방법은 여기에 초파리 배아 모델의 유틸리티를 확대,이 방법 자연 장벽을 극복 단계를 설명합니다.

의 Permeabilization의 방법<em&gt; 초파리</em작은 분자 활동의 분석 실험을위한&gt; 태아

이 책의 목적은 시각화 및 초파리에서 추출한 RNA에 향상된 북부 얼룩 프로토콜의 동작 단계를 논의 배아, 세포 및 조직을 melanogaster하는 것입니다. 이 프로토콜은 작은 RNA 종의 효율적인 검출에 특히 유용하다.

작은 RNA 종의 북부 오 탐지의 향상된 초파리 Melanogaster

이 작품 설명 프로토콜 위한 고해상도 제자리에 이 C 라이브러리에서의 세대 단단히 준비 사전 gastrulation 초파리 melanogaster 태아.

단단히 준비 초기 초파리 배아에서 게놈 넓은 Chromatin 구조 캡처 라이브러리의 생성

우리는 Drosophila melanogaster에있는 신경 변성을 전시하는 돌연변이를 위한 스크린에 전방 유전 접근을 사용하여 프로토콜을 제시합니다. 그것은 궁극적으로 신경 보호의 프로세스와 관련있는 새로운 유전자를 확인하기 위하여 등반 분석, 기관학 분석, 유전자 매핑 및 DNA 순서를 통합합니다.

소독멜라노가스터에서 새로운 신경보호 유전자를 식별하기 위한 생체 전방 유전자 스크린

이 방법은 세포주에서 PRC2 매개 염색질 도메인의 형성을 따르도록 설계되었으며, 이 방법은 다른 많은 시스템에 적응될 수 있다.

크로마틴 도메인의 드 노보 형성을 연구하는 방법

이 프로토콜은 과일 파리가 변형을 겪으면서 Drosophila 복부 상피에서 세포 배향 및 조직 성장의 역학을 이미징 및 분석하기 위해 설계되었습니다. 여기에서 기술된 방법론은 Drosophila 또는 그밖 모형 유기체에 있는 다른 발달 단계, 조직 및 subcellular 구조물의 연구 결과에 적용될 수 있습니다.

푸팔 단계 동안 개발 초파리 에피텔리아에서 조직 방향 과 성장 역학의 이미징 및 분석

이 프로토콜은 드로소필라 폴리텐 세포에서 이종로크로마틴 골재를 시각화하는 것을 목표로 한다.

드로소필라 살리바리 땀샘의 이종로크로마티닌 관련 단백질의 시각화를 위한 면역형성 염색

5-에티닐-2'-데옥시리딘(EdU) 및 인산히스톤 H3(pH3) 라벨링을 함유한 세포 주기 분석은 광범위한 최적화를 요구할 수 있는 다단계 절차이다. 여기서는 상이한 세포 주기 단계에서 세포를 구별하기 위해 이미지 분석 및 정량화를 포함한 이 절차에 대한 모든 단계를 설명하는 상세한 프로토콜을 제시합니다.

Drosophila 신경 줄기 세포에서 세포 주기 진행 분석을 위한 5-에티닐-2'-Deoxyuridine/인성-히스톤 H3 이중 라벨링 프로토콜

여기에서는 성공적인 유전자 변형의 마커 없는 식별을 위해 PCR 기반 기술을 활용하여 안정적인 knock-in 라인의 개발을 촉진하는 초파리에 대한 단순화된 내인성 유전자 태깅 프로토콜을 제시합니다.

Drosophila melanogaster의 내인성 유전자 태깅을 위한 원스텝 CRISPR 기반 전략

배우세요 Drosophila를 이용한 헤테로크로마틴 촉진 약물 스크리닝 방법을 통해 눈 색깔 표현형으로 약물 효과를 평가하고 암 치료 연구에 활용할 수 있는 비용 효율적인 in vivo 시스템을 확인하세요.

초파리를 이용한 헤테로크로마틴 촉진 약물의 식별을 위한 스크리닝 방법

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