Name: 인 비보 식세포 분석기를 사용하여 성인 Drosophila 멜라노가스터 혈구의 연령별 식세포 능력 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: 학습하세요 Drosophila melanogaster 성인 혈구의 연령별 식세포 능력 평가 방법입니다. 형광 입자 주입 및 이미징을 통해 개별 세포의 식세포 이벤트를 정량화하고 유전자형 간 변이를 분석할 수 있습니다.

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이 작품은 건강 R03 AG061484-02의 국립 연구소와 자연 및 수학 과학 벡톤 디킨슨 교수 연구 기금의 UMBC 대학에서 보조금에 의해 지원되었다.

<ol><li>Abhyankar, V., Kaduskar, B., Kamat, S. S., Deobagkar, D., Ratnaparkhi, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+DNA%2FRNA+methyltransferase+contributes+to+robust+host+defense+in+ageing+animals+by+regulating+sphingolipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila DNA/RNA methyltransferase contributes to robust host defense in ageing animals by regulating sphingolipid metabolism.</a> The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 22 (2018).</li>
<li>DeVeale, B., Brummel, T., Seroude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+and+aging%3A+the+enemy+within%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Immunity and aging: the enemy within.</a> Aging Cell. 3 (4), 195-208 (2004).</li>
<li>Gomez, C. R., Nomellini, V., Faunce, D. E., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Innate immunity and aging.</a> Experimental Gerontology. 43 (8), 718-728 (2008).</li>
<li>Panda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+innate+immunosenescence%3A+causes+and+consequences+for+immunity+in+old+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human innate immunosenescence: causes and consequences for immunity in old age.</a> Trends in Immunology. 30 (7), 325-333 (2009).</li>
<li>Aw, D., Silva, A. B., Palmer, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosenescence%3A+emerging+challenges+for+an+ageing+population%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunosenescence: emerging challenges for an ageing population.</a> Immunology. 120 (4), 435-446 (2007).</li>
<li>Min, K. -J., Tatar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+molecular+mechanism+of+immunosenescence+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Unraveling the molecular mechanism of immunosenescence in Drosophila.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), 2472(2018).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+on+the+fly%3A+a+primer+on+the+Drosophila+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system.</a> Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).</li>
<li>Banerjee, U., Girard, J. R., Goins, L. M., Spratford, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+genetic+model+for+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a genetic model for hematopoiesis.</a> Genetics. 211 (2), 367-417 (2019).</li>
<li>Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+phagocytosis+and+identification+of+a+Drosophila+receptor+for+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli.</a> Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).</li>
<li>Garschall, K., Flatt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interplay+between+immunity+and+aging+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">The interplay between immunity and aging in Drosophila.</a> F1000Research. 7, (2018).</li>
<li>Brennan, C. A., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%3A+The+genetics+of+innate+immune+recognition+and+response%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Drosophila: The genetics of innate immune recognition and response.</a> Annual Review of Immunology. 22 (1), 457-483 (2004).</li>
<li>Rosales, C., Uribe-Querol, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+a+fundamental+process+in+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: a fundamental process in immunity.</a> BioMed Research International. 9042851, Research article (2017).</li>
<li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+going+through+the+acid+test%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (10), 781-795 (2008).</li>
<li>Stuart, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systems+biology+analysis+of+the+Drosophila+phagosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A systems biology analysis of the Drosophila phagosome.</a> Nature. 445 (7123), 95-101 (2007).</li>
<li>Mackenzie, D. K., Bussière, L. F., Tinsley, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence+of+the+cellular+immune+response+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Senescence of the cellular immune response in Drosophila melanogaster.</a> Experimental Gerontology. 46 (11), 853-859 (2011).</li>
<li>Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+ability+declines+with+age+in+adult+Drosophila+hemocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes.</a> Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).</li>
<li>Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+the+cellular+and+humoral+immune+responses+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila.</a> Current Biology. 10 (13), 781-784 (2000).</li>
<li>Garg, A., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Rab14+mediates+phagocytosis+in+the+immune+response+to+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).</li>
<li>Bloomington Drosophila Stock Center: Indiana University Bloomington. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/innformation/recipes/molassesfood.html">https://bdsc.indiana.edu/innformation/recipes/molassesfood.html</a> (2019).</li>
<li>Fellous, S., Lazzaro, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+food+quality+affects+adult+%28but+not+larval%29+immune+gene+expression+independent+of+effects+on+general+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Larval food quality affects adult (but not larval) immune gene expression independent of effects on general condition.</a> Molecular Ecology. 19 (7), 1462-1468 (2010).</li>
<li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemese%2C+a+hemocyte-specific+transmembrane+protein%2C+affects+the+cellular+immune+response+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2622-2627 (2003).</li>
<li>Goto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+haemocyte-specific+protein%2C+hemolectin%2C+similar+to+human+von+Willebrand+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">A Drosophila haemocyte-specific protein, hemolectin, similar to human von Willebrand factor.</a> Biochemical Journal. 359, Pt 1 99-108 (2001).</li>
<li>Cevik, D., Acker, M., Michalski, C., Jacobs, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericardin%2C+a+Drosophila+collagen%2C+facilitates+accumulation+of+hemocytes+at+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Pericardin, a Drosophila collagen, facilitates accumulation of hemocytes at the heart.</a> Developmental Biology. 454 (1), 52-65 (2019).</li>
<li>Ghosh, S., Mandal, S., Mandal, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+proliferation+of+adult+hemocytes+in+Drosophila+by+BrdU+incorporation+and+PH3+expression+in+response+to+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Wellcome+Open+Research%22%5BJournal%5D)">Detecting proliferation of adult hemocytes in Drosophila by BrdU incorporation and PH3 expression in response to bacterial infection.</a> Wellcome Open Research. 3, (2018).</li>
<li>Hao, Y., Yu, S., Luo, F., Jin, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jumu+is+required+for+circulating+hemocyte+differentiation+and+phagocytosis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">Jumu is required for circulating hemocyte differentiation and phagocytosis in Drosophila.</a> Cell Communication and Signaling. 16 (1), 95(2018).</li>
<li>Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+blood+cell+populations+of+the+Drosophila+melanogaster+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assaying blood cell populations of the Drosophila melanogaster larva.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).</li>
<li>Gyoergy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+allowing+independent+visualization+and+genetic+manipulation+of+Drosophila+melanogaster+macrophages+and+surrounding+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tools allowing independent visualization and genetic manipulation of Drosophila melanogaster macrophages and surrounding Tissues.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (3), 845-857 (2018).</li>
<li>Bosch, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+cells+of+adult+Drosophila+do+not+expand%2C+but+control+survival+after+bacterial+infection+by+induction+of+Drosocin+around+their+reservoir+at+the+respiratory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Blood cells of adult Drosophila do not expand, but control survival after bacterial infection by induction of Drosocin around their reservoir at the respiratory epithelia.</a> BioRxiv. 578864, (2019).</li>
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저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기에 설명된 프로토콜은 통제된 실험 조건하에서 phagocytosis의 다른 양상을 정량화하는 신뢰할 수 있는 방법입니다. 우리는 그램 음성 세균 성 입자와 이 절차를 테스트 하 고 결과 그램 긍정적인 세균 성 입자를 사용 하는 경우 다를 수 있습니다. 실제로, 다른 실험 조건에서 그램 음성 및 그램 양성 박테리아모두에 phagocytic 반응을 비교 하는 것이 재미있을 것 이다. 나노 인젝터를 사용하면 사출 량을 정밀하게 제어할 수 있으므로 각 플라이에 동일한 양의 입자가 주입됩니다. 프로토콜에 대한 한 가지 제한은 파티클 준비의 불일치에서 비롯됩니다. 입자가 얼어 나면 집계되므로 희석 볼륨의 작은 변화 또는 소용돌이 부족이 실험 간의 입자 농도에 영향을 줄 수 있습니다. 연령 간 입자 농도의 가능한 변화를 최소화하기 위해 동일한 바늘과 입자 용액을 사용하여 같은 날 1 주 및 5 주 된 파리를 주입하는 것이 좋습니다. 또 다른 잠재적인 단점은 해부 중에 핀을 제대로 처리하지 않으면 등산 용기 및/또는 큐티클이 쉽게 손상될 수 있다는 것입니다. 등대 용기의 방해를 피하기 위해 해부당 사용되는 핀 수를 최소화합니다. 이 해부 방법의 장점은 모든 고정, 세척 및 염색 단계가 해부 플레이트에서 수행 될 수 있다는 것입니다. 큐티클이 고정되어 있기 때문에 단계 사이에 큐티클이 손실되는 것을 방지합니다.
기존방법(18),19,,25,,26,,27,,28, 29에,29비해, 기재된 프로토콜은 그 장점과 한계를 갖는다. 등쪽 용기를 해부함으로써, 우리는 이 위치에서 개별 혈구를 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 이것은 실험 단 사이 phagocytic 활동에 있는 미묘한 변이를 검출하는 가능하게 합니다. ,다른 방법은,, 출혈/긁힘 분석19,25, 26,,27,또는 그대로 복부 큐티클(18,19,,1928,29)을통해 혈류세포를 수집하여 형광성 표기28입자를시각화한다.26 그러나, 개별 혈구는 등구 를 통해 시각화될 때 평가될 수 없습니다. 이 프로토콜의 장점은, 출혈/긁힘 방법과 비교할 때 우리의 방법은 우리가 등쪽 용기와 관련된 그 혈구만 평가할 수 있고, 순환 세포 또는 신체 벽을 따라 그 를 고려한다는 것입니다, 이는 기능적으로 다를 수 있습니다. 등쪽 용기를 해부하면 Trypan Blue19,,26과같은 형광 열반이있는 두 번째 주사를 포함 할 필요가 없습니다. 이는 셀에 얽매이지 않거나 셀에 얽매이지 않는 입자가 세척 단계에서 씻겨 나기 때문입니다. 반대로, 대체 메서드는 해부를 필요로 하지 않기 때문에 수행하기 쉬울 수 있습니다. 등쪽 용기를 해부하는 것은 배우기 쉽지만, 이 단계는 일부 실험 설계에서 실현 가능하지 않을 수 있는 복잡성수준을 추가합니다.
생체 내 식세포 분석에서 이의 설명된 사용은 서로 다른 연령 사이의 phagocytic 사건을 평가하고 정량화하는 것이지만, 이 프로토콜은 매우 적응력이 뛰어나며 유전자형, 성별 또는 조직 유형 사이의 phagocytosis의 다른 측면을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. phagocytosis대부분의 다세포 동물에 대 한 중앙 중요성되 고, 나이와 함께이 과정 감소 하는 방법을 이해 노화 인구에 대 한 더 나은 치료 치료로 이어질 수 있습니다. 이 접근법은 phagocytosis에 특별한 초점으로 면역 반응에 있는 나이 관련 변경의 양상을 해명하기 위한 장기 적인 잠재력을 제공합니다.

감염뿐만 아니라 세포 성분에 대한 물리적 및 화학적 장벽으로 구성된 타고난 면역 체계는 다세포 유기체1,,2에걸쳐 진화적으로 보존된다. 방어의 첫 번째 선으로, 타고난 면역 계통은 모든,동물1,2,23에있는 침략병원체를 퇴치에 있는 중요한 역할을 합니다. 선천성 면역 반응의 성분은 특이성 및 면역학적2기억2, 3,3,4가부족하다는 이유로 분류되는 광범위한 세포 유형을 포함한다. 인간에서, 이 세포 모형은 phagocytic 단핵세포 및 대식세포, 호중구 및 세포독성 자연 살인자 세포4,,5를포함합니다. 기능성 면역 계통이 호스트 생존을 위해 필수적이지만, 면역 세포의 기능이 나이가 들면서 감소하는 것이 분명하며, 면역 노화5,,6로알려진 현상이 분명하다. phagocytosis의 프로세스의 다른 양상을 포함하여 면역 반응에 있는 나이 관련 변경을 평가할 수 있다는 것은, 면역 노화의 우리의 이해에 도움이 될 수 있었습니다. 우리가 여기에서 설명하는 절차는 Drosophila melanogaster에 있는 혈투세포에 의하여 phagocytic 사건을 평가하고 정량화하기 위하여 효과적이고 반복가능한 접근법을 제공합니다.
Drosophila는 여러 가지 이유로 면역 반응을 공부하기위한 이상적인 모델입니다. 하나에 대 한, 조직 의존 방식으로 유전자 발현을 쉽게 조작 할 수 있도록 사용할 수 있는 유전 도구의 광범위 한 세트가 있다7. 이러한 도구에는 돌연변이체, RNA 간섭 주식, GAL4/UAS 주식 및 전체 게놈 서열이 분류된 205개의 서로 다른 근친선이 포함된 Drosophila 유전자 참조 패널의 컬렉션이 포함됩니다8. Drosophila의 짧은 수명 주기및 생산된 개별의 다수는 연구원이 통제된 환경에서, 시간의 짧은 기간에 있는 다중 개별을 시험하는 것을 허용합니다. 이것은 크게 유전자형 중 감염에 면역 반응에 미묘한 차이를 식별하는 능력을 향상, 남녀 사이 또는 나이에 걸쳐. 중요하게도, 많은 유전 성분과 충혈증을 포함한 타고난 면역 반응의 기능은 드로소필라와 포유동물1,,2사이에서 진화적으로 보존된다.
Drosophila에서, 감염을 따르는 phagocytosis의 과정은 포유류 대식세포9에해당하는 혈장 세포에게 불린 phagocytic 혈구에 의해 수행됩니다. 혈청세포는 광범위한 입자를 인식하고 미생물 병원균9,10,,11,,,12,,13을클리어하는 데 필수적이다. 이들 세포는 자기로부터 자아를 분화해야 하는 다양한 수용체를 발현하고,,,10,11,,12,13,,14,,15를수행하는 데 필요한 신호 이벤트를 개시한다. 일단 입자가 결합되면, 입자 주위로 팽창하는 플라즈마 멤브레인의 액틴 사이토골격의 재구성 및 리모델링에 의해 내면화되기 시작하여, 식세포컵(11,12,,13,14)을형성한다.,, 이 과정에서, 신호의 또 다른 세트는 파고세포 컵을 닫음으로써 입자를 더 내면화하도록 세포에 지시하고, 막 경계식섬(11,,12,,13,,14,15)을15형성한다. 그런 다음 phagosome은 다른 단백질과 연결되고 리소좀과 융합하여 산성 성 식질11,12,,,13,,14,,15를형성하여 성숙 과정을 겪습니다. 이 시점에서 입자는 효율적으로 분해되고11,,12,,13,,14,,15를제거할 수 있다. Drosophila 연구 결과는 오래된 파리 (4 주)가 더 젊은 파리에 비해 감염을 취소하는 감소 된 능력을 가지고 있음을 밝혔다 (1 주 오래), 가능성이 적어도 부분적으로, phagocytosis의 일부 양상에서감소16,,17.
여기서 설명한 방법은 2개의 별도 형광 표시 열 사멸 한 대장균 입자, 표준 형광소를 베어링 하나 및 pH 민감하나, phagocytosis의 두 가지 다른 측면을 평가하기 위해 활용: 입자의 초기 침몰, 그리고 phagolysososome에서 입자의 분해. 이 분석에서, 형광 입자형광은 입자가 혈구에 의해 결합되고 침몰할 때 관찰할 수 있으며, pH 민감한 입자는 파고종의 낮은 pH 조건에서만 형광을 한다. 형광 이벤트는 그 때 등류 혈관을 따라 현지화하는 혈구에서 관찰될 수 있습니다. 우리는 세균 성 통관에 기여하는 것으로 알려진 혈구를 찾고 일관되게 분리하는 해부학적 랜드 마크를 제공하는 등등 용기에 국한 된 혈구에 초점을 맞추고 있습니다. 그러나, 신체의 다른 부분에서 혈청과 혈청은 또한 정리에 대 한 중요 한. 비록 우리가 이 세포 인구를 공부하지 않더라도, 우리의 일반적인 절차는 또한 이 세포의 phagocytic 분석에 적용될 수 있었습니다. 우리의 접근 방식의 한 가지 장점은 우리가 식세포 프로세스에 있는 미묘한 변이를 검출하는 것을 허용하는 개별 혈구 내의 phagocytic 사건을 정량화할 수 있다는 것입니다. 18,19를 통해 형광 이벤트를18시각화하는 다른 연구는17세에따라 총 혈구 수가 변경될 것으로 예상되는 우리의 경우 고려해야 할 중요한 혈구 수의 차이를 고려하지 않는다.

<table><tbody><tr><td>0.10 mm 곤충 핀</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>여기: 핀을 반으로 자르고 날카로운 끝을 사용합니다</td></tr><tr><td>1 mL 멸균 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td>바늘을 로드하기 위해 미네랄 오일로 채워짐</td></tr><tr><td>15% 태아 소 혈청(FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>해부 매체용</td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td>EM 등급, 4% 작동, 1X PBS에 희석</td></tr><tr><td>1x 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Trasnfer Pipet</td><td>Falcon</td><td>357524</td><td></td></tr><tr><td>3.5" 유리 모세혈</td>관 <td>Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td>1.14mm O.D X 3.5" 길이 X 0.53" I.D</td></tr><tr><td>35x10 mm 페트리 접시</td><td>Becton Dickinson</td><td>351008</td><td>해부 플레이트로 사용되며 절반을 채웁니다. Sylgard</td></tr><tr><td>6x 페니실린/스트렙토마이신</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>해부 매체</td></tr><tr><td>70% 글리세롤</td><td>시그마</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>아날로그 와류 믹서</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>생물학적 포인트 겸자, Dumont No. 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐린돌)</td><td>생명 기술</td><td>D1306</td><td>1x PBST</td></tr><tr><td>초파리 균주</td><td></td><td></td><td>w[*]에서 1:1000 희석; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8</td></tr><tr><td>E. coli (K-12 strain) BioParticles;, Alexa Fluor&trade; 594 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>E23370</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Premiere</td><td>D17026102</td><td></td></tr><tr><td>Live cell imaging solution</td><td>Life Technologies</td><td>A14291DJ</td><td>입자 준비 및 희석을 위한 선호되는 완충액</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Mpbio</td><td></td><td></td>194836</tr><tr><td>Nanoject II 자동 나노리터 주입기</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>좁은 폴리스티렌 슈퍼 벌크 초파리 바이알</td><td>Genesee</td><td>32-116SB</td><td>크기: 25 X 95 mm</td></tr><tr><td>너트 믹서</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-043</td><td>사용 속도: 20 rpm</td></tr><tr><td>pHrodo&trade; 레드 대장균 BioParticles&trade; Phagocytosis</td><td>Life Technologies</td><td>P35361</td><td></td></tr><tr><td>Schneider's Drosophila 세포 배양 매체 (1x)</td><td>Gibco</td><td>21720-024</td><td>해부 매체, 결합: Schneiders, FBS 및 펜/연쇄상구균; 필터 살균</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>2mM (또는 20%) 작동</td></tr><tr><td>스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머</td><td>전자 현미경 과학</td><td>24236-10</td><td>제공된 프로토콜</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td>에 따라 준비 <td>PBS + 0.1%</td></tr><tr><td>트윈 수직 피펫 풀러 모델 700C</td><td>David Kopf Instruments</td><td>812368</td><td>히터: 55? 솔레노이드: 45</td></tr><tr><td>Zeiss AxioImager.Z1 형광 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Here: Zeiss Zen 이미징 소프트웨어를 사용한 Apotome 구조 간섭 시스템</td></tr></tbody></table>

인 비보 식세포 분석기를 사용하여 성인 drosophila 멜라노가스터 혈구의 연령별 식세포 능력 평가

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

식세포증은 타고난 면역 반응의 필수적인 기능입니다. 이 과정은 광범위한 입자를 인식하고 미생물 병원균을 파괴하는 기본 기능이 있는 식세포 혈구에 의해 수행됩니다. 유기체가 나이로, 이 과정은 쇠퇴하기 시작하지만, 면역 노화의 근본적인 기계장치 또는 유전적 기초에 관하여 거의 알려지지 않습니다. 여기서, 생체 내 식세포 분석체에 기초한 주사는 성자 Drosophila의 Drosophila 혈청세포에서 의식세포 이벤트를 정량화함으로써, 내화된 입자의 결합, 침몰 및 저하와 같은 phagocytosis의 다양한 양상에서 연령 관련 변화를 평가하는 데 사용됩니다. 하나에 대 한, 많은 유전 구성 요소 및 타고난 면역 반응의 기능, phagocytosis를 포함 하 여, 진화 드로 소 필라와 포유류 사이 보존. 그 때문에, 이 프로토콜을 사용하여 얻은 결과는 다양한 유기체에서 면역 기능에 있는 나이 관련 변경을 이해하는 것과 널리 관련이 있을 가능성이 높습니다. 또한,이 방법은 다양한 연구 주제에 유용 할 수있는 혈낭 세포 세포의 정량적 추정을 제공하며 노화 연구에 국한 될 필요가 없습니다.

설명된 주입 방법을 설명하기 위해 도 1A는 드로소필라 멜라노가스터상에 대한 주사 부위를 보여주고, 식품 염료가 어떻게 플라이가 주입되었다는 시각적 확인을 허용하는가(도1B). 식품 염료의 첨가는 또한 막힌 바늘의 인식에 도움이됩니다. 주사는 복부에서 수행 될 수 있습니다., 하지만 실험에 걸쳐 일관 된 주입 사이트를 유지. 이렇게 하면 각 실험 간의 가능한 변형을 최소화할 수 있습니다.
등불 혈관을 따라 상주 혈청 내의 형광성 입자를 시각화하기 위해 등불 용기와 부착 된 복부 표피를 해부했습니다. 그림 2A-F는 해부 메서드를 간략하게 설명합니다.
식세포증을 수행하기 위해 젊고 숙성된 파리의 연령별 능력을 평가하기 위해 등류 혈관을 따라 혈청이 형광 현미경을 사용하여 시각화됩니다. 등쪽 혈관을 따라 세포만 계산되도록 하기 위해, 헤메스와 헤몰렉틴, 또는 페리카르딘(도3)과같은 특정 혈액 세포 마커 또는 심장 특이적 콜라겐에 대한 항체 또는 GFP 태그 유전자를 각각22,,23,24로사용할 수 있다., 형광으로 표지된 대장균 입자는 길이가 1mm이고, 혈구는 직경17mm이다. DAPI 양성 핵을 중심으로 10mm 직경 내에 위치한 형광 이벤트만계산됩니다(그림 4). 형광 이벤트를 정량화하기 위해 ImageJ 소프트웨어가 사용됩니다(그림5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig1.jpg"> 그림 1: 사출 사이트 및 시각적 검증. (A)흉부의 측면은 모세관 바늘로 관통된다. (B)주사는 입자 용액에 녹색 식품 염료를 추가하여 시각적으로 확인됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig2.jpg"> 그림 2: 등쪽 용기 해부. (A)핀은 흉부와 후방 복부 (검은 화살)에 배치됩니다. (B-C) 두 개의 수평 절개 (녹색 화살표)는 복부(B)및 전방 끝(C)의후면 끝에서 만들어집니다. (D)수직 절개(녹색 화살표)는 복부의 중간아래로 만들어 두 개의 수평 컷을 연결한다. (E)선택적 핀(*)은 복강을 열어 내부 조직을 노출하는 데 사용됩니다. (F)내부 조직(작물, 창자, 자궁, 난소, 지방체)이 제거되어 등뼈 혈관을 노출시합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig3.jpg"> 도 3: pH 민감입자를 주입한 5주된 여성으로부터 해부된 등쪽 용기의 복부선보기( A)를대상으로 항체로염색하였다. 점선 흰색 선은 전방 영역을 가리키는 화살표와 함께 등쪽 용기의 측면윤곽을 가리킨다. (B)확대 된 이미지(A)- 동막 용기의 첫 번째 대동맥 챔버 내에서 박테리아를 적극적으로 분해한 혈중 세포 (파란색 화살표)의 클러스터. (C)(A)콜라겐과 같은 단백질인 페리카르딘(Green arrow)의 확대 된 이미지는 등쪽 혈관을 제자리에 고정시키는24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig4.jpg"> 도 4: pH 민감한 입자 또는 불소 입자로 주입된 암컷 플라이로부터 해부된 등쪽 용기 및 관련 혈전. (A)등쪽 용기 및 관련 혈구와 관련된 혈구는 pH 민감 라벨E. 대장균 입자(빨강), 또는(E)불소 라벨이 부착된 대장균 입자(빨강), 1주일B,F된 비행으로부터 분리된 후 60분 동안 회수한후(A)및(E)(흰 상자)의 매율증을 각각 2개나 증식하였다. (C)등쪽 용기 및 관련 혈구와 관련된 혈구는 pH 민감 라벨E. 대장균 입자(빨강), 또는 (G)불소 라벨이 부착된 대장균 입자(빨강), 5주D,H된 비행으로부터 분리된 후 60분 동안 회수한후(C)및(G) 및 (G)개별 적인 매립을 각각 2개( G)로 증식하고 있다. 점선 흰색 선은 전방 영역을 가리키는 화살표와 함께 등쪽 용기의 측면윤곽을 가리킨다. 핵은 DAPI (파란색)로 염색. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig5.jpg"> 그림 5: ImageJ에서 셀 카운터를 사용하여 10mm 혈구 내에서 식세포 이벤트를 정량화합니다. (A)ImageJ에서 이미지를 열면 셀 카운터 공지 도구를 사용하여 셀당 식세포 이벤트를 추적할 수 있습니다. (B)이 도구는 계산하도록 선택된 각 셀에 다른 색상을 할당하며, 각 점은 해당 셀 내의 형광 이벤트에해당한다. 'alt+y'를 누르면 셀당 계산된 이벤트 수를 보여주는 테이블이 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 소아 세포토균에 젊고 숙성된 Drosophila 멜라노가스터 혈구세포의 능력을 평가하고 정량화하는 데 사용되는 phagocytosis의 생체 내 분석방법을설명합니다.

인 비보 식세포 분석기를 사용하여 성인 Drosophila 멜라노가스터 혈구의 연령별 식세포 능력 평가

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

당사의 프로토콜은 혈청에서 phagocytic 이벤트를 평가하고 정량화하기 위한 효과적이고 반복가능한 접근 방식을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 개별 혈청 세포 내에서 phagocytic 이벤트를 정량화할 수 있어 개별 파리의 유전자형 중 식세포 과정의 변화를 감지할 수 있다는 것입니다. 해부를 수행하는 것은 어려울 수 있으므로 이 기술을 처음 수행 할 때 전체 절차를 수행하기 전에 가능한 한 많은 해부를 연습하십시오.먼저 주사를 위해 유리 바늘을 준비합니다. 1mm 주사기를 미네랄 오일로 채우고 나노 인젝터와 함께 제공되는 30 게이지 피하 바늘을 부착합니다. 30 게이지 바늘을 뽑아낸 모세관 바늘의 무딘 끝에 삽입하여 미네랄 오일로 채웁니다.기포가 형성되지 않도록 30 게이지 바늘을 천천히 제거합니다. 콜릿을 제거하고 밀봉된 O 링에 들여쓰기를 향하게 합니다. 더 큰 O-링을 금속 플런저에 붙인 다음 조임 없이 콜릿을 다시 부착합니다.금속 플런저를 오일로 채워진 유리 바늘의 무딘 끝에 삽입하고 부드럽게 더 큰 O 링에 삽입아래로 밀어 넣습니다. 그런 다음 콜릿을 고정할 때까지 조입니다. 플루오로 또는 pH에 민감한 입자로 바늘을 채운 후 흉부의 스테인럴 플레이트에 파리를 주입하십시오.녹색 염료가 즉석로 들어가면 주사가 성공합니다. 주입 된 파리를 새로운 음식 유리병에 넣고 첫 번째와 마지막 비행이 주입 된 시간을 지적합니다. 모든 파리가 회복될 때까지 유리병을 옆에 놓아 음식에 갇히지 않도록 하십시오.해부 스테레오 현미경 아래 플라이 복부 측면을 오리엔팅합니다. 그런 다음 흉부에 곤충 핀을 삽입하고 생식기 근처의 복부의 가장 후방 끝을 통해 다른 것을 삽입하십시오. 모든 파리가 고정되면 전송 파이프를 사용하여 파리를 덮을 충분한 해부 미디어를 추가하십시오.큐티클 가위로 머리를 제거하고 복부의 후방 핀 바로 위에 수평 절개를 한 다음 복부의 가장 앞쪽 끝에 있는 다른 쪽을 만듭니다. 복강을 여는 두 개의 수평 절개를 연결하는 수직 절개를 합니다. 집게를 사용하여 내부 장기와 조직을 제거하여 등불 혈관을 피하십시오.필요한 경우 추가 핀을 사용하여 큐티클의 절단 끝을 고정합니다. 그런 다음 큐티클 가위로 흉부를 제거합니다. 해부 매체를 폐기하고 4%의 PFA의 1밀리리터로 대체하여 해부를 가능한 한 빛으로부터 보호합니다.20 rpm에서 흔들면서 실온에서 15 분 동안 해부를 수정하십시오. 그런 다음 고정을 제거하고 1X PBST의 1 밀리리터를 추가합니다. 원하는 경우, 항체와 해부를 얼룩.현미경 슬라이드에 큐티클을 장착 한 후, 그들을 복부 측면을 방향을 구성하기 위해 집게를 사용하고 등쪽 용기가 보이는지 확인합니다. 젊고 숙성된 파리는 등대 혈관을 따라 혈구의 형광 화상 진찰에 의해 phagocytosis를 실행하는 연령 특정 능력에 대해 평가되었습니다. 페리카르딘에 대한 항체는 등대 혈관을 따라 세포만 계산되도록 하기 위해 사용되었다.형광 표지E.coli 입자는 길이가 1 마이크로미터이고 혈구는 직경이 10 마이크로미터이기 때문에 DAPI 양성 핵을 중심으로 한 10 마이크로미터 직경 내에서 형광 이벤트만 계산되었습니다. ImageJ 소프트웨어는 이벤트를 정량화하는 데 사용되었습니다. 이 절차를 시도할 때, 비행이 실제로 주입되었다는 것을 시각화하고 타이밍이 중요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.적시에 주사와 해부를 완료하면 식세포 속도의 실험 적 오류 및 가능한 변화를 최소화하는 데 도움이됩니다. 이 기술은 연구원이 성공적인 면역 반응 도중 AMP 생산에서 세포 면역, 혈액 세포의 다른 인구 또는 구별하는 phagocytosis에 관하여 질문을 포함하여 다양한 연구 주제를 탐구하는 것을 허용할 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

초파리 혈림프는 혈액과 간질액의 역할을 하며 유충과 성충 단계에서 몸 전체를 순환합니다. 이 비디오는 순환 세포를 정량화하기 위해 유충 혈림프를 수집하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

큐티클 파괴: 초파리 유충에서 혈림프를 수집하는 방법

이 비디오는 Drosophila melanogaster의 균질화된 배아 세포에서 세포사멸 세포 삼킴을 시각화하는 면역염색 기술을 보여줍니다. 이 방법은 자가사멸 세포 삼킴의 정도를 결정하여 세포 생리학에 대한 통찰력을 제공합니다.

Phagocytosis Assay: Drosophila melanogaster의 배아 세포에서 세포사멸 세포 삼킴을 시각화하는 면역염색 기술

이 비디오는 성체 초파리 파리의 세균성 식세포작용을 측정하기 위해 고안된 생체 내 분석을 보여줍니다. 성충 파리의 복부에 형광 표지된 박테리아를 주입한 후, 등쪽 혈관과 관련된 혈구는 식세포작용에 관여합니다. 트리판 블루 염료의 도입은 세포외, 비식세포작용 박테리아가 방출하는 형광을 소멸시키는 역할을 합니다. 이 담금질 과정은 형광 현미경으로 관찰할 때 식세포작용 박테리아의 식별을 향상시킵니다.

성체 초파리 파리에서 박테리아 식세포작용을 정량화하기 위한 In Vivo 분석

초파리 혈액 세포 또는 혈구는 거주 부위와 순환 사이를 순환합니다.  유충에서 상주(고착성) 혈구는 유도성 미세환경인 Hematopoietic Pockets에 국한되는 반면, 순환하는 혈구는 혈림프에서 자유롭게 움직입니다. 이 프로토콜의 목표는 행동적으로 다르지만 상호 변화하는 이 두 가지 혈구 집단의 표준화된 분리 및 정량화입니다.

의 시금 혈액 세포 집단<em&gt; 초파리</em&gt; 유충

초파리와 포유류의 조혈 시스템은 조혈을 연구하기 위해 초파리에게 매력적인 유전 적 모델을 만들고, 많은 일반적인 기능을 공유 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 면역 조직 화학의 주요 애벌레 조혈 기관의 해부 및 장착을 보여줍니다. 우리는 또한 순환 혈구 세포와 고착 결정 세포 등 다양한 애벌레 조혈 구획을 분석하는 방법을 설명합니다.

방법은 림프 글 랜드와 혈구 세포에서를 검사합니다<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

우리는 여기에 Drosophila 의 분산 배아 세포를 사용하여 식균 작용 분석을 설명합니다. 그것은 우리가 생체 내 식균 작용 수준을 쉽고 정확하게 정량화 할 수있게하며, 세포 사멸 세포의 식균 작용에 필요한 새로운 분자를 확인합니다.

에있는 Apoptotic 세포를위한 Phagocytosis 검정 Drosophila 태아

이 메서드는 3 차원 (3D) 모델 곤충 세포로 병원 체 침입을 시각화 하는 방법을 보여 줍니다. 초파리 애벌레에서 hemocytes 바이러스 성 또는 세균성 병원 체, ex vivo 또는 vivo에서감염 되었습니다. 감염 된 hemocytes 다음 고정 되었고 confocal 현미경 및 후속 3D 셀룰러 재건 이미징 스테인드.

미생물 감염 및 분석에 대 한 초파리 melanogaster 애벌레에서 Hemocytes의 추출

이 프로토콜에서는 성인 초파리 melanogaster 식 인식 및 미생물 감염의 계량에서 vivo에서 먹어서 분석 결과를 설명 합니다.

과일 파리, 초파리 melanogaster에 비보 먹어서 분석 결과 사용 하 여의 세포 면역 반응 평가

이 프로토콜은 배아에서 성인에 이르기까지 모든 발달 단계에서 Drosophila의 생존 가능성을 평가하기 위해 고안되었습니다. 이 방법은 상이한 유전자형 또는 성장 조건의 생존 가능성을 결정하고 비교하는 데 사용될 수 있다.

초적혈구 멜라노가스터의생존능력을 배아에서 성인으로 평가하는 직접적이고 간단한 방법

학습하세요 Drosophila melanogaster 성인 혈구의 연령별 식세포 능력 평가 방법입니다. 형광 입자 주입 및 이미징을 통해 개별 세포의 식세포 이벤트를 정량화하고 유전자형 간 변이를 분석할 수 있습니다.

인 비보 식세포 분석기를 사용하여 성인 Drosophila 멜라노가스터 혈구의 연령별 식세포 능력 평가

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