Name: 다층 하이드로겔 바이오잉크를 3차원 바이오프린팅에 사용하여 균일한 세포 분배 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: 학습하세요 다층 하이드로겔 바이오잉크를 활용한 3D 바이오프린팅 기술로 세포 침전을 방지하고 균일한 세포 분배를 구현하는 방법을. 이 기술은 조직 공학 및 재생의학 연구에 활용됩니다.

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저자는 중국 국립 자연과학 재단(81771971, 81970442, 81703470 및 81570422), 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2018YFC1005002), 상하이 시립기술위원회(17JC14002), 상하이시립과학위원회(17JC14000) 및 상하이시립과학위원회(17JC14002)의 보조금을 인정한다. 2017SHZDZX01) 및 상하이 시교육위원회(혁신 프로그램 2017-01-07-07-07-E00027).

1. 세포가 함유된 SF-GelMA 준비
<ol><li>0.22 μm 주사기 필터 장치를 사용하여 모든 재료를 살균합니다. 생물학적 안전 캐비닛에서 모든 단계를 수행합니다.</li>
	<li>1x PBS를 50°C로 따뜻하게 하고, 가열된 1x PBS에서 교반을 통해 젤라틴을 용해시다. PBS에서 젤라틴의 최종 농도는 10 %(w / v)여야합니다.</li>
	<li>젤라틴 용액에 메타크릴 무수화물을 넣고(0.6 대 1의 젤라틴에 메타크릴 무수화물의 중량 비)를 천천히 교반하고, 적어도 1h(50°C)에 대한 복합체를 혼합한다. 전형적으로, 메타크릴 무수화물 12g으로 10% 젤라틴 용액의 200mL를 준비; 볼륨은 연구의 요구에 따라 달라집니다.</li>
	<li>젤라틴 및 메타크릴 무수화물을 포함하는 혼합 용액을 50mL 멸균 튜브로 이송합니다.</li>
	<li>3,500 x g에서혼합 용액을 원심 분리합니다. 일반적으로 두 개의 레이어를 얻기 위해 3-5 분이 걸립니다. 상층(GelMA)을 수집하고 하단 레이어(반응되지 않은 메타크릴 무수화물)를 폐기합니다.</li>
	<li>1.5단계에서 얻은 상부층 용액을 2부량의 탈온화된 물(40-50°C)으로 희석시켰다.</li>
	<li>5-7일 동안 염분수(40-50°C)에 대해 12-14kDa 분자량 차단 투석막으로 1.6단계에서 얻은 용액을 투석한다. 매일 두 번 물을 변경합니다.</li>
	<li>수집 및 하룻밤 -80 ° C에서 GelMA 용액을 동결.</li>
	<li>-45°C로 설정된 온도와 0.2mbar로 설정된 압력으로 동결 건조기에서 3-5일 동안 GelMA 용액을 lyophilize합니다.</li>
	<li>용이성 GelMA (약 75%의 대체 정도) 1x PBS에서 10% FBS(태아소 혈청, v/v), 25m HEPES(N-2-하이드록소예틸파이프라진-N-에탄-설포닉산), 광신염기(0.5%, w/v)를 함유하여 GelMA 바이오잉크 제제를 획득하였다. 참고: GelMA의 대체 정도는 닌히드린 분석3에의해 계산될 수 있다.</li>
	<li>GelMA 용액(10%, w/v)을 초기 SF 솔루션(5%, w/v) 및 1x PBS의 다양한 부피와 혼합하여 SF의 다양한 농도를 가진 SF-GelMA 바이오잉크를 얻습니다. 다른 바이오잉크에서 GelMA 및 SF 용액의 1mL당 비율은 표 1에제시된다. 참고: 모든 바이오잉크는 5%(w/v) GelMA의 최종 농도를 포함해야 하지만, SF의 농도는 서로 다른 SF-GelMA 바이오잉크에서 0.5, 0.75, 1.0, 1.25 및 1.5%(w/v)입니다. SF-M-계층-GelMA를 사용하여 SF로 변형된 GelMA 바이오잉크를 레이어별로 용어로 지칭한다. SF-X-GelMA를 사용하여 동질적인 방식으로 SF로 변형된 GelMA를 용어로 사용합니다(예를 들어, 1% SF를 수정한 GelMA는 SF-1-GelMA라고 불려졌다).</li>
	<li>모든 바이오 잉크를 10-20분 동안 초음파 처리합니다.</li>
	<li>DMEM을 사용하여 NIH3T3 세포를 성장 (덜벡코의 수정 독수리 매체) 포함 10% FBS 와 1% 페니실린 -연쇄 상색 - 5 % CO2와37 ° C). 밀도가 80%에 도달하면 세포를 1:3의 비율로 통과시합니다.</li>
	<li>원심분리기 는 1500 rpm에서 NIH3T3 세포의 현탁액을 5분 동안 제거합니다. 참고: 바이오잉크내의 캡슐화된 세포의 농도는 1 x 106 세포/mL이어야 하며, 농도는 사이토미터로 계산되어야 한다.</li>
	<li>다양한 세포-감방 바이오잉크를 얻기 위해 세포 펠릿을 중단하기 위해 2mL의 다른 SF-GelMA 바이오잉크를 사용한다.</li>
</ol>2. SF-M 계층-GelMA의 적재, 재가열 및 바이오 프린팅
<ol><li>주사기의 하단 층에 셀 라덴 SF-0.5-GelMA의 0.4 mL를 적재한다. 참고: 이 연구에서 2mL 주사기를 바이오잉크 저장소로 사용합니다. 상이한 SF-GelMA 바이오잉크를 층별로 주사기에 적재한다.</li>
	<li>주사기를 얼음 수조(0°C)에 5분 간 배치하여 바닥층 바이오잉크가 젤 상태로 변하게 됩니다.</li>
	<li>하중 0.4 mL의 세포 라덴 SF-0.75-GelMA 바이오잉크를 바닥 층 위에 한다.</li>
	<li>2층의 바이오잉크를 얼음수조(0°C)에 5분 간 배치하여 두 층의 바이오잉크가 젤 상태로 변하게 한다.</li>
	<li>다른 층에서 SF의 다른 농도를 가진 다층 바이오 잉크 시스템을 얻기 위해 나머지 3종의 바이오잉크(SF-1-GelMA, SF-1.25-GelMA, SF-1.5-GelMA)를 사용하여 로딩 및 냉각 단계를 3회 더 순환한다. 모든 바이오 잉크의 적재에 사용되는 부피는 0.4 mL여야 합니다.</li>
	<li>바이오프린팅 전에 30분 동안 인큐베이터(37°C)에 주사기를 배치하여 다층 바이오잉크를 재가열한다.</li>
	<li>2mL 주사기를 27G 프린팅 노즐이 있는 바이오크 저수지로 사용하십시오. 50 μL/min에서 유동 속도를 설정하고 노즐의 이동 속도는 2mm/s로 설정하고 노즐의 높이를 1mm에서 수행합니다.<ol>
<li>조직 구조를 이전 연구에서 적응한 매개변수(11,,12)에서맞춤형 바이오 프린터를 사용하여 압출 방식으로 인쇄한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>40s에 자외선(365nm, 800mW)을 사용하여 생체 인쇄 조직 구조를 교차연결합니다.</li>
	<li>배양DMEM(덜벡코의 수정이글 배지)에서 교차연결 조직 구조는 인큐베이터(37°C 와 5%CO2)에서10%의 FBS 및 1% 페니실린-연쇄절제술을 함유한다. 배지는 처음 2 일 동안 8 h마다 변경되었고 그 후 2-3 일마다 변경되었습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Khademhosseini, A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+progress+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">A decade of progress in tissue engineering.</a> Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).</li>
<li>Heinrich, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting%3A+from+benches+to+translational+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting: from benches to translational applications.</a> Small. , 1805510(2019).</li>
<li>Daniela, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalization%2C+preparation+and+use+of+cell-laden+gelatin+methacryloyl-based+hydrogels+as+modular+tissue+culture+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms.</a> Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).</li>
<li>Pedde, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+biofabrication+strategies+for+engineering+complex+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs.</a> Advanced Materials. 29 (19), (2017).</li>
<li>Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioink+properties+before%2C+during+and+after+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Bioink properties before, during and after 3D bioprinting.</a> Biofabrication. 8 (3), 032002(2016).</li>
<li>Guillotin, B., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+patterning+technologies+for+organotypic+tissue+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication.</a> Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).</li>
<li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of tissues and organs.</a> Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).</li>
<li>Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-stage+crosslinking+of+a+gel-phase+bioink+improves+cell+viability+and+homogeneity+for+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).</li>
<li>Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multimaterial+bioink+method+for+3D+printing+tunable%2C+cell-compatible+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels.</a> Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).</li>
<li>Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+piezoelectric+cell+printing+accuracy+and+reliability+through+neutral+buoyancy+of+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).</li>
<li>Chen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+bioink+with+multilayered+interfaces+improves+dispersibility+of+encapsulated+cells+in+extrusion+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).</li>
<li>Zhu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+extrusion+bioprinting+of+bio-macromolecular+bioinks+through+alginate-templated+dual-stage+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking.</a> Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127(2018).</li>
<li>Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+insulin-like+growth+factor-I+and+ribonuclease+through+fibrin+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels.</a> Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

다계층 시스템의 안정성은 이 프로토콜을 성공적으로 수행하는 핵심 포인트입니다. 우리는 이론적으로 나우만의 연구13에기초하여 GelMA 용액에서 SF 분자의 확산을 계산했다. 용액에 있는 단백질의 확산이 그들의 분자량과 관련되었다는 것을 것을을 발견되었습니다. 소 세럼 알부민(BSA)의 평균 분자량(MW)은 66.5kDa이며 확산 계수는 64-722μm 2/s이다. 피브리노겐의 평균 MW는 339.7 kDa이며 확산 계수는 23-34 μm2/s입니다. 우리의 연구 결과에 있는 SF 분자의 평균 MW는 대략 100 kDa입니다. Nauman의 연구 결과에 기초하여, 단일 SF 분자의 확산 계수는 25°C에서 물에서 23-72 μm2/s사이입니다. 스토크스-아인슈타인 방정식에 따르면 확산 계수는 다음과 같이 정의됩니다.
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3차원(3D) 바이오프린팅은 생물제조 및 재생의학1,,2,,3에서토착 조직의 복잡한 건축 및 기능적 복제본을 제조하는 유망한 방법이었다. 잉크젯, 압출 및 스테레오그래피 인쇄를 포함한 바이오 프린팅의 일반적인 전략에는 서로 다른 관점에서 장단점이있습니다 4. 이러한 기술 중, 압출 절차는 비용 효율성으로 인해 가장 일반적으로 사용됩니다. 바이오잉크는 압출 바이오프린팅의 공정 안정성에 중요한 역할을 합니다. 이상적인 세포-감이 있는 바이오크는 생체 적합성뿐만 아니라 기계적 특성5에도적합해야 한다. 점도가 낮은 바이오잉크는 전형적으로 액체와 같은 상태로 제시됩니다. 이러한 바이오 잉크는 쉽고 빠르게 증착될 수 있으며 압출 시 높은 전단 응력으로 인한 세포막 손상을 피할 수 있습니다. 그러나, 장기간 인쇄 기간을 요구하는 복잡한 경우에는 점도가 낮은 경우가 종종 생체 잉크 저장소에서 캡슐화 된 세포의 피할 수없는 침전을 초래하며, 이는 일반적으로 중력에 의해 구동되며 바이오 잉크6,,7에서불균일 한 세포 분산으로 이어집니다. 따라서, 불균일한 세포 분산성을 가진 바이오크는 기능성 조직 구조의 체외 생체 인쇄를 방해한다.
바이오 잉크에 초점을 맞춘 몇 가지 최근 연구는 캡슐화 된 세포의 균질 분산성의 홍보를보고했다. 이중 단계 교차 연결을 기반으로 한 변형 된 알기네이트 바이오잉크는 압출 바이오 프린팅8에사용되었다. 알기네이트 폴리머는 이 연구에서 펩티드와 단백질로 변형되었다. 세포는 펩티드와 단백질에 의해 제공되는 부착 부위로 인해 일반적으로 사용되는 알기네이트보다 이 수정된 알기네이트에서 보다 균일한 분포를 제시했다. 대안적으로, 혼합된 바이오잉크는 바이오잉크내세포의 퇴적물을 해결하기 위해 활용되고 있다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 젤라틴 또는 젤라틴 메타크라릴(GelMA)을 함유한 블렌드 바이오잉크가 기계적 견고성을 향상시키는 또 다른 연구9에서사용되었다. 캡슐화된 세포는 혼합된 바이오잉크의 점도가 향상되었기 때문에 주로 균일분포를 제시했다. 일반적으로 생체 잉크의 점도, 세포의 중력, 세포의 밀도 및 작업 기간의 지속 기간과 같은 생체 잉크내캡슐화된 세포의 분산성에 영향을 미치는 몇 가지 요인이 있다. 이러한 요인 중, 세포의 중력퇴적 완화를 촉진에 중요 한 역할을. 점성 바이오잉크가 제공하는 부력과 마찰은 현재까지 중력에 대한 주요 세력으로 조사되었다10.
본 명세서에서는 바이오잉크 저장소에서 여러 액체 인터페이스를 조작하여 생체 잉크내캡슐화된 세포의 균일한 분산성을 촉진하는 새로운 전략을 개발했습니다. 바이오잉크의 다층 변형에 의해 생성된 이러한 액체 인터페이스는 세포의 침전을 지연시키는 얼굴 간 보존을 제공할 뿐만 아니라 생체 잉크의 적절한 생체 적합성 및 유변학적 거동을 유지할 수 있습니다. 실제로, 우리는 실크 섬유신 (SF)으로 수성 GelMA 용액 (5%, w /v)을 다층 방식으로 수정하여 4 개의 인터페이스를 세로로 생성하여 혼합 된 바이오 잉크의 얼굴 간 장력을 제공합니다. 그 결과, 세포상에 적재된 중력적 적재는 인공면형 장력에 의해 상쇄되었고, 바이오잉크내의 캡슐화된 세포의 거의 균일한 분산은 인접한 세포층을 가로지르는 적은 퇴적물으로 인해 얻어졌다. 액체 바이오 잉크의 면면 보존을 조작하여 캡슐화된 세포의 침전을 늦추는 유사한 프로토콜은 현재까지 보고되지 않았다. 우리는 생물 인쇄에서 세포 퇴적물을 해결하는 새로운 방법을 보여주기 위해 여기에 우리의 프로토콜을 제시합니다.

<table><tbody><tr><td>2-하이드록시-4&프라임;-(2-하이드록시에톡시)-2-메틸프로피오페논(PI2959)</td><td>TCI</td><td>M64BK-QD</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 변형 된 독수리' s 매체 (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10569044</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10091</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>시그마-알드리치</td><td>V900863MSDS</td><td></td></tr><tr><td>메타크릴 무수물 (MA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>276685MSDS</td><td></td></tr><tr><td>페니실린&ndash; 스트렙토마이신 항생제</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Silk fibroin</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5154</td><td></td></tr></tbody></table>

다층 하이드로겔 바이오잉크를 3차원 바이오프린팅에 사용하여 균일한 세포 분배

Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution

압출 기반 의 3 차원 바이오 프린팅 공정 동안 점도가 낮은 액체 와 같은 바이오잉크는 전단 응력에 의해 유도 된 막 손상으로부터 세포를 보호하고 캡슐화된 세포의 생존을 향상시킬 수 있습니다. 그러나, 저수지의 급속한 중력 구동 세포 침전은 생체 인쇄 구조물에 있는 불균일한 세포 분포로 이끌어 내고 그러므로 액체 같이 bioinks의 적용을 방해할 수 있었습니다. 여기서는 캡슐화된 세포의 침전을 방지하기 위해 액체형 바이오잉크(예: 점도가 낮은 젤라틴 메타크라이로일)에 대한 새로운 다층 변형 전략을 개발했습니다. 다층 바이오잉크에서 여러 개의 액체 인터페이스를 조작하여 얼굴 간 유지를 제공하였다. 따라서 다층 시스템에서 인접한 층을 가로지르는 세포 침전 작용은 바이오크 저장소에서 지연되었다. 안면 유지가 세포의 퇴적물 당김보다 훨씬 높았으며, 세포 침전을 방지하고 다층 바이오잉크에서 세포의 보다 균일한 분산을 촉진하는 데 있어 면면 간 보존의 중요한 역할을 입증한 것으로 나타났습니다.

세포가 함유된 바이오잉크의 제조의 회로도가 도 1에도시된다. 상이한 바이오잉크의 제조 후, 적재, 재가열 및 바이오프린팅이 수행되었다(그림2). 바이오잉크 저장소내 캡슐화된 세포의 분포를 평가하기 위해, 3개의 96웰플레이트(그림 3A)에서3개의 다른 세포 라덴 바이오잉크를 사용하여 생체 인쇄 절차를 수행하였다. 2개의 대조군(자연 그대로겔마 및 SF-1-GelMA 바이오잉크) 및 실험군(SF-M-계층화-GelMA bioink)은 캡슐화된 세포의 분산을 조사하기 위해사용되었다(도 3B). 세포가 함유된 바이오잉크의 60마이크로리터는 3개의 96웰 플레이트의 모든 우물에서 압출되었다. 3종의 바이오잉크의 총 부피는 2mL였고, 그 결과 바이오프린팅 기간은 30분 이상이었다. 인쇄 전(30분) 이전의 추가 인큐베이션을 통...

여기서, 우리는 캡슐화된 세포의 침전을 방지하기 위하여 액체 같이 bioinks (낮은 점도를 가진 젤라틴 methacryloyl)를 위한 새로운 다층 수정 전략을 개발했습니다.

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by ...

우리의 프로토콜을 사용하여, 액체와 같은 바이오 잉크 희석제의 다층은 캡슐화된 세포의 균일한 분산을 촉진할 뿐만 아니라 세포에 적합한 바이오잉크 환경을 유지합니다. 우리는 배출 인쇄 중에 세포에 높은 전단 응력 부하를 피하고, 바이오 잉크 저장소 내에서 캡슐화된 세포의 침전을 막기 위해 얼굴 간 장력을 사용합니다. 이 기술을 사용하여, 우리는 균일 한 세포 분포와 3D 조직 구조를 생성 할 수 있습니다, 약물 스크리닝 및 재생 의학 연구에 사용하기위한 기능적 시험관 조직 금형을 제공.바이오 잉크를 준비할 때, 이러한 요인이 잉크의 품질에 영향을 줄 수 있으므로 실험 온도 및 히그로겔 적재 절차에주의를 기울이는 것이 중요합니다. 준비를 시작하기 전에 0.22 마이크로미터 주사기 필터 장치를 사용하여 모든 재료를 살균하고 생물학적 안전 캐비닛에서 50도-섭씨 PBS에서 10% 최종 농도로 젤라틴을 용해하십시오. 50°C에서 적어도 1시간 동안 느린 교반을 하는 0.6 대 1 중량 비로 젤라틴 용액에 메타크릴 무수화물을 추가합니다.인큐베이션이 끝나면 혼합 용액을 멸균 50밀리리터 튜브로 옮기고 원심분리에 의해 용액을 층으로 분리한다. 상부 GelMA 층을 수집하고 수집된 용액을 섭씨 40~50도의 2부로 희석합니다. GelMA 용액을 12~14킬로달톤 의 분자량 차단 투석 막으로 40~50도에서 5~7일 동안 분해된 물에 대해 투석을 하여 매일 두 번 물을 교체합니다.투석이 끝나면 GelMA 용액을 하룻밤 동안 영하 80도에서 동결하십시오. 다음으로 3~5일 동안 냉동 건조기에서 영하 45도, 압력 0.2밀리바의 용액을 lyophilize합니다. 그런 다음 PBS에서 10%의 태아 소 혈청, 25 밀리몰러 HEPES 및 0.5%의 광신화로 보충된 효용젤마를 용해시합니다.실크 섬유진 GelMA 바이오 잉크를 얻으려면 GelMA 용액을 초기 실크 섬유용액의 상이한 볼륨과 표에 제안된 PBS의 다른 부피와 혼합하십시오. 모든 바이오잉크가 준비되면 10~20분 동안 용액을 초음파처리합니다. 잉크가 초음파 처리되는 동안, 바이오잉크 용액당 15밀리리터 원뿔튜브로 80%의 컨실릭 NIH/3T3 세포 배양에서 세포를 수집하고 원심분리에 의해 세포를 펠릿한다.그런 다음 수퍼나티를 조심스럽게 흡인시키고 바이오잉크 용액 농도의 밀리리터 당 6개의 세포로 10회 10시에 바이오잉크 2밀리리터로 각 튜브의 세포를 재연한다. 인쇄용 바이오잉크를 적재하려면 2밀리리터 주사기의 하단 층에 셀이 함유된 실크 섬유증 0.5 GelMA의 흡인 400 마이크로리터를 추가합니다. 주사기를 0-섭씨 0-섭씨 얼음 수조에 넣고 실크 섬유진 0.5 GelMA층에 셀 라덴 실크 섬유진 0.75 GelMA 바이오잉크 의 400 마이크로리터를 적재하기 전에 바닥 층 바이오크를 젤 상태로 변환합니다.그런 다음 주사기를 얼음 욕조에 5분 동안 돌려보내, 셀라덴 바이오잉크의 각 추가 농도를 주사사기에 같은 방식으로 추가로 첨가합니다. 상이한 층 내에서 실크 섬유신의 농도가 다른 다층 바이오잉크 시스템이 달성되면, 30분 동안 37도-섭씨 인큐베이터로 바이오잉크를 재가열한다. 인큐베이션이 끝나면 27게이지 프린팅 노즐을 주사기에 적재하고, 분당 50마이크로리터로 유동 속도를 설정하고, 노즐의 이동 속도는 초당 2밀리리터로, 노즐의 높이를 1밀리미터로 설정합니다.다음으로 실온에서 맞춤형 바이오프린터를 사용하여 조직 구조를 압출 방식으로 인쇄하고, 생체 인쇄 조직 구조를 800 밀리와트에서 40초 동안 365나노미터의 자외선과 교차 연결한다. 그런 다음 DMEM에서 교차 연결된 조직 구조를 배양하여 세포 배양 인큐베이터에서 10%의 태아 소 혈청과 1%페니실린 연쇄절제술을 보충하여 처음 2일 동안 8시간마다 배지를 변경하고 그 후 2~3일마다 배지를 변경한다. 이 대표적인 분석에서, 바이오프린팅 절차가 진행됨에 따라, 표적 우물내의 세포의 밀도는 모든 그룹에서 감소하였다.실크 섬유통 제로 GelMA 그룹에서, 세포의 약 70%가 바닥 층으로 증착되었다. 실크 섬유증 1GelMA 그룹에서, 세포의 약 40%가 바닥 층으로 증착되었고, 세포의 약 5%가 상부 층에 증착되었다. 실크 섬유증 다층 GelMA 그룹에서 캡슐화된 세포의 증착은 대조군의 증착보다 더 균일했다.이 프로토콜의 가장 중요한 부분은 SF-GelMA 바이오잉크 다층의 로딩입니다. 이 프로토콜은 액체와 같은 바이오 잉크를 사용하는 다른 압출 바이오 프린팅 분석에 적용될 수 있습니다.

using-multilayered-hydrogel-bioink-three-dimensional-bioprinting-for

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

bioprinter는 희생 형에 따라 패턴 하이드로 겔을 만드는 데 사용되었다. 폴록 사머 형은 두 번째 히드로 겔로 채워질 그리고 세 번째 하이드로 겔로 채워졌다 빈 공간을 남겨 용출되었다. 이 방법은 생체 고분자의 복잡한 구조를 생성하는 빠른 용출과 폴록 사머의 좋은 인쇄 적성을 사용합니다.

모방의 창조 3D 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 Thermoresponsive 역 금형 인쇄

Cartesian bioprinter는 정밀하고 재현 가능한 형상으로 다중 재료 증착을 허용하는 동시에 환경 요인을 제어할 수 있도록 설계 및 제작되었습니다. 3차원 바이오프린터를 사용하면 복잡하고 실행 가능한 구조를 인쇄하고 쉽게 복제할 수 있습니다.

세 디스펜서 데카르트 프린터 사용 Bioprinted 세포를 구축의 생존

우리는 함께 기능적 가능한 3 차원 조직의 구조체는 시험 관내 스크리닝의 용도 bioprinted 될 수있는 조직 흉내 낸 bioink 하이드로 겔을 제공하는 일련의 프로토콜을 설명한다.

Bioprinting Cellularized는 조직 고유의 하이드로 겔 Bioink를 사용하여 구축

이 프로토콜은 에칭된 지형 안내 신호와 하이드로겔 바이오잉크를 함유한 셀의 정밀 증착을 통합하는 자동화된 로봇 증착 시스템을 사용하는 바이오프린팅 방법론을 설명합니다. 프린트된 셀은 에칭된 피처에 직접 전달되어 이를 감지하고 방향을 지정할 수 있습니다.

세포의 표면지도 및 Bioprinting에 대한 자동화 된 로봇 분배 기법

우리 어디 보조 세포 유형 수 더 시드할 수이 microfibrous 구조 vascularized 조직 및 organoids를 생성 하는 틈새 공간으로 microfibrous 혈관 침대 엔지니어링에 대 한 미세 bioprinting 전략에 따라 일반화 된 프로토콜을 제공 합니다.

공학에 대 한 미세 Bioprinting 나가도록 조직 및 Organoids

우리 불멸 하 게 종양 및 섬유 세포 bioprintable alginate/젤라틴 bioink에 포함 된 구성 된 이기종 유 방 암 모델 개발. 모델이 비보에 종양 microenvironment tumorigenesis 운전 메커니즘에 대 한 통찰력을 양보 하는 다세포 종양 spheroids의 형성을 촉진 한다.

셀 회전 타원 체 형성을 유발 하는 모델 시스템에 3D 생체 외에서 Bioprintable Alginate/젤라틴 하이드로 겔

본 문서에서는 저가형 상업용 3D 프린터를 세균 3D 프린터로 변환 하 여 패턴화 된 바이오 필름의 인쇄를 촉진할 수 있는 방법을 설명 합니다. 바이오 필름 및 바이오 잉크를 제조 하는 데 필요한 모든 측면 뿐만 아니라 생물 막의 형성을 평가 하기 위한 검증 방법도 설명 합니다.

엔지니어 드 바이오 필름의 3 차원 패터 닝-it-스스로 바이오 필름

여기에 제시된 젤라틴 메타크릴로일의 3D 바이오프린팅을 위한 방법이다.

젤라틴 메타크릴 하이드로겔 기반 바이오잉크의 3D 바이오프린팅 프로토콜

이 프로토콜은 결정성 나노셀룰로오스(CNC)/아가로즈 복합 하이드로겔 생체재료 잉크를 마우스 골수 유래 마스트 세포와 함께 세포 표면 수용체의 세포 생존성 및 표현성 발현, 키트(CD117) 및 고친화도 이에 수용체(FcθRI)의 생체 적합성을 신속하게 평가하는 방법을 강조한다.

골수 유래 마스트 세포 배양을 위한 결정성 나노셀룰로오스 내장 아가로즈 생물재료 잉크의 제조

이 기사에서는 세포외 기질 경화 및 섬유아세포 활성화를 연구하기 위해 광조정 가능 하이드로겔을 3D 바이오프린팅하는 방법을 설명합니다.

섬유아세포 활성화를 연구하기 위한 3D 바이오프린팅 광조정 가능 하이드로겔

이 연구는 새로운 κ-carrageenan 서브 마이크로겔 현탁액 수조를 소개하여 놀라운 가역적 재밍-언재밍 전이 특성을 보여줍니다. 이러한 특성은 임베디드 3D 바이오프린팅에서 생체 모방 조직 및 장기를 구성하는 데 기여합니다. 고해상도와 세포 성장으로 심장/식도 유사 조직의 성공적인 프린팅은 고품질 바이오프린팅 및 조직 공학 응용 분야를 보여줍니다.

κ-Carrageenan Sub-Microgel Medium을 사용한 조직 유사 구조의 임베디드 바이오프린팅

학습하세요 다층 하이드로겔 바이오잉크를 활용한 3D 바이오프린팅 기술로 세포 침전을 방지하고 균일한 세포 분배를 구현하는 방법을. 이 기술은 조직 공학 및 재생의학 연구에 활용됩니다.

다층 하이드로겔 바이오잉크를 3차원 바이오프린팅에 사용하여 균일한 세포 분배

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