Name: 하위 구조 분석기: 형광 현미경 이미지에서 세포 체의 신속한 탐색 및 정확한 분석을 위한 사용자 친화적인 워크플로우 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 28 s
Description: 학습하세요 형광 현미경 이미지에서 세포 체를 자동 분석하는 사용자 친화적인 워크플로우입니다. 오픈소스 Icy 소프트웨어 기반으로 이미지 품질 향상과 정확한 세분화를 제공하여 연구자들이 다양한 현미경 지표를 효율적으로 분석할 수 있습니다.

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G.H.는 미니슈르 델레구에 아 라 레쉐 에 오 테크놀로지스의 대학원 펠로우십에 의해 지원되었다. L.H.는 인스티투트 드 칸세로로지 드 로렌(ICL)의 대학원 펠로우십의 지원을 받았고, Q.T.는 프랑스 국립연구청(ANR)이 감독하는 공공 보조금으로 지원받았고, 두 번째 "인베스트먼트 다베니르" 프로그램 파이트-HF(참조: ANR-15-RHU40)의 일환으로 지원되었다. 이 작품은 CNRS와 유니버시테 드 로렌 (UMR 7365)에 의해 투자되었다.

<ol><li>Möckl, L., Lamb, D. C., Bräuchle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolved+fluorescence+microscopy%3A+Nobel+Prize+in+Chemistry+2014+for+Eric+Betzig%2C+Stefan+Hell%2C+and+William+E.+Moerner%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner.</a> Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).</li>
<li>Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imagining+the+future+of+bioimage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Imagining the future of bioimage analysis.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1250-1255 (2016).</li>
<li>Wiesmann, V., Franz, D., Held, C., Münzenmayer, C., Palmisano, R., Wittenberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+free+software+tools+for+image+analysis+of+fluorescence+cell+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs.</a> Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).</li>
<li>de Chaumont, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Icy%3A+an+open+bioimage+informatics+platform+for+extended+reproducible+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research.</a> Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).</li>
<li>Girish, V., Vijayalakshmi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affordable+image+analysis+using+NIH+Image%2FImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ.</a> Indian J Cancer. 41 (1), 47(2004).</li>
<li>Zaitoun, N. M., Aqel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+on+image+segmentation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Procedia+Computer+Science%22%5BJournal%5D)">Survey on image segmentation techniques.</a> Procedia Computer Science. 65, 797-806 (2015).</li>
<li>Molecular Devices. MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy">https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy</a> (2018).</li>
<li>Nikon. NIS-Elements Imaging Software. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element">https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element</a> (2014).</li>
<li>Meyer, F., Beucher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Communication+and+Image+Representation%22%5BJournal%5D)">Morphological segmentation.</a> Journal of Visual Communication and Image Representation. 1 (1), 21-46 (1990).</li>
<li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+Function+in+Redox+Signaling+and+Oxidative+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li>
<li>D'Autréaux, B., Toledano, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+as+signalling+molecules%3A+mechanisms+that+generate+specificity+in+ROS+homeostasis.+Nature+Reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews.</a> Molecular Cell Biology. 8 (10), 813-824 (2007).</li>
<li>Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., Lauriola, A., D'Arca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS%2C+Cell+Senescence%2C+and+Novel+Molecular+Mechanisms+in+Aging+and+Age-Related+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3565127(2016).</li>
<li>Disher, K., Skandalis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+the+modulation+of+mRNA+splicing+fidelity+in+humans+by+oxidative+stress+and+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Evidence of the modulation of mRNA splicing fidelity in humans by oxidative stress and p53.</a> Genome. 50 (10), 946-953 (2007).</li>
<li>Takeo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress-induced+alternative+splicing+of+transformer+2%CE%B2+%28SFRS10%29+and+CD44+pre-mRNAs+in+gastric+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2β (SFRS10) and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 297 (2), 330-338 (2009).</li>
<li>Seo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+Stress+Triggers+Body-Wide+Skipping+of+Multiple+Exons+of+the+Spinal+Muscular+Atrophy+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Oxidative Stress Triggers Body-Wide Skipping of Multiple Exons of the Spinal Muscular Atrophy Gene.</a> PLOS ONE. 11 (4), 0154390(2016).</li>
<li>Will, C. L., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spliceosome+Structure+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Spliceosome Structure and Function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707(2011).</li>
<li>Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annotated+high-throughput+microscopy+image+sets+for+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Annotated high-throughput microscopy image sets for validation.</a> Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cajal+bodies+are+linked+to+genome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cajal bodies are linked to genome conformation.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7, 100(2006).</li>
<li>McQuin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler+3.0%3A+Next-generation+image+processing+for+biology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology.</a> PLoS Biology. 16 (7), 2005970(2018).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

형광 세포 이미지의 분석에 사용할 수있는 무료 소프트웨어 도구의 증가가 사용할 수 있습니다. 사용자는 문제가 있는 복잡성, 이미지 처리에 대한 지식 및 분석에 지출하려는 시간에 따라 적절한 소프트웨어를 올바르게 선택해야 합니다. 얼음, 셀 프로파일러, 또는 ImageJ / 피지는 유용성과 기능 모두를 결합하는 강력한도구입니다 3. Icy는 명확한 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 제공하는 독립 실행형 도구이며, 특히 워크플로를 쉽게 설계하거나 조작할 수 있는 "프로토콜" 포인트 및 클릭 인터페이스를4. 이 소프트웨어의 기능은 ImageJ 플러그인을 지원하고 활용함으로써 강화되며, 많은 문서가 많은 사용자 커뮤니티 덕분에 사용할 수 있습니다. 우리는 하위 구조 분석기 워크플로우를 개발하기 위해 Icy 소프트웨어의 유용성과 기능의 강력한 조합을 사용했다. 주요 목적은 여러 이미지에서 세포 형광 신호의 전체 분석을 수행하기 위해 자...

가벼운 현미경 검사법과 특히 형광 현미경 검사는 생물 과학에서 일반적으로 사용되는 견고하고 다재다능한 기술입니다. 그(것)들은 그들의 특정 형광 표시를 통해 단백질 또는 RNA 같이 각종 생체 분자의 정확한 현지화에 접근을 줍니다. 지난 10년 동안 에릭 베치그, 스테판 W. 지옥, 윌리엄 E. 모너가 슈퍼 해결형 형광 현미경 검사법(SRFM)1의개발을 수여한 2014년 노벨 화학상에서 입증된 바와 같이 현미경 및 이미징 기술의 급속한 발전이 특징지어졌습니다. SFRM은 나노 크기로 가져오기 위해 기존의 광학 현미경 검사법의 회절 한계를 우회합니다. 라이브 이미징 또는 높은 처리량 스크리닝 접근법과 같은 기술의 개선은 또한 각 실험에 대해 치료할 데이터의 양과 복잡성을 증가시킵니다. 대부분의 경우 연구자들은 세포의 이질적인 집단에 직면하고 단일 세포 수준에서 표현형을 분석하고자 합니다.
처음에, foci 계산과 같은 분석은 계산 프로세스를 완전히 시각적인 통제를 제공하기 때문에 몇몇 연구원에 의해 선호되는 눈에 의해 수행되었습니다. 그러나 이러한 데이터의 수동 분석은 너무 오래 걸리고 관찰자 간의 가변성을 유발하며 컴퓨터 지원 접근 방식이 널리 사용되고 거의 피할 수 없는2가되도록 보다 복잡한 기능에 대한 액세스를 제공하지 않습니다. 생체 이미지 정보학 방법은 데이터 분석의 효율성을 크게 향상시키고 수동 계수 분석의 피할 수 없는 작업자 주관성과 잠재적 편향이 없습니다. 이 분야의 수요 증가와 컴퓨터 전력의 개선으로 인해 많은 수의 이미지 분석 플랫폼이 개발되었습니다. 그들 중 일부는 자유롭게 사용할 수 있으며 개인용 컴퓨터로 분석을 수행하기 위해 다양한 도구에 액세스 할 수 있습니다. 오픈 액세스 도구의 분류는 최근 설립되었습니다3 유용성과 기능을 결합하는 강력한 소프트웨어로 얼음4를 제시한다. 또한, 얼음은 ImageJ와 통신의 장점이있다.
이미지 분석 전문 지식이 없는 사용자의 경우 주요 장애물은 문제가 있는 매개 변수에 따라 적절한 도구를 선택하고 잘 이해하지 못하는 매개 변수를 올바르게 조정하는 것입니다. 또한 설정 시간은 종종 깁니다. Icy는 "프로토콜"이라는 사용자 친화적인 포인트 앤 클릭 인터페이스를 제안하여 전체 컬렉션4내에서 발견되는 일부 플러그인을 결합하여 워크플로우를 개발할 수 있습니다. 유연한 모듈식 설계와 포인트 앤 클릭 인터페이스를 통해 프로그래머가 아닌 사람들에게 가능한 분석을 설정할 수 있습니다. 여기서 우리는 특정 셀룰러 구획에서 형광 신호를 분석하고 밝기, foci 수, foci 크기 및 공간 분포와 같은 다양한 기능을 측정하는 Icy의 인터페이스에서 개발 된 하위 구조 분석기라는워크플로우를 제공합니다. 이 워크플로우는 신호 전좌의 정량화, 형광 기자를 발현하는 전감염된 세포의 분석, 또는 개별 세포에서 다른 세포 하위 구조에서 의 초점 분석과 같은 몇 가지 문제를 해결합니다. 여러 이미지를 동시에 처리할 수 있으며, 출력 결과를 일반적으로 사용되는 스프레드시트 프로그램에서 열 수 있는 탭 구분워크시트로 내보낼 수 있습니다.
하위 구조 분석기 파이프라인은 그림 1에표시됩니다. 첫째, 지정된 폴더에 포함된 모든 이미지는 신호 대 노이즈 비율을 개선하기 위해 미리 처리됩니다. 이 단계는 다음 단계의 효율성을 높이고 실행 시간을 줄입니다. 그런 다음 형광 신호를 감지해야 하는 이미지 영역에 대응하는 관심 영역(ROI)이 식별되고 세분화됩니다. 마지막으로 형광 신호를 분석하고 결과는 탭 구분 워크시트로 내보냅니다.
물체 세분화(경계 감지)는 이미지 분석에서 가장 까다로운 단계이며, 그 효율성은 결과 셀 측정의 정확도를 결정합니다. 이미지(1차 개체라고 함)에서 확인된 첫 번째 개체는 DNA 염색 된 이미지 (DAPI 또는 Hoechst 염색)에서 종종 핵이지만 기본 개체는 전체 세포, 구슬, 반점, 종양 또는 얼룩이있는 물체일 수 있습니다. 대부분의 생물학적 이미지에서 세포 또는 핵은 서로 접촉하거나 중첩되어 간단하고 빠른 알고리즘이 실패합니다. 현재까지, 어떤 범용 알고리즘도 모든 객체의 완벽한 세분화를 수행할 수 없으며, 대부분 특성(크기, 모양 또는 텍스처)이 분할5의효율성을 조절하기 때문입니다. 현미경 소프트웨어(예: 분자 장치에 의한 변형 이미징 소프트웨어6또는 Nikon7의NIS-Elements Advances 연구 소프트웨어)와 함께 일반적으로 배포되는 세분화 도구는 일반적으로 상관 관계 일치, 임계값 또는 형태학적 작업과 같은 표준 기술을 기반으로 합니다. 기본 시스템에서는 효율적이지만 이러한 보다 일반화된 메서드는 보다 까다롭고 특정한 컨텍스트에서 사용할 때 한계를 빠르게 제시합니다. 실제로, 세분화는 세포 유형, 세포 밀도 또는 바이오마커와 같은 실험 파라미터에 매우 민감하며, 종종 큰 데이터 세트에 대한 반복적인 조정이 필요하다. 하위 구조 분석기 워크플로는 간단하고 정교한 알고리즘을 통합하여 이미지 복잡성및 사용자 요구에 맞게 다양한 대안을 제안합니다. 특히 고클러스터된 개체에 대한 마커 기반 유역 알고리즘8을 제안합니다. 이 세분화 방법의 효율성은 각 개체의 개별 마커 선택에 의존합니다. 이러한 마커는 사용자가 많은 수의 객체에 직면할 때 매우 많은 시간이 소요되는 전체 세분화에 대한 올바른 매개 변수를 얻기 위해 대부분의 시간을 수동으로 선택합니다. 하위 구조 분석기는 이러한 마커를 자동으로 감지하여 매우 효율적인 세분화 프로세스를 제공합니다. 세분화는, 대부분의 경우 이미지 분석의 제한 단계이며 이미지의 해상도, 이미지당 개체 수 및 개체 의 클러스터링 수준에 따라 처리 시간을 상당히 수정할 수 있습니다. 일반적인 파이프라인은 표준 데스크톱 컴퓨터에서 이미지당 몇 초에서 5분이 필요합니다. 더 복잡한 이미지를 분석하려면 보다 강력한 컴퓨터와 이미지 분석에 대한 몇 가지 기본 지식이 필요할 수 있습니다.
이 워크플로의 유연성과 기능은 대표 결과의 다양한 예제와 함께 설명되어 있습니다. 이 워크플로우의 장점은 특히 산화 스트레스 (OS) 조건하에서 핵 하위 구조의 연구를 통해 표시됩니다. OS는 산화제에 찬성하는 레독스 항상성의 불균형에 대응하고 반응성 산소 종 (ROS)의 높은 수준과 연관된다. ROS는 신호 분자로서 작용하기 때문에, 그들의 농도 및 세포 세포 소소화의 변화는 신호 변환, 수리 메커니즘, 유전자 발현, 세포 사멸 및 증식9,,10을포함하여 생리적 기능을 조절하는 수많은 경로 및 네트워크에 긍정적 또는 부정적으로 영향을 미친다. 따라서 OS는 다양한 병리학 (신경 퇴행성 및 심혈관 질환, 암, 당뇨병 등)뿐만 아니라 세포 노화에도 직접 관여합니다. 따라서 인간 세포의 조직과 기능에 대한 OS의 결과를 해독하는 것은 인간 병리학의 발병 및 개발에서 OS의 역할을 이해하는 데 중요한 단계입니다. OS는 여러 전사 인자(p53, Nrf2, FOXO3A)11을통해 전사를 조절함으로써 유전자 발현을 조절하는 것으로 확립되었지만, 또한 전RNA12,,13,14의대체 접합(AS)과 같은 여러 공동 및 전사 후 과정의조절에영향을 미치는 것으로 확립되었다. 1차 코딩 및 비코딩 전사체의 대체 접합은 전사동형태를 생성하여 게놈의 인코딩 능력을 증가시키는 필수적인 메커니즘이다. AS는 거의 300 단백질과 5 U-풍부한 작은 핵 RNA (UsnRNAs)15를포함하는 spliceosome에게 불린 거대한 ribonucleoprotein 복합체에 의해 수행됩니다. Spliceosome 조립 및 AS는 세포에서 단단히 통제되고 화려한 성숙의 몇몇 단계는 Cajal 바디라는 막없는 핵 구획 내에서 생깁니다. 이러한 핵 하위 구조는 주로 코일린 단백질을 가진 RNA 및 단백질 성분의 다원적 상호 작용에 의해 수행되는 구조와 그 조성물의 동적 특성을 특징으로 합니다. 하위 구조 분석기 워크플로우를 가진 수천 개의 셀을 분석하여 OS가 Cajal Body에 미치는 영향을 설명하지 않은 특성화를 허용했습니다. 실제로, 얻은 데이터는 OS가 카잘 바디의 핵을 수정하고, 수많은 작은 핵 포시로 코일린 단백질의 핵 소플라즈마 재분배를 유도한다는 것을 건의합니다. Cajal 바디의 구조의 이러한 변화는 화려한의 성숙에 영향을 미치고 OS에 의한 AS 변조에 참여할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>16% 포름알데히드 용액(w/v) 메탄올 무함유</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>세포를 고정하기 위한</td>Thermo Fisher Scientific 28908</tr> 염소 <tr><td>안티 마우스</td><td></td><td>A-11008</td><td>형광 2차 항체</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 염소 안티 마우스</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21425</td><td>형광 2차 항체</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A34055</td><td>형광 2차 항체</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 표준(BSA)</td><td>euromedex</td><td>04-100-812-E</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796-500ml</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040-5ML</td><td>Mounting Medium</td></tr><tr><td>Human: HeLa S3 cells</td><td>IGBMC, Strasbourg, France</td><td></td><td>실험 수행에 사용된 세포주</td></tr><tr><td>과산화수소 용액 30%(H2O2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H100ml</td><td>, 스트레스제로 사용</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668-019</td><td>형질주입 시약</td></tr><tr><td>마우스 monoclonal anti-coilin</td><td>abcam</td><td>ab11822</td><td>Coilin 특이적 항체</td></tr><tr><td>Nikon Optiphot-2 형광 현미경</td><td>Nikon</td><td></td><td>epifluoresecence microscope</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td>transfection medium</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (10x)</td><td>gibco</td><td>70011-036</td><td>세포 세척</td></tr><tr><td>토끼 다클론 항-53BP1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA1-16565</td><td>53BP1 특이적 항체</td></tr><tr><td>토끼 다클론 항-EDC4</td><td>시그마-알드리치(Sigma-Aldrich</td>) <td>SAB4200114</td><td>EDC4 특이적 항체</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>Roth</td><td>6683</td><td>을 사용하여 세포를 투과화합니다.</td></tr></tbody></table>

하위 구조 분석기: 형광 현미경 이미지에서 세포 체의 신속한 탐색 및 정확한 분석을 위한 사용자 친화적인 워크플로우

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

지난 10년 동안 공간 해상도 개선뿐만 아니라 살아있는 세포 이미징 및 고처리량 현미경 기술에서도 도시된 형광 현미경 기술의 돌파구가 특징입니다. 이로 인해 단일 실험에 대한 현미경 데이터의 양과 복잡성이 지속적으로 증가했습니다. 현미경 데이터의 수동 분석은 매우 시간이 많이 걸리고 주관적이며 정량적 분석을 금지하기 때문에 생체 이미지 분석의 자동화는 거의 피할 수 없게되고 있습니다. 우리는 형광 현미경 검사법에서 생체 이미지에서 신호 분석을 완전히 자동화하기 위해 하위 구조 분석기라는 정보학 워크플로우를 구축했습니다. 이 워크플로우는 사용자 친화적인 오픈 소스 플랫폼 Icy에서 개발되었으며 ImageJ의 기능으로 완료됩니다. 그것은 소음 비에 신호, 세포의 개별 세분화 (세포 경계의 검출) 및 특정 세포 구획에서 농축 된 세포 체의 검출 /정량화를 개선하기 위해 이미지의 사전 처리를 포함한다. 이 워크플로우의 주요 장점은 사용자 친화적인 인터페이스를 통해 이미지 분석 전문 지식 없이 사용자에게 복잡한 바이오 이미징 기능을 제안하는 것입니다. 더욱이, 그것은 매우 모듈식이며 핵 /세포 분석 전대의 특성화에서 다른 세포 하위 구조에서 다른 세포 체의 비교 분석에 이르기까지 여러 문제에 적응한다. 이 워크플로우의 기능은 산화 스트레스(OS) 조건 하에서 Cajal(코일) 바디의 연구를 통해 설명됩니다. 형광 현미경 검사법의 데이터는 인간 세포에 있는 그들의 무결성이 OS의 유도 후에 몇 시간 영향을 받았다는 것을 보여줍니다. 이러한 효과는 코일린의 핵재분배와 연관된 코일린 핵형성의 감소를 특성형 카잘 체체로 감소시켜 더 작은 포시 수로 재분배하는 것을 특징으로 한다. CB 성분과 주변 뉴클레오플라즘 사이의 교환에서 코일린의 중심 역할은 코일린의 OS 유도 재분배가 Cajal Body의 조성 및 기능에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.

설명된 모든 분석은 64비트 버전의 Java와 함께 작동하는 표준 랩톱(2.80GHz의 쿼드 코어 프로세서)에서 수행되었습니다. 랜덤 액세스 메모리는 분석할 이미지의 양과 해상도에 따라 고려해야 할 중요한 매개 변수입니다. 자바의 32 비트 버전을 사용 하 여 약 1300 MB에 메모리를 제한, 빅 데이터 분석에 적합 할 수 있는 반면, 반면 64 비트 버전 아이시에 할당 된 메모리를 증가 수 있습니다. 그림 3은 다양한 유형의 이미지와 다른 해상도에 대한 세분화에 필요한 시간을 보고합니다. 고해상도가 기본 개체 세분화 시간을 크게 증가시킨다는 것을 확인합니다.
다음 단락에 제시된 데이터는 하위 구조 분석기 워크플로우가 세포 및 분자 생물학에서 발생하는 일반적인 문제의 대부분을 해결하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다 (세포 계산, 포시 계수 및 분석, 전좌 분석).
<p class="jove_conte...

우리는 형광 현미경 이미지의 특정 세포 구획에서 세포 체의 신속한 탐사와 정확한 분석을 위해 구축 된 자유롭게 사용할 수있는 워크플로우를 제시합니다. 이 사용자 친화적인 워크플로우는 오픈 소스 소프트웨어 Icy에서 설계되었으며 ImageJ 기능을 사용합니다. 파이프라인은 이미지 분석에 대한 지식없이 저렴합니다.

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

하위 구조 분석기는 여러 공정 현미경 메트릭의 자동 분석을 수행하는 사용자 친화적인 워크플로우입니다. 그것은 오픈 소스 소프트웨어 얼음의 제로 톤을 의미하지 않으며 또한 기계 기능을 사용하여. 중요한 것은, 이 워크플로우는 지식이있는 지식과 이미지 분석을 생산하는 저렴한 리조트입니다.다중 채널 이미지는 워크플로 내에서 로드되고 신호 대 노이즈 비율을 개선하고 이미징 또는 결함을 제거하기 위해 미리 처리됩니다. 그런 다음 이미지 세분화는 배경에서 ROI라고도 하는 관심 영역을 격리합니다. 클러스터링 수준과 관심 있는 개체의 특성에 따라 여러 분할 방법을 사용할 수 있습니다.분할된 개체는 특정 폴더에 특정 설명자가 저장됩니다. 그런 다음 힘 및 신호는 행 내에서 분석되고 위치, 크기, 밀도 텍스처의 모양 과 같은 여러 피쳐를 분석하지만 숫자와 크기는 자동으로 생성된 스프레드시트로 내보냅니다. 얼음 웹 사이트에서 얼음을 다운로드합니다.그런 다음 프로토콜의 얼음 라이브러리에서 하위 구조 분석기 프로토콜을 다운로드합니다. 얼음을 열고 리본 메뉴에서 도구를 클릭합니다. 프로토콜을 클릭하여 프로토콜 편집기 인터페이스를 엽니다.부하를 클릭하고 프로토콜 하위 구조 분석기를 엽니다. 프로토콜 로드는 몇 초 정도 걸릴 수 있습니다. 워크플로는 특정 하위 작업을 수행하는 여러 상자로 구성된 파이프라인으로 작동하는 각 블록 13개의 일반 블록으로 구성됩니다.각 블록 또는 상자에번호가 매겨지며 워크플로 내에서 특정 랭크가 있습니다. 이 번호를 클릭하여 선택한 블록에 가장 가까운 위치를 첫 번째 블록에 할당합니다. 다른 블록의 위치가 재구성됩니다.왼쪽 상단 모서리 아이콘을 클릭하면 블록을 축소할 수 있습니다. 확대, 좁아지거나 제거할 수도 있습니다. 워크플로의 각 파이프라인은 다른 입력 및 출력에 의해 함께 연결된 상자 네트워크에 의해 발생합니다.연결을 만들려면 출력을 클릭하고 커서가 입력과 관련될 때까지 유지 관리합니다. 출력 태그를 클릭하여 연결을 제거할 수 있습니다. 시퀀스를 병합할 되도록 파일이름을 변경해야 하는 경우 동일한 이름 접두사 뒤에 고유한 분리기가 있습니다.예를 들어 이미지 A의 개별 채널 시퀀스는 이미지 A의 이름은 빨간색, 이미지 A는 파란색 을 강조합니다. 동일한 폴더에서 병합할 채널당 새 폴더를 만듭니다. 예를 들어 빨간색, 녹색 및 파란색 채널을 병합하려면 세 개의 폴더를 만들고 해당 시퀀스를 이러한 폴더 내에 저장합니다.블록 병합 채널만 사용하고, 다른 블록을 제거하고, 프로토콜을 병합 채널로 저장합니다. 매개 변수를 설정하기 위해 상자에 액세스합니다. 상자에서 채널 번호 x는 추출할 채널을 선택합니다.클래식 RGB 이미지에서는 0이 빨간색이고 하나는 녹색이고 두 개는 파란색입니다. 상자에서 폴더 채널 번호 x, 채널 x의 이미지가 포함 된 폴더의 이름을 다시 슬래시. 상자에 채널 번호 x를 분리합니다.이미지 이름에 대한 분리기 사용입니다. 상자에서 색상 맵 채널 번호 x는 Icy에서 해당 채널을 시각화하는 데 사용할 모델 열수를 나타냅니다. 병합된 이미지의 형식인 상자에 병합된 이미지를 저장하기 위해 확장을 작성합니다.병합 채널 블록의 왼쪽 위 모서리에서 폴더 오른쪽에 있는 링크를 직접 클릭합니다. 나타나는 열린 대화 상자에서 상자 폴더 채널 번호 1에 정의된 첫 번째 채널의 시퀀스가 포함된 폴더를 두 번 클릭합니다. 그런 다음 열어 클릭하고 프로토콜을 실행합니다.병합된 이미지는 개별 채널의 폴더와 동일한 디렉토리의 병합된 폴더에 저장됩니다. 개체 세분화는 이미지 분석에서 가장 어려운 단계입니다. 효율성은 결과 집합 측정의 정확도를 결정합니다.따라서 구조 분석기는 간단하고 복잡한 알고리즘을 통합하여 이미지 복잡성과 사용자 요구에 맞게 다른 대안을 제안합니다. 개체가 서로 접촉하지 않는 경우, 다른 사용자는 개별적으로 블록 세분화 A.개체가 서로 접촉하지 않는 경우, 그러나 그들 중 일부는 근접에 있는 클러스터된 개체를 구별 할 필요가 없습니다, 블록 세그먼트 B.의 경우 높은 클러스터링 수준과 볼록 모양의 객체를 사용, 차단 C.개체가 높은 클러스터링 레벨을 제시하고 불규칙한 모양이있는 경우, 차단 C.를 사용 , 블록 세분화 D.를 사용하여 분화된 핵을 마커로 사용하여 개별적으로 접촉하는 세포질을 분할하기 위해 클러스터 세포질에서 블록 세분화를 사용합니다. 기본 개체 세분화에 대한 블록 적응형은 여러 블록을 동일한 실행에서 사용하여 특정 하위 구조에 대한 효율성을 비교하거나 다양한 유형의 하위 구조를 분할하는 데 사용할 수 있도록 독립적으로 처리할 수 있습니다.세분화를 설명하기 위해 더 많은 수의 문제에 맞는 블록 세분화 B가 선택되었습니다. 이 블로그를 사용하려면. 먼저 폴더를 선택하려면 링크합니다.그런 다음 채널 신호를 호출하여 개체의 채널을 세그먼트로 설정합니다. 예를 들어, B에 대응하기 위해, 상자 HK 수단에서, 검출할 객체의 픽셀에서 강도 클래스 매개 변수와 대략 최소 및 최대 크기를 설정합니다. 강도 클래스의 경우 두 값의 값은 배경과 전경의 두 클래스에서 픽셀을 분류합니다.따라서 개체와 배경 사이의 대비가 높을 때 조정됩니다. 전경 오브젝트의 원점 강도가 있거나 배경과의 대비가 낮은 경우 클래스 수를 늘립니다. 상자에서 활성 윤곽은 개체 테두리의 검색을 최적화합니다.이 과정에서 세그먼트된 개체의 이미지를 저장하기 위해 폴더가 만들어집니다. 상자 텍스트에서 이 폴더의 이름을 지정합니다(예: 핵 분할). 분할된 개체의 이미지를 저장하는 형식을 설정하려면 분할된 개체의 이미지의 상자 형식을 채우고 프로토콜을 실행합니다.폴더는 병합된 이미지가 포함된 폴더에 만들어집니다. 분할된 개체에서 분석할 법률 및 채널 및 셀 구획의 수에 적응하기 위해 다양한 블록이 개발되었습니다. 다음 예제에서는 분석을 위해 동일한 구획에서 블록 형광 분석 P.Two 채널을 선택하고 폴더를 선택하도록 연결합니다.이 분석이 매개 변수 받은 편지함 폴더 이미지 ROI를 설정하기 전에 세분화 블록이 처리되어야하며 백슬래시가 앞에 놓인 분할 된 개체의 이미지가 포함된 폴더의 이름을 작성합니다. 분할된 개체의 이미지의 받은 편지함 형식을 사용하여 분할된 개체의 이미지를 저장하는 데 사용되는 형식을 작성합니다. 받은 편지함에서 테두리를 제거하여 두 개체를 모두 제거합니다.그렇지 않으면, 지금, 이미징의 더 완전한 J 컬렉션의 설치는이 기능을 사용 하 여 필요. 상자 채널 스팟 신호에서 스팟을 감지해야 하는 채널을 설정합니다. 클래식 RTP 이미지에서 0은 빨간색 1이 녹색이고 두 개는 파란색입니다.국소화 된 분자의 상자 이름으로, 반점에 국한 분자의 이름을 작성합니다. 대답할 필드 수는 분자 수에 따라 다릅니다. 검출기 블록당 상자 파장에서 각 개별 채널에 대한 스팟 감지 매개 변수를 설정합니다.방에서 다른 블록을 처리하려면 블록 선택 폴더와 함께 선택한 블록의 연결을 유지합니다. 워크플로의 좋은 처리 보다 낮은 순위를 확인합니다. 워크플로를 실행하기 전에 사용하지 않은 블록을 제거하고 새 프로토콜을 다른 이름으로 저장하는 것이 좋습니다.실행을 클릭하여 워크플로를 시작합니다. 눈을 뜨면 책이 나타납니다. 간호사 이미지가 들어 있는 폴더를 두 번 클릭한 다음 열기를 클릭하면 워크플로가 자동으로 실행됩니다.처리가 메시지를 완료하면 성공적으로 실행된 워크플로가 오른쪽 아래 모서리에 나타나고 모든 블록에 녹색 기호가 표시됩니다. 블록과 화살표 기호를 표시하는 내부 상자가 아닌 경우 요소가 올바른 요소를 나타냅니다. 중요한 것은, 여러 디스플레이처리를 제어하기 위해 각 실행 중에 중간 결과를 시각화할 수 있습니다.이 워크플로의 신속성, 유연성 및 기능은 다양한 예로 제한됩니다. 이 첫 번째 예에서는 TNF 알파의 농도가 증가함에 따라 NF 카파 B.의 핵 전좌를 분석합니다. 핵과 세포질은 세분화 C 및 E 블록을 사용하여 묘사되었다.신호에서 번창하는 NF kappa B는 글로벌 전좌 분석 블록을 사용하여 분석되었다. 96개의 심상에서 40개 이상의 000세포가 26분 만에 분석되었다. 생성된 데이터는 TNF 알파에 의한 NF Kappa B 핵 전좌의 유도를 보여주는 이 용량 반응 곡선을 확립하는 데 사용되었다.워크플로를 사용하여 파일 크기를 감지하고 해당 기능에 대한 특정 정보를 추출할 수도 있습니다. 여기서, 개별 세포에서의 특성은 단백질에 대한 EDC를 국소화함으로써 검출되었다. 세포질내핵은 세분화 A 및 E 블록을 사용하여 묘사되었다.EDC4는 이러한 예에 C.In 형광 분석 블록을 사용하여 분석되었으며, 세포질 EDC4 사인은 분석된 두 세포모두에서 검출되었다. 각 전체 면의 픽셀 크기는 스프레드시트에 제공됩니다. 이 예에서는 워크플로우의 다재다능함을 활용하여 탄수화물을 산화 스트레스의 긴 운동학으로 연구했습니다.코일린의 핵력 징후는 탄수화물의 주요 구조 성분으로, 53BP1로 국소화된 이중 가닥 파손에 의해 평가된 크기, 응력 상태에 따라 그 수와 크기를 분석했다. 핵은 코일린 및 53BP1의 세분화 프록시, 핵력 및 신호를 사용하여 묘사되었으며, 2300개의 개별 세포로부터의 데이터를 사용하여 형광 분석 블록 B.를 사용하여 동시에 분석되었으며, 그 크기 감소와 관련된 응력 유도 후 그린필드 부위의 수가 크게 증가했음을 입증하였다. 이 데이터는 산화 스트레스가 코일린 발현의 변화를 정당화하기 위해 핵 플라스믹 분포를 더 작은 핵의 수로 사용하는 탄수화물의 핵형성 능력을 변화시키고 코일린 발현의 변화를 정당화할 수 있음을 강력하게 시사한다.외인성 GFP 코일린 융합 단백질이 과발현되었다. 우리 몸의 특징은 GFP 코일린 과발현 수준에 따라 분석되었다. 핵은 분할 블록 A.코일린및 GFP 코일린의 형광 신호를 사용하여 묘사되었고, 형광 분석 블록 B.GFP 코일린의 과발현 수준은 개별 핵에서 GFP 신호의 의미 밀도에 의해 반영되었다.하위 구조 분석기에서 생성된 데이터는 과발현의 GFP 코일린이 탄수화물의 크기와 수를 크게 증가시킨다는 것을 보여줍니다. 산화 스트레스는 탄수화물의 수를 증가하지만 크기를 감소시키기 때문에. 이 데이터는 탄수화물의 구조에 산화 스트레스 효과 가장 아마 코일린의 특정 금액에 미치는 영향 보다는 그들의 조성의 변화에 의해 유도 될 수 있습니다 반영할 수 있습니다.따라서 구조 분석기는 바이오 이미지 분석을 위한 고도로 모듈식 워크플로우입니다. 채널의 단순한 병합에서 수천 개의 셀에서 여러 바닥및 신호의 정량화에 이르기까지 여러 컨텍스트에 적응할 수 있습니다. 또한 이미지 복잡성에 따라 간단하고 복잡한 세분화 알고리즘을 통합하고 형광 신호 피쳐 추출을 자동화합니다.

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연구

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