Name: 라이브 셀 슈퍼 분해능 현미경 및 단일 분자 추적을 위한 기존의 BODIPY 접합체 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 배우세요 BODIPY 접합체를 활용한 라이브 셀 초분해능 현미경법으로 30나노미터 해상도에서 중성 지질과 지방산을 추적하는 방법을. 포유류와 효모 세포에서 지질 생물학을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

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이 간행물에 보고된 연구는 수상 번호 R21GM127965의 밑에 건강의 국가 학회의 일반 의학의 국가 학회에 의해 지원되었습니다.

참고 : 효모 복제 및 내생 태그는 최근 간행물10을참조하십시오.
1. 화상 진찰을 위한 효모 세포 견본의 준비
<ol><li>w303 효모 균주의 액체 하룻밤 배양을 준비한다. 멸균 된 나무 막대기를 사용하여 효모 추출물 - 펩톤 - 덱스트로오스가 함유 된 한천 판에서 소량의 효모 세포를 합성 완전 덱스트로스 (SCD) 배지의 ~ 2 mL의 배양 튜브에 넣습니다. 270 rpm 및 30°C에서 흔들리는 인큐베이터에서 밤새 튜브를 인큐베이션합니다.</li>
	<li>SCD에서 세포의 1:50 아침 희석을 수행합니다. 270 rpm 의 흔들림 인큐베이터에서 30°C에서 4시간 동안 희석된 세포를 배양하여, 세포가 지수상에서 성장하고 ~0.6의 광학 밀도(OD)에 도달할 수 있도록 한다. 참고: 절차는 어떤 신진 대사 상태가 공부되고 있는지에 따라 여기에서 달라질 수 있습니다. BODIPY 접합체는 지수 성장 단계에서 세포를 필요로하지 않는다. 그러나 고정 된 단계 동안 죽은 세포에서 자가 형광을 인식해야하며, 배경 신호가 너무 강해서 단일 BODIPY-DII 방출기를 분석할 수 없습니다.</li>
	<li>금식 세포를 연구하기 위해, 배지 교환없이 2 일 동안 효모 배양을 성장시다.</li>
	<li>세포를 도금하기 전에 ~ 30 분에서, 실온에서 탈이온화H2O에서 0.8 mg / mL의 80 μL의 챔버 커버 글라스를 배양합니다. 30 분 후, 커버 글래스를 탈이온화 된 H2O로 세 번 씻으하십시오.</li>
	<li>이미징 전 ~30분 에서, 챔버커버글라스상의 세포를 피펫으로 하여 ~ 0.12의 광학 밀도를 달성하기 위해 신선한 SCD의 정확한 부피를 갖는다(일반적으로 240 μL SCD에서 OD ~0.6에서 60 μL 효모 배양). 세포가 침전되어 ConA 표면에 30 분 동안 부착시키십시오.</li>
	<li>원하는 BODIPY 컨쥬게이트를 ~100 nM의 최종 농도에서 챔버 커버글래스에 직접 첨가합니다. 참고: 특정 셀룰러 구획의 BODIPY의 국소 밀도에 따라 BODIPY 농도 최적화 실험이 필요할 수 있습니다.</li>
</ol>2. SMLM 화상 진찰을 위한 포유류 세포의 준비
<ol><li>T25 플라스크에서 10% 태아 소 혈청, 4 mM 글루타민, 1 mM 나트륨 피루브산 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 항생제를 사용하여 비형광 DMEM에서 포유류 U2OS 세포를 유지합니다. 참고: 세포는 또한 10% 태아 소 혈청 및 1% 페니실린 연쇄상 구균 항생제를 가진 DMEM에서 유지될 수 있습니다, 그러나, 매체는 비 자동 형광 용액으로 화상 진찰의 앞에 교환될 필요가 있습니다.</li>
	<li>세포를 70-80% 컨플루언스 1:5로 분할하여 8웰 플레이트의 단일 웰로 분할합니다. 이미징 전에 12~24시간 동안 8웰 플레이트에서 세포를 배양하였다.</li>
	<li>BODIPY-C12,리소트래커 그린 또는 기타 BODIPY 컨쥬게이트를 이미징 전에 100 nM(디메틸 설폭사이드 [DMSO]의 재고 용액)의 최종 농도로 추가합니다. 이 시간은 원하는 실험에 따라 달라질 수 있습니다. 참고: 이미징은 라이브 셀 이미징 솔루션을 사용하여 주변 온도(23°C)에서 수행할 수 있습니다. 그러나, 37°C 및 5% COMEM을 10% 태아 소 혈청, 4 mM 글루타민, 1 mM 피루바테 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 항생제와 혼합하여 37°C 및 5%CO2에서 이미징은 생리학적 조건에 더 가깝게 세포를 유지하고 생물학적 결론을 내리는 것이 바람직하다.</li>
</ol>3. 장비 준비
<ol><li>사용 중인 BODIPY의 방출 색상에 따라 방출 경로에 적절한 필터 세트를 장착합니다. 참고: 쿼드 밴드 이색 거울(zt/405/488/561/640rdc)은 먼저 방출 라이트에서 여기를 분리합니다. 녹색 방출(525 nm) 및 적색 방출(595 nm)은 이색 장패스 빔 스플리터(T562lpxr)에 의해 분할된 다음 녹색 채널에서 밴드 패스 필터 ET525/50, 적색 채널의 ET 595/50으로 나눕니다. 그런 다음 두 채널이 동일한 카메라 칩의 다른 영역에 투사됩니다. 유사하게, 적색 방출(595 nm) 및 원적 방출은 먼저 이색장 장패스 빔 스플리터(FF652-Di01)에 의해 분할되고, 그 다음에는 대역 통과 필터 ET ET 610/75가 적색 및 FF731/137로 나뉘어진다.</li>
	<li>현미경, 현미경 단계, 레이저 (488 nm, 561 nm) 및 카메라를 켭니다. 여기서 완벽한 초점 시스템을 갖춘 반전된 현미경과 -68°C로 냉각된 EMCCD 카메라가 사용됩니다.</li>
	<li>현미경 목표에 침지 오일 한 방울을 추가합니다.</li>
	<li>밝은 필드 이미징, 레이저 파워, 레이저 셔터 및 이미징용 카메라 설정을 위해 LED 조명을 제어하는 Hal4000 소프트웨어(재료 표참조)를 엽니다. EMCCD 게인을 30으로 설정하고 카메라 온도를 -68°C로 설정합니다. 20Hz에서 영화를 녹화하기 위해 카메라와 해당 소프트웨어를 준비합니다. 참고: 이 기술은 광 활성화 국소화 현미경 검사법(PALM) 및 탁상광학 재건 현미경(STORM) 이미징이 가능한 모든 광시야현미경에 적용됩니다. 해당 소프트웨어는 다를 수 있습니다.</li>
	<li>현미경 스테이지 히터를 켜고 37°C의 온도와CO2 수준 5%로 설정합니다. 그에 따라 목표 보정 칼라를 조정합니다.</li>
	<li>현미경 단계에 샘플을 장착하고 초점 시스템이 맞을 때까지 초점을 맞춥니다. 정상 셀이 시야에 나타날 때까지 스테이지 컨트롤러를 사용하여 스테이지를 이동합니다. 참고: 실온에서 효모 세포로 이미징을 할 때히터 또는CO2 컨트롤을 켤 필요가 없습니다.</li>
	<li>단량체뿐만 아니라 디머의 여기에 대한 적절한 레이저를 켭니다. BODIPY 녹색 또는 LysoTracker 녹색의 경우, 우리는 SMLM에 대한 DII 상태를 자극하기 위해 561 nm 레이저와 기존의 형광에 대한 단량체를 자극하는 488 nm 레이저를 사용합니다. 참고: BODIPY 빨간색의 경우 640 nm 레이저를 사용하여 SMLM의 DII 상태를 자극하고 561 nm 레이저를 사용하여 기존의 형광에 대한 단량체를 자극합니다. BODIPY 빨간색의 경우 561 nm 및 640 nm 레이저 파워를 조정하여 적색 채널에서 벌크 형광을 시각화하고 원적 채널에서 단일 분자 버스트를 시각화합니다. 561 nm의 일반적인 전력은 640 nm의 경우 ~ 0.06 W / cm2 및 ~ 5 kW / cm2입니다. BODIPY 녹색의 경우, 561 nm 여기 하에서 녹색 방출 채널에서 기존의 형광을 볼 것으로 예상됩니다. BODIPY 빨간색의 경우, 640 nm 여기 에서 빨간색 채널에서 기존의 형광을 볼 것으로 예상. 이 신호는 안티 스톡 방출에서 발생, 이는 연속 레이저 여기와 단량체 / 디머 공동 지역화 이미지에 유용하게.</li>
</ol>4. 데이터 수집
<ol><li>단량체뿐만 아니라 디머의 여기레이저 셔터 시퀀스를로드합니다. 참고: 우리는 일반적으로 561 nm에서 9개의 단일 분자 여기 프레임을 사용하고 488 nm에서 하나의 기존 여기 프레임을 사용합니다. 이것은 더 밝은 전통적인 형광 신호를 제공하고 다중 색깔 화상 진찰 응용에 있는 빨간 단 하나 분자 검출 채널로 녹색 형광 단백질 (GFP)와 같은 또 다른 488 nm 흥분형 형광의 누출을 방지합니다. 또는, 561 nm 레이저를 연속적으로 켜고 더 짧은 파장 채널에서 기존의 이미지에 대한 안티 스톡 방출에 의존한다.</li>
	<li>561 nm 여기 하에서 적색 이동 방출 채널에서 단일 분자 형광 버스트가 검출되도록 레이저 파워를 조정하고, 기존의 형광은 488 nm 여기와 녹색 방출 채널에 나타납니다. 561 nm 레이저의 일반적인 레이저 파워는 SMLM의 경우 약 0.8-1 kW/cm2, 기존 형광 이미징 모드에서 488 nm 레이저의 경우 0.035-0.07 W/cm2입니다. 2</li>
	<li>동영상의 대상 폴더를 선택하고 5,000-20,000개의 수집 프레임을 녹화하여 초고해상도 이미지를 재구성하기에 충분한 지역화를 수집합니다.</li>
	<li>다른 보기 필드로 이동하고 위의 단계를 반복하여 더 많은 셀에서 데이터를 수집합니다.</li>
</ol>5. 데이터 분석 및 단일 분자 추적
<ol><li>영화를 SMLM 분석 소프트웨어에 로드합니다. 참고: 모든소프트웨어(18)를 사용할 수 있습니다. 우리는 INSIGHT (재료의 표참조)를 사용하고 imageJ (피지)에 대한 썬더 스톰19 플러그인을 사용하여 결과를 교차 검증합니다.</li>
	<li>영상을 시각적으로 가리고 단일 분자 형광 깜박임이 보이지않는 대비 설정을 조정합니다. 필요한 경우 샘플의 일부가 지속적으로 형광되는 경우 SMLM 데이터 분석을 위한 영역 또는 프레임 범위를 제한합니다.</li>
	<li>2D 가우시안 PSF(ROI: 픽셀 크기 160nm, 너비 260-650nm, 높이 > 50광자)로 피팅을 위한 단일 분자 식별 매개변수를 설정합니다. 일부 예제 프레임을 통해 시각적으로 스크리미쳐 식별 파라미터를 확인하고 뚜렷한 단일 분자 형광 버스트를 안정적으로 검출합니다(도 1C참조). 참고: 높이 및 너비와 같은 특정 식별 매개 변수를 약간 조정하여 시각적으로 인식된 단일 분자 형광 신호의 인식을 최적화할 수 있습니다.</li>
	<li>최적화된 식별 매개변수로 SMLM 이미지 분석을 수행한 다음 각 단일 분자를 감지된 광자 수의 역 제곱근에 의해 폭이 가중되는 2D 가우시안으로 렌더링합니다.</li>
	<li>데이터의 품질을 평가합니다. 제한된 프레임 범위를 사용하여 특정 인스턴스에서 단일 분자 분포를 적시에 관찰합니다. 이것은 데이터 수집 도중 세포기관의 움직임을 설명할 수 있습니다.</li>
	<li>분자 분포의 공간 분포 와 역학을 추가로 분석하려면 좌표, 모양 프레임, 광자, 폭 및 지역화 높이를 포함하는 얻은 분자 목록을 내보냅니다. 사용자 지정 서면 분석 절차에서 분자 목록을 가져옵니다.</li>
	<li>단일 분자 분포의 공간 정보를 얻기 위해, 방사형 분포 함수 θ(r)를 계산하고, 이는 방사형거리(20)의함수로서 국소화의 밀도를 나타낸다. θ (r)를 얻으려면 모든 지역화의 고유 한 쌍 별 거리를 계산하고 높이 H(ri)를 가진 ri를 중심으로 하는 쓰레기통과 폭 dr을 사용하여 히스토그램을 구성하고 2πri* dr로 나눕니다. (θ(i)= H(r i)/π(ri+dr)2-rii2). 그런 다음 방사형 분포 함수를 사용하여 클러스터링의 정도와 클러스터의 특성 크기를 정량화하고 비교할 수 있습니다.</li>
	<li>분자의 확산에 대한 동적 정보를 얻으려면 연속적인 데이터 수집 프레임에서 3픽셀(0.48 μm) 내에 나타나는 지역화를 연결하여 단일 분자 추적을 생성합니다. 참고: 연결 거리는 분자의 확산과 지역화밀도에 따라 달라집니다. 최대 연결 거리는 각프레임(21,,22)에서지역화의 밀도를 분석하여 추정할 수 있다. 평균 밀도는 μm2당0.043 의 국소화로 결정되었다; 따라서 0.48 μm 반경은 다른 분자가 함께 연결되지 않았는지 확인하기 에 충분한 밀도가 낮았다.</li>
	<li>평균 제곱 변위(MSD) 대 Δt 플롯을 만들기 위해 적어도 3번 의 지연 시간이 지속되는 여러 트레이스의 다른 지연 시간 Δt에 대한 변위를 평균화합니다. MSD = 4DΔt +σ2방정식으로 MSD 대 Δt 곡선을 맞추어 평균 확산 계수D3을계산합니다.</li>
</ol>

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<li>Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348(2015).</li>
<li>Grimm, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+to+fine-tune+fluorophores+for+live-cell+and+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging.</a> Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 이익을 선언하지 않습니다.

이 프로토콜에서는 기존의 BODIPY 접합체를 사용하여 공간 해상도가 상당히 개선된 SMLM 이미지를 얻는 방법을 시연했습니다. 이 방법은 이중 분자 만남을 통해 일시적으로 형성되는 기존의 BODIPY 염료의 이전에 보고된 적색 이동 DII 상태를 악용하는 것을 기반으로 합니다. 이러한 상태는 특히 흥분 하고 적색 이동 파장으로 감지 될 수 있으며 SMLM에 대 한 충분히 희소 하 고 수명이 짧은. 레이저 파라미터와 함께 BODIPY 단량체의 농도를 조정함으로써 현지화 및 신호 대 잡음의 최적의 밀도를 달성할 수 있습니다. 우리는 지방산 유사체와 중성 지질의 세포 내 분포와 이동성을 ~ 30 nm 해상도 (이론적 톰슨의 공식)로 사육 및 단식 조건 하에서 살아있는 효모 세포에서 해결했습니다. 또한 BODIPY DII 상태의 ~40%가 20Hz에서 2개 이상의 데이터 수집 프레임에 머물러 있어 단일 분자 추적이 서로 다른 조건에서 이동성을 정량화할 수 있다는 것을 발견했습니다. 우리의 결과는...

단 분자 국소화 현미경 검사법 (SMLM) 스토크 광학 재건 현미경 검사법 (STORM) 및 광 활성화 국소화 현미경 검사법 (PALM)과 같은 기술은 아베의 광학 회절 한계1,,2 및 단일 생체 분자의 역학을 추적하기위한 정보로 초고해상도 이미지를 생성하는 방법으로등장3,,4. SMLM과 호환되는 프로브에 대한 요구 사항 중 하나는 포인트 확산 함수(PSF)의 공간 중복을 피하기 위해 언제든지 활성 형광단의 수를 제어하는 기능입니다. 각각의 데이터 수집 프레임에서 각 형광형광단의 위치는 해당 포인트 확산 함수를 피팅하여 ~20nm 정밀도로 결정됩니다. 전통적으로, 형광의 온-오프 깜박임은 위성 광 전환1,2,2,5 또는 화학적으로 유도된 본질적인 깜박임6을통해 제어되었습니다. 다른 접근법은 불소-활성화 단백질7,,8 및 프로그램가능한 결합-전체 내부 반사 형광(TIRF) 또는 광 시트여기(lightsheet) 9에 표지된 DNA 올리고머의 과도 결합시 플루오로겐의 유도된 활성화를 포함한다. 최근, 우리는 SMLM10에 대한 신규하고 다재다능한 라벨링 전략을 보고했는데, 이는 기존의 붕소 디파이메탄(BODIPY) 컨쥬게이트11,,12,,13의 적색 시프트 디메나메(DII)상태를 보고하고 적색 이동 파장에서 특이적으로 흥분되고 검출된다.
BODIPYs는 특히 하위 세포 구획 및 생체 분자14,,15,,16을라벨 변이체의 수백 염료널리 사용된다. 살아있는 세포에 있는 사용의 용이성과 적용성 때문에, BODIPY 이체는 전통적인 형광 현미경 검사법에 대해 상업적으로 유효합니다. 여기서는 상용 BODIPY 컨쥬게이트 수백 개에 대한 상세하고 최적화된 프로토콜을 라이브 셀 SMLM에 사용할 수 있는 방법에 대해 설명합니다. BODIPY 단량체의 농도를 조정하고 여기 레이저 파워, 이미징 및 데이터 분석 매개 변수를 최적화하여 고품질 의 초고해상도 이미지 및 단일 분자 추적 데이터를 살아있는 세포에서 얻을 수 있습니다. 저농도(25-100 nM)에서 사용될 경우, BODIPY 접합체는 적색 시프트 채널에서 SMLM과 종래의 종래형 형광 현미경 검사법에 대해 동시에 사용될 수 있다. 얻어진 단일 분자 데이터는 움직이지 않는 구조의 공간 조직을 정량화하고 살아있는세포(17)에서분자의 확산 상태를 추출하기 위해 분석될 수 있다. 녹색 및 빨간색 형태의 BODIPY 프로브의 가용성은 다른 호환 형광단과 올바른 조합으로 사용될 때 다색 이미징을 허용합니다.
이 보고서에서는 BODIPY-C12,BODIPY(493/503), BODIPY-C12 빨간색 및 리소트래커-그린을 사용하여 라이브 셀 SMLM 데이터를 여러 색상으로 획득하고 분석하기 위한 최적화된 프로토콜을 제공합니다. 우리는 살아있는 효모와 포유류 세포에서 지방산과 중성 지질을 ~ 30 nm 해상도로 해결합니다. 우리는 또한 효모 세포가 그들의 신진 대사 상태에 따라 외부적으로 추가된 지방산의 공간 분포를 조절한다는 것을 더 보여줍니다. 우리는 BODIPY-fatacids (FA)를 추가한 것이 먹이 조건 하에서 산상성 망상 (ER) 및 지질 방울 (LDs)에 국한되는 반면 BODIPY-FA는 단식 시 플라즈마 막에 비 LD 클러스터를 형성한다는 것을 발견했습니다. 우리는 살아있는 포유류 세포에 있는 리소좀 및 LDs를 심상하기 위하여 이 기술의 응용을 더 확장합니다. 기존의 BODIPY 접합체를 사용하는 SMLM에 대한 당사의 최적화된 프로토콜은 무수히 많은 BODIPY 접합체를 사용하여 나노 스케일에서 생물학적 공정을 연구하는 데 유용한 리소스가 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>BODIPY C12</td><td>ThermoFisher</td><td>D3822</td><td>녹색 지방산 아날로그</td></tr><tr><td>BODIPY C12 Red</td><td>ThermoFisher</td><td>D3835</td><td>빨간색 지방산 아날로그</td></tr><tr><td>BODIPY(493/503)</td><td>ThermoFisher</td><td>D3922</td><td>Neutral lipid marker</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2010</td><td>Cell immobilization on glass surface</td></tr><tr><td>Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base</td><td>US Biological</td><td>D9515</td><td>SCD용 아미노산</td></tr><tr><td>포도당</td> 시<td>그마-알드리치</td><td>G7021</td><td>SCD 용 탄소원</td></tr> 8 <tr><td></td> 웰 <td>셀비스</td><td>C8-1.58-N</td><td>챔버 커버 글라스</td></tr><tr><td>에이트 웰, Lb-Tek II</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td>챔버 커버 글라스</td></tr><tr><td>ET525/50</td><td>크로마</td><td></td><td>대역 통과 필터</td></tr><tr><td>ET595/50</td><td>크로마</td><td></td><td>대역통과 필터</td></tr><tr><td>ET610/75</td><td>Chroma</td><td></td><td>Bandpass filter</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td>Serum</td></tr><tr><td>FF652</td><td>Semrock</td><td></td><td>Beam splitter</td></tr><tr><td>FF731/137</td><td>Semrock</td><td></td><td>Bandpass filter</td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>A1896701</td><td>Cell culture medium</td></tr><tr><td>Hal4000</td><td>Zhuang Lab, Harvard University</td><td></td><td>데이터 수집 소프트웨어</td></tr><tr><td>Ixon89Ultra DU-897U</td><td>Andor</td><td></td><td>EMCCD 카메라 광자 검출 용</td></tr><tr><td>Laser 405, 488, 561, 640 nm</td><td>CW-OBIS</td><td></td><td>여기 용 레이저</td></tr><tr><td>Insight3</td><td>Zhuang Lab, Harvard University</td><td></td><td>단일 분자 현지화 소프트웨어</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>생세포 이미징 솔루션에</td> 필요한 아미노산 <td>ThermoFisher</td><td>A14291DJ</td><td>이미징 버퍼</td></tr><tr><td>Lysotracker Green</td><td>ThermoFisher</td><td>L7526</td><td>Bodipy 기반 리소좀 마커</td></tr><tr><td>포유류 ATCC U2OS 세포(버지니아주 매너서스)</td><td>Dr. Jochen Mueller(미네소타 대학교)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A</td><td>Nikon</td><td></td><td>오일 이멀젼 목적</td></tr><tr><td>: 페니실린 스트렙토 마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>항생제</td></tr><tr><td>나트륨 피루브 산</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>세포 배양 보충제</td></tr><tr><td>T562lpxr</td><td>크로마</td><td></td><td>빔 스플리터</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>부착 세포</td></tr><tr><td>W303 MATa 균주</td><td>Horizon-Dharmacon</td><td>YSC1058</td><td>의 해리부모 효모 균주</td></tr><tr><td>효모 질소 염기</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>Y1250</td><td>아미노산이없는 질소 염기</td></tr><tr><td>zt405 / 488 / 561 / 640rdc</td><td>크로마</td><td></td><td>쿼드 밴드 이색성 거울</td></tr></tbody></table>

라이브 셀 슈퍼 분해능 현미경 및 단일 분자 추적을 위한 기존의 bodipy 접합체

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

단 하나 분자 국소화 현미경 검사법 (SMLM) 기술은 전통적인 형광 현미경 검사법의 광학 회절 한계를 극복하고 ~ 20 nm 정밀도로 세포 내 구조 및 생체 분자의 역학을 해결할 수 있습니다. SMLM의 전제 조건은 수천 개의 데이터 수집 프레임에서 포인트 확산 함수의 주공간적 중복을 피하기 위해 어두운 상태에서 형광 상태로 전환하는 형광단입니다. BODIPYs는 기존의 현미경 검사법에 사용되는 수많은 접합체가있는 잘 확립 된 염료입니다. 적색 이동 BODIPY 접지 상태 이량체 (DII)의과도 형성은 밝은 단일 분자 방출을 가능하게하여 단일 분자 국소화 현미경 검사법 (SMLM)을 가능하게합니다. 여기에서 우리는 살아있는 효모 및 포유류 세포에 있는 전통적인 BODIPY 접합체를 가진 SMLM를 위한 간단하 그러나 다재다능한 프로토콜을 제시합니다. 이 절차는 초고해상도 이미지를 획득하고 단일 BODIPY-DII 상태를 추적하여 BODIPY 접합체의 주공간 적 정보를 추출하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 나노 스코프 길이 규모에서 살아있는 효모 및 포유류 세포에서 지질 방울 (LDs), 지방산 및 리소좀을 해결하기 위해이 절차를 적용합니다. 또한 다른 형광 프로브와 함께 사용할 경우 BODIPY 염료로 멀티 컬러 이미징 기능을 시연합니다. 우리의 대표적인 결과는 보디피 지방산과 효모의 중성 지질의 차등 공간 분포 와 이동성을 보여줍니다. SMLM에 대한 이 최적화된 프로토콜은 수백 개의 상용 BODIPY 접합체와 함께 사용할 수 있으며 이 작업의 적용을 훨씬 뛰어넘는 나노 스케일에서 생물학적 공정을 연구하는 데 유용한 리소스입니다.

여기서, 우리는 위의 프로토콜에 기초하여 BODIPY 접합체를 사용하여 SMLM에 대한 최적화된 샘플 준비, 데이터 수집 및 분석 절차를 제시한다(도1A). SMLM 데이터를 획득하고 분석하기 위한 워크플로우의 예를 설명하기 위해 효모에서 BODIPY(493/503)를 사용하여 광학 회절 한계 미만의 LD를해결합니다(그림 1B-F).-F GFP, mEos2와 같은 다른 프로브와 함께 BODIPY의 상이한 다중 컬러 이미징 모드의 예는 도 2에도시되어 있다. 우리는 효모에서 대사 상태를 ~48 h에 대해 동일한 배지로 성장시킴으로써 조절 상태를 조작하고 BODIPY-C12가 먹이 조건 하에서 LDs로 의한 혼입과 는 대조적으로 금식 시 세포 주변부에서 움직이지 않는 비 LD 클러스터를 형성한다는 것을 보여줍니다<strong class="xfi...

기존의 BODIPY 접합체는 일시성형, 적색 이동 접지 상태 이량체의 착취를 통해 살아있는 세포 단분자 국소화 현미경 검사법(SMLM)에 사용될 수 있습니다. 우리는 나노스코프 길이 척도에서 살아있는 포유류 및 효모 세포에서 세포내 중성 지질과 지방산을 추적하고 해결하기 위해 최적화된 SMLM 프로토콜을 제시합니다.

라이브 셀 슈퍼 분해능 현미경 및 단일 분자 추적을 위한 기존의 BODIPY 접합체

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

우리의 프로토콜은 그들의 희소한, 적색 이동 상태를 사용하여 초해상도 현미경 검사법에 대한 기존의 BODIPY 염료의 사용을 설명합니다. 이를 통해 30나노미터 해상도로 살아있는 세포에서 세포기관과 생체 분자를 연구할 수 있습니다. 이 방법의 장점은 단일 분자 신호의 오래 지속되는 소스를 제공하는 다양한 BODIPY 컨쥬게이트의 단순성과 다재다능함입니다.우리의 입증 된 응용 프로그램은 회절 한계 이하의 지질 방울과 지방산을 해결하여 지방 간 질환이나 타입-2 당뇨병과 같은 질병에 대한 통찰력을 얻는 것이 중요해질 수 있습니다. 우리는 효모와 포유류 세포에서 지방산과 지질 물방울 생물학에 대한 통찰력을 얻습니다. 그러나,이 기술은 낮은 배경 형광을 가진 다른 모든 투명 세포 유형에 적용 할 수 있습니다.처음으로 기술력을 사용하는 경우, 밝은 단일 분자 신호를 관찰하기 위해 디 농도와 레이저 능력을 최적화해야합니다. 이 기술의 시각적 데모는 레이저 전력의 디 농도 및 최적화가 밝은 단일 분자 신호를 어떻게 초래하는지 확인하는 것이 중요합니다. 비형성 DMBM에서 포유류 U2OS 세포를 10%의 태아 소 혈청 4밀리머 글루타민, 1밀리머 나트륨 피루바테, 그리고 T-25 플라스크에서 페니실린 연쇄절제술 항생제 1%를 유지한다.셀을 70~80%로 1~5개, 파이펫을 8개의 웰 플레이트의 단일 웰에 분배합니다. 12 ~24시간 동안 8개의 웰 플레이트에 있는 세포를 변경합니다. 이미징하기 10분 전에 BODIPY-C12 리소트래커 그린 또는 다른 BODIPY 컨쥬게이트를 추가하고 100 나노몰러의 최종 농도를 추가합니다.사용되는 BODIPY의 방출 색상을 기반으로 배출 경로에 적절한 필터 세트를 장착합니다. 현미경을 켭니다. 현미경 단계, 488 나노미터 및 561 나노미터 레이저뿐만 아니라 카메라.현미경 목표에 신흥 오일 한 방울을 추가합니다. 밝은 필드 이미징, 레이저 파워, 레이저 셔터 및 이미징을 위한 카메라 설정을 위해 LED 조명을 제어하는 HAL4000 소프트웨어를 엽니다. EMCCD 게인을 30도로 설정하고 카메라 온도를 섭씨 영하 68도로 설정합니다.카메라와 해당 소프트웨어를 준비하여 20 Hertz에서 영화를 녹화합니다. 현미경 스테이지 히터를 켜고 섭씨 37도의 온도와 이산화탄소 5%로 설정합니다. 그에 따라 객관적인 보정 색상을 조정합니다.현미경 단계에 샘플을 장착하고 초점 시스템이 참여할 때까지 초점을 맞춥니다. 건강한 세포가 시야에 나타날 때까지 스테이지 컨트롤러를 사용하여 스테이지를 이동합니다. 1개의 분자 국소화 현미경 검사법에 대해 561 나노미터 레이저의 레이저 전력이 평방 센티미터당 821킬로미터 사이로, 단일 분자 형광 모공이 적색 이동 방출 채널에서 검출되는 등, 무너마뿐만 아니라 디머의 여기를 위한 로드 레이저 셔터 서열.488나노미터 레이저의 경우 035점과 포인트 07와트 사이의 레이저 전력을 조정하여 기존의 형광이 녹색 방출 채널에 나타나게 합니다. 영화에 대한 대상 폴더를 선택하고 5000에서 20000 획득 프레임을 기록하여 슈퍼 해상도 이미지를 재구성하기에 충분한 현지화를 수집합니다. 다른 보기 필드로 이동하고 더 많은 셀에 대한 데이터를 수집하기 위해 반복합니다.영화를 단일 분자 국소화 현미경 분석 소프트웨어로 로드합니다. 시각적으로 영화를 상영하고 단 하나 분자 형광 깜박임이 보이는 등 대비 설정을 조정합니다. 2D 가우시안, PSFs를 피팅하기 위한 단일 분자 식별 매개변수를 설정합니다.일부 예제 프레임을 통해 시각적으로 검사하여 식별 매개 변수를 확인하고 뚜렷한 단일 분자 형광 버스트를 안정적으로 감지합니다. 단일 분자 국소화 현미경 검사를 수행하기 위한 프레스 분석은 최적화된 식별 파라미터를 사용하여 분석을 상상한다. 그리고 각 단일 분자를 감지된 광자 수의 역 제곱 근당에 의해 폭이 가중치가 있는 2D Gaussian으로 렌더링합니다.데이터의 품질을 평가합니다. 제한된 프레임 범위를 사용하여 보다 구체적인 인스턴스 및 시간에 단일 분자 분포를 관찰합니다. 이는 데이터 수집 중 세포기관 이동을 고려합니다.이 연구에서는 BODIPY 컨쥬게이트를 사용하여 단일 분자 국소화 현미경 검사법을 사용하여 최적화된 샘플 준비, 데이터 수집 및 분석 절차를 제시했습니다. 단일 분자 국소화 현미경 데이터를 획득하고 분석하기 위한 워크플로우의 예를 입증하기 위해 효모의 BODIPY는 광학 회절 제한 이하의 지질 방울을 해결하기 위해 사용되었습니다. GFP 및 mEos2와 같은 다른 프로브와 결합된 BODIPY의 상이한 다색 이미징 모드의 예가 여기에 나와 있다.BODIPY-C12는 금식 시 세포 주변의 이동식 비지질 물방울 클러스터에서 형성된 반면, 공급 조건하에서 지질 방울로 통합하는 것과는 대조적입니다. BODIPY 컨쥬게이트의 단일 분자 국소화 현미경 능력을 포유류 세포로 더욱 확장하기 위해, 살아있는 U2OS 세포에서 BODIPY-C12 및 리소트래커 그린을 심발하였다. BODIPY 농도를 최적화하고 레이저 파워는 밝은 단일 분자 신호를 시각화하고 슈퍼 해상도 이미지를 재구성하기 위한 중요한 단계입니다.이 방법은 살아있는 세포 내부의 특정 바이오 분자의 특별한 시간 분포에서 고해상도 통찰력을 얻기 위해 다른 BODIPY 컨쥬게이트와 함께 사용할 수 있습니다. 우리의 테크닉은 나노 스코픽 렌즈 규모에 지질 방울과 지방산 생물학을 더 심문하는 길을 포장했다. 그러나, 이 응용 프로그램은 다양한 기능 BODIPY 컨쥬게이트의 가용성으로 인해 특정 필모테를 훨씬 넘어.생물학적 샘플 및 염료를 처리하기위한 표준 수술 절차를 따르고, 또한 우리의 의무 헤지가되고 레이저 안전 절차를 따르십시오.

conventional-bodipy-conjugates-for-live-cell-super-resolution

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

우리는 박테리아 FtsZ-링의 구조 조직, 세포 분열에 필수적인 장치에 꼽는 영상 방법 수퍼 해상도를 설명합니다. 이 방법은 photoactivated 현지화 현미경 (PALM) 이미지의 정량 분석​​에 기반을두고 있으며 다른 세균 cytoskeletal 단백질에 적용 할 수 있습니다.

세균 본부 기계의 슈퍼 해상도 이미징

우리는 형광 광 활성화 국소화 현미경(FPALM)을 사용하여 세포 내에서 여러 유형의 형광 표지 분자를 동시에 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 설명된 기술은 단일 세포 내에서 수십 나노미터의 정밀도로 수천 개에서 수십만 개의 개별 형광 표지 단백질의 국소화를 산출합니다.

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy(형광 광활성화 국소화 현미경을 사용한 생물학적 구조의 동시 다색 이미징)

단백질-단백질 상호 작용은 BiFC(bimolecular fluorescence complementation)와 PALM(photoactivated localization microscopy)을 결합하여 나노미터 공간 해상도로 세포에서 시각화됩니다. 여기에서는 개별 Ras-Raf 복합체의 나노 스케일 클러스터링 및 확산을 시각화하기 위해 U2OS 세포에서 Ras-Raf 상호 작용을 이미징하기 위해 BiFC-PALM을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

이분자 형광 보완과 광 활성화 현지화 현미경 (BiFC-PALM)

우리는 접착 포유류 세포에서 액틴 세포 골격의 이미징에 간섭 광 활성화 지역화 현미경 (iPALM), 3 차원 단일 분자 지역화 초 해상 현미경 법의 적용 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 다른 기존의 회절 제한 광학 현미경으로 해결되지 않은 남아있을 것입니다 나노 구조적 특징의 빛 기반 시각화 할 수 있습니다.

입체 슈퍼의 간섭 광 활성화 현지화 현미경으로 F-액틴 필라멘트의 해상도 현미경 (iPALM)

최근 우리 라이브 셀에 기본 속눈썹 안쪽 translocating 다양 한 단백질에 대 한 전송 경로의 3 차원 (3D) 공간 위치 매핑. 여기 실험 설정, 생물 학적 샘플의 과정 및 접근을 새로 이미징 3D 슈퍼 해상도 형광에 대 한 데이터 분석에 적용이 종이 세부 기본 속눈썹 살고 있습니다.

라이브 주 Cilium에서 고속 슈퍼 해상도 속도 현미경의 응용

3D 단일 분자 국소화 현미경 검사법은 살아있는 세균 세포에서 형광표지된 단백질의 공간 위치 및 운동 궤적을 조사하는 데 사용됩니다. 본원에 기재된 실험 및 데이터 분석 프로토콜은 풀화된 단일 분자 궤적에 기초하여 세포성 단백질의 널리 퍼진 확산 거동을 결정한다.

단일 분자 추적 현미경 검사법 - 세포화 분자의 확산 상태를 결정하는 도구

우리는 현대 형광 라벨링 기술을 사용하여 살아있는 세포에서 멤브레인 수용체 역학을 연구하기 위해 Förster 공명 에너지 전송 (FRET)과 결합 된 라이브 셀 이중 색 형광 교차 상관 분광법 (FCCS)을 수행하기 위해 실험 프로토콜 및 데이터 분석 워크플로우를 제시합니다.

살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 연구하기 위한 이중 색 형광 교차 상관 분광법

많은 본질적으로 무질서한 단백질은 수많은 세포 과정에 중요한 행동인 매우 역동적인 생체 분자 응축물의 형성에 관여하는 것으로 나타났습니다. 여기에서, 우리는 살아있는 세포에 있는 생체 분자 응축물에서 단백질이 서로 상호 작용하는 동역학을 정량화하기 위한 단 하나 분자 화상 진찰 근거한 방법을 제시합니다.

생체 분자 응축물 내 단백질 상호 작용 역학의 단일 분자 측정

이 프로토콜은 광학 광자 재할당이 가능한 회전 디스크 공초점 현미경을 사용하여 심층 전세포 단일 분자 위치 현미경(SMLM)을 수행하는 절차를 설명하여, 맞춤형 광학 장치나 복잡한 조명 없이 DNA-PAINT 이미징을 가능하게 합니다.

광학 광자 재배치가 포함된 회전 디스크 공초점 디스크에 대한 DNA-PAINT를 통한 전세포 초해상도 영상

이 프로토콜은 고해상도 셀룰러 및 아셀룰러 이미징을 위한 다중화 배열 검출기와 통합된 레이저 스캐닝 공초점 현미경 시스템의 첨단 영상 응용과 공유 자원 관리를 상세히 설명합니다. 이 워크플로우는 단일 플랫폼 내에서 공초점에서 초해상도(~120 nm)까지 다중 모달 이미징을 가능하게 하여 나노스케일 시각화를 더욱 쉽게 접근할 수 있게 합니다.

초해상도 영상 및 공유 관리: 다중화 검출이 포함된 공초점 현미경 프로토콜

배우세요 BODIPY 접합체를 활용한 라이브 셀 초분해능 현미경법으로 30나노미터 해상도에서 중성 지질과 지방산을 추적하는 방법을. 포유류와 효모 세포에서 지질 생물학을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

라이브 셀 슈퍼 분해능 현미경 및 단일 분자 추적을 위한 기존의 BODIPY 접합체

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