Name: 살아있는, 그대로 조직에서 세포 분열의 분석을 위한 초파리 애벌레와 Pupal 고환의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 학습하세요 살아있는 조직에서 형광 현미경을 이용한 세포 분열 메커니즘 분석 방법을 Drosophila 애벌레와 초기 번데기 고환을 사용하여. 이 기술은 세포의 생리학적 환경을 보존하면서 장시간 라이브 이미징이 가능합니다.

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이 작품은 J.T.S에 국방부 창업 자금에 의해 지원되었다.

1. 해부를 위한 동물, 도구 및 미디어 준비
<ol><li>수컷과 암컷이 날아다니는 것을 교차하여 원하는 유전자형의 자손을 얻습니다. meiotic spermatocytes의 확인 및 발판을 위한 유용한 형질전환 마커는 meiotic 스핀들 및 RFP-히스톤 2A를 표지하는 GFP-tubulin을 포함합니다8. 십자가 당 5 ~10 암컷을 사용하고 세 번째 instar 애벌레가 바이알의 측면을 크롤링 시작할 때까지 25 °C 인큐베이터에서 바이알에 표준 플라이 푸드에 십자가를 유지 (4-5 일). 일찍 흰 새끼가 하루 후에 형성되기 시작합니다.</li>
	<li>미세 한 팁 으로 직선 집게 두 쌍을 가져옵니다. 팁이 날카로운지, 심지어 길이가 길고, 곧게 펴야합니다(그림 1A). 이러한 포셉은 해부용으로만 사용하며 사용하지 않을 때는 10 μL 파이펫 팁이 있는 캡을 사용하십시오.</li>
	<li>
메스 도구를 준비합니다.
	<ol>
<li>검은 색 양극 산화 강철 곤충 핀의 무딘 끝을 핀 홀더에 넣고 홀더의 나사를 비틀어 핀을 제자리에 고정시다. 한 쌍의 집게와 해부 현미경 으로, 중간에 곤충 핀을 잡고 135 °(그림 1B)의내부 각도를 형성하기 위해 구부립니다. 날카로운 끝은 조직을 절단하기위한 것이고 가장자리는 매체 방울 사이에 고환을 전달하는 데 사용됩니다.</li>
		<li>사용하지 않을 때는 1,000 μL 파이펫 팁이 있는 캡.</li>
	</ol>
</li>
	<li>조직 배양 후드에서 작업하고, 슈나이더 의 배지의 5 mL aliquots를 준비하고 사용 시점까지 4 °C에서 저장한다. 해부를 시작할 준비가 되면 실온으로 5 mL 미디어 aliquot를 따뜻하게 하십시오. 그런 다음 온난해부를 10 mL 주사기로 옮기고 0.22 μm 주사기 필터를 부착한다.</li>
</ol>2. 애벌레와 초기 pupae에서 고환의 해부
<ol><li>용지 채워진 필터 주사기를 사용하여 유리 슬라이드의 위, 중간 및 하단에 3 방울의 용지(각각 50 μL)를 배출합니다.</li>
	<li>해부 프로브를 사용하여 5-10번째 instar 애벌레 또는 초기 번데기(여전히 흰색 또는 노란색인 번데기)를 상부 드롭으로 옮니다. 해부 프로브로 매질 제거 프로브로 매개체에서 애벌레와 번데기를 부드럽게 교반하여 음식이나 이물질을 제거합니다.</li>
	<li>해부 현미경의 밑에, 바디의 후방 3에 있는 타원형 모양 반투명 구조물로 나타나는 존재하는 경우에 두 양측 고환을 확인하기 위하여 해부 탐사기로 그것의 측에 단 하나 애벌레 또는 pupa를 돌립니다(그림 2A, B). 고환이 없는 동물은 암컷이며 버려야 합니다.</li>
	<li>수컷 유충이나 강아지가 발견되고 깨끗하면 두 번째 미디어 드롭으로 옮기입니다. 3 또는 4 마리의 수컷 애벌레 및/또는 번데기가 두 번째 매체 로 옮겨질 때까지 반복합니다.</li>
	<li>매체의 두 번째 방울에서 작업, 그것의 중간 지역에 집게의 쌍으로 단일 남성 애벌레 또는 강아지를 잡아, 고환에 단지 앞쪽. 두 번째 집게를 사용하여 동물을 반으로 부드럽게 찢습니다.</li>
	<li>포셉 한 쌍으로 유리 슬라이드에 애벌레 또는 강아지의 후방 끝을 잡고. 집게 바로 옆에서 시작하여 메스 도구의 가장자리를 사용하여 표피를 아래로 밀고 메스를 동물의 절단 끝쪽으로 이동합니다. 이것은 동물의 내부 장기를 추방 합니다., 용기를 포함 하는, 뚱뚱한 시체, 그리고 고환.</li>
	<li>부드럽게 장기의 나머지 부분에서 고환을 떨어져 애타게. 고환은 지방 체의 리본에 내장 된 명확한 타원형 모양의 기관입니다(그림 2C).</li>
	<li>고환을 한 번에 하나씩 미디어 의 세 번째 드롭으로 전송합니다. 이를 위해 지방 체 아래에 메스 의 가장자리를 삽입하고, 미디어를 들어 올리고, 신속하게 세 번째 방울로 이동하십시오.</li>
	<li>대안적으로, 고환에 아직 부착된 지방체가 충분하지 않은 경우 조직을 성공적으로 들어올리려면, 해부매체로 미리 습적인 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직을 부드럽게 옮김을 전달한다.</li>
	<li>메스 도구의 날카로운 끝을 사용하여 고환에서 과도한 지방 체체를 부드럽게 슬라이스하여 가장자리 주위에 지방 체의 작은 테두리만 남습니다(그림 2C). 그것은 지방 시체를 모두 제거 할 필요가 없습니다, 그렇게하려고하면 가능성이 손상 또는 고환의 파열귀착될 것입니다.</li>
	<li>유리 슬라이드의 모든 수컷 애벌레에 대해 위의 단계를 반복합니다.</li>
	<li>3단계 또는 5단계로 진행합니다.</li>
</ol>3. 살아있는 현미경 화상 진찰을 위한 장착 고환
참고: 이 장착 절차는 Drosophila 애벌레 뇌 신경 아세포20의화상 진찰을 위한 최근에 간행된 프로토콜에서 적응되었습니다. 추가 세부 정보는 이 참조에서 찾을 수 있습니다.
<ol><li>필터 주사기를 사용하여 슈나이더 의 배지 한 방울(약 30 μL)을 50mm 가스 투과성 배양 접시의 중앙에 증착합니다.</li>
	<li>미리 습윤 된 파스퇴르 파이펫을 사용하여 준비된 고환을 가스 투과성 접시의 드롭으로 옮김하십시오. 고환은 일반적으로 낙하의 표면에 떠있을 것입니다.</li>
	<li>메스 도구를 사용하여 고환을 가스 투과성 멤브레인에 부드럽게 밀어 넣습니다. 메스의 날카로운 점으로 가스 투과 성 멤브레인이 파열되지 않도록주의하십시오. 모든 고환을 드롭의 중앙으로 밀어 넣습니다.</li>
	<li>할로카본 오일로 채워진 1mL 주사기를 사용하여 가스 투과성 멤브레인에 각각 약 30 μL의 오일 4방울을 만듭니다. 22mm 유리 커버슬립의 네 모서리에 해당하도록 고환을 포함하는 매체 의 방울 주위에 오일 방울을 공간.</li>
	<li>22mm 유리 커버슬립의 모서리에 4방울의 할로카본 오일을 넣고 커버슬립을 용지와 오일에 부드럽게 낮춥시다. 커버슬립이 가라앉고 고환이 들어있는 매체가 오일 방울 사이에 퍼지도록 하십시오.</li>
	<li>커버슬립이 고환의 표면에 가라앉을 수 있도록 여분의 용지를 제거합니다. 해부 현미경으로 고환을 관찰하는 동안, 작은 양의 액체를 심지 위해 커버 슬립 아래의 매체에 섬세한 작업의 모서리를 닦아 넣습니다. 유리 커버 슬립이 가장 큰 고환의 표면과 접촉 할 때까지 충분한 용지를 지두하십시오. 너무 많은 매체를 제거하고 커버슬립을 너무 멀리 낮추지 않는 것이 중요합니다. Figure 5</li>
</ol>4. Meiotic 정자 세포의 살아있는 화상 진찰
참고: 정자 세포는 레이저 스캐닝 또는 회전 디스크 공초점 현미경을 사용하여 이미지 화 될 수있다. 시스템은 형광 성 단백질의 광 표백 이나 조직의 광 손상을 피하기 위해 적절 한 속도 및 감도 있어야 합니다.
<ol><li>고환 바로 위의 유리 커버 슬립에 침지 오일 한 방울을 놓습니다. 접시를 뒤집어 현미경 단계에 놓고 현미경 목표 (40 x 또는 60x)를 고환 바로 아래에 놓을 때까지 오일로 옮니다. 투과된 빛을 사용하여 단일 고환을 찾아 초점을 맞춥니다.</li>
	<li>공초점으로 빠른 이미지를 캡처하는 동안 고환을 이동하여 세포의 구성을 검사합니다. 고환의 한쪽 끝에는 작고 조밀하게 포장 된 세포가 많이 있습니다. 이 끝에는 생식줄기세포와 정자가 포함됩니다. 기관의 다른 쪽 끝으로 이동, 이산 클러스터 또는 낭종으로 조직 점진적으로 더 큰 세포를 식별. 이들 큰 세포는 정자 세포이다(도3A).</li>
	<li>GFP-tubulin을 화상 진찰하는 경우에, 세포의 피질에 있는 2개의 밝은 microtubule asters (즉, centrosomes)의 존재에 의해 30-60 분 안에 만이제이오즘을 개시할 정액세포를 확인합니다(그림 3B, C).</li>
	<li>meiotic 정자 세포의 낭종이 확인되면, 시간이 지남에 따라 이미지의 z 스택을 캡처하기 위해 수집 매개 변수를 설정합니다. 전형적으로, z 차원에서 떨어져 1.5 μm 간격으로 15-20개의 심상을 취득하는 것은 동일 낭종 내의 몇몇 정자 세포의 전체 부피를 포착하기에 충분하다.</li>
	<li>전체 z-스택 을 취득 2 분 전체 첫 번째 meiotic 부문을 이미징 하는 경우, 약 소요 1.5 시간. 특히 특정 한 사건만 분석할 경우 더 빠른 획득 률을 사용할 수 있습니다. 그러나 레이저 여기시 샘플의 반복노출로 인해 광표백이나 광손상이 발생하지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>연속자동 초점 제어 시스템을 사용하여 오랜 기간 동안 초점 드리프트를 방지합니다. 현미경 단계에서 시료의 온도 조절은 일반적으로 약 22-23 °C의 실온을 가정할 때 필요하지 않습니다. 온도 조절이 가능한 경우 현미경 스테이지에서 시료를 25°C로 유지합니다.</li>
	<li>meiotic 정자세포가 발견되지 않는 경우에, 25°C 인큐베이터및 심상에 몇 시간 또는 밤새 동안 견본을 저장합니다.</li>
</ol>5. 고정 및 면역 염색
<ol><li>위의 단계 2.10에서, PBSTx에서 8 % 파라 포름 알데히드의 0.5 mL을 포함하는 9 웰 유리 해부 접시에 잘 고환을 전송하기 위해 유리 파스퇴르 파이펫을 사용합니다 (0.3 % 트리톤 X-100와 인산 완충 식염수). 고환이 접시의 바닥에 누워 있는지 확인하십시오. 참고: 파라 포름 알데히드는 독성이 있으며 연기 후드에 장갑으로 처리해야합니다.</li>
	<li>실온에서 20 분 동안 고환을 고정하십시오.</li>
	<li>고환을 0.5 mL PBSTx를 함유한 우물로 옮기고 부드러운 교반으로 5분 동안 세척합니다. 신선한 PBSTx로 새 우물에서 세척 단계를 두 번 더 반복합니다.</li>
	<li>1차 항체를 1.5 mL 미세원원지 튜브에서 5% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 0.5 mL PBSTx에서 원하는 농도로 희석한다. 희석된 1차 항체의 튜브로 9웰 유리 해부 접시에서 고환을 옮기고 부드러운 흔들림 또는 영양분으로 4°C에서 밤새 배양한다.</li>
	<li>고환을 PBSTx 0.5 mL로 9웰 유리 해부 접시에 5분 동안 세척합니다. 신선한 PBSTx로 세척 단계를 두 번 더 반복합니다.</li>
	<li>5% BSA를 함유하는 PBSTx의 250 μL에서 이차 항체를 희석하고 9웰 유리 해부 접시의 깨끗한 우물로 분배합니다. 원하는 경우 DNA 얼룩에 DAPI를 추가합니다. 고환을 이차 항체를 함유하고, 플라스틱 랩으로 덮고, 실온에서 4 시간 동안 부드러운 교반으로 어둠 속에서 배양하십시오.</li>
	<li>고환을 0.5 mL의 PBSTx로 채워진 깨끗한 우물로 옮기고, 신선한 PBSTx로 5분 동안 두 번, 30분 동안 세 번째로 씻어줍니다.</li>
</ol>6. 고정 고환 장착
<ol><li>파스퇴르 피펫을 사용하여 마지막 세척에서 유리 현미경 슬라이드로 고환을 옮김. 필요한 경우 메스 도구의 가장자리를 사용하여 고환을 슬라이드 표면으로 밀어 넣습니다.</li>
	<li>고환에서 여분의 액체를 심지 섬세한 작업 닦아의 모서리를 사용합니다. 가능한 한 많은 액체를 제거하십시오.</li>
	<li>고환에 현미경 장착 매체의 30-50 μL 드롭을 적용하십시오.</li>
	<li>22mm 커버슬립을 장착 매체의 드롭에 놓고 커버슬립이 가라앉고 장착 매체가 커버슬립 아래에 퍼질 수 있도록 합니다. 필요한 경우 커버슬립에 부드러운 압력을 가하여 과도한 장착 매체를 짜내고 커버슬립이 고환 표면에 놓이도록 하십시오.</li>
	<li>매니큐어를 사용하여 커버슬립의 가장자리를 밀봉하십시오.</li>
</ol>

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<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 102-104 (2012).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

우리는 정액 세포 분열의 장기, 살아있는 화상 진찰을 위해 최적화된 애벌레 또는 초기 pupal Drosophila 고환의 준비를 위한 프로토콜을 기술했습니다. 이것은 손상되지 않은 조직의 생리적 맥락에서 세포 분열을 분석하기위한 강력한 방법입니다. 이 방법의 힘은 특정 유전자 돌연변이, 조직 특이적 RNAi 매개 억제 및 형광 표지된 단백질 및 세포기관 마커와 같은 Drosophila 유전 도구와 결합될 때 더욱 확장됩니다. 또한, 애벌레와 pupal 고환의 작은 크기, 유리 커버 슬립에 매우 가까운 분할 세포를 이미지 할 수있는 능력, 초고해상도 접근을 포함한 고해상도 이미징에 이상적인 방법을 합니다. 이 실험 시스템의 다양성은 세포 분열 동안 ER의 동적 재구성을 설명하는 대표적인 결과에 의해 입증된다. 초파리 정자 세포는 이러한 세포의 큰 크기와 상대적으로 느린 전달으로 인해 세포 분열 동안 세포 역학의 이러한 분석에 특히 유용합니다. 추가적으로, 동일 세포는 세포역학 역학...

세포 분열은 배양1에서자란 세포주를 사용하여 종종 연구된다. 우리는 이 연구 결과2에서근본적인 기계장치의 귀중한 통찰력 그리고 이해의 재산을 얻고 있는 동안, 배양에서 성장한 세포는 온전하고 살아있는 조직에서 생기는 세포 분열의 생리학을 완전히 되풀이할 수 없습니다. 예를 들어, 손상되지 않은 조직 및 장기에서 세포는 자손 세포가 조직 내에 적절하게 위치할 수 있도록 적절한 장소와 적절한 시기에 분할하여 적절한 분화 또는 기능적 프로그램을 겪을 수 있도록 하고 세포 증식이 조직 성장 또는 항상성과 적절하게 조정되도록 해야 합니다3. 한편, 배양에서 성장한 세포의 경우, 세포 분열은 일반적으로 배양 배지4의성장 인자에 의해 조절되며, 따라서 우리는 이러한 세포로부터 조직 구조 또는 발달 신호전달과 같은 환경적 요인이 분열 과정에 어떻게 영향을 미치는지 배울 수 없다. HeLa 및 U2OS 세포와 같은 세포 분열을 연구하는 데 사용되는 많은 세포주가 전이성 종양5에서유래되었다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서, 이러한 암세포의 기본 생리학의 많은 양상, 예: 세포 주기 조절 기전 및 염색체 안정성은 건강한 세포에 비해 변경되었을 가능성이 있다. 세포 분열 생리학의 완전한 이해는, 그러므로, 생리적인 규정 기계장치 및 조직 건축을 보존하는 그들의 네이티브, 생체 내 환경에서 분할 세포를 공부하는 우리의 기능에 달려 있습니다.
세포 분열이 손상되지 않은 조직 및 기관 내에서 어떻게 작동하는지 이해하는 발전은 생체 내 또는 생체 내 분석에 내재된 어려움에 의해 방해받습니다. 첫째, 큰 기관 또는 두꺼운 조직 내의 현미경 분석을 위해 분할 세포에 접근하는 것이 어렵거나 불가능할 수 있습니다. 둘째, 개별 세포가 생체 내에서 분할 될 때 예측하는 것은 종종 어렵습니다. 셋째, 조직 생리학은 생체 배양 동안 급속히 악화될 수 있다. 이 프로토콜에서는, 우리는 완전히 온전한 고환 내의 meiotic 세포 분열을 겪을 때 Drosophila melanogaster 정액 세포의 살아있는 및 고정된 분석을 위한 쉽게 접근가능한 방법을 기술합니다. 이 세포는 공초점 현미경 검사법과 같은 표준 광학 방법으로 쉽게 접근할 수 있기 때문에 생체 내 생체 분석에 이상적이며, 예측 가능한 시간과 위치에서 분할되며, 손상되지 않은 고환은 최대 약 24 시간 동안 생체 배양에서 유지될 수 있습니다. 또한, Drosophila 정자 세포는 큰 둥근 세포 (약 20-30 μm 직경) 그들은 분할 할 때 모양을 변경하지 않습니다, 스핀들 장치 및 세포질 세포기관과 같은 세포 구성 요소의 고해상도, 시간 경과 이미징에 이상적이다. 이 세포는 유사분열과 반대로 만피증을 겪더라도, 많은 필수 세포 분열 프로세스는 이 2개의 세포 분열 기계장치6사이에서 아주 유사합니다. 이러한 장점은, 강력한 Drosophila 유전 도구와 결합, 스피들 형성 및 조절, 사이토 카인시스, 및 소기관 리모델링 및 분할7,8,8,9,,10,,11을포함하여 필수 세포 분열 과정의 생체 분석을 위해 광범위하게 사용되는 모델로 Drosophila 정자 세포를 만들었습니다.
정자 세포는 정자 발생의 meiotic 단계에 있는 세포입니다. Drosophila에서정자 발생은 고환12,,13의한 극에서 작은 영역 또는 "허브"에 위치한 생식선 줄기 세포의 그룹으로 시작됩니다. 이 세포는 비대칭 유사분열에 의해 분할되고, 단 하나 분화한 정자를 초래합니다. Spermatogonia는 그 때 단 하나 낭종 내의 밀접하게 연관된 남아 있는 16의 세포의 단을 생성하기 위하여 4개의 동기 미토를 겪습니다. 이 단계에서, 세포는 meiotic 세포 주기에 유사분열에서 전이하고 정액 세포로 불립니다. 정자 세포는 세포 주기의 확장된 G2 단계에서 약 2~3일을 소비하며, 이 기간 동안 극적으로 성장하고 두 가지 메소다 분열 및 후속 정자 발생에 대비하여 세포학적 변화를 겪는다13,,14. 단일 낭종 내의 16 정자 세포의 전체 그룹은 동시에 첫 번째 meiotic 분열을 입력합니다. 따라서, 몇몇 meiotic 정자 는 세포 분열을 통해서 진행하는 때 동시에 심상될 수 있습니다. 첫번째 meiotic 분할은 대략 1.5 시간 동안 진행하고 성숙한 정자로 분화하기 위하여 계속하는 64의 총 정자를 산출하는 두 번째 meiotic 분할에 의해 거의 즉시 따릅니다.
살아있는 세포 분열을 연구하기 위하여 정액 세포를 사용하는 유일한 이점은, 온전한 조직은 세포의 단 또는 낭종이 정액 발생의 다른 단계를 통해 지속적으로 점진하고, 정액 발생의 모든 단계에서 세포는 일반적으로 어떤 주어진 된 고환에서 확인될 수 있습니다 (그림 3A참조). 따라서 전체 고환에서 meiotic 세포를 찾는 것이 비교적 쉽습니다. 우리는 일반적으로 이 세포가 고해상도 화상 진찰에 훨씬 더 크고 더 순종하기 때문에 두 번째 만두와 반대로 첫번째에 우리의 분석을 집중합니다, 그러나 두 meiotic 분할을 포괄하는 전체 프로세스는 성공적으로 심상될 수 있습니다. 또한 고환 제제 및 배양을 위한 일반적인 프로토콜은 정자 의전증으로 성숙함에 따라 발생하는 초기 유사분열 줄기 세포 또는 정자 분열 또는 세포학적 변화와 같은 정자 발생의 다른 과정을 분석하는데 사용될 수 있다는 점에 유의해야 한다15. 정자 발생의 이러한 측면의 대부분은 매우 초파리와 인간 사이에 보존16.
초파리 정자세포는 초파리 발달13의세 번째 유충 단계에서 정자 발생의 메소형성 단계에 도달하기 시작한다. 따라서, 세 번째 instar 애벌레로 시작하고 pupae 및 성인을 포함하여 수명 주기 단계에서 격리된 고환은 정자 세포의 분할 분석용으로 사용될 수 있습니다. 몇 가지 우수한 프로토콜은 정자 발생의 라이브 및 고정 분석을위한 성인 남성 파리에서 고환의 추출을 위해 사용할 수 있습니다17,,18,,19. 이 프로토콜은 정자 발생의 후기 단계를 공부하기 위해 바람직할 지도 모릅니다 또는 성인에서만 보이는 유전 마커가 이용되어야 하는 경우에. 이 프로토콜은 이 단계에서 고환이 고해상도, 시간 경과 현미경 검사법에 의하여 세포 분열 분석에 특히 관련되는 몇몇 이점이 있기 때문에, 애벌레와 초기 pupae에서 고환 준비에 대신 집중합니다. 첫째, 애벌레와 번데기의 고환은 성인보다 작고 장기 내의 세포는 덜 혼잡합니다. 이 때문에, 분할 정자 세포는 종종 빛 산란 조직의 여러 층을 통해 침투 할 필요없이, 애벌레 고환의 외부 표면 근처에 이미지 화 될 수있다. 둘째, 성인 고환은 연결된 부속 기관의 수축으로 인해 리드미컬하게 움직이며, 이러한 움직임은 개별 세포의 시간 경과 이미징을 어렵게 만듭니다. 셋째, 애벌레 고환은 pupal 또는 성인 치사성을 일으키는 유전자 돌연변이를 연구할 때 유리합니다. 우리의 방법은 현미경 단계에 고환의 장기 문화를 위해 최적화되어, 동일한 준비에 있는 정액 발생의 다중 단계를 통해 세포 분열의 다중 라운드 또는 개별 세포의 진행의 화상 진찰을 허용합니다. 우리는 또한 전체 고환의 고정 및 면역 염색을 위한 프로토콜을 기술합니다. 전반적으로, 우리의 프로토콜은 손상되지 않은 조직에서 세포 분열을 공부에 관심이 있는 사람들을 위해 특히 유용하고, 고도로 견인성 Drosophila 유전 공구와 정액 세포 분석을 결합하는 기능은 이것을 특히 강력한 접근하게 합니다.

<table><tbody><tr><td>5" 해부 프로브</td><td>Fisher</td><td>08-965-A</td><td></td></tr><tr><td>5.75" 유리 파스퇴르 Pipet</td><td>Fisher</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP9703-100</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11252-20</td><td>세밀한 팁이 있는 직선 포셉트</td></tr><tr><td>서리 낀 현미경 슬라이드</td><td>Fisher</td><td>12-544-2</td><td>고정 조직 장착용 슬라이드, 반투명 필기 표면</td></tr><tr><td>포함 할로카본 오일 700</td><td>시그마</td><td>H8898-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>루목스 접시 50</td><td>Sarstedt</td><td>SAR946077410</td><td>가스 투과성 조직 배양 접시</td></tr><tr><td>현미경 커버 유리</td><td>Fisher</td><td>12-541-B</td><td>22 mm x 22 mm, #1.5 유리 커버슬립</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-15</td><td>만드는 데 사용되는 곤충 핀 메스 도구</td></tr><tr><td>니켈 도금 핀 홀더</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 32% 용액, EM 등급</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>계획 경사진 모서리 현미경 슬라이드</td><td>Fisher</td><td>12-549-5</td><td>해부에 사용되는 슬라이드</td></tr><tr><td>PYREX Spot Plate</td><td>Fisher</td><td>13-748B</td><td>9-well glass 해부 접시</td></tr><tr><td>Schneider의 Drosophila 매체</td><td>Fisher</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터, 0.22 &마이크로; m</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>현미경 장착 매체</td></tr></tbody></table>

살아있는, 그대로 조직에서 세포 분열의 분석을 위한 초파리 애벌레와 pupal 고환의 준비

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

세포 분열이 발달, 조직 항상성 및 질병 과정과 어떻게 통합되는지에 대한 우리의 이해에 필수적입니다. (1) 정자를 포함하는 전체 Drosophila 고환은 현미경 검사법을 위해 준비하기 가 상대적으로 쉽기 때문에, (2) 정자 세포의 큰 크기는 고해상도 화상 진찰을 위해 그(것)들을 잘 적색하고, (3) 강력한 Drosophila 유전 공구는 생체 내 분석과 통합될 수 있기 때문에 만연증을 겪고 있는 혈소판 세포는 이 분석을 위해 이상적입니다. 여기에서, 우리는 Drosophila 제 3 instar 애벌레 및 초기 pupae에서 전체 고환의 준비를 위한 쉽게 접근가능한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 준비된 전체 고환에 있는 meiotic 정자 를 확인하는 방법과 시간 경과 현미경 검사법에 의해 그(것)들을 사는 심상하는 방법을 기술합니다. 전체 고환의 고정 및 면역 염색을 위한 프로토콜도 제공됩니다. 애벌레 고환의 사용은 정자 세포 분석을 위해 성인 고환을 사용하는 사용 가능한 프로토콜에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 가장 중요한 것은, 애벌레 고환은 성인 고환 보다는 세포로 더 작고 적게 혼잡하고, 이것은 크게 정액 세포의 고해상도 화상 진찰을 촉진합니다. 이러한 장점과 프로토콜의 적용을 입증하기 위해, 우리는 시간 경과 공초점 현미경검사법에 의해 이미지된 단일 정자 세포에서 세포 분열 동안 스핀들 미세소관에 대하여 소포체의 재분배를 보여주는 결과를 제시한다. 프로토콜은 형광 태그 단백질 또는 세포 기관 마커의 수의 발현과 결합 될 수있다, 유전자 돌연변이 및 기타 유전 도구뿐만 아니라, 전체 조직과 장기의 생리적 맥락에서 세포 분열 메커니즘의 분석을 위해이 접근 방식을 특히 강력.

이 프로토콜이 성공적으로 실행되면, 고환은 공초점 현미경 검사법 또는 그밖 형광 현미경 방법에 의하여 화상 진찰을 위해 완전히 손상되지 않을 것입니다. 그림 3A에서볼 수 있듯이, 고환의 세포 조직이 보존되고, 정자 세포, 및 haploid 정자를 포함하여 다른 고환의 한쪽 끝에서 다른 세포 분화의 진행이 볼 수 있습니다. GFP-tubulin는 분할 정자 세포를 확인하고 만피증을 통해 세포의 진행의 살아있는 화상 진찰을 위한 유용한 마커입니다. 도 3B에도시된 바와 같이, 시작 된 만막증에 대한 정자 세포는 그들의 두 개의 눈에 띄는 미세 소관 아스터에 의해 식별 될 수있다. 메타페이즈에 의해 큰 meiotic 스핀들은 GFP-tubulin에 의해 아름답게 표지됩니다(그림 3C).
초파리 정자의 큰 크기...

이 프로토콜의 목표는 Drosophila meiotocytes를 사용하여 살아있는 고정 세포 현미경 검사법에 의해 손상되지 않은 조직에서 세포 분열을 분석하는 것입니다. 이 프로토콜은 Drosophila 유충과 초기 번데기에서 전체, 손상되지 않은 고환을 분리하는 방법과 현미경 검사를 위해 처리하고 장착하는 방법을 보여줍니다.

살아있는, 그대로 조직에서 세포 분열의 분석을 위한 초파리 애벌레와 Pupal 고환의 준비

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

이 프로토콜은 형광 현미경 검사를 사용하여 살아있는, 그대로 조직의 맥락에서 세포 분열의 메커니즘을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포의 토착 생리 환경이 보존되는 동시에 오랜 과정을 통해 실시간 이미징을 허용한다는 것입니다. 이 기술의 가장 중요한 부분은 해부 또는 장착 중에 고환이 손상되지 않도록 하는 것입니다.이것은 약간의 시간과 연습으로 획득 한 기술입니다. 이 방법의 시각적 데모는 고환을 식별하고 격리하는 방법과 조직을 손상시키지 않고 이미징을 위해 장착하는 방법을 보여 주므로 중요합니다. 원고에 설명된 대로 동물, 도구 및 미디어를 준비합니다.해부를 시작하기 전에 미디어 충전 필터 주사기를 사용하여 유리 슬라이드의 상단, 중간 및 하단에 있는 50마이크로리터마다 3방울의 미디어를 배출합니다. 해부 프로브를 사용하여 5-10세 인스타 애벌레 또는 초기 강아지를 슬라이드에서 미디어 상단 으로 옮기십시오. 해부 프로브로 애벌레와 강아지를 부드럽게 교반하여 음식이나 이물질을 제거합니다.해부 프로브를 사용하여 단일 애벌레 또는 강아지를 옆으로 돌립니다. 신체의 후방 세 번째에 반투명 타원형 구조로 나타나는 두 가지 양자 고환을 찾습니다. 고환이 부족한 동물은 여성이며 버려야합니다.남성 애벌레 또는 강아지가 발견되고 깨끗할 때, 미디어의 두 번째 방울로 이동합니다. 3~4개의 수컷 애벌레 또는 푸파가 두 번째 미디어 드롭으로 옮겨질 때까지 반복한다. 그런 다음 미디어의 두 번째 드롭에서 작업, 그 중간 지역에서 집게의 쌍으로 하나의 동물을 잡아, 단지 고환에 전방.두 번째 집게를 사용하여 동물을 반으로 부드럽게 찢습니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 동물의 뒤쪽 끝을 유리 슬라이드에 누십시오. 집게 바로 옆에서 시작하여 메스 가장자리를 사용하여 큐티클을 누른다.메스를 동물의 절단 끝으로 이동합니다. 이것은 창 자, 뚱뚱한 바디 및 고환을 포함하는 동물의 내부 기관을 추방할 것입니다. 고환은 무색및 지방 체의 리본에 내장된 거의 투명한 타원형 기관입니다.나머지 장기에서 고환을 부드럽게 따로 떼어냅니다. 고환을 한 번에 하나씩 옮기려면, 지방 체 아래에 메스의 가장자리를 삽입하고, 미디어에서 조직을 들어 올리고, 신속하게 세 번째 드롭으로 이동합니다. 아직 고환에 부착된 지방체가 충분하지 않으면 메스로 조직을 들어 올릴 수 있는 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 해부 배지로 미리 습식된 유리 파스퇴르 파이펫을 사용한다.매체의 세 번째 드롭에서 작업, 부드럽게 고환에서 여분의 지방 몸을 슬라이스 메스의 날카로운 끝을 사용하여, 가장자리 주위에 지방 몸의 단지 작은 테두리를 떠나. 먼저 필터 주사기를 사용하여 슈나이더의 배지 한 방울을 약 30마이크로리터를 50mm 가스 투과성 배양 접시의 중앙에 증정합니다. 메스 도구 또는 미리 습식 된 파스퇴르 파이펫을 사용하여 준비 된 고환 의 최대 5 개까지 접시에 드롭합니다.다음으로 메스 도구를 사용하여 고환을 가스 투과성 멤브레인에 부드럽게 밀어 넣고 중간 낙하의 중심으로 밀어 넣습니다. 1 밀리리터 주사기를 사용하여 중간 크기의 낙하를 둘러싼 가스 투과성 멤브레인에 할로카본 오일 4방울을 놓습니다. 방울의 위치는 22밀리미터 클래스 커버슬립의 네 모서리에 해당해야 합니다.그런 다음 22mm 유리 커버슬립의 모서리를 할로카본 오일 4방울과 정렬하고 커버슬립을 미디어와 오일에 부드럽게 낮춥춥시게 합니다. 커버슬립이 정착하도록 허용하고, 고환을 포함하는 매체의 경우 오일 방울 사이에 확산을 허용합니다. 배양 접시를 해부 현미경 아래에 놓습니다.과도한 용지를 제거하려면 커버슬립 아래에 섬세한 작업 지우기의 모서리를 삽입합니다. 유리 커버슬립을 위한 충분한 매체를 멀리 하여 가장 큰 고환표면과 접촉할 수 있습니다. 너무 많은 미디어를 제거하고 커버 슬립을 너무 멀리 낮추지 마십시오.이것은 고환에 압력을 가하고 파열하는 원인이 될 수 있습니다. 마지막으로, 고환 바로 위에 유리 커버슬립에 침지 오일 한 방울을 놓습니다. 접시를 뒤집어 현미경 단계에 놓습니다.40 또는 60 X 현미경 목표를 고환 바로 아래에 때까지 오일로 이동합니다. 전송된 빛을 사용하여 단일 고환을 찾아 초점으로 가져옵니다. PBSTx에 8%의 파라포름알데히드의 0.5 밀리리터를 9개의 잘 해부하는 요리 중 한 곳에 놓습니다.유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 고환 의 10개까지 우물로 옮기. 고환이 우물 바닥에 누워 있는지 확인합니다. 20 분 후, PBSTx의 0.5 밀리리터를 포함하는 우물로 고환을 전송합니다.5분간 부드럽게 교반하여 고환을 씻으십시오. 신선한 PBSTx로 새로운 우물에서 두 번 더 세척하십시오. 원고에 설명된 바와 같이 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에서 1 차 항체의 희석을 준비한다.그런 다음 9 개의 잘 유리 해부 접시에서 튜브로 고환을 옮김시합니다. 부드러운 흔들거나 견과류와 함께 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 튜브를 배양하십시오. 이차 항체로 고환을 염색하는 절차는 유사하다.자세한 내용은 원고를 참조하십시오. 먼저 파스퇴르 파이펫을 사용하여 9개의 웰 플레이트에서 유리 현미경 슬라이드로 고환을 옮김합니다. 필요한 경우 메스 가장자리를 사용하여 고환을 슬라이드 표면으로 밀어 넣습니다.다음으로, 섬세한 작업 닦기의 모서리를 사용하여 고환에서 여분의 액체를 심지하십시오. 가능한 한 많은 액체를 제거하십시오. 그런 다음 고환에 미세 크기 장착 매체의 30~ 50 마이크로리터 드롭을 적용한다.마지막으로, 22mm 커버슬립을 장착 매체의 드롭에 놓습니다. 커버슬립이 정착하도록 하고 장착 매체가 커버슬립 아래에 퍼질 수 있습니다. 필요한 경우 커버슬립에 부드러운 압력을 가하여 과도한 장착 매체를 짜내고 커버슬립이 고환 표면에 놓일 수 있도록 하십시오.이 프로토콜이 성공적으로 실행되면 고환의 셀룰러 조직이 보존되고, 고환의 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝으로 세포 분화의 진행이 표시됩니다. 심마세포는 meiosis를 시작하기 위하여 대략 및 메타Phase에 있는 그 확인될 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 준비된 고환에서, 살아있는 화상 진찰 분석은 정자 세포를 분할에 있는 폐장 망상 및 마이크로 tubules의 동적 재구성을 보여줍니다.프로토콜에 설명된 바와 같이, 고환이 파열되는 압력을 가하지 않도록 주의를 기울여야 합니다. 정자 세포의 낭종은 파열 된 고환에서 급속히 흐르고, 라이브 타임 경과 이미징을 어렵게 만듭니다. 이 프로토콜은 살아있는, 그대로 조직에 있는 정자를 나누는 화상 진찰에 최적화됩니다.따라서 해부 또는 장착 중에 고환이 손상되지 않는 것이 필수적입니다. 우리의 방법은 또한 세포 분열을 통제하는 동적 세포 프로세스에 새로운 통찰력을 제공하는 구조화된 조명 현미경 검사법과 같은 초해상도 화상 진찰 기술에 적합해야 합니다.

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연구

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Developmental Biology

발생생물학

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정자의 세포 학적 분석 : 라이브와 고정 준비<em&gt; 초파리</em&gt; 고환

면역염색은 조직 내의 특정 세포 유형과 단백질을 시각화하는 효과적인 기술입니다. 초음파 처리를 활용함으로써, 여기에 설명된 프로토콜은 면역 염색 전에 후기 단계의 배아와 유충에서 Drosophila melanogaster 조직을 해부해야 할 필요성을 완화합니다. 우리는 포름알데히드가 고정된 전체 산 유충의 면역 염색을 위한 효율적인 방법론을 제공합니다.

늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색<em&gt; 초파리</em&gt; 조직<em&gt; 제자리에서</em

이 프로토콜은 Drosophila melanogaster 번데기에서 온전한 고환과 생식 세포 낭종의 해부 및 배양을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 생체 외 정자 형성을 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 또한, 번데기 고환에서 생식 세포 발달의 특정 단계에 대한 억제제의 효과에 대한 약리학적 분석을 설명합니다.

해부, 이미징 및 약물 학적 치료 : 초파리의 번데기 고환 및 단일 남성 생식 줄 낭종의 생체 내 문화

Drosophila 난소 줄기 세포 틈새 시장 개발을 공부 하는 우수한 모델 시스템입니다. 애벌레와 성인 난소를 해 부 방법 출판 되었습니다 비록 번데기 난소 해 자세히 게시 되지 않은 다른 기술이 필요 합니다. 여기 우리는 해 부, 얼룩, 번데기 난소를 장착 한 프로토콜 개요.

해 부와 초파리 번데기 난소의 얼룩

우리는 여기에 공초점 현미경 검사법에 적합하고 재현 가능하고 신뢰할 수있는 라벨을 허용 Drosophila 고환의 전체 마운트 준비 및 면역 스테인링을위한 향상된 프로토콜을 제시합니다. 우리는 대형 S4-S5 정자 세포에 대한 공동 지역화 실험의 3D 표현 및 정량화에 의해이 프로토콜을 설명합니다.

대형 정자 세포의 3D 공초점 분석을 위한 전산 Drosophila 고환의 면역 염색

여기에 제시된 프로토콜은 플레이트 기반의 고함량 이미저를 사용하여 배아 발달 중에 여러 Drosophila 배아를 마이크로주입하고 동시에 이미지화하는 프로토콜이다.

자동 고함량 분석기를 사용하여 수행된 살아있는 세포 현미경 검사법을 위한 Drosophila 배아 준비 및 미세 주입

여기서, 우리는 후기 배아 초파리 남성 생식선을 생생하게 이미지화하는 데 필요한 해부 프로토콜을 제공한다. 이 프로토콜은 정상적인 조건 하에서 또는 트랜스제닉 또는 약리학적 조작 후에 동적 세포 과정의 관찰을 허용할 것이다.

후기 배아 초파리 고나드의 해부와 라이브 이미징

여기에서는 초파리 난소 틈새 시장에서 생식세포 줄기세포(GSC)의 비대칭 분열에 대한 실시간 이미징을 수행하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 분광 단백질 Par-1의 녹색 형광 단백질(GFP) 융합을 유비쿼터스하게 발현하는 형질전환 라인을 사용합니다.

여성 Drosophila melanogaster 생식세포 줄기세포 틈새의 확장된 라이브 이미징

학습하세요 살아있는 조직에서 형광 현미경을 이용한 세포 분열 메커니즘 분석 방법을 Drosophila 애벌레와 초기 번데기 고환을 사용하여. 이 기술은 세포의 생리학적 환경을 보존하면서 장시간 라이브 이미징이 가능합니다.

살아있는, 그대로 조직에서 세포 분열의 분석을 위한 초파리 애벌레와 Pupal 고환의 준비

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