Name: 뇌 슬라이스와 기본 세포 배양에서 피라미드 뉴런의 탄도 라벨링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 학습하세요 쥐 뇌 슬라이스와 기본 세포 배양에서 피라미드 뉴런의 탄도 라벨링 방법을. 고급 재구성 소프트웨어를 활용하여 수상돌기 가시 형태를 정량 분석하고 신경인지 기능 장애의 기전을 규명합니다.

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이 작품은 NIH 보조금 HD043680, MH106392, DA013137 및 NS100624에 의해 지원되었다.

모든 동물 프로토콜은 사우스 캐롤라이나 대학의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다 (연방 보증 번호 : D16-00028).
1. DiI / 텅스텐 비드 튜브 의 준비
<ol><li>100 mg의 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 ddH2O. 소용돌이 로 10 mL로 가볍게 용해시고 PVP 용액을 가볍게 녹입니다.</li>
	<li>PVP 용액으로 튜브를 채우고 (재료 표참조) 20 분 동안 둡니다. 이어서, 10 mL 주사기를 사용하여 배관의 다른 쪽 끝을 통해 PVP 용액을 추방한다.</li>
	<li>170 mg의 텅스텐 마이크로 캐리어 비드와 250 μL의 메틸렌 염화물을 결합합니다. 텅스텐 비드 현탁액을 철저히 소용돌이.</li>
	<li>6 mg의 친유성 DilC18(3) 염료와 300 μL의 메틸렌 염화물을 섞습니다. 와류 딜C18 (3) 염료 용액을 철저히. 참고: 연기 후드에서 1.3-1.4 단계를 수행합니다.</li>
	<li>텅스텐 비드 현탁액의 피펫 250 μL을 유리 슬라이드 상에. 서스펜션이 공기 건조될 때까지 기다립니다(~3분).</li>
	<li>텅스텐 비드 서스펜션 층 의 상단에 DilC18 (3) 염료 용액 의 300 μL을 추가합니다. DiIC18(3) 염료 용액과 텅스텐 비드 현탁액을 파이펫 팁과 철저히 혼합하고 혼합물을 공기 건조 (~ 3 분)에 허용하십시오.</li>
	<li>일단 건조, 두 개의 1.5 mL 원심 분리튜브로 혼합물을 분할 면도날을 사용 하 여. 튜브를 물로 채웁니다.</li>
	<li>수조에서 초음파 처리 (앰프 I, 100 %) 균질(~5분)까지. 초음파 처리기의 끝이 비드 현탁액이있는 튜브에 직접 놓여 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>균질화된 혼합물 2개 1.5 mL을 15 mL 원엽 튜브에 결합합니다. 혼합물을 3분 더 소성시합니다.</li>
	<li>텅스텐 비드-DilC18(3) 염료 혼합물을 10 mL 주사기를 사용하여 PVP 코팅 튜브에 넣습니다. 튜빙을 준비 스테이션에 공급합니다(재료 표참조).</li>
	<li>준비 스테이션에서 1분 동안 회전합니다. 10 mL 주사기를 사용하여 튜브에서 모든 물을 조심스럽게 제거하십시오.</li>
	<li>질소 가스를 켜고 질소 흐름을 분당 약 0.5 리터 (LPM)로 조정하고 준비 스테이션에서 튜브를 회전시키고 질소로 30 분 동안 건조시십시오.</li>
	<li>준비 스테이션에서 튜브를 제거하고 튜브 커터를 사용하여 13mm 길이(카트리지의 로딩 크기와 일치)로 자른다. 13mm 길이를 암흑 에 있는 반짝이 바이알에 보관하십시오.</li>
</ol>2. 뇌 섹션의 준비
참고: 성인 남성 F344/N 쥐 는 음식과 물에 광고 리비툼 액세스와 12/12 빛:어두운 주기에서 통제 된 환경에서 보관 했다. 모든 동물은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대 한 가이드에 건강의 국가 학회에 의해 설립 된 지침을 사용 하 여 에 대 한 관심.
<ol><li>5% 세보플루란을 사용하여 쥐를 깊이 마취시킵니다.</li>
	<li>쥐가 유해 자극에 반응하지 않고 반사 신경이 없을 때 다음 단계로 진행하십시오.</li>
	<li>쥐를 화학 연기 후드 내부의 척추 위치에 고정시다.</li>
	<li>흉부 중간선을 따라 피부를 통해 절개를합니다. 다이어프램을 분리하고 가위로 가슴을 엽니다. 좌심실에 20G × 25mm 바늘을 삽입하십시오.</li>
	<li>즉시 가위로 오른쪽 심방을 잘라. 5mL/min의 유량으로 100mM PBS의 50mL를 퍼퓨즈합니다. 100 mM PBS에서 버퍼링된 4% 파라포름알데히드의 100 mL을 퍼퓨즈.</li>
	<li>관류 직후 쥐 뇌 전체를 제거하십시오.</li>
	<li>4% 파라포름알데히드로 10분 동안 뇌 전체를 접두사. 참고 : 라벨에 영향을 미치기 때문에 30 분 이상 4 % 파라 포름 알데히드에 붙이지 마십시오.</li>
	<li>쥐 뇌 매트릭스를 사용하여 500 μm 두께의관상 동맥 부분을 잘라냅니다(재료 표 참조). 첫 번째 컷을 만들고 블레이드를 제자리에 유지하십시오. 두 번째 블레이드를 사용하여 두 번째 컷을 만들고 첫 번째 블레이드를 수직으로 제거하여 조직을 블레이드 표면에 유지합니다.</li>
	<li>각 우물에 100 mM PBS의 1 mL와 24 잘 접시에 뇌 조각을 배치합니다. 모든 슬라이스가 잘리때까지 이 과정을 반복합니다.</li>
</ol>3. 뇌 섹션의 탄도 라벨링 및 시각화
<ol><li>대상각 에서 PBS를 제거합니다.</li>
	<li>DiI/텅스텐 비드 튜브 조각으로 카트리지를 적재하고 어플리케이터에 넣습니다.</li>
	<li>두 개의 메쉬 스크린 사이에 여과지를 놓습니다. 어플리케이터를 헬륨 호스에 연결합니다. 헬륨의 출력 압력을 평방 인치당 90파운드(psi)로 조정합니다.</li>
	<li>샘플과 메쉬 스크린 사이의 거리에서 대상 의 중심에 손으로 수직으로 어플리케이터를 놓습니다. DiI/텅스텐 비드 튜브를 발사하십시오. 참고: 촬영 전에 대상 우물에서 모든 PBS를 제거해야 합니다.</li>
	<li>다음 DiI/텅스텐 비드 튜브로 카트리지를 적재하십시오. 나머지 조각의 튜빙에서 DiI/텅스텐 구슬을 지속적으로 발사합니다.</li>
	<li>PBS 의 100mM로 24 웰 플레이트를 채웁니다. PBS 3x의 신선한 100 mM의 500 μL로 씻으소서. PBS로 세척하는 동안 슬라이스가 뒤집지 않도록 하십시오.</li>
	<li>신선한 100 mM PBS 500 μL을 추가하고 3 시간 동안 어두운 4 °C에서 슬라이스를 유지합니다.</li>
	<li>미세한 브러시를 사용하여 뇌 조각을 유리 슬라이드로 옮김을 옮김. 참고 : 세 개의 뇌 섹션은 각 유리 슬라이드에 전송 할 수 있습니다.</li>
	<li>즉시 각 섹션에 안티 페이드 장착 매체 1 mL를 추가합니다. 22mm x 50mm 커버슬립을 뇌 섹션에 놓습니다. 2 일 동안 어둠 속에서 유리 슬라이드를 건조.</li>
	<li>공초점 현미경 시스템을 켜고 60 × 목표로 전환하십시오.</li>
	<li>공초점 현미경 시스템을 60×(A/1.4, 오일)의 배율과 0.15 μm의 Z 평면 간격(핀홀 크기 30 μm, 백 프로젝션 핀홀 반경 167nm)으로 설정합니다. 543 nm 파장을 사용하여 관심있는 뉴런의 이미지를 획득하십시오.</li>
	<li>뇌 영역 경계 및 뉴런의 형태학적 특성을 기반으로 표적 화된 뉴런 유형에 대한 Z 스택 이미지를 가져옵니다. 참고 : 각 동물m에서 적어도 세 개의 이미지를 획득합니다.</li>
</ol>4. 세포 배양방법론의 사용
<ol><li>이전에 보고된 방법론을 사용하여 산후 날에 F344/N 쥐로부터 1차 피질 뉴런을분리합니다 14.</li>
	<li>1 주일 동안 35 mm 유리 바닥 접시에 배양 기본 피질 뉴런. 분리 후 3일째에 신선한 뉴런 성장 배지로 배양 배지의 절반을 변경한다. 100 mM PBS의 1 mL로 유리 바닥 접시 2 x를 씻으하십시오.</li>
	<li>실온에서 15 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 고정하십시오. 3.2-3.6 단계를 반복하여 셀에 탄도로 레이블을 지정합니다.</li>
	<li>100 mM PBS 3 x의 1 mL로 씻으하십시오. 500 μL의 신선한 100 mM의 PBS를 추가하고 3 시간 동안 어둠 속에서 4 °C에서 유지하십시오.</li>
	<li>안티페이드 마운팅 매체200 μL을 추가합니다.</li>
	<li>3.10단계의 매개 변수를 사용하여 각 표적 뉴런에 대한 Z 스택 이미지를 가져옵니다.</li>
</ol>5. 신경 분석 및 수지상 척추 정량화
<ol><li>코드 번호를 사용하여 실험자의 편향을 방지하는 블라인드 뉴런.</li>
	<li>관심 있는 뇌 영역에 따라 뉴런에 대한 선택 기준을 설정합니다. 참고 : 뉴런에 대한 선택 기준은 연속 수지상 염색, 낮은 배경, 세포 내부의 염료 클러스터 없음, 세포 외 공간으로의 DiI 염료의 최소 확산, 피라미드 뉴런의 올바른 형태(그림 1)를포함한다.</li>
	<li>오픈 뉴런 재구성 소프트웨어(첨부된 비디오 1참조).</li>
	<li>왼쪽 위 모서리에 있는"파일 폴더"이미지를 클릭하여 이미지 파일을 로드합니다.</li>
	<li>"Soma"를클릭하고 이미지에 있는 뉴런의 소마를 표시합니다.</li>
	<li>"트리"를클릭하고"사용자 안내"를선택합니다.</li>
	<li>관심있는 모든 수지상 지점을 추적합니다. 참고 : 하나의 상판 모수석과 여러 바실라 수상돌기로 특징 지어지는 피라미드 형 뉴런의 경우 정점 모수석만 추적됩니다. 연결되는 모든 분기가 서로 연결되어 있는지 확인합니다.</li>
	<li>"척추"를클릭합니다.</li>
	<li>감지 매개 변수를 정의하고"모두 감지"를 클릭합니다. 참고: 뇌 조각의 경우 뇌 영역에서 사용되는 일관된 매개 변수는 2.0(외부 범위), 0.3(최소 높이), 100%(검출기 민감도) 및 10(최소 개수)입니다. 세포 배양을 위해 검출기 감도를 높이고 최소 카운트를 줄이셔야 합니다.</li>
	<li>"모두분류"를선택하여 가시를 분류합니다. 참고: 수지상 척추는 신경 재건소프트웨어(15)에필수적인 알고리즘을 사용하여 분류된다.</li>
	<li>왼쪽 위 모서리에 디스크 이미지를 선택하여 추적을 저장합니다.</li>
	<li>신경 및 수지상 척추 형태 학적 분석을 수행합니다.<ol>
<li>오픈 뉴런 재구성 정량 분석 소프트웨어(첨부된 비디오 2참조).</li>
		<li>"파일"및"데이터 파일 열기"를클릭하여 이미지를 로드합니다.</li>
		<li>"분석Analysis" 및"분기 구조 분석"을클릭하여 신경 형태 및 수지상 척추 형태를 분석합니다.</li>
		<li>신경 형태에 대 한, 클릭 "나무 합계" 그리고"수상 돌기 합계"에대 한 상자를 선택 합니다.</li>
		<li>수지상 척추 형태에 대 한, 클릭"척추" 다음 에 대 한 상자를 선택 "척추 세부 사항".</li>
		<li>출력 테이블을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고"파일에 저장"을선택하여 출력을 텍스트(.txt) 파일로 저장합니다.</li>
		<li>"분석"및"Sholl 분석"을클릭합니다.</li>
		<li>시작 반경을 10 μm로 설정하고 반지름 증분을 10 μm로 설정합니다.</li>
		<li>상자"수상돌기"를클릭하고"표시"를클릭합니다.</li>
		<li>출력 테이블을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고"파일에 저장"을선택하여 출력을 텍스트(.txt) 파일로 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>뉴런 형태(즉, 수지상 분기 복잡성) 데이터를 분석합니다.<ol>
<li>각 분기 순서에 모수석 수를 추가하고 총 수상 돌기 수로 나눕니다. 100을 곱하여 각 분기 순서의 수상돌기 수에 대한 상대 주파수를 계산합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sholl 분석 데이터를 분석하여 뉴런 아버의 복잡성과 수지상 척추 연결성을 검사합니다.<ol>
<li>각 반지름의 교차수에 대한 평균 및 표준 오차를 계산합니다.</li>
		<li>각 반경에서 척추 유형(즉, 얇고, 스터비, 버섯)에 의존하는 척추 수를 합산하고 해당 척추 유형에 대한 총 척추 수를 나눈다. 100을 곱하여 각 반지름의 등 수에 대한 상대 주파수를 계산합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+%22DiOlistic%22+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li>
<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocol%22%5BJournal%5D)">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202(2009).</li>
<li>Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiOLISTIC+labeling+of+neurons+from+rodent+and+non-human+primate+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li>
<li>Spacek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+Golgi+method%3A+a+time-lapse+study+of+the+early+stages+of+impregnation+in+single+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections.</a> Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).</li>
<li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Timing%3A+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Science Reports. 9 (1), 827(2019).</li>
<li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons%3A+dendritic+structure+and+synaptic+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).</li>
<li>Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+number+and+distribution+of+inhibitory+and+excitatory+synapses+on+hippocampal+CA1+pyramidal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells.</a> Neuroscience. 102, 527-540 (2001).</li>
<li>Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+pyramidal+neuron+of+the+rat+cerebral+cortex.+The+perikaryon%2C+dendrites+and+spines%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines.</a> American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).</li>
<li>Harris, K. M., Sultan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+the+number%2C+location%2C+and+size+of+synaptic+vesicles+provides+an+anatomical+basis+for+the+nonuniform+probability+of+release+at+hippocampal+CA1+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses.</a> Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).</li>
<li>Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+assessment+of+the+involvement+of+perforations%2C+spinules%2C+and+spine+branching+in+hippocampal+synapse+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation.</a> Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).</li>
<li>Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+dendritic+spine+detection%3A+from+Golgi+to+high-resolution+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging.</a> Neuroscience. 251, 129-140 (2012).</li>
<li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens%3A+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavior+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285(2018).</li>
<li>Roscoe, R. F. Jr, Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+transgenic+female+rat%3A+synaptodendritic+alterations+of+medium+spiny+neurons+in+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).</li>
<li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Filamentous+Actin+%28F-actin%29+Puncta+in+Rat+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53697(2016).</li>
<li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Three-Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+Spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (10), 1371(2008).</li>
</ol>

어떤 저자도 선언할 이해상충이 없습니다.

이 프로토콜에서는 쥐 뇌와 시험관 내에서 자란 뉴런에 대한 다목적 라벨링 기술을 설명합니다. 또한, 우리는 신경 형태와 수지상 척추를 평가하기 위해 신경 재건 소프트웨어 및 신경 재건 정량 분석 소프트웨어를 활용하는 방법론을보고합니다. 신경 형태와 수지상 척추의 평가는 수지상 분기 복잡성, 신경 아버 복잡성, 수지상 척추 형태 및 시냅스 연결의 변화를 결정할 수있는 기회를 제공합니다.
프로토콜을 수행 할 때, 연구원은 몇 가지 단계에 특별한주의를 기울여야한다. 첫째, 너무 오래 4% PFA에 있는 사후 고정은 친유성 막의 무결성을 손상하고 세포의 외부로 새는 염료를 일으키는 원인이 됩니다. 둘째, 뇌 슬라이스에서 탄도 라벨링의 특이성과 비교하여, 뉴런만을 대상으로 하는, 시험관내 에서 1차 피질 뉴런의 라벨링은 뇌 슬라이스의 탄도 라벨링이 뉴런의 종류에 특이적이지 않기 때문에 글리아의 비특이적 라벨링을 도입한다(즉, 피라미드형 뉴런, 중간 가시 뉴런, 과립 세포). 따라서 Bre...

2000년, Gan et al.은 다양한 친유성 염료를 결합한 신경계에서 개별 뉴런및 글리아에 대한 신속한 라벨링 기술을 설명하여, 다른 색을 가진 많은 뇌 세포의 동시 라벨링을허용1,,2. 더 최근에, 탄도 표지 기술은 Seabold 등.3 뇌 조각의 뉴런으로 형광 염료 (Dil)를 도입했다고 기술되었습니다. 다재다능한 염색 기술인 탄도 라벨링은 여러 동물 종과 다양한 연령대에서 활용될 수 있는 능력으로 평가받고 있습니다. 또한, 뇌 세포의 하위 집단을 식별하기 위해 면역 염색과 결합 될 수있다3. 기존의 기법(예를 들어, 골지콕스 은침, 미세주입)과 비교하여4,탄도 라벨링은 수지상 척추를 포함한 형태학적 특성을 보다 명확하게 구별할 수 있는 기회를 제공하며, 이는 뉴런복잡성 및 시냅스 연결성에 대한 추론을 그리는 데 중요한특징이다5.
흥분성 피라미드 뉴런은 단일, 큰 상피 덴드라이트, 다중 짧은 기저 모수석, 및 수지상 척추의 수천을 특징으로한다6. 피라미드 뉴런은 전두엽 피질 (PFC) 및 해마를 포함하여 더 높은 차수인지 처리와 관련된 여러 뇌 영역에서 발견됩니다. PFC에서, 피라미드 뉴런은 층 II/III 및 층 V에서 관찰되며, 각각고유한 형태를 나타낸다. 구체적으로, PFC의 층 II/III에 있는 피라미드형 뉴런은 층V6에있는 피라미드 형 뉴런 보다는 더 짧은 정점 수상돌기 및 더 적은 분기가 있습니다. 해마 내에서 피라미드 형 뉴런은 CA1 및 CA3 영역 모두에 위치하며 각 신경 세포는 뚜렷한 형태를 표시합니다. 구체적으로, CA1 영역의 피라미드 형 뉴런은 CA3 영역6에비해 소마로부터 더 멀리 발생하는 분기와 함께 보다 독특한 정점 수상돌기를 나타낸다.
PFC와 해마 둘 다에 있는 피라미드 형 뉴런에 수지상 척추는 흥분성의 시냅스의 1 차적인 사이트입니다7. 수지상 척추의 형태학적 특성은 고전적으로 3가지 1차 범주(즉, 얇고, 스터비, 또는 버섯8)로특징지어지며, 흥분성 시냅스9의크기와 관련이 있다. 길고 얇은 목, 작은 구근 머리 및 작은 후두 밀도를 특징으로하는 얇은 척추는 더 불안정하고 약한 연결을 개발합니다. 그러나, 버섯 척추, 더 큰 수지상 척추 머리, 강한 시 냅 스 연결을 형성에 대 한 인식, 그들의 더 큰 크기에서 발생 하는 효과. 선명한 대조적으로, 스터비 척추는 척추 목이없는, 거의 동등한 머리와 목 볼륨 비율을 나타내는8. 해마 내에서, 분지 된 척추는 또한 관찰 될 수 있으며, 척추는 동일한 수지상 척추 목(10)에서나타나는 여러 개의 머리를 가지고 있다. 따라서 수지상 척추의 형태학적 변화는 기능과 구조적 능력을 반영할 수 있습니다. 또한 수지상 척추의 크기와 모양은 구조적 가소성과 관련이 있으며, 작은 척추가 학습과 관심에 관여하는 반면, 더 크고 안정적인 척추는 기억11을포함한 장기 프로세스에 관여한다는 것을 입증했습니다. 부가적으로, 수상돌기를 따라 수지상 척추의 분포는 시냅스 연결과 연관될 수 있다5,,12.
따라서, 본 방법론 논문은 세 가지 목표를 갖는다: 1) 탄도 라벨링에 대한 우리의 프로토콜을 제시, 이는 성공률로 활용되고있다 (즉, 뉴런은 선택 기준을 충족하고 분석에 적합한) 의 83.3%55,12,,13 및 여러 뇌 영역 (즉, PFC, 핵 accumbens, 해마); 2) 시험관내에서 성장한 뉴런에 대한 기술의 일반화 및 그 적용성을 입증한다; 3) 신경 재건 소프트웨어에 활용된 방법론과 그러한 데이터로부터 도출될 수 있는 추론을 상세히 설명한다.

<table><tbody><tr><td>20Gx25mm PrecisionGlide 바늘</td><td>BD</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>24웰 세포 배양 플레이트</td><td>Costar</td><td>3562</td><td></td></tr><tr><td>35mm 유리 바닥 접시</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균 용액</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>B-27 보충제</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>50X</td></tr><tr><td>배럴 라이너</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2417</td><td></td></tr><tr><td>붕사</td><td>시그마</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>시그마</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>카트리지 홀더</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2426</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 이미징 소프트웨어</td><td>Nikon</td><td>EZ-C1</td><td>버전 3.81b</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Nikon</td><td>TE-2000E</td><td></td></tr><tr><td>커버 glass</td><td>VWR</td><td>637-137</td><td></td></tr><tr><td>DilC18(3)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D282</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>F344 rat</td><td>(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>VWR</td><td>101174Y</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>100X</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>시그마</td><td>H4641</td><td>10X</td></tr><tr><td>Helios 확산 스크린</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2475</td><td></td></tr><tr><td>Helios 유전자 총 키트</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2411</td><td></td></tr><tr><td>Helios 유전자 총 시스템</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2431</td><td></td></tr><tr><td>헬륨 호스 어셈블리</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2412</td><td></td></tr><tr><td>아이리스 집게</td><td>세계 정밀 기기</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>아이리스 가위</td><td>세계 정밀 기기</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>메틸렌 클로라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>D150-1</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida 360 소프트웨어</td><td>mbf 생명 과학</td><td></td><td>수지상 척추 분석</td></tr><tr><td>파라 포름 알데히드</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>파라 포름 알데히드</td><td>시그마</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>폴리 -L- 라이신</td><td>시그마</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>폴리 비닐 피롤리 돈</td><td>Fisher Scientific</td><td>5295</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 퇴색 방지 시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>장착 매체</td></tr><tr><td>쥐 뇌 매트릭스, 300 - 600g, 코로나, 0.5mm</td><td>Ted Pella</td><td>15047</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>Merritt 수의학 공급</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>중탄산 나트륨</td><td>Life Technologies</td><td>25080</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154%</td><td></td></tr><tr><td>주사기 키트</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2421</td><td></td></tr><tr><td>테프젤 튜빙</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2441</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>튜빙 커터</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2422</td><td></td></tr><tr><td>튜빙 준비 스테이션</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2418</td><td></td></tr><tr><td>텅스텐 M-25 마이크로캐리어 1.7 &마이크로; m</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2269</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 가위</td><td>세계 정밀 기기</td><td>500086</td><td></td></tr></tbody></table>

뇌 슬라이스와 기본 세포 배양에서 피라미드 뉴런의 탄도 라벨링

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

수지상 척추의 크기와 모양은 구조적 가소성과 관련이 있는 것으로 보고되었습니다. 피라미드 형 뉴런과 수지상 척추의 형태 학적 구조를 식별하기 위해 탄도 라벨링 기술을 활용할 수 있습니다. 본 프로토콜에서, 피라미드 형 뉴런은 DilC18 (3) 염료로 표지되고 신경 형태 및 수지상 척추를 평가하기 위해 뉴런 재건 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. 신경 구조를 조사하기 위해 수지상 분기 분석과 Sholl 분석을 수행하여 연구원들이 수지상 분기 복잡성과 뉴런 아버 복잡성에 대한 추론을 각각 그릴 수 있습니다. 수지상 척추의 평가는 재건 소프트웨어에 필수적인 자동 보조 분류 알고리즘을 사용하여 수행되며, 척추를 네 가지 범주 (즉, 얇은, 버섯, 스터비, 필로포디아)로 분류합니다. 또한 수지상 척추 형태학의 변경을 평가하기 위해 추가적인 세 가지 매개변수(예: 길이, 머리 직경 및 부피)도 선택됩니다. 탄도 라벨링 기술의 광범위한 적용 가능성을 검증하기 위해 시험관 내 세포 배양으로부터의 피라미드 뉴런이 성공적으로 표지되었습니다. 전반적으로, 탄도 라벨링 방법은 쥐의 다른 뇌 영역에서 뉴런을 시각화하는 데 독특하고 유용하며, 정교한 재건 소프트웨어와 함께 연구자들은 근본적인 가능한 메커니즘을 해명 할 수 있습니다. 신경 인지 기능 장애.

도 2A에서,쥐 두뇌 단면도에 있는 해마 지구에 있는 전형적인 피라미드 뉴런은 소마의 주위에 1개의 큰 정점 수상돌기 및 몇몇 더 작은 기저 모수석을 특징으로 하는 탄도 표지 기술에 의해 확인되었습니다. 도 2B는 소마가 검출된 후 뉴런 재구성 정량 분석 소프트웨어에서 뉴런을 나타내고, 수지상 가지를 추적하고, 척추를 검출했다. 이어서, 데이터는 신경 재건 정량 분석 소프트웨어를 사용하여 분석되었고, 이는 수지상 분기복잡성(도 2C)및 뉴런 아버 복잡성을 평가할 수 있는 기회를 제공했다(도2D).
그림 2C에서는"트리 합계" 출력에서 수집된 원심 분기 순서 지정 방법을 사용하여 각 모수석 및 할당된 분기 순서를 따라...

우리는 신경 화학적 및 행동 적 이상을 뒷받침 할 수있는 뉴런과 수지상 척추의 잠재적 인 형태 학적 변화를 평가하는 데 중요한 피라미드 뉴런에 라벨을 지정하고 분석하는 프로토콜을 제시합니다.

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

이 프로토콜은 신경 화학및 행동 이상을 강조할 수 있는 신경 세포 및 수지상 척추에 있는 잠재적인 형태학적 변경을 평가하는 가능하게 합니다. 그것은 쥐에 있는 다른 두뇌 지구에 있는 신경세포를 시각화하기 위한 독특하고 유용합니다, 정교한 재건 소프트웨어와 함께 연구원이 신경 인지 기능 장애의 근본적인 가능한 기계장치를 해명할 수 있습니다. 원고 의 지시에 따라 PVP 솔루션을 준비하여 시작합니다.튜브를 PVP로 채우고 20 분 동안 둡니다. 그리고 10 밀리리터 주사기로 다른 쪽 끝을 통해 추방하십시오. 170 밀리그램의 텅스텐 마이크로 캐리어 구슬과 250 마이크로리터의 메틸렌 염화물을 결합합니다.그런 다음 서스펜션을 철저히 소용돌이시다. 다음으로, 메틸렌 염화물 및 소용돌이의 300 마이크로 리터에 300 마이크로 리터에 지방혈 성 DilC18 (3)염료6 밀리그램을 추가합니다. 텅스텐 비드 서스펜션의 파이프 250 마이크로리터가 유리 슬라이드에 들어있습니다.서스펜션이 공기가 건조할 때까지 기다렸다가 300마이크로리터의 염료 용액을 추가하십시오. 일단 건조되면 면도기를 사용하여 혼합물을 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브 두 개로 나누고 튜브를 물로 채웁니다. 균일 할 때까지 수조에 혼합물을 초음파 처리합니다.초음파 처리기 팁이 튜브에 직접 놓여 있는지 확인합니다. 15 밀리리터 원내 튜브에 두 혼합물을 결합합니다. 그리고 또 다른 3 분 동안 초음파 처리, 염료 코팅 구슬의 큰 덩어리가 남아 있지 않도록.초음파 처리 후, 10 밀리리터 주사기와 PVP 코팅 튜브에 혼합물을 그립니다. 그리고 준비 역에 튜브를 공급합니다. 튜브를 1분 동안 회전합니다.주사기를 사용하여 모든 물을 조심스럽게 제거하십시오. 질소 가스를 켜고 질소 흐름을 분당 약 0.5리터로 조정합니다. 준비 스테이션에서 튜브를 회전시키고 질소로 30 분 동안 건조시십시오.역에서 튜브를 제거하고 튜브 커터로 13밀리미터 세그먼트로 잘라냅니다. 쥐가 유해 자극에 반응하지 않고 반사 신경이 없는지 확인하십시오. 그런 다음 스핀 위치에 고정하십시오.흉부 미드 라인을 따라 절개를합니다. 다이어프램을 분리하고 가위로 가슴을 엽니다. 그런 다음 20 게이지 25 mm 바늘을 왼쪽 심실에 삽입합니다.즉시 가위로 오른쪽 아트리움을 자르고 100 밀리리터 PBS의 15 밀리리터를 분당 5밀리미터의 유량으로 감내냅니다. 그런 다음 PBS에서 버퍼링된 4%PFA의 100밀리리터를 perfuse. 관류 후, 전체 쥐 뇌를 제거합니다.그리고 10 분 동안 4 % PFA로 우편으로 바치게합니다. 쥐 뇌 매트릭스를 사용하여 500 마이크로미터 두께의 관상 섹션을 절단합니다. 주먹을 잘라 내고 블레이드를 제자리에 유지합니다.그런 다음 두 번째 블레이드로 두 번째 절단을 하고 첫 번째 블레이드를 수직으로 제거하여 블레이드 표면에 조직을 유지합니다. 뇌 슬라이스를 24웰 플레이트에 배치하여 각 웰에 PBS 1 밀리리터를 배치합니다. 그리고 모든 조각이 잘될 때까지 프로세스를 반복합니다.대상각에서 PBS를 잘 제거합니다. 연골을 딜/텅스텐 튜브 조각으로 적재하고 어플리케이터에 넣습니다. 두 메쉬 스크린 사이에 필터 용지 를 넣습니다.그리고 헬륨 호스에 어플리케이터를 연결합니다. 그런 다음 헬륨의 출력 압력을 평방 인치 당 90 파운드로 조정합니다. 어플리케이터를 시료와 메쉬 화면 사이에 1.5cm 의 대상 우물 중앙에 수직으로 배치합니다.그런 다음 딜 /텅스텐 튜브를 발사합니다. 다음 튜브로 연골을 적재하고 나머지 조각의 튜브에서 구슬을 지속적으로 발사합니다. 100 밀리머 PBS와 24 웰 플레이트를 채웁니다.그리고 신선한 PBS의 500 마이크로 리터로 슬라이스를 세 번 세척합니다. 세척 중에 슬라이스가 뒤집지 않도록 합니다. 완료되면 500 마이크로리터의 신선한 PBS를 슬라이스에 추가합니다.그리고 어둠 속에서 섭씨 4도에서 3 시간 동안 배양하십시오. 인큐베이션 후 미세 브러시를 사용하여 뇌 조각을 유리 슬라이드로 옮기십시오. 그리고 즉시 각 섹션에 안티 페이드 장착 매체의 1 밀리리터를 추가합니다.섹션 위에 22 by 15mm 커버슬립을 놓고 어둠 속에서 슬라이드를 건조시다. 공초점 현미경 시스템을 켜고 60X 목표로 전환합니다. 원고 방향에 따라 이미징 설정을 조정합니다.및 뇌 영역 경계 및 뉴런의 형태학적 특성에 따라 표적 뉴런 유형에 대한 Z 스택 이미지를 얻을 수 있습니다. 출생 후 날에 F344/N 쥐에서 기본 피질 뉴런을 분리하고 일주일 동안 35 밀리미터 유리 바닥 접시에 그들을 문화. 격리 후 3일째에 중간 크기의 절반을 상쾌하게 합니다.100 밀리머 PBS의 1 밀리리터로 두 번 접시를 씻으시다. 그리고 실온에서 15 분 동안 4 %의 PFA로 세포를 고정하십시오. 이전에 설명된 바와 같이 세포를 탄도적으로 레이블을 지정합니다.그리고 PBS의 1 밀리리터로 세 번 더 씻으시다. 500 마이크로리터의 PBS를 세포에 추가하고 어둠 속에서 섭씨 4도에서 3 시간 동안 배양하십시오. 그런 다음 200 마이크로리터의 페이드 마운팅 매체를 추가합니다.그리고 각 표적 뉴런에 대한 Z 스택 이미지를 가져옵니다. 쥐 뇌 섹션의 해마 부위의 전형적인 피라미드 뉴런은 소마 주변의 하나의 큰 정점과 여러 개의 작은 기저 선점특징탄도 라벨링 기술로 확인되었다. 뉴런 재건 정량 분석 소프트웨어는 수지상 가지를 추적하고 척추를 감지하는 데 사용되었습니다.그 후, 소프트웨어는 수지상 분기 복잡성 및 신경 식목 복잡성을 평가하는 데 사용되었다. 수지상 척추의 형태학적 변화는 길이, 부피 및 머리 직경을 사용하여 평가되었다. 그런 다음 척추는 얇고, 그루터기, 버섯 등뼈로 분류되었다.그리고 각 반경 사이의 척추 수의 상대적 주파수를 검사하였다. 더 많은 탄도 라벨링 기술은 세포 배양에서 1 차적인 피라미드 뉴런에서 검증되었다. 피라미드 뉴런은 소마와 큰 정점의 삼각형 모양에 기초하여 확인되었다.그런 다음 뉴런 재건 소프트웨어는 얇은 수지상 척추및 수지상 척추 길이의 분포를 분석하는 데 사용되었다. 이 프로토콜을 시도할 때는 탄도 염료 코팅 텅스텐 구슬의 큰 덩어리 또는 클러스터가 준비를 시작하는 것을 피하는 것이 중요합니다. 덩어리는 개별 적인 뉴런을 구별하는 것을 허용하지 않을 것입니다.신경 재건 소프트웨어와 결합이 방법은 우리가 해마 피라미드 뉴런에서 신경 및 수지상 척추 형태를 검사 할 수 있습니다. 신경 재건 소프트웨어는 알고리즘을 사용하여 수지상 척추의 자동 보조 분류를 제공합니다. 다중 신경 매개 변수의 정량화는 더 나은 신경 인지 기능 장애의 메커니즘을 이해하는 기회를 제공합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

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이것은 피라미드 뉴런에서 전기 레코딩을 만드는 목적 organotypic 문화 neocortical 슬라이스 준비를 준비하고 유지하는 프로토콜입니다.

네크로 텍스의 Organotypic 슬라이스 준비에서 전체 셀 녹음

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정확 하 게 지역화 하 고 반복적인 뇌 조각 동봉 된 시스템에서의 장기적인 문화 중 간헐적인 이미징 수정된 롤러 튜브 메서드

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성인 마우스의 덴테이트 자이루스에서 전신 기록 및 신경 재건을위한 등산 해마에서 급성 슬라이스의 준비

이 프로토콜은 현장 축삭 성장 및 성장 원뿔 역학 을 연구하는 간단하고 강력한 방법을 보여줍니다. 생체외 생리학적으로 관련된 급성 뇌 조각을 준비하는 방법을 설명하고 사용자 친화적인 분석 파이프라인을 제공합니다.

시투에서 Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures 시각화

여기서 우리는 급성 설치류 뇌 조각에서 시냅스 특이적 전기생리학적 특성을 허용하기 위해 광유전학적 구조를 가진 분리된 뇌 영역의 바이러스 형질도입을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

생체 외 내측 전두엽 피질에서 외측 내후각 피질까지의 장거리 시냅스 전달 및 가소성에 대한 광유전학적 심문

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뇌 슬라이스와 기본 세포 배양에서 피라미드 뉴런의 탄도 라벨링

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