휴대용 qPCR 시스템을 이용한 마이트리카리아 샤모말라의 현장 식별

건강을 개선하기 위해 식물을 사용하는 관행은 수천 년 전으로 거슬러 올라갑니다. 최근 지속불가능한 수확 관행과 기후 변화와 함께 수요 증가가 공급망에 스트레스를 주면서 공급망에 스트레스를 주게 되었습니다. 이 때문에 식물성 변속이 점점 더 중요해지고 있어 식물 성 식별이 품질 관리의 필수적인 부분으로 점점 더 중요해지고 있습니다.

이상적으로는 식별이 가능한 한 원본에 가깝게 수행되므로 리소스를 올바른 ID 의 재료에 효율적으로 할당할 수 있습니다. 식물 성 식별에 대한 접근 법은 여러 가지가 있습니다. 전통적으로 식물 성 식별은 형태학적 평가 및 화학 분석 방법을 통해 수행됩니다.

형태학적 식별은 식물 재료의 거시적 및 현미경 기능의 차이를 기반으로합니다. 그러나 잘 훈련된 식물학자가 필요하며 분말 식물 재료에 대한 적용이 제한되어 있습니다. 화학 분석 방법은 약전 및 실험실에서 널리 사용되지만 계측기 및 환경 요구 사항의 크기로 인해 현장 테스트에 적합하지 않습니다.

최근에는 유전체학적 방법이 식물재료의 유전체정보의 높은 충실도 및 특이성으로 인해 식물종 식별을 위한 대체 기술로 부상하고 있다. 이제 휴대용 장치의 형태로 제공되는 분자 진단 도구를 사용하면 이 접근 방식이 현장 적용을 위해 가능해집니다. 이 프로토콜의 목표는 휴대용 qPCR 시스템을 사용하여 식물 물질을 공급하는 농장과 같이 실험실 장비 및 전문 지식에 대한 접근이 제한된 상황에서 식물 성 식별 방법을 도입하는 것입니다.

일반적으로 독일 카모마일로 알려진 Matricaria chamomilla는 수세기 동안 건강을 증진하기 위해 한방 약물로 사용되어 왔습니다. 현재 방법의 특이성을 입증하기 위해, 로마 카모마일로 알려진 다른 일반적으로 사용되는 카모마일 꽃으로부터 독일 카모마일의 분화가 비교에 포함된다. 현장 식별 절차는 독일 카모마일 농장 의 한가운데에서 입증됩니다.

평평한 수평 면으로 필드에 테스트 영역을 설정합니다. 카모마일 꽃밭에서 식물의 대다수의 특성을 반영하는 대표적인 식물을 식별합니다. 멸균 장갑을 사용하여 대표 식물에서 꽃 머리를 선택합니다.

샘플을 2.0 밀리리터 수집 튜브에 넣습니다. 같은 공장에서 약 0.5~0.7cm 길이의 전단지를 반복하고 수집합니다. 마른 목욕 인큐베이터를 섭씨 95도로 예열합니다.

각 수집 튜브에 식물 DNA 추출 키트에서 추출 용액 100 마이크로리터를 추가합니다. 더 나은 DNA 추출 효율을 위해, 조직 봉기를 사용하여 샘플을 갈기. 튜브를 닫습니다.

식물 조직이 추출 과정 전반에 걸쳐 추출 용액에 의해 덮여 있는지 확인하십시오. 예열된 드라이 목욕 인큐베이터에 수집 튜브를 놓고 수집 튜브를 섭씨 95도에서 10분 동안 배양하고 마른 목욕 인큐베이터에서 튜브를 꺼냅니다. DNA 추출 키트에서 희석 용액 100마이크로리터를 추가하고 여러 번 위아래로 파이프를 통해 용액을 혼합합니다.

전단지 추출에 대해 동일한 단계를 반복합니다. 셰이크를 흔들어 용액을 더 섞습니다. 식물 문제는 일반적으로이 치료 후 저하 되지 않는 것 같습니다.

액체 색이 바뀌고 흐리게 될 수 있습니다. 초기 데칭을 위한 일정한 온도 단계로 시작하여 25사이클의 증폭을 시작하고 온도 램핑으로 끝나는 표 하나에 따라 qPCR 계측기 열순환 조건을 구성하여 고해상도 용융 곡선을 얻습니다. 사용하기 전에 실온에서 표 2에 나열된 qPCR 마스터 믹스 및 프라이머를 해동하십시오.

각 우물에 로드될 반응을 계획합니다. 대상 종에 대한 양수 제어, 비 표적 종, 샘플 및 음의 대조를 포함하는 우물. 이 예에서는 10개의 우물이 사용되고, 5개는 독일 카모마일 식별 테스트에, 또 다른 5개의 우물은 로마 카모마일 식별 시험을 위해 사용된다.

종 식별 시험의 각 유형에 대해, 하나는 표적 종 참조 물질에서 추출된 DNA를 가진 양성 대조군을 잘 포함하고, 하나는 잘 비표적 종 기준 물질에서 추출된 DNA를 가진 양성 대조군을 포함하고, 2개의 우물은 현장에서 추출된 꽃과 잎 DNA 샘플로 채워지고, 1개의 우물은 음의 대조를 위해 할당된다. 표 3은 각 웰 유형을 설명합니다. 각 식물종 식별 테스트에 대해 표 4에 따라 반응 마스터 믹스를 준비한다.

전형적인 반응 마스터 믹스는 범용 qPCR 마스터 믹스, 두 번, 전방 및 역종 특정 프라이머 및 뉴클레아제없는 물을 포함합니다. 사용하기 전에 파이펫팅하여 반응 마스터 믹스를 철저히 혼합했습니다. PCR 반응 카트리지를 평평하고 안정적인 표면에 올려 놓습니다.

본상에 정의된 웰에 따라 카트리지 웰에 이전 단계에서 구성된 반응 마스터 믹스의 18 마이크로리터를 적재한다. 이 데모를 위해, GC 테스트에 표시 된 우물에 독일 카모마일 식별 테스트 반응 마스터 믹스를 추가, 우물 1, 3, 5, 일곱, 아홉, 로마 카모마일 식별 테스트 반응 마스터 믹스 RC 테스트에 표시 된 우물에, 우물 2, 4, 6, 8, 10. DNA 추출 튜브의 상체에서 샘플 DNA의 2개의 마이크로리터를 전송하고 미리 추출된 DNA 양성 제어를 qPCR 마스터 믹스로 미리 로드된 카트리지 우물로 옮다.

qPCR 마스터 믹스에 각 DNA 템플릿을 추가한 후 파이펫팅하여 용액을 부드럽게 혼합합니다. 정착 필름으로 카트리지를 조심스럽게 밀봉하십시오. 카트리지를 열순환 챔버에 적재하고 닫습니다.

실행할 qPCR 계측기를 설정합니다. 현재 프로토콜에서, 염료를 상호 확장시키는 것은 실시간으로 표적 조각의 증폭을 측정하는 데 사용됩니다. Ct 값은 미리 정의된 임계값을 통과하는 형광 신호에 필요한 사이클 수로 정의됩니다.

25사이클 미만의 Ct 값은 양수 증폭으로 간주되었다. 이 그림에서 로마의 긍정적 인 통제는 로마 카모마일 식별 테스트에서만 증폭되었지만 독일 카모마일 식별 테스트에서는 증폭되지 않았습니다. 독일 카모마일 양성 제어 및 필드 샘플은 독일 카모마일 식별 테스트에서만 증폭되었지만 로마 카모마일 식별 테스트에서는 증폭되지 않았습니다.

음의 제어는 어느 테스트에서도 증폭되지 않았습니다. 양성 대조군 및 시료의 특정 증폭을 더욱 확인하기 위해 각 우물의 PCR 및 제품 분수는 실험실에서 2%의 아가로즈 젤에서 실행되었습니다. 독일 카모마일과 로마 카모마일 사이에 다른 예상 크기로 Ct 값25 미만의 모든 우물은 예상 된 크기로 앰플리턴을 산출했습니다.

차선의 나머지 부분에서는 현장 테스트에서 관찰된 이러한 우물에 대한 형광 신호가 없는 것과 합의하여 특정 증폭 생성물이 나타나지 않았습니다. PCR 증폭 에 이어 형광 신호를 모니터링하는 데 사용된 동일한 소프트웨어를 사용하여 용융 곡선 해석이 수행되었습니다. 온도의 증가와 함께, 이중 가닥 앰플리콘은 형광 강도의 감소의 결과로 해리하기 시작합니다.

형광 강도 변화는 로마 카모마일에서 독일 카모마일의 특징적인 용융 피크에 의해 더 차별화하기 위해 녹는 피크 곡선으로 더 변환되었습니다. 이 그림에서, 독일 카모마일 양성 제어의 용융 피크는 섭씨 85.6도이며 로마 카모마일 양성 제어의 용융 피크와 구별된다. 필드 샘플의 PCR 앰플리콘은 독일 카모마일 양성 제어에 가까운 용융 피크를 생성합니다.

필드 샘플의 ID는 컨트롤과 일치하는 특정 증폭 및 특성 용융 온도에 따라 결정됩니다. 이 예에서, 필드에서 수집 된 꽃과 잎은 모두 Matricaria chamomilla, 독일어 카모마일로 식별됩니다. 이 두 샘플에 대한 로마 카모마일 테스트 결과는 음수입니다.

이 프로토콜은 휴대용 qPCR 시스템을 사용하여 현장에서 독일어 카모마일의 식별을 보여줍니다. 유사한 방법을 개발하여 테스트할 수 있는 식물 포트폴리오를 확장할 수 있습니다. 이 비디오가 과학자, 심지어 비 전문가가 현장 이나 제한된 실험실 장비가있는 환경에서 식물 식별을 수행하는 귀중한 교육 자료를 제공 할 수 있기를 바랍니다.

DNA 기반 현장 식별 테스트는 실험실 분석과 일치하는 매우 정확한 결과를 생성할 뿐만 아니라 실험실에서 수행되는 기존 방법과 관련된 시간과 비용을 줄입니다.