Name: 이식 품질 평가를 위해 화학 생검 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min
Description: 배우세요 신장 이식 품질 평가를 위한 화학 생검 기법을 SPME 프로브와 LCMS 분석을 활용하여 대사체 및 지질체 프로파일링을 수행하는 방법입니다. 이 기술은 저침습적이고 효율적인 이식 장기 품질 평가에 활용됩니다.

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이 연구는 국립 과학 센터에서 Opus UMO-2017/27/B/NZ5/01013에 의해 지원되었습니다. 저자는 SPME 장치를 제공하는 머크 KGaA, 다름슈타트의 사업인 밀리포레시그마(MilliporeSigma)를 인정하고 싶습니다. 머크의 생명 과학 사업은 미국과 캐나다의 밀리포레시그마로 운영되고 있습니다. 또한 저자는 Q-Exactive Focus orbitrap 질량 분광계에 대한 액세스에 대한 Thermo Fisher Scientific에게 감사를 표하고 싶습니다. 저자는 알렉산드라 Woderska-Jasiinska 박사와 프로젝트에 그들의 친절한 지원에 대한 Bydgoszcz에서 이식 및 일반 수술의 부서의 직원에게 감사드립니다. BB는 워털루 대학에 머무는 동안 토론토 종합 병원에서 샘플 수집의 기회를 준 야누스 파울리진 교수에게 감사를 표하고 싶습니다.

모든 동물은 국립 의학 연구 학회가 공식화한 '실험실 동물 관리의 원리'와 캐나다 온타리오 주 국립 보건연구소가 발표한 '실험실 동물 관리를 위한 가이드'에 따라 인도적인 치료를 받았습니다. 토론토 일반 연구소의 동물 관리 위원회는 모든 연구를 승인했습니다. 연구 관련 된 인간의 과목 은 토룬에서 Bydgoszcz 니콜라우스 코페르니쿠스 대학에 있는 Collegium Medicum에 생물 윤리 위원회에 의해 승인되었습니다.
참고: 적절한 윤리 위원회의 승인을 받으세요. 항상 안전 장갑을 착용해야합니다. SPME 프로브의 추출 단계를 만지지 마십시오. 비활성화 된 유리 바이알의 사용은 리피도믹 분석에 권장됩니다.
1. 프로브 준비
<ol><li>7mm 믹스 모드 소벤트로 코팅된 티타늄-니켈 합금 프로브(길이 40mm, 직경 0.2mm)를 준비합니다. 프로브 수는 전체 절차 중에 타겟팅된 시간 점과 복제 횟수(시간당 3개 권장)에 따라 달라집니다. 참고: 추출 단계의 길이 및 유형은 연구 모드, 대사 산물의 극성 및 샘플 매트릭스에 따라 조정될 수 있다.</li>
	<li>2:1 클로로폼:메탄올(v/v)으로 구성된 세정 혼합물을 준비한다. Pipet 1.0 mL of the solution to each 2.0 mL glass vial and place one probe, previously pierced through the cap, in each vial. 참고: 사용하기 전에 모든 프로브를 청소하여 오염 입자를 제거합니다.</li>
	<li>교반기위에 바이알을 놓고 교반 속도를 1,200 rpm으로 설정합니다. 45분 후 장치를 멈추고 LC-MS 급수로 코팅을 헹구십시오.</li>
	<li>코팅은 이를 활성화하기 위해 사전 조절 단계를 거쳐야 하므로 1:1 메탄올:물(v/v)으로 구성된 사전 조절 혼합물을 준비한다. Pipet 1.0 mL of the solution to each 2.0 mL glass vial and place one probe, previously pierced through the cap, in each vial.</li>
	<li>소용돌이 교반기에 바이알을 넣고 교반 속도를 1,200 rpm에서 설정합니다.</li>
	<li>60분 후 교반기는 멈추고 LC-MS 급수로 코팅을 헹구십시오.</li>
	<li>표준 외과 장비 살균 프로토콜에 따라 프로브를 살균합니다.</li>
</ol>2. 추출
<ol><li>멸균 환경을 보장하기 위해 샘플링 직전에 멸균 패키지를 엽니다.</li>
	<li>각 시점에서 10 분 동안 신장 피질에 직접 두 개의 프로브를 삽입합니다. 코팅의 전체 길이는 조직 매트릭스에 의해 가려져야한다; 특정 각도는 필요하지 않지만 ca. 90 deg는 일반적으로 사용됩니다. 참고: 전체 의료 절차는 지정된 기관의 표준 프로토콜을 따릅니다. SPME 샘플링에 대한 수정은 고려되지 않습니다. 절차는 다음 여섯 샘플링 시간 점을 포함한다: a) 신장 절제술 전에, 기증자로부터 생체 내에서; b)-e) 후 1 h, 3 h, 5 h, 7 h 신장 관류, 장기 챔버에서 전 생체; f) 레퍼퓨전 후, 수신자로부터 생체 내.</li>
	<li>조직에서 프로브를 꺼내서 프로브를 철회한 다음 LC-MS 등급의 물로 코팅을 헹구어 코팅 표면에서 남은 혈액을 제거합니다. 수술 부위에서 멀리 헹구고, 프로브를 제거한 직후에 헹구는 다.</li>
</ol>3. 운송 및 저장
<ol><li>프로브를 별도의 바이알에 놓고 닫습니다.</li>
	<li>유리병을 드라이 아이스로 가득 차거나 액체 질소로 채워진 스티로폼 상자에 놓아 운반합니다.</li>
	<li>샘플을 냉동고(-80°C)에 저장하거나 즉시 탈착 단계를 시작합니다.</li>
</ol>4. 탈착
<ol><li>메타볼로믹 분석을 위한 80:20 아세토니일:물(v/v)과 1:1 이소프로판올:메탄올(v/v)으로 구성된 탈색 용액을 준비하여 리피도믹 분석을 위한 다정압을 준비한다.</li>
	<li>용액의 파이프 100 μL은 2.0mL에 삽입하여 라벨이 부착된 바이알에 배치하고 이전에 각 유리병에 캡을 관통한 프로브 1개를 배치합니다.</li>
	<li>소용돌이 교반기에 바이알을 넣고 120 분 동안 1,200 rpm에서 교반 속도를 설정합니다.</li>
	<li>바이알에서 프로브를 제거합니다. 획득한 추출물은 이제 기악 분석에 대한 준비가 되었습니다.</li>
</ol>5. LC-MS 분석
<ol><li>LC-MS 시스템의 자동 샘플러에 추출물이 포함된 바이알을 배치합니다. 참고: 액체 크로마토그래피(RP, HILIC)와 고해상도 질량 분석기 및 궤도랩 질량 분석기와 결합하여 이 연구를 위해 사용되었습니다. 메타볼로믹 분석 매개 변수의 경우 5.2 단계로 이동하십시오. lipidomic 분석 매개 변수의 경우 5.6 단계로 이동하십시오.</li>
	<li>펜타플루오로페닐(PFP) 컬럼(2.1mm x 100mm, 3 μm)을 사용하여 상 분리를 반전시라.<ol>
<li>유량을 각각 300 μL/min, 자동 샘플러 및 기둥 온도를 4°C 및 25°C로 설정합니다.</li>
		<li>다음 비율에 따라 이동 상 준비: 물: 포믹 산 (99.9:0.1, v/v), 및 이동 단계 B: 아세토닐:포믹 산 (99.9:0.1, v/v). 다음 매개 변수에 따라 이동 상 흐름을 설정: 이동 상 흐름 시작 (0-3 분): 100% A 는 10% A (3-25 분)에 선형 그라데이션 다음, 34 분까지 10 % A의 등도 흐름으로 끝나는, 열 재평시간의 6 분.</li>
	</ol>
</li>
	<li>HILIC 분리의 경우 HILIC 컬럼(2.0mm x 100mm, 3 μm, 200A)을 사용하십시오. 유량을 400 μL/min으로 설정합니다.<ol>
<li>다음 비율에 따라 이동 상 준비: 아세토닐트릴:암모늄 아세테이트 버퍼 (9:1, v/v, 유효 소금 농도 20 mM), 이동 단계 B: 아세토닐레:암모늄 아세테이트 버퍼 (1:1, v/v, 효과적인 소금 농도 20 mM).</li>
		<li>다음 매개 변수에 따라 이동 상 흐름을 설정: 모바일 위상 흐름 시작 (0-3 분) 100% A에서, 3.0 분 동안 유지 한 다음 5 분 이내에 100 % B로 램프. 12분까지 100% B로 잡고, 8분 동안 열평형 시간을 갖는다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>스캔 범위를 85-1000 m/z로 설정합니다. 푸티지 이온화 모드에서 HESI 이온 소스 파라미터를 설정: 스프레이 전압 1,500 V, 모세관 온도 300°C, 칼집 가스 40 a.u., 보조 가스 유량 15 a.u., 프로브 히터 온도 300°C, S-렌즈 RF 레벨 55%.</li>
	<li>각 분석된 샘플(정기적으로 10-12개의 샘플마다)의 10μL로 구성된 QC 샘플을 실행하여 계측기 성능을 모니터링합니다.</li>
	<li>반전 된 위상 분리의 경우 C18 컬럼 (2.1 mm x 75mm, 3.5 μm)을 사용합니다.<ol>
<li>유량을 각각 200 μL/min, 자동 샘플러 및 기둥 온도를 4°C 및 55°C로 설정합니다. 다음 비율에 따라 이동 단계 준비: H2O:MeOH (60:40, v/v), 10 mM 암모늄 아세테이트 및 1 mM 아세트산; 이동상 B: IPA:MeOH (90:10, v/v), 10mM 암모늄 아세테이트 및 1 mM 아세트산.</li>
		<li>다음 매개 변수에 따라 이동 상 흐름을 설정: 0-1 분 (20% B), 1-1.5 분 (20-50% B), 1.5-7.5 분 (50-70% B), 7.5 -13분(70~95% B), 13-17분(95% B), 17-17.1분(95~20% B), 17.1~23분(20%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>HILIC 분리의 경우 HILIC 컬럼(100 x 2.1 mm, 3 μm)을 사용합니다.<ol>
<li>유량을 각각 400 μL/min, 자동 샘플러 및 기둥 온도를 4°C 및 40°C로 설정합니다.</li>
		<li>모바일 단계 A: ACN; 이동상 B: 물에 5mM 암모늄 아세테이트. 다음 매개 변수에 따라 이동 상 흐름을 설정: 0-2 분 (96% B), 2-15 분 (96-80% B), 15-15.1 분 (80-96% B), 15.1-21 분 (96% B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>HESI 이온 소스 파라미터를 전압 3,500V, 모세관 온도 275°C, 칼집 가스 20a.u., 보조 가스 유량 10a.u., 프로브 히터 온도 300°C, S-렌즈 RF 레벨 55%를 분사하도록 양수 이온화 모드에서 HESI 이온 소스 파라미터를 설정합니다.</li>
	<li>각 분석된 샘플(매 10-12개의 샘플)의 10μL로 구성된 QC 샘플을 실행하여 계측기 성능을 모니터링합니다.</li>
	<li>계측기와 호환되는 소프트웨어에서 데이터 수집을 수행합니다.</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>표적화된 메타볼로믹스 및 리피도믹스 분석에 전념하는 소프트웨어를 사용하여 데이터 처리, putative 식별 및 통계 분석을 수행합니다. 참고: 데이터 구조를 시각화하기 위해 주 성분 분석(PCA) 및 박스 수염 플롯을 얻을 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 Q-Exactive 포커스 궤도 랩 질량 분광계에 대한 액세스를 위한 SPME 장치 및 써모 피셔 과학을 제공하는 밀리포레시그마 (머크 KGaA, 다름슈타트, 독일)를 인정하고 싶습니다.

장기 품질의 평가는 주어진 기관이 이식을 위해 실행 가능한지 또는 버려야 하는지 여부에 관하여 신속한 통보된 결정을 내려야 하는 의사를 위한 큰 도전남아 있습니다. 기증자 나이, 허혈의 기간 및 감염 및 선동적인 프로세스와 같은 다중 요인은, 장기 이식 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 신장 동종 이식 기능을 진단하기 위해 현재까지 다양한 방법이 개발되었지만, 조직 병리학 검사는 그 물질3,,4,,12에서금 본위제로 남아 있다. 생검 절차는 기존의 기증자 질병과 혈관 변화에 관한 중요한 정보를 얻을 수 있지만, 그것은 결함의 무료아니다. 기관 기능에 관한 포괄적인 정보에 대한 관측자 간 가변성 및 샘플링과 관련된 샘플링 오류는 이점에서 전형적인 관심사로 남아 있습니다. 더욱이, 표본 제제는 냉동 구간의 경우 이식편에 대한 불완전한 평가, 파라핀 단면화시 절차 시간 연장 등의 몇 가지 문제점을 가져온다. 그러나, 현미경 또는 총 혈뇨로 급격하게 나타날 수 있는 출혈의 증가한 리스크는, 생검 절차와 관련되었던 중요한 생명을 위협하는 합병증입니다. 이러한 이유로, 허용생검의 수는 이식 절차에서 엄격하게 제한되어 있으며, 이 방법을 통해 동적 변화 및 타임시리즈 분석의캡처를방해하는요인(12,13,,14). 조직학 분석의 이점은 방법론과 관련된 위험에 대해 무게를 두어야 합니다. 조직학적 발견의 가치는 논란의 여지가 없지만 수차의 분자 메커니즘을 설명하지는 않습니다.
메타볼로믹스와 리피도믹스는 "오믹스" 과학 가족의 가장 어린 영역입니다. 대사 네트워크 내에서 연결된 저분자(&1,200 Da) 인간 대사산물 및 지질의 전체 세트는 인간 메타볼로메로 정의된다. 게놈은 돌연변이에 기인한 경미한 수정과 함께 그것의 일생 내내 상대적으로 일정하게 남아 있습니다. metabolome는 모든 생물학적 과정뿐만 아니라 환경 요인의 변화에 매우 민감한 유전자 발현의 산물입니다. 대사 산물과 지질의 동적 특성은 현재 장기 상태,7,8,15,,16의완벽한 지표를 만든다., 상기 프로토콜에 제안된 SPME 방법은 기증자의 바디에서 기관 제거에서 시작하여 수령인의 에 재보정까지 그것의 보존 도중 기관에서 생기는 변경의 검출을 가능하게 합니다. 프로브의 작은 직경 (~200 μm)은 최소한의 침습성을 제공하며 조직에 손상을 주지 않고 동일한 기관에서 여러 번 샘플링할 수 있습니다. 신장을 이용한 연구를 수행, 가장 자주 이식 기관으로, 더 나은 이해와 이식의 품질과 기능을 감소에 대한 책임 대사 경로의 추가 특성을 허용. 시간이 지남에 따라 수정을 모니터링할 가능성은 생검과 같은 기존의 침습적 방법에 비해 기술의 중요한 이점입니다. 현재 제시된 분석은 지질과 대사산물의 각종 단의 변경된 농도를, 특히 필수 아미노산, 청신, 퓨린 뉴클레오시드 및 글리세로포스포지질의 확인했습니다. 이들 결과는 이전 조직 분석 보고서5,6,,17,18,,,,19,,20과일치한다. 현재까지, 대부분의 과학적 보고는 이식 또는 허혈/재관주입 손상(IRI) 현상 후 합병증을 유도하는 과정을 설명하기 위해 메타볼로믹스 또는 리피도믹스를 이용한 과학적 보고의 대다수가 생물유체21,,22,,23의분석에 국한되어 왔다.
각 임상 응용 프로그램은 분석 방법의 성능이 예상 기준을 충족하는지 확인하기 위해 샘플링 프로토콜의 최적화가 필요합니다. 이와 관련하여 SPME를 활용하는 이점은 다양한 실험 설계에 대한 조건을 조정할 수 있다는 점입니다. 접근 가능한 추출 단계의 다양성은 다양한 극성을 가진 추출된 대사 산물의 넓은 스펙트럼을 제공합니다. 동시에, 이것은 각 sorbent가 특정 기능에 대한 선택성을 제공하고 샘플 매트릭스에 존재하는 모든 화합물을 추출하지 않는다는 사실로 인해 방법의 제한으로 간주 될 수 있습니다. SPME 코팅은 자유 분자를 통해서만 추출되며, 단순히 아닐리바이트의 바운드 분수와 상호 작용하지 않는다는 점에 유의해야 합니다. 코팅의 생체 적합성은 단백질과 같은 큰 분자의 추출을 억제하면서 조직에 독성을 도입하지 않습니다. 결과적으로 효소 공정은 이미 샘플 수집 단계에서 억제되고 유물의 존재가 최소화되어 대체 샘플링 방법에 비해 큰 이점이 있습니다. 코팅의 길이는 추출의 효율성에 영향을 미칩니다(즉, 코팅의 길이는 표면적 및 추출 상 부피를 지정합니다); 따라서 코팅이 길수록 더 높은 회수가 가능합니다. 반면에 코팅이 짧을수록 공간 해상도가 높아지다. 신뢰할 수 있는 결과를 위해 프로브를 신장 피질의 정확한 동일한 깊이로 잠수하는 것이 중요합니다. 삽입이 너무 깊게 삽입하면 신장 수질에 들어갈 위험이 있습니다. 추출 시간도 추출 효율에 비례합니다. 따라서 최적의 추출 시간을 선택하는 것은 SPME 방법 개발에서 가장 중요한 단계 중 하나입니다. 시간 측정의 정확도는 가장 높은 반복성을 제공합니다. 논의된 것과 같은 생물학적 응용 분야에서는 분석 프로토콜의 민감도와 반복성 및 의료 절차의 제한 사이에는 항상 타협이 있습니다. 평형 추출은 안전상의 이유로 가장 높은 감도를 제공하지만 추출 시간은 수술의 총 지속 기간에 영향을 미치지 않아야하므로 사전 평형 조건은 종종 이러한 응용 분야에서 사용됩니다. 탈취의 효율은 크로마토그래피 분리9,,10,,11에사용되는 이동 상상과 호환되어야 하는 탈착 용매의 공정 및 조성물에 의해 결정된다.
외과 간 평가에 사용되는 진단 계측에 대한 주요 요구 사항 중 하나는 분석 시간입니다. 현재는 미세유체 개방 인터페이스(MOI) 24 또는 코팅 블레이드 스프레이(CBS)(CBS) (CBS) 25를통해 질량 분광계에 직접 결합된 생체 내 SPME 추출을 위한 신속한 도구를 개발하기 위한 시도가 이루어지고 있다.24 이러한 접근 방식은 분석 결과를 실제 또는 실시간으로 공개할 수 있게 해 줄 것입니다. 신진 대사와 lipidomic 프로필의 사전 개입 분석을위한 이러한 방법의 사용은 이식 절차 동안 의사 결정 과정을 향상시킬 수, 장기 실패의 경우 최상의 개인화 된 접근 방식과 빠른 응답을 가능하게.
요약하자면, 제안된 프로토콜이 신장 이식의 완전한 신진 대사 및 지질 학적 프로파일의 달성을 가능하게 할 것이라는 가설이 있으며, 이는 차례로 허혈 재퍼퓨전 손상에 대한 책임있는 과정의 장기 품질 및 특성화에 대한 포괄적 인 평가를 제공 할 것입니다. 이 프로젝트의 참신함에는 고체 상 미세 추출(SPME)의 활용을 포함하며, 살아있는 시스템의 낮은 침습적 샘플링을 제공하는 것이 포함되며, 메타볼로믹스 및 리피도믹스 분석(예: Orbitrap 고해상도 질량 분광계)에 사용할 수 있는 가장 혁신적인 기술 중 하나와 함께 합니다. SPME는 한 단계에서 대사 산물의 샘플 수집, 추출 및 담금질을 결합하여 신속한 분석을 위한 완벽한 도구입니다. 이 프로토콜은 신장의 사전 이식 조건이 지연된 기관 기능 또는 이식 후에 그것의 역기능에 책임 있는 무슨에 관련있는 질문에 대답하는 것을 도울 것이라는 점을, 뿐만 아니라 접목 보존 프로토콜이 기관의 생화학에 어떻게 영향을 미치는지에 영향을 미칠 것으로 예상됩니다. 이러한 지식은 이식과 관련된 가능한 합병증의 예방에 상당한 영향을 미칠 뿐만 아니라 현재 이식 보존 프로토콜을 개선하는 데 도움이 될 수 있으며, 생존 가능한 이식 조직의 손실과 생명 의 손실을 최소화할 수 있습니다. 제안된 해결책은 이식학에 있는 특정 잠재적인 biomarkers의 검증 및 치료 결과의 개선을 포함하여 이 필드에 있는 추가 조사에 문을 열 것입니다.

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The third affiliation was&#160;updated from:
Department of Transplantation and General Surgery, University Hospital, University of Nicolaus Copernicus Torun&#34;
to:
Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland

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Erratum: Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

미국의 장기 조달 및 이식 네트워크에 따르면, 2019년에 미국에 있는 신장 이식을 기다리는 94,756명의 환자가 있었습니다; 2018년 유럽에 있는 동안, 그 수는 10,791명이었습니다. 10분마다, 누군가는 미국에 있는 국가 이식 대기자 명단에 추가되고, 20명의 사람들이 이식1,,2를기다리는 매일 정지하는 것으로 추정됩니다. 신장 이식은 전 세계적으로 말기 신장 기능 장애로 고통받는 많은 사람들을위한 생명을 구하는 치료법입니다. 절차는 전통적인 투석에 비교될 때 증가한 생존율 및 더 중대한 삶의 질과 연관됩니다.
그러나 이식은 장기 부족이나 장기 품질 평가를 위한 효과적인 도구 부족과 같은 많은 심각한 문제에 직면해 있습니다. 표준 프로토콜은 접목의 질에 관한 포괄적인 정보를 제공하지 않는 거시적인 외관 검사 또는 침습적인 조직 생검으로 제한됩니다. 시각적 평가는 눈에 보이는 종양의 식별을 허용, 해부학 적 이상, 또는 접목에 광범위한 손상, 이 접근 방식은 관찰자의 경험에 따라 그 효과에 따라 매우 주관적이다. 반면생염은 기존의 신장 질환에 관한 귀중한 정보를 제공할 수 있으며, 따라서 이식 결과를 결정할 때 객관적이고 입증된 가치의 방법으로 간주됩니다. 그러나 생검 절차는 결함이 없습니다. 출혈과 같은 잠재적 인 합병증의 위험이 있으며 추가4-5 시간의 샘플 준비가 필요하며 감기 허혈 시간을 크게 연장합니다. 따라서, 특히 유럽에서, 직접 조직 분석의 사용은 순환사멸 후 확대기준 기증자(ECD) 및 기증자(DCD)3,,4로제한된다.
Metabolomics와 lipidomics는 최근에 기관 보존 도중 생기는 생화확적인 통로에 있는 변경의 더 나은 이해를 달성하기 위하여 유망한 접근으로 인식되었습니다. 메타볼로믹 및 지질 성 프로파일링은 후속 결과와 기관 제거와 관련된 갑작스런 환경 변화에 시스템의 즉각적인 반응을 모니터링 할 수 있습니다 : 허혈, 산화 스트레스, 또는 염증 반응5,,6,,7,,8. 신장은 신진 대사 과정과 크게 관련 된 기관, 따라서 대사 산물 및 지질 농도의 측정 잠재적인 장기 품질의 바이오 마커의 식별을 허용 하 고 접목 결과의 더 나은 예측을 가능.
현재 기관 품질 평가 방법과 관련된 위의 합병증 및 한계를 감안할 때, 신속하고 복잡한 장기 품질 평가를 위해 덜 침습적 인 진단 솔루션이 필요합니다. 고체 상 미세 추출(SPME)은 광범위한 대사 산물 및 지질스펙트럼의 적용을 가능하게 하는 최소침습적 분석 방법으로 이러한 요구 사항을 준수합니다. 이 기술은 얇은 (~200 μm), 생체 적합성, 티타늄-니켈 합금 프로브의 삽입을 단시간 검사 된 기관으로 선별적으로 추출하는 것을 기반으로합니다. SPME는 단백질 추출을 방지하고, 따라서 대체 방법에 비해 중요한 이점인 샘플 수집 단계에서 이미 신진 대사 억제를 가능하게 한다는 것을 강조해야 합니다. 더욱이, 장치의 소형화는 장기9,,10,,11의몇 가지 구조의 반복적이고 동시 분석의 실행을 허용한다.

<table><tbody><tr><td>아세트산</td><td>Merck</td><td>5330010050</td><td>이동상 첨가제</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Alchem</td><td>696-34967-4X2.5L</td><td>HPLC 용매</td></tr><tr><td>아세트산 암모늄</td><td>Merck</td><td>5330040050</td><td>모바일 상 첨가제</td></tr><tr><td>BENCHMIXER XL MULTI-TUBE VORTEXER</td><td>벤치 마크 과학</td><td>BV1010</td><td>볼텍스 믹서</td></tr><tr><td>캡</td><td>Perlan Technologies</td><td>5183-2076</td><td>블루 scrw tp, 사전 슬릿 PTFE/Si spta, 100PK</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Merck</td><td>1024441000</td><td></td></tr><tr><td>Discovery HS F5 Supelguard 카트리지, 3 &mu; m, L &시간; I.D. 2 cm &times; 2.1 mm</td><td>Merck</td><td>567570-U</td><td>HPLC 가드 컬럼</td></tr><tr><td>Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 &mu; m</td><td>Merck</td><td>567502-U</td><td>HPLC 컬럼</td></tr><tr><td>포름산</td><td>Alchem</td><td>497-94318-50ML</td><td>이동상 첨가제</td></tr><tr><td>유리 바이알</td><td>Perlan Technologies</td><td>5182-0714</td><td></td></tr><tr><td>HILIC Luna 3 &mu; m, 200A, 100 x 2.0 mm</td><td>Shim-Pol</td><td>PHX-00D-4449-B0</td><td>HPLC 컬럼</td></tr><tr><td>HILIC SecurityGuard 카트리지, 3 &mu; m, 4 x 2.0 mm</td><td>Shim-Pol</td><td>PHX-AJ0-8328</td><td>HPLC 가드 컬럼</td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>알켐</td><td>231-AL03262500</td><td>HPLC 용매</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>알켐</td><td>696-34966-4X2.5L</td><td>HPLC 용매</td></tr><tr><td>나노 순수</td><td>Merck</td><td>1037281002</td><td>HPLC 용매</td></tr><tr><td>Q Exactive Focus 하이브리드 사중극자-Orbitrap MS</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q Exactive Focus</td><td>질량 분광계</td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-cHILIC 3&micro; m, 100&Aring; 100 x 2.1 mm</td><td>Merck</td><td>1506570001</td><td>HPLC 컬럼</td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-HILIC 가드 키트, 20 x 2.1 mm</td><td>Merck</td><td>1504360001</td><td>HPLC 가드 컬럼</td></tr>, <tr><td>SPME LC 파이버 프로브, 혼합 모드</td><td>, Supelco</td><td>프로토타입 파이버</td><td></td></tr><tr><td>UltiMate 3000 HPLC 시스템</td>, <td>Thermo Scientific</td><td>UltiMate 3000</td><td>HPLC 시스템</td></tr><tr><td>바이알 인서트(비활성화)</td><td>Perlan Technologies</td><td>5181-8872</td><td></td></tr><tr><td>XSelect CSH C18 3.5&mu; m 2.1x75mm</td><td>Waters</td><td>186005644</td><td>HPLC 컬럼</td></tr><tr><td>XSelect CSH C18 VanGuard 카트리지 3.5&mu; m, 2.1x5mm</td><td>Waters</td><td>186007811</td><td>HPLC 가드 컬럼</td></tr></tbody></table>

이식 품질 평가를 위해 화학 생검 사용

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

신장 이식은 전 세계적으로 말기 신장 기능 장애를 가진 사람들의 다수를 위한 생명을 구하는 처리입니다. 절차는 전통적인 투석에 비교될 때 증가한 생존율 및 환자의 생활의 더 중대한 질과 연관됩니다. 유감스럽게도 이식학은 장기 품질 평가를 위한 신뢰할 수 있는 방법의 부족으로 고통받고 있습니다. 표준 진단 기술은 접목에 대한 포괄적인 정보를 제공하지 않는 거시적 외관 검사 또는 침습성 조직 생검으로 제한됩니다. 제안된 프로토콜은 이식을 위해 할당된 신장에 존재하는 모든 저분자 화합물의 포괄적인 메타볼로믹스 및 리피도믹 분석을 위한 이상적인 분석 방법으로 고체 위상 미세 추출(SPME)을 도입하는 것을 목표로 합니다. SPME 프로브의 작은 크기는 화학 생검의 성능을 가능하게하며, 이는 조직 수집없이 기관에서 직접 대사 산물을 추출 할 수 있습니다. 이 방법의 최소 침습성은 시간이 지남에 따라 여러 분석의 실행을 허용합니다 : 기관 수확 직후, 보존 중, 그리고 수령인의 신체에서 재구성 직후. 고해상도 질량 분광계와 이 새로운 샘플링 방법의 조합이 이식 품질의 생물학적 마커로 작용할 수 있는 특성 화합물 세트의 차별과 장기 기능 장애의 가능한 개발 지표의 차별을 허용한다는 가설이 있습니다.

샘플 수집은 7mm 혼합 모드 추출 단계로 코팅된 프로브를 사용하여 상술한 SPME 방법에 따라 수행되었다. 샘플링은 이식 조직(이식 전 생체내), 신장 챔버에서 1h, 3h, 5h 및 7h 의 관류 후, 그리고 수신자에서 의 재보정 후 생체내에서 직접 수행되었다. 표적화된 메타볼로믹 및 리피도믹 분석은 액체 크로마토그래피(RP, HILIC)를 고해상도 질량 분석과 결합하여 양극화 모드로 설정된 질량 분석기를 사용하여 수행하였다. 데이터 품질을 평가하고 결과에 대한 일반적인 통찰력을 얻기 위해 데이터는 주 성분 분석(PCA)을 거쳤습니다. 도 1에도시된 바와 같이, QC 샘플은 분석의 품질을 확인하여 단단한 클러스터를 형성했다. 연구된 그룹은 이식 전후의 대사 및 지질성 프로파일의 차이를 시각화할 수 있도록 하는 비교적 양호한 분리를 나타내며, 기관 관류(그림2)를나타낸다. SPME 샘플링은 시간이 지남에 따라 기관의 대사 프로파일링을 허용합니다. 선택된 대사 산물의 박스 수염 플롯은 실험 전반에 걸쳐 대사 산물 수준에서 의 변화를 예시하는 역할을한다(그림 3). RP 및 HILIC 열 모두에 분리된 추출된 피쳐의 넓은 스펙트럼은 도 4에표시됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig01.jpg"> 그림 1: 메타볼로믹 반전 상(A), HILIC(B) 및 리피도믹 반전 상(C), HILIC(D) 분석을 위한 품질 관리 샘플의 클러스터링을 보여주는 주요 성분 분석. 품질 관리는 기악 불안정에 의해 유도 된 가능한 변화를 모니터링하기 위해 대상 분석에서 필요합니다. QC 샘플의 단단한 클러스터는 관찰된 모든 변화가 생물학적 기원임을 보장합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig02.jpg"> 그림 2: 특정 샘플링 점 간의 메타볼로믹(A) 및 리피도믹(B) 차이를 보여주는 주요 성분 분석. SPME-LC-HRMS를 가진 신장의 표적되지 않은 프로파일링은 그들의 보존의 후속 단계에서 기관에 있는 생화확적인 다름을 관찰할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig03.jpg"> 그림 3: 복엽기 기간 동안 대사산물(A, B) 및 지질(C, D)의 변화를 나타내는 선택된 화합물의 박스 수염 플롯. 차별 화합물의 선택 및 식별 후 상자 수염 플롯 프로토콜의 후속 단계에서 이러한 화합물의 수준에 변화를 모니터링하고 다른 보존 프로토콜을 실시 하거나 다른 기증자에서 수확 하는 장기에서 대사 산물 수준을 비교 할 수 있습니다 심장 박동 기증자 또는 기증자 심장 죽음 후 기증자. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig04.jpg"> 그림 4: LC-MS 분석에서 얻은 피처의 이온 맵(m/z 대 보존 시간)은 (A) 반전 단계 및 (B) HILIC 분리를 결합합니다. 이 플롯을 사용하면 제안된 프로토콜(추출에서 검출까지)으로 얻은 전체 기능 수를 추정하고 극성에 따라 분석 적용 범위를 평가할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig4v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

프로토콜은 이식에 할당된 신장 이식의 질 평가를 위한 포괄적인 metabolomic 및 lipidomic 분석 뒤에 화학 생검 접근의 이용을 제시합니다.

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...

화학 생검은 빠르고 복잡한 이식 품질 평가를 위한 장기 이식에 있는 새로운 진단 해결책입니다. 현재 이러한 분석을 가능하게 하는 다른 낮은 침습적 방법은 없습니다. 이 기술의 주요 장점은 SPME 프로브의 단순성과 낮은 침습성으로 인해 보존 시간이 지남에 따라 접목 조직 수정을 모니터링 할 수있는 가능성입니다.프로브의 작은 직경과 생체 적합성 코팅의 큰 다양성은 이식 된 장기의 분석에 적합하고 종양 분석과 같은 의학 연구에 적용 할 수 있습니다. 이 기술을 처음 시도할 때는 작은 실수가 결과에 큰 영향을 미칠 수 있기 때문에 특정 단계의 세부 사항 및 타이밍에 주의를 기울입니다. 프로토콜은 간단하지만 시각적 데모 후 이해하고 수행하는 것이 더 쉽습니다.먼저 1대 1메탄ol과 물로 구성된 사전 조절 혼합물을 준비한다. 파이펫 1 밀리리터의 용액은 각 2밀리리터 유리 바이알에 넣고 각 바이알에 하나의 프로브를 배치합니다. 1시간 동안 1200 RPM에서 소용돌이 교반기에서 바이알을 교양합니다.그런 다음 LCMS 급수로 프로브를 헹구고 표준 수술 살균 프로토콜 또는 멸균 처리 부서에 따라 프로브를 살균하십시오. 시료를 추출할 준비가 되면 멸균 포장을 열고 2개의 프로브를 신장 피질에 직접 삽입하여 시간당 10분 동안 코팅의 전체 길이가 조직 매트릭스에 의해 덮여 있는지 확인합니다. 각 프로브의 샘플링 시간을 추적해야 합니다.조직에서 프로브를 철회하고 즉시 LCMS 등급의 물로 코팅을 헹구어 수술 부위에서 헹구는 나머지 혈액을 제거합니다. 프로브를 운반하려면 별도의 바이알에 배치하여 닫습니다. 그런 다음 바이알을 드라이 아이스 또는 액체 질소로 채워진 상자에 놓습니다.샘플을 음의 섭씨 80도에 저장하거나 즉시 탈착을 진행합니다. 메타볼로믹 분석을 위해 아세토닐과 물로 구성된 탈착액을 준비하고, 리피도믹 분석을 위해 이소프로판올과 메탄올로 구성된 또 다른 용액을 준비한다. 100마이크로리터를 추가하여 두 밀리리터표시 바이알에 삽입하고 각 바이알에 1개의 프로브를 1200 RPM에서 2시간 동안 교반한 다음 바이알에서 프로브를 제거하고 LCMS 분석을 진행합니다.고해상도 질량 분석과 결합된 액체 크로마토그래피는 표적화된 메타볼로믹 및 리피도믹 분석을 수행하는 데 사용되었습니다. 데이터는 결과에 관한 일반적인 통찰력을 즐겁게 하는 품질을 평가하기 위해 주 성분 분석을 실시하였다. 품질 관리 샘플은 분석의 품질을 확인하는 단단한 클러스터를 형성했습니다.연구된 단은 상대적으로 좋은 분리를 전시했습니다, 이식 전후뿐만 아니라 기관 관류 도중 신진 대사와 지방피도믹 단면도에 있는 다름의 시각화를 허용했습니다. 추출된 피처의 넓은 스펙트럼은 반전된 위상 및 액체 크로마토그래피 컬럼 모두에서 분리되었다. 실험 전반에 걸친 변경 및 대사산물 수준은 선택된 대사산물의 상자 수염 플롯으로 입증되었다.이 절차를 수행 할 때, 장기 이질성을 명심하십시오. 프로브를 원하는 위치에 배치하여 샘플링 시간을 항상 동일하게 유지하고 샘플링 후 섬유를 올바르게 고정합니다. SPME로 발견된 바이오마커는 MSMS, LCMS 또는 기타 분석 계측과 결합된 이 추출 방법을 사용하여 정량화될 수 있다.더욱이, 아무 견본도 소모되지 않습니다, 생검과 같은 일상적인 분석은 수행될 수 있습니다. 이 방법은 샘플 전처리를 위한 필요 없이 그밖 조직 metabolomics 및 lipidomics 분석을 위해 적응될 수 있습니다. 특정 대사 산물의 경우.다른 코팅은 에세이의 선택성과 감도를 높이기 위해 사용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 동영상은 기관지 내 생검에서 수지상 세포를 식별하기 위한 면역조직화학 염색 기법에 대해 설명합니다.

면역조직화학적 염색: 얇은 조직 절편에서 공간 정보를 얻는 방법

이 비디오에서는 사전 적출된 기증자 신장에서 SPME 프로브 기반 대사 산물 추출을 보여줍니다. 추출된 대사 산물은 이식을 위한 장기 품질을 평가하기 위해 대사체 및 지질체 분석을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

고체상 미세추출 시료 채취: 이식편 조직에서 시료 추출을 위한 프로브 기반 기법

지방 이식은 연조직 결핍을 재건하기 위한 필수 기술입니다. 그러나 이는 다양한 이식 생존을 특징으로 하는 예측할 수 없는 절차로 남아 있습니다.  우리의 목표는 지방 이식 준비 및 전달의 서로 다른 기술 간의 부피 유지를 비교하기 위해 새로운 이미징 방법을 활용하는 마우스 모델을 고안하는 것이었습니다.

마이크로 컴퓨터 단층 촬영과 누드 마우스에 인간의 지방 주입의 생존 능력의 평가

현재까지 두꺼운 조직 결손은 일반적으로 자가 조직 플랩 또는 엔지니어링 조직을 적용하여 재구성됩니다. 이 프로토콜에서는 자가 피판을 대체하기 위해 자가 척추경을 지닌 혈관 조직 피판을 엔지니어링하는 새로운 방법을 제시합니다.

엔지니어링 혈관을 근육 플랩

새로운 프로토콜에있어서 인간의 조직들을 분해하고, 콜라겐 스폰지와 함께, 피부 병변의 치료에 사용할 준비 인간 생체 복합체를 야기 미세자가 이식편을 만들 설명. 또한,이 시스템은 기계적 세분화 한 후 다른 시간에 마이크로 이식편의 세포 생존율을 유지.

피부 마이크로 이식 세대를위한 새로운 세분화 방법 후 조직 특성

인간의 수지상 세포(DC)를 포함한 폐 상주 면역 세포는 흡입된 병원체와 알레르겐에 대한 방어에 매우 중요합니다. 그러나 인간의 폐 조직이 부족하기 때문에 연구가 제한적입니다. 이 연구는 면역조직화학 및 유세포 분석을 사용하여 폐 DC를 연구하기 위한 인간 점막 기관지 내 생검을 처리하는 프로토콜을 제시합니다.

면역 및 유동 세포 계측법을 사용하여 기관지 생검의 공간 분포 및 표현형 확인 : 인간의 폐 수지상 세포

우리는 각막 기증자 기질의 고품질 평가를 위한 방법으로 전체 필드 광학 간섭 현미경의 사용을 설명합니다. 이 프로토콜은 건강 또는 질병을 나타내는 특징을 식별하는 데 사용할 수 있으며 기증자 조직의 스크리닝 및 선택, 따라서 각막 성형술의 결과를 개선하는 것을 목표로 합니다.

각막 이식편의 기질 특징에 대한 조직학과 유사한 분석을 위한 전체 필드 광학 간섭 현미경

이 방법은 급진적 인 전립선 절제술을 따르는 바이오 뱅킹 조직이 샘플링 절차를 안내하기 위해 전립선 암 환자에 대한 임상 진단 데이터를 활용하는 것을 포함합니다. 이것은 다운스트림 응용의 넓은 범위에 대한 새로운 조직의 효율성과 가용성에 관한 이전에 게시 된 방법과 문제를 극복한다.

전립선암 바이오뱅킹을 위한 샘플링 절차를 안내하기 위해 자기 공명 영상 및 생검 데이터 사용

여기에서, 우리는 유전자 조작된 마우스 모델 유래 종양 에서 생체내에서 배아 치사되는 유전자 녹아웃을 수행하기 위한 프로토콜을 제시하고, 이어서 녹아웃이 종양 성장, 증식, 생존, 이동, 침윤 및 시험 관내 및 생체내에서 전사체에 미치는 영향을 평가한다.

악성 말초 신경 시스 종양 세포에서 Floxed 대립 유전자의 Ex vivo 절제에 의한 종양 발생에서 유전자 기능 정의

이 프로토콜은 근치적 전립선 절제술 표본에서 샘플 수집을 용이하게 하는 방법을 설명합니다. 목표는 해부병리학적 기준에 따라 표본의 조직 샘플을 Biobank에 저장하기 전에 매핑, 특성화 및 미시적 매크로 절개하는 것입니다.

개선된 샘플링 기법 및 조직학적 특성 분석을 통한 전립선 종양 바이오뱅킹 신뢰성 향상

배우세요 신장 이식 품질 평가를 위한 화학 생검 기법을 SPME 프로브와 LCMS 분석을 활용하여 대사체 및 지질체 프로파일링을 수행하는 방법입니다. 이 기술은 저침습적이고 효율적인 이식 장기 품질 평가에 활용됩니다.

이식 품질 평가를 위해 화학 생검 사용

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