Name: 근접 결찰 분석술을 사용하여 C. 예쁜꼬마선에서 리보뉴클레오 단백질 복합어셈블리의 시투 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 배우세요 근접 결찰 분석술(PLA)을 사용하여 C. elegans 생식선에서 단백질 상호작용을 시눬 검출하는 방법을. 이 기술은 공간적·시간적 패턴을 밝혀 발달 생물학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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이 연구에서 사용된 몇몇 선충 긴장은 NIH (P40OD010440)에 의해 투자된 Caenorhabditis 유전학 센터에 의해 제공되었습니다. 공초점 현미경 검사법은 NIH 어워드 P20GM103546 및 S10OD021806의 지원으로 운영되는 몬태나 대학교 생물분과 현미경 코어 연구소에서 수행되었습니다. 이 작품은 E.V.에 NIH 교부금 GM109053, 미국 심장 협회 펠로우십 18PRE34070028 X.W.에 의해 부분적으로 지원되었다, 그리고 X.W에 과학의 몬태나 아카데미 상. 기금은 연구 디자인이나 보고서 작성에 관여하지 않았다. 엘렌베커 에게 토론에 감사드립니다.

<ol><li>Berggård, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li>
<li>Nooren, I. M., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Diversity of protein-protein interactions.</a> EMBO Journal. 22 (14), 3486-3492 (2003).</li>
<li>Patil, A., Kinosselecta, K., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hub+promiscuity+in+protein-protein+interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Hub promiscuity in protein-protein interaction networks.</a> International Journal of Molecular Science. 11 (4), 1930-1943 (2010).</li>
<li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+essentials%3A+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Computational Biology. 6 (6), e1000807(2010).</li>
<li>Pazdernik, N., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+germ+cell+development+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 1-16 (2013).</li>
<li>Nousch, M., Eckmann, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+the+Caenorhabditis+elegans+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Translational control in the Caenorhabditis elegans germ line.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 205-247 (2013).</li>
<li>Vangindertael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+optical+super-resolution+microscopy+for+the+adventurous+biologist%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Applications+in+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003(2018).</li>
<li>Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy-based+relative+localization+analysis+%28STORM-RLA%29+for+quantitative+nanoscale+assessment+of+spatial+protein+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).</li>
<li>Thymiakou, E., Episkopou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+signaling+effector-complexes+downstream+of+bmp4+using+PLA%2C+a+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+in+situ+protein-protein+complexes+at+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+using+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of in situ protein-protein complexes at the Drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), 52139(2015).</li>
<li>Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+as+a+biomolecular+research+tool+-+understanding+its+potential+while+avoiding+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls.</a> Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).</li>
<li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29%3A+a+5-year+update+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives.</a> Biotechniques. 53 (5), 285-298 (2012).</li>
<li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Biochemical Science. 32 (9), 407-414 (2007).</li>
<li>Hiatt, S. M., Shyu, Y. J., Duren, H. M., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis+of+protein+interactions+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 45 (3), 185-191 (2008).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li>
<li>Wilson, M. J., Salata, M. W., Susalka, S. J., Pfister, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+chains+of+mammalian+cytoplasmic+dynein%3A+identification+and+characterization+of+a+family+of+LC8+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Light chains of mammalian cytoplasmic dynein: identification and characterization of a family of LC8 light chains.</a> Cell Motility and Cytoskeleton. 49 (4), 229-240 (2001).</li>
<li>Erdős, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+linear+motif+filtering+protocol+reveals+the+role+of+the+LC8+dynein+light+chain+in+the+Hippo+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel linear motif filtering protocol reveals the role of the LC8 dynein light chain in the Hippo pathway.</a> PLoS Computational Biology. 13 (12), e1005885(2017).</li>
<li>Navarro-Lérida, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+identification+of+brain+proteins+that+interact+with+dynein+light+chain+LC8%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic identification of brain proteins that interact with dynein light chain LC8.</a> Proteomics. 4 (2), 339-346 (2004).</li>
<li>Rapali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DYNLL%2FLC8%3A+a+light+chain+subunit+of+the+dynein+motor+complex+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">DYNLL/LC8: a light chain subunit of the dynein motor complex and beyond.</a> FEBS Journal. 278 (17), 2980-2996 (2011).</li>
<li>Rapali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+reveals+the+binding+motif+preference+of+the+LC8%2FDYNLL+hub+protein+and+predicts+large+numbers+of+novel+binders+in+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Directed evolution reveals the binding motif preference of the LC8/DYNLL hub protein and predicts large numbers of novel binders in the human proteome.</a> PLoS One. 6 (4), e18818(2011).</li>
<li>Clark, S. A., Jespersen, N., Woodward, C., Barbar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivalent+IDP+assemblies%3A+Unique+properties+of+LC8-associated%2C+IDP+duplex+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Multivalent IDP assemblies: Unique properties of LC8-associated, IDP duplex scaffolds.</a> FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2543-2551 (2015).</li>
<li>Jespersen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+recognition+motifs+for+the+hub+protein+LC8%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of recognition motifs for the hub protein LC8.</a> Life Science Alliance. 2 (4), (2019).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+light+chain+DLC-1+promotes+localization+and+function+of+the+PUF+protein+FBF-2+in+germline+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dynein light chain DLC-1 promotes localization and function of the PUF protein FBF-2 in germline progenitor cells.</a> Development. 143 (24), 4643-4653 (2016).</li>
<li>Dorsett, M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+dynein+in+the+inhibition+of+germ+cell+proliferative+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A role for dynein in the inhibition of germ cell proliferative fate.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 6128-6139 (2009).</li>
<li>Ellenbecker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+Light+Chain+DLC-1+Facilitates+the+Function+of+the+Germline+Cell+Fate+Regulator+GLD-1+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Dynein Light Chain DLC-1 Facilitates the Function of the Germline Cell Fate Regulator GLD-1 in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 211 (2), 665-681 (2019).</li>
<li>Day, N. J., Ellenbecker, M., Voronina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+DLC-1+associates+with+ribonucleoprotein+complexes+to+promote+mRNA+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans DLC-1 associates with ribonucleoprotein complexes to promote mRNA regulation.</a> FEBS Letters. 592 (22), 3683-3695 (2018).</li>
<li>Detwiler, M. R., Reuben, M., Li, X., Rogers, E., Lin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+zinc+finger+proteins%2C+OMA-1+and+OMA-2%2C+are+redundantly+required+for+oocyte+maturation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Two zinc finger proteins, OMA-1 and OMA-2, are redundantly required for oocyte maturation in C. elegans.</a> Developmental Cell. 1 (2), 187-199 (2001).</li>
<li>Spike, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+of+the+oogenic+program+by+components+of+OMA+ribonucleoprotein+particles+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Translational control of the oogenic program by components of OMA ribonucleoprotein particles in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 198 (4), 1513-1533 (2014).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).</li>
<li>Gervaise, A. L., Arur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Analysis+of+Active+ERK+in+the+C.+elegans+Germline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li>
<li>Duerr, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+staining+in+C.+elegans+using+%22freeze-cracking%22%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Antibody staining in C. elegans using "freeze-cracking".</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li>
<li>Crittenden, S., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+immunolabeling+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation and immunolabeling of Caenorhabditis elegans.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2009).</li>
</ol>

저자는 이해관계의 충돌이 없습니다.

C. elegans 생식선에 있는 PPI를 공부할 때, 공동 면역 염색에 비교된 PLA에 의해 제안된 더 높은 해결책은 상호 작용이 생식선에서 일어나는 위치의 시각화 그리고 정량화를 허용합니다. 이전에는 DLC-1이 시험관 내 GST 풀다운 분석(26)을26사용하여 OMA-1과 직접 상호 작용한다는 보고가 있었다. 그러나, 이 상호 작용은 생체 내 풀다운에 의해 복구되지 않았습니다. 3xFLAG::DLC-1의 형광 동면역염색; OMA-1::GFP 생식선은 DLC-1 및 OMA-1에 대한 발현 패턴의 중첩을 나타낸다; 그러나, 그들의 상호 작용이 생식선에서 어디에서 발생하는지에 대한 징후가 없으며, 중첩 자체는 어떤 단백질에 융합되지 않은 3xFLAG::DLC-1 및 GFP 사이의 것보다 크지 않다(음성 대조군). situ PLA에서, DLC-1은 다른 접근법에 비해 PLA가 PPI의 검출을 위해 더 민감할 수 있다는 것을 건의하는 생식선에...

단백질의 80% 이상은 세포2에있는 특정 생물학 기능의 실행에 PPI가 얼마나 중요한지 강조하는 그밖 분자1와상호 작용이 있기 위하여 추정됩니다. 몇몇 단백질은 세포 생존을 위해 필요한 더 큰 복합물의 집합을 촉진하는 허브로작동합니다 1. 이 허브는 다중 PPI를 중재하고 세포3에있는 특정 기능을 용이하게 하는 네트워크로 단백질을 구성하는 것을 돕습니다. 단백질 복합체의 형성은 또한 특정 상호 작용하는 파트너의 존재 또는 부재와 같은 생물학적 맥락에 의해 영향을 받습니다4,세포 신호 이벤트, 및 세포의 발달 단계.
C. 예쁜꼬마선충은 일반적으로 발달을 포함한 다양한 연구를 위한 모델 유기체로서 사용된다. 이 동물의 간단한 해부학은 고나드, 창자 및 투명 표피를 포함한 여러 장기로 구성되어 있어 웜 발달 분석을 용이하게합니다. gonad에 있는 생식선은 배아로 발전하고 결국 자손의 다음 세대로 발전하는 gametes5로 어떻게 생식선 줄기 세포가 성숙하는지 공부하는 중대한 공구입니다. 생식선의 말단 팁 영역은 자가 갱신 줄기 세포의 풀을 포함합니다(그림 1). 줄기 세포가 틈새 시장을 떠날 때, 그들은 meiotic pachytene로 진행하고 결국 젊은 성인 단계에서 oocytes로 발전합니다(그림 1). 생식선에서의 이러한 발달 프로그램은 RNA 결합 단백질(RBPs)에 의해 촉진된 전사 후 조절 네트워크를 포함하는 상이한 메커니즘을 통해 엄격하게 조절된다6. PP는 RBP가 다른 보조 인자와 연결하여 기능을 발휘하기 때문에 이러한 규제 활동에 중요합니다.
웜에서 PPI를 검색하는 데 사용할 수 있는 몇 가지 방법이 있지만 각 방법에는 고유한 제한이 있습니다. 생체 내 면역 침전 (IP)은 전체 웜 추출물에서 단백질 단백질 복합체를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 이 방법은 웜에서 PPI가 발생하는 위치를 나타내지 않습니다. 또한, 단백질 복합체는 특정 발달 단계 또는 제한된 수의 세포에서 일시적이며 단지 형성되는 단백질 복합체는 공동 면역 침전에 의해 회복되기 어려울 수 있다. 마지막으로, IP 실험은 친화성 매트릭스상에서 단백질의 용해 및 비특이적 보존 후 단백질 복합 재분류에 대한 우려를 해결해야 합니다.
PPI의 구내 검출에 대한 대안적 접근법은 공동 면역 염색, Förster 공명 에너지 전달(FRET), 및 이중 분자 형광 보완(BiFC)이다. 공동 면역 염색은 고정 된 웜 조직에서 관심있는 두 단백질의 동시 검출및 신호 동국화 의 정도 측정에 의존합니다. 표준 현미경 검사법7보다더 자세한 정보를 제공하는 초고해상도 현미경 검사법을 사용하면 200-300 nm8의회절 제한 장벽을 넘어 단백질 공동 국소화를 보다 엄격하게 테스트하는 데 도움이됩니다. 그러나, 기존의 및 초고해상도 현미경 검사법을 모두 사용하는 공동 면역 염색은 잘 정의된 국소화 패턴을 가진 단백질에 가장 적합합니다. 반대로 분산된 상호 작용 파트너에게는 훨씬 덜 유익합니다. 중첩에 기초한 신호의 공동 국소화를 위한 측정은 단백질이 서로 복잡한지 에 대한 정확한 정보를 제공하지 않습니다9,,10.
더욱이, 단백질 단백질 복합체의 공동 면역 침전 및 공동 면역 염색은 양이 아니므로 그러한 상호 작용이 중요한지 결정하기가 어렵습니다. FRET와 BiFC는 모두 형광 기반 기술입니다. FRET는 하나의 FP(공여자)로부터의 에너지가 다른FP(acceptor)(acceptor)(acceptor)(11)로이송되는 스펙트럼 이중되는 형광 단백질(FPs)을 가진 관심 단백질의 태그 지정에 의존한다. 이러한 비방사성 에너지 전달은 각각의 방출 파장에서 검출될 수 있는 수용기 FP의 형광을 초래한다. BiFC는 생체 내 형광 단백질의 재구성을기반으로합니다. 그것은 두 개의 상보적인 단편으로 GFP를 분할 수반, 나선 등 1-10 그리고 나선 1112,다음 관심의 두 단백질에 융합. 이 두 단백질이 상호 작용하는 경우에, GFP의 상보적인 단편은 GFP 불소를 재구성하는 접고 집합하기에 충분히 가깝게 됩니다. 재구성된 GFP는 형광으로 직접 관찰되고 PPI가 발생한 위치를 나타냅니다.
따라서, FRET와 BiFC 둘 다 태그된 단백질의 기능을 방해할 수 있는 큰 형광 태그에 의존합니다. 또한, FRET 및 BiFC는 정확한 데이터를 얻기 위해 태그가 지정된 단백질의 풍부하고 유사한 발현을 필요로 한다. FRET는 한 파트너가 다른 파트너를 초과하는 실험에 적합하지 않을 수 있으며, 이는 높은 배경13으로이어질 수 있습니다. BiFC 실험에서과발현은 배경이 증가하는 비특이적어셈블리(14)를 유도할 수 있기 때문에 피해야 한다. 두 기술 모두 태그가 지정된 단백질의 발현 및 이미징 조건의 최적화를 필요로 하며, 이는 실험을 완료하는 데 필요한 시간을 연장할 수 있습니다.
근접 결찰 분석법(PLA)은 위에서 언급한 기술의 한계를 해결할 수 있는 대안적인 접근법이다. PLA는 관심 있는 단백질(또는 그들의 꼬리표)을 인식하는 1차 항체를 이용한다. 이들 1차 항체는 40 nm(또는 더 짧은) 거리15내에 있을 때 서로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 함유하는 이차 항체에 의해 결합된다. 생성된 혼성화된 DNA는 DNA를 보완하는 프로브에 의해 검출되는 PCR 반응을 통해 증폭됩니다. 이것은 현미경에 의해 구상되는 초점에서 유래합니다. 이 기술은 복잡한 조직 (즉, 웜 고나드)에서 현장에서 PPI를 감지 할 수 있으며, 이는 다양한 개발 및 분화 단계에서 세포를 포함하는 조립 라인으로 구성됩니다. PLA를 사용하면 PPI가 고정 된 웜 고나드에서 직접 시각화 될 수 있으며, 이는 특정 개발 단계에서 PPI가 발생하는지 여부를 조사하는 데 유리합니다. PLA는 정확한 측정에 이상적인 공동 현지화 기반 분석에 반대되는 PPI의 더 큰 분해능을 제공합니다. 사용 하는 경우, 초고해상도 현미경 세포 내에서 PLA 초점의 위치에 대 한 더 미세한 세부 정보를 제공할 가능성이 있다. 또 다른 장점은 PLA 반응으로 인한 초점을 ImageJ 기반 분석 워크플로우에 의해 계산할 수 있어 이 기술을 정량적으로 만들 수 있다는 것입니다.
다인 경쇠의 LC8 제품군은 먼저 다인 모터 컴플렉스16의 소단위로 설명되었고 화물 어댑터역할을 하도록 가설되었다. 초기 발견 이후, LC8은 다인 모터 복합체 이외에 다중 단백질 복합체에서 발견되었으며17,,18,,19,,20. LC8 상호작용모티프(19)를 포함하는 단백질 서열을 스캐닝하는 것은 LC8이 다양한 단백질17,18,,19,,20,,21,,22와많은 상호작용을 가질 수 있음을 시사한다., 그 결과, LC8 패밀리 단백질은 이제 본질적으로 무질서한 단백질21의조립체와 같은 더 큰 단백질 복합체19,,22의조립을 촉진하는 데 도움이 되는 허브로 간주된다.
하나의 C. elegans LC8 패밀리 단백질, 다인 경막-1(DLC-1)은 많은 조직에 걸쳐 널리 발현되며 특정 세포내구조(23,,24)에서농축되지 않는다. 따라서, C. 예쁜꼬마선충에서 DLC-1의 생체 내 파트너의 생물학적으로 관련성이 있는 식별은 여러 가지 이유로 도전적입니다: 1) 공동 면역 침전은 상호작용이 발생하는 조직 공급원을 나타내지 않는다; 2) 특정 파트너 또는 일시적인 상호 작용의 제한된 발현은 공동 면역 침전에 의한 상호작용을 검출하는 능력을 방해할 수 있다; 및 3) DLC-1의 확산 분포는 공동 면역 염색에 의해 잠재적인 파트너 단백질과 비특이적 중첩을 유도한다. 이러한 과제를 바탕으로 PLA는 DLC-1과의 생체 내 상호 작용을 테스트하기 위한 이상적인 접근 방식입니다.
이전에는 DLC-1이 RNA 결합 단백질(RBPs) FBF-223 및 GLD-125와직접 상호 작용하고 보조 인자역할을 한다는 것이 보고되었다. 우리의 일은 허브 단백질로 봉사하는 DLC-1의 모형을 지원하고 DLC-1이 dynein19,,22를넘어 서 상호 작용 네트워크를 용이하게 한다는 것을 건의합니다. GST 풀다운 분석을 사용하여 OMA-1이라는 새로운 DLC-1 상호 작용 RBP가26으로확인되었습니다. OMA-1은 난모세포 성장 및 meiotic성숙(27)과 다수의 번역억제기 및활성제(28)와함께 기능하는 데 중요하다. FBF-2 및 GLD-1은 줄기 세포 및 메오틱 파키텐 영역에서 각각 발현되는 반면, OMA-1은 난모세포27(도 1)을통해 메오틱 파키텐으로부터 생식선으로 확산발된다.1.1. 이것은 DLC-1이 고나드의 다른 지역에 있는 RP를 가진 복합체를 형성한다는 것을 건의합니다. 또한 시험관 내에서 관찰된 DLC-1과 OMA-1 사이의 직접적인 상호작용이 생체 내 IP에 의해 회복되지 않는다는 것이 밝혀졌다. PLA는 C. elegans 생식선에서 이 상호 작용을 추가로 연구하기 위한 대체 접근법으로 성공적으로 사용되었으며, 결과는 PLA가 웜의 다른 많은 PPI를 조사하는 데 사용될 수 있음을 시사한다.

<table><tbody><tr><td>16% 파라포름알데히드 용액</td><td>전자 현미경 서비스</td><td>15710</td>은 <td>4% 작업 용액</td></tr><tr><td>1M KH2P<Osub>4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td>를 만드는 데 사용됩니다<td>. 1M 작업 재고</td></tr><tr><td>준비 1x M9</td><td>다양한</td><td>다양한</td><td>준비 1x 1x에서 사용되는 10x 재고로 다양하게 준비; 프로토콜</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>다양한</td><td></td><td>다양한 참조는 wormbook.org 참조하십시오. 프로토콜</td></tr><tr><td>26.5 게이지 바늘</td><td>Exel International</td><td>26402</td><td>해부에 사용되는</td></tr><tr><td>바늘 wormbook.org BSA</td><td>Lampire</td><td>7500802</td><td></td></tr><tr><td>원심 분리기 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td>05-529C</td><td>동기화에 사용되는 50ml Oak ridge 원심 분리기 튜브</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td>880</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>PolyLab</td><td>62101</td><td></td></tr><tr>샘플 <td>Globe Scientific</td><td>1411-10</td><td>22x40mm를</td> <td>동결하기 위한 커버슬립</td>, 슬라이드</tr><tr><td>Globe Scientific</td><td>1404-15</td><td>22x22mm를</td><td>밀봉하기 위한 1.5번 커버슬립</td>, 면역</tr><tr>형광 <td>벡터</td>용 No. 1.5<td>DAPI 마운팅 매체</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Ligase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82029</td><td>Duolink 1x Ligase, Duolink In Situ Detection Reagents Red kit의 일부로 제공 DUO92008</td></tr><tr><td>증폭 적색 완충액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82011</td><td>Duolink 5x 증폭 적색 완충액, Duolink 현장 검출 시약 DUO92008 키트</td></tr><tr><td>결찰 완충액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82009</td><td>Duolink 5x 결찰 완충액의 일부로 제공, Duolink 현장 검출 시약 Red kit DUO92008</td></tr><tr><td>항체 희석제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82008</td><td>Duolink 항체 희석제, DUO92004 및 DUO92002 함께 제공, 참고: 1x PBS/1% BSA 용액을 항체 희석을 위한 대용품으로 사용할 수도 있습니다.</td></tr><tr><td>블로킹 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82007</td><td>Duolink 블로킹 솔루션, PLA 용 DUO92004 및 DUO92002 마운팅 매체와 함께 제공</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040</td><td>Duolink In Situ 마운팅 매체 (DAPI</td></tr><tr><td>MINUS 프로브</td> 포함) <td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td>Duolink In Situ 프로브 안티 마우스 마이너스</td></tr><tr><td>플러스 프로브</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td>Duolink In Situ 프로브 Anti-Rabbit PLUS</td></tr><tr><td>세척 버퍼 A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>DUO82046 Duolink 현장 세척 버퍼 A</td></tr><tr><td>세척 버퍼 B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82048</td><td>Duolink 현장 세척 버퍼 B</td></tr><tr><td>중합효소</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82030</td><td>Duolink 중합효소, Duolink 현장 검출 시약의 일부로 제공 레드 키트 DUO92008</td></tr><tr><td>에피형광 현미경</td><td>Leica</td><td></td><td>DFC300G 카메라, DM5500B 현미경</td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 Alexa 594</td><td>JacksonImmuno</td><td>115-585-146</td><td>1:500</td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 Alexa 488</td><td>JacksonImmuno</td><td>111-545-144</td><td>1:200</td></tr><tr><td>사용 이미지 처리 소프트웨어</td><td>Adobe</td><td></td><td>Adobe Photoshop + Illsutrator CS3</td></tr><tr><td>유리 피펫</td><td>Corning</td><td>7095B-5X</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>ACROS 유기물</td><td>187870100</td><td>250mM 작업 재고 준비</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>A454</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 플래그</td><td>시그마</td><td>F1804</td><td>면역 형광 및 PLA에 1:1000에서 사용, 일반 염소 혈청으로 사전 차단 권장</td></tr><tr><td>Nailpolish</td><td>L.A. 색상</td><td>CNP195</td><td></td></tr><tr><td>선충 성장 매체 (NGM)</td> <td>다양한</td><td></td><td>wormbook.org 참조하십시오. </td></tr><tr><td>프로토콜 Normal Goat Serum</td><td>JacksonImmuno</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 파스퇴르 피펫</td><td>글로브 사이언티픽</td><td>135030</td><td></td></tr><tr><td>폴리 -L- 라이신</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>P1524</td><td>물에 0.1 % 원액으로 준비, -20C에서 보관, 물에 1:100으로 희석하여 슬라이드 코팅</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Tritech</td><td>PD7060</td><td>60 mm 직경</td></tr><tr><td>토끼 anti-GFP</td><td>Thermo Fisher</td><td>G10362</td><td>면역형광의 경우 1:200, PLA 슬라이드의 경우 1:4000에서 사용</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>30-2066A-Brown</td><td>바가 있는 3각 14x14mm 오토클레이브 슬라이드는 Fisher Scientific을 통해 맞춤 주문됩니다. 실험실의 슬라이드에 폴리 L- 라이신이 추가되었습니다</td></tr><tr><td>차아 염소산 나트륨 용액</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS290-1</td><td></td></tr><tr><td>작업 와이프</td><td>Kimtech</td><td>34120</td><td>4.4x8.4 인치 작업 와이프</td></tr><tr><td>트레이 (242x241x20mm)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>240845</td><td>습한 챔버를 만드는 데 사용</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>ACROS 유기물</td><td>327372500</td><td></td></tr><tr><td>초순수</td><td>Milli-Q</td><td></td><td>Milli-Q Integral Water Purification System</td></tr><tr><td>Watchglass</td><td>Carolina Biological</td><td>742300-20</td><td></td></tr>에서 얻은 초순수<tr><td>; C 냉동고</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-80 &deg; C 냉동고</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 균주 E. coli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nematode strain(요청 시 둘 다 사용 가능)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mntSi13[pME4.1] II; UNC-119(ED3) III세; teIs1 [pRL475]</td><td></td><td>UMT 376</td><td>dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; 참조 : 24</td></tr><tr><td>mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III</td><td></td><td>UMT 422</td><td>dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); 참고: 이 연구</td></tr></tbody></table>

근접 결찰 분석술을 사용하여 c. 예쁜꼬마선에서 리보뉴클레오 단백질 복합어셈블리의 시투 검출

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

단백질 단백질 상호 작용 (PPIs)가 발생하는 시기와 위치를 이해하는 것은 세포에 있는 단백질 기능을 이해하고 발달과 같은 더 넓은 프로세스가 어떻게 영향을 받는지 이해하는 것이 중요합니다. Caenorhabditis 예쁜꼬마선충은 줄기 세포, 남성 분열 및 발달의 조절과 관련된 PPI를 연구하기위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 관심 있는 단백질이 표준 항체에 의해 인식을 위해 태그될 수 있도록 하는 다양한 잘 개발된 기술이 있으며, 이 시스템은 근접 결찰 분석(PLA) 반응에 유리합니다. 그 결과, PLA는 PPI가 다른 접근법보다 더 효과적으로 생식선에서 공간적 및 시간적 방식으로 발생하는 위치를 보여줄 수 있다. 여기서 설명된 것은 C. elegans 생식선에서 PPI를 프로브하기 위한 이 기술의 적용 및 정량화를 위한 프로토콜이다.

둘 다 3xFLAG::DLC-1의 공동 면역 염색; GFP 및 3xFLAG: :DLC-1; OMA-1::국기 및 GFP 항체를 가진 GFP 생식선은 생식선에서 그들의 발현 패턴을밝혔다(그림 3Aii-iii, 3Bii-iii). GFP가 생식선 전체에 걸쳐 발현되었지만(도3Aiii),OMA-1::GFP 발현은 후기 파키텐 및 난모세포(도 3 Biii)로 제한되었다(도3Biii)27. FLAG 면역염색은 3xFLAG::DLC-1이 두 균주에서 생식선 전체에 걸쳐 발현되었다는 것을나타낸다(도 3Aii,3Bii).</st...

이 프로토콜은 C. elegans 생식선에서 의한 체르메게에서 단백질-단백질 상호작용을 조사하기 위한 근접 결찰 분석법의 사용을 입증한다.

근접 결찰 분석술을 사용하여 C. 예쁜꼬마선에서 리보뉴클레오 단백질 복합어셈블리의 시투 검출

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...

근접 결찰 분석법은 사용자가 장소에서 단백질 단백질 상호 작용을 감지할 수 있게 해 주며, 상호 작용의 공간 적 및 시간적 패턴을 드러냅니다. 이 기술은 C.elegans 개발의 규제에 대한 중요한 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 FRET 및 BiFC와 같은 다른 기술의 복잡성 없이 단백질-단백질 상호 작용의 검출을 위한 비교감도를 제공합니다.곤드를 풀어 놓기 위해 벌레를 해부한 적이없는 개인은이 단계로 어려움을 겪을 수 있습니다. 벌레를 해부하는 연습을 하고, PLA로 이동하기 전에 처리 및 해부 기술을 완벽하게 하기 위해 면역 불경을 위해 사용합니다. 우선 30~40마리의 청년 벌레를 1x M9와 레바미솔 500마이크로리터가 들어 있는 시계 유리 접시에 넣으세요.벌레를 수집 한 후, 조심스럽게 제거하고 벌레와 함께 전송되는 박테리아를 제거하기 위해 미디어의 대부분을 폐기. 1x M9과 레바미솔의 신선한 500 마이크로리터를 추가하고 파이펫을 사용하여 부드럽게 잡아서 미디어를 분배하여 벌레를 헹구십시오. 조심스럽게 제거하고 미디어의 대부분을 폐기.2~3회 세척을 반복합니다. 세서히 후, 웜을 약 100마이크로리터의 미디어에 8분 이상 방치하십시오. 유리 또는 폴리에틸렌 파이펫을 사용하여 웜을 001% 폴리 L-리신으로 코팅한 25mm-75mm 현미경 슬라이드로 이송합니다.약 15 마이크로리터의 미디어가 슬라이드에 남아 있도록 초과 미디어를 제거합니다. 여분의 버퍼를 제거하는 것은 해부된 웜과 생식선이 슬라이드를 준수하는지 확인하는 데 중요합니다. 26 1/2 게이지 바늘이있는 해부 현미경에서 한 바늘을 다른 바늘 위에 놓고 끝이 한 쌍의 가위를 형성합니다.이런 식으로 지향 바늘을 사용하여, 배검을 해제하는 인두 뒤에 벌레를 잘라. 5분 이내에 모든 웜을 해부합니다. 모든 벌레가 해부된 후 슬라이드 에 수직이되도록 슬라이드 위에 22mm 에서 40mm 의 커버 슬립을 부드럽게 놓습니다.커버슬립의 끝은 슬라이드를 끊어야 합니다. 건조 얼음에 유지되는 미리 차가운 알루미늄 블록에 슬라이드를 20분 이상 동결하십시오. 차가운 연필을 커버슬립 위에 부드럽게 놓아 얼음 팽창으로 인해 커버슬립이 느슨해지는 것을 방지합니다.고정을 준비하면 연필로 커버립을 튕기고 슬라이드를 1 분 동안 신선하고 차가운 메탄올이 들어있는 항아리에 즉시 담급다. 그런 다음 샘플을 둘러싼 슬라이드의 가장자리를 부드럽게 닦고 실온에서 고정 포름알데히드 150 마이크로 리터를 적용하여 5 분 동안 수정하십시오. 슬라이드를 90도 각도의 수직 으로 종이 타월에 터치하여 고정이 슬라이드에서 벗어나 종이 타월에 흡수되도록 합니다.PBT/BSA의 50 밀리리터와 코플린 항아리에 실온에서 15 분 동안 슬라이드를 두 번 차단합니다. 그런 다음 10%의 일반 염소 세럼이 포함된 PBT/BSA 솔루션으로 슬라이드를 차단합니다. 슬라이드를 둘러싸는 가장자리를 부드럽게 닦고 각 슬라이드에 솔루션의 100 마이크로리터를 적용합니다.그리고 부드럽게 솔루션을 확산하는 데 도움이 슬라이드를 동요. 습한 챔버에서 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오. 슬라이드를 종이 타월에 놓고 용액이 슬라이드에서 벗어날 수 있도록 하고 가장자리를 부드럽게 닦습니다.슬라이드를 차단하려면 블로킹 시약 1방울을 14mm-14mm 공간에 적용합니다. 습한 챔버에서 섭씨 37도에서 1 시간 동안 슬라이드를 배양하십시오. 슬라이드를 종이 타월에 놓고 차단 시약이 슬라이드에서 실행되도록 하고 가장자리를 부드럽게 닦습니다.1 차적인 항체를 희석하기 위하여 항체 희석제를 이용합니다. 슬라이드에 14-14밀리미터 공간당 희석된 1차 항체 용액의 40마이크로리터를 적용합니다. 슬라이드를 습한 챔버에 놓고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 배양하십시오.아침에는 5분 동안 슬라이드를 두 번 씻고, 각 슬라이드는 코플린 항아리의 실온에서 1x 세척 버퍼 A의 50 밀리리터로 세척합니다. 60 rpm으로 설정된 궤도 셰이커에 코플린 항아리를 설정합니다. 슬라이드를 종이 타월에 놓고 세척 버퍼가 슬라이드에서 흘러 나와 가장자리를 부드럽게 닦아냅니다.플러스 및 마이너스 프로브를 포함하는 40 마이크로리터 솔루션을 준비합니다. 각 14-14밀리미터 공간에 솔루션을 추가합니다. 섭씨 37도에서 한 시간 동안 습한 챔버에서 슬라이드를 배양하십시오.코플린 항아리의 실온에서 1x 세척 버퍼 A의 50 밀리리터로 5 분 동안 슬라이드를 두 번 씻으십시오. 60 rpm으로 설정된 궤도 셰이커에 코플린 항아리를 설정합니다. 초순수물로 결찰 버퍼를 1~5개 희석시 희석시다.이 버퍼를 사용하여 리갈아를 1에서 40으로 희석하여 리기션 솔루션의 작업 재고를 준비합니다. 슬라이드를 종이 타월에 놓고 세척 버퍼가 측면을 벗어나고 가장자리를 부드럽게 닦습니다. 각 14-14밀리미터 공간에 40마이크로리터의 리공션 솔루션을 추가합니다.섭씨 37도에서 30분 동안 습한 챔버에서 슬라이드를 배양합니다. 이전에 설명한 대로 슬라이드를 세척하고 건조한 후, 빛으로부터 보호되는 갓 준비된 증폭 용액 40마이크로리터를 각 14-14밀리미터 공간에 추가합니다. 습하고 어두운 챔버에서 슬라이드를 섭씨 37도에서 1시간 40분 동안 배양합니다.슬라이드를 1x 세척 버퍼 B50밀리리터로 각각 10분 동안 두 번 세척하고, 슬라이드의 50 밀리리터로 1분 동안 슬라이드를 세척하고, 슬라이드의 에폭시 코팅 둘레를 건조한 후, 각 샘플에 10 마이크로리터의 장착 미디엄을 추가하고, 중간 크기로 퍼질 수 있도록 10마이크로리터를 1분 동안 세척합니다. 커버슬립의 가장자리를 매니큐어로 페인트하여 커버슬립을 밀봉하고 미끄러질 수 있습니다. 커버슬립을 이동하지 마십시오.매니큐어가 빛으로부터 보호되는 실온에서 적어도 20 분 동안 굳어지게하십시오. FLAG 및 GFP 항체와 세균의 면역 염색은 생식선에서 발현 패턴을 드러냈습니다. GFP는 생식선 전체에 걸쳐 표현되었지만, OMA-1:GFP 발현은 후기 파시텐과 난모세포로 제한되었다.플래그 면역 염색은 3xFLAG:DLC-1이 두 균주에서 세균라인을 통해 발현되었다는 것을 보여줍니다. 세균선에서 PLA 정량화에 대한 관심 영역은 모든 세균의 난모세포를 통해 후기 파시테네를 포괄했다. 이것은 OMA-1 식의 영역입니다.3xFLAG:DLC-1, OMA-1:GFP 세균은 3xFLAG:DLC-1, GFP 생식선에 비해 이 지역 내에서 더 많은 양의 PLA 포시를 갖는 것으로 나타났다. 챔버의 습도를 높이기에 충분한 물이 있는지 확인하십시오. 또한 슬라이드가 챔버 내부의 수준인지 확인하여 시약의 유출을 방지합니다.근접 결찰 분석에 따라 압출 된 생식선은 공초점 현미경으로 이미지화되고 피지, ImageJ 워크플로우를 사용하여 정량화 할 수 있습니다. 이 정량화는 상호 작용이 통계적으로 유의한지 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. PLA를 통해 선충 성 생식선 개발의 중요한 조절기관 간의 시상 상호 작용을 평가할 수 있었습니다.

in-situ-detection-ribonucleoprotein-complex-assembly-c-elegans

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리의 단백질 표현 및 현지화의 postembryonic 규제를 식별할 수 sensitized 방법을...

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans</em

이 동영상은 선충 세포에서 현장 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 근접 결찰 분석에 대해 설명합니다. 관심 단백질의 근접성은 2차 항체에 부착된 PLA 프로브의 도움으로 원형 DNA 템플릿을 생성합니다. 프로브는 긴 단일 가닥 DNA를 생성한 후 검출기 프로브의 혼성화를 생성하는 증폭 용액을 사용하여 추가로 증폭되어 세포 내 단백질-단백질 상호 작용의 국소화를 가능하게 합니다.

In Situ 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 근접 결찰 분석(Proximity Ligation Assay)

이 동영상은 근접 결찰 분석법(PLA)을 사용하여 초파리 신경근 접합부(NMJ)에서 단백질-단백질 상호 작용의 시각화를 보여줍니다. 체벽을 분리한 후 상호 작용하는 단백질을 1차 항체 및 PLA 접합 2차 항체로 조사합니다. 상호 작용하는 단백질의 근접성은 커넥터 올리고뉴클레오티드와 프로브의 결찰을 용이하게 하여 원형 DNA를 형성한 다음 롤링 서클 증폭에 의해 증폭됩니다. 형광 프로브는 증폭된 DNA에 결합하여 NMJ에서 단백질-단백질 상호 작용을 시각화할 수 있습니다.

Detection of Protein-Protein Interactions in Drosophila larvae using a Proximity Ligation Assay(근접 결찰 분석을 사용한 초파리 유충의 단백질-단백질 상호작용 검출)

이 프로토콜은 근접 내고 분석은 초파리 애벌레 신경 근육 접합부에서 현장 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출 할 수있는 방법을 보여줍니다. 이 기술, 디스크 크고 후진타오 - 리 타이 샤오는 시냅스 지역에서 복잡한, 이전에 공동 면역 통해 식별 관계를 형성하기 위해 표시됩니다.

검출 현장에서 단백질 - 단백질 복합체 초파리 애벌레 신경 근육 접합부

우리는 반복적인 염기서열을 관찰하고 정량화하기 위해 예쁜꼬마선충의 생식선과 배아에서 형광 현장 교잡화(FISH)의 간결한 절차를 보고합니다. 우리는 두 가지 다른 반복 서열, 즉 텔로미어 반복과 텔로미어의 대체 연장(TALT) 템플릿을 성공적으로 관찰하고 정량화했습니다.

관측 및 텔로미어의 정량 및 반복 시퀀스 사용하여 형광<em&gt; 현장에서</emPNA 프로브에와&gt; 하이브리드 (FISH)<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

여기, 우리는 고정 된 세포에서 소포체와 미토콘드리아의 내생 적 상호 작용을 시각화하고 고감도로 정량화 할 수있는 절차를 설명합니다. 프로토콜은이 미토콘드리아 관련 막 계면에서 이노시톨에게 1,4,5- 트리 포스페이트 수용체 / 혈당 조절 단백질 75 / 전압 가변 음이온 채널 / 시클로 필린의 D 복합체 타겟팅 시츄 근접 결찰 분석법 최적화 기능.

소포체와 미토콘드리아의 상호 작용의 연구에 의해<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석 고정 세포의

우리는 해부 C.에서 활동 ERK의 공간과 시간 현지화에 대한 면역 형광 이미징 기반의 방법을 제시한다 간스의 생식선. 여기에 설명 된 프로토콜 C. 어떤 시그널링 시각화 또는 구조 단백질을 적용 할 수있다 엘레 생식선은 적절한 항체 시약을 사용할 제공했다.

활성 ERK의 공간 및 시간 분석<em&gt; C. 엘레</em&gt; 생식선

여기에서는 유전 독성 스트레스에 노출 된 현탁 세포 배양 물에서 ATM과 p53 사이의 직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하고 시각화하기 위해 현장에서의 근접 연결 분석 (PLA)이 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다.

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

여기, 우리가 근접 결 찰 분석 결과 (PLA)를 사용 하 여 높은 감도와 고정된 셀에 MST1/MST2 heterodimerization를 시각화 하는 방법을 보여 줍니다.

제자리에 근접 결 찰 분석 결과 사용 하 여 단백질 Isoforms의 Heterodimerization의 검출

D-루프 포획(DLC) 및 D-루프 확장(DLE) 분석은 정량적 PCR과 함께 근접 결찰 원리를 활용하여 사카로마이세스 세레비시아에서 유도성 이중 가닥 절단 부위에서 D-루프 형성, D-루프 확장 및 생성물 형성을 정량화합니다.

사카로마이세스 세레비시아에서 근접 결찰 및 정량적 PCR을 통한 상동 재조합 중간체의 검출

배우세요 근접 결찰 분석술(PLA)을 사용하여 C. elegans 생식선에서 단백질 상호작용을 시눬 검출하는 방법을. 이 기술은 공간적·시간적 패턴을 밝혀 발달 생물학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

근접 결찰 분석술을 사용하여 C. 예쁜꼬마선에서 리보뉴클레오 단백질 복합어셈블리의 시투 검출

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