Name: 미세 유체 챔버 시스템을 사용하여 모터 뉴런 배양에서 세포기관의 축축한 수송 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 배우세요 미세 유체 챔버 시스템을 활용한 모터 뉴런 축삭 수송 분석 방법입니다. E12.5 마우스 배아 척수에서 분리한 모터 뉴런 배양을 통해 미토콘드리아와 산성 세포소기관의 실시간 이동을 관찰할 수 있습니다. 이 기법은 축삭 생물학 및 퇴행성 신경질환 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 이스라엘 과학 재단 (ISF, 561/11)과 유럽 연구 위원회 (ERC, 309377)의 보조금에 의해 지원되었다.

<ol><li>Misgeld, T., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitostasis+in+Neurons%3A+Maintaining+Mitochondria+in+an+Extended+Cellular+Architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture.</a> Neuron. 96, 651-666 (2017).</li>
<li>Devine, M. J., Kittler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+at+the+neuronal+presynapse+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).</li>
<li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li>
<li>Mandal, A., Drerup, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+Transport+and+Mitochondrial+Function+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373(2019).</li>
<li>Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+mitochondrial+transport+and+morphology+are+common+pathological+denominators+in+SOD1+and+TDP43+ALS+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models.</a> Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).</li>
<li>Anderson, R. G. W., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+view+of+acidic+intracellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A view of acidic intracellular compartments.</a> Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).</li>
<li>Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab+GTPases+and+Membrane+Trafficking+in+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration.</a> Current Biology. 28, R471-R486 (2018).</li>
<li>Ya-Cheng Liao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Granules+Hitchhike+on+Lysosomes+for+Long-Distance+Transport%2C+Using+Annexin+A11+as+a+Molecular+Tether%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether.</a> Cell. 179, 147-164 (2019).</li>
<li>Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Quantum-Dot+labeled+neurotropic+factors+transport+along+primary+neuronal+axons+in+compartmental+microfluidic+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers.</a> Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).</li>
<li>Gershoni-Emek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+RNAi+Machinery+to+Axonal+Branch+Points+and+Growth+Cones+Is+Facilitated+by+Mitochondria+and+Is+Disrupted+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311(2018).</li>
<li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+Microfluidic+Platforms%3A+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li>
<li>Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmental+microfluidic+system+for+studying+muscle-neuron+communication+and+neuromuscular+junction+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance.</a> European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).</li>
<li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+co-culture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li>
<li>Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+compartmental+system+underlines+the+contribution+of+mitochondrial+immobility+to+the+ATP+supply+in+the+NMJ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ.</a> Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).</li>
<li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).</li>
<li>Ionescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Sigma-1+Receptor+via+Pridopidine+Ameliorates+Central+Features+of+ALS+Pathology+in+a+SOD1G93A+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model.</a> Cell Death & Disease. 10 (3), 210(2019).</li>
<li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+coculture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li>
<li>Maimon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mir126-5p+downregulation+facilitates+axon+degeneration+and+nmj+disruption+via+a+non-cell-autonomous+mechanism+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS.</a> Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

이 프로토콜에서는 운동 뉴런에서 미토콘드리아 및 산성 구획의 축색 수송을 추적하는 시스템을 설명합니다. 이 단순화된 체외 플랫폼은 세포외 뉴런 구획을 정밀하게 제어, 모니터링 및 조작할 수 있게 해주며, 모터 뉴런 국소 기능을 실험분석할 수 있습니다. 이 프로토콜은 ALS와 같은 MN 질환을 연구하는 데 유용할 수 있으며, 질병10,,16에서축색 수송 기능 장애의 기본 메커니즘을 이해하는 데 초점을 맞출 수 있다. 더욱이, 이 시스템은 또한 영양 인자9,,16,microRNA10,mRNA8,및 건강하고 병에 걸린 MN 또는 감각9 또는 교감 축삭14와같...

MN은 성인 인간에서 1 미터 까지 도달하는 긴 축색을 가진 높게 편광한 세포입니다. 이러한 현상은 MN 연결 및 기능 유지 관리에 중요한 과제를 만듭니다. 따라서, MN은 세포체에서 시냅스및 뒤로 축세포를 따라 정보, 세포기관 및 물질의 적절한 수송에 의존합니다. 단백질 RNA 및 세포기관과 같은 다양한 세포 성분은 축색을 통해 정기적으로 셔틀됩니다. 미토콘드리아는 MN에서 일상적으로 수송되는 중요한 세포기관입니다.1,2 미토콘드리아의 축색 수송은 잘 연구 된 과정3,,4. 흥미롭게도, 미토콘드리아 수송에 있는 결점은 몇몇 신경 퇴행성 질병 및 특히 MN질병5에서관련시키기 위하여 보고되었다. 산성 구획은 MN 축색을 따라 움직이는 본질적인 세포기관에 대한 또 다른 예가 됩니다. 산성 구획에는 리소좀, 내인성, 트랜스 골지 장치 및 특정 분비 소포6이포함된다. 산성 구획의 축축한 수송에 있는 결점은 몇몇 신경 퇴행성 질병 에서 뿐만 아니라7에서찾아냈고, 최근 논문은 MN 질병8에서그 중요성을 강조합니다.
축축산 수송을 효율적으로 연구하기 위해, 체세포와 축색 구획을 분리하는 미세 유체 챔버는 자주9,,10을사용한다. 미세 유체 시스템의 두 가지 중요한 장점, 및 구획화 및 축슨의 분리는, 아세포 과정(11)의연구에 이상적 렌더링. 신경 세포 체와 축세포 사이의 공간 분리는 다른 뉴런 구획의 세포 외 환경을 조작하는 데 사용할 수 있습니다 (예를 들어, 축사 대 소마). 생화학적, 신경 성장/변성 및 면역 형광 분석실험은 모두 이 플랫폼에서 유익합니다. MFC는 또한 골격 근12,,13,,14와같은 다른 세포 유형과 뉴런을 coculturing으로써 세포 간 통신을 연구하는 데 도움을 줄 수 있습니다.
여기에서는 운동 뉴런에서 미토콘드리아 및 산성 구획 수송을 모니터링하기 위한 간단하면서도 정확한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 또한 역행 및 전위 이동 소기관의 상대적 비율뿐만 아니라 수송 속도의 분포를 비교하여이 방법의 사용을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>35mm 플루오디쉬 &ndash; 유리 바닥 접시</td><td>World Precision Instruments</td><td>WPI FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>50mm 플루오디쉬 & 유리 바닥 접시</td><td>World Precision Instruments</td><td>WPI FD5040-100</td><td></td></tr><tr><td>Andor iXon DU-897 EMCCD 카메라</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ARA-C (Cytosine &beta;-D-arabinofuranoside)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td>2mM 재고 필터링 DDW</td></tr><tr><td>B-27 보충제 (50X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Alomone Labs</td><td>B-250</td><td>10 &micro로 희석; 0.01% BSA로 필터링된 ddw의 g/mL)</td></tr> <tr><td>생검 펀치 1.25mm</td><td>World Precision Instruments WPI</td><td>504530</td><td>대형 MFC</td></tr><tr><td>생검 펀치 6mm</td><td>World Precision Instruments WPI</td><td>504533</td><td>소형 MFC</td></tr><tr><td>생검 펀치 7mm</td><td>World Precision Instruments WPI</td><td>504534</td><td>대형 MFC</td></tr><tr><td>Bitplane Imaris 소프트웨어 사전 준비 - 버전 8.4.1</td><td>Imaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>시그마 알드리치</td> <td>#A3311-100G</td><td>5 % w / v ddw</td></tr><tr><td>클로로 트리 메틸 실란</td><td>시그마 - 알드리치</td> <td># 386529-100ML</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>알로몬 연구소</td><td>C-240</td><td>10 &micro로 희석; 0.01% BSA로 필터링된 ddw의 g/mL)</td></tr><tr><td>밀도 구배 매체 - Optiprep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I (DNAse) 소 췌장에서 추출한</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td>재고 10mg/mL neurobasal</td></tr><tr><td>Dow Corning 고진공 실리콘 그리스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554-1EA</td><td>에폭시 몰드 준비용</td></tr><tr><td>DPBS 10X</td><td>Thermo Fisher</td><td>#14200-067</td><td>DDW에서 1:10을 희석합니다.</td></tr><tr><td>Dumont 세밀한 집게 #55 0.05 &times; 0.02 mm</td><td>F.S.T</td><td></td><td></td></tr> 1125520 <tr><td>에폭시 경화제</td><td>Trias Chem S.R.L</td><td>IPE 743</td><td>에폭시 금형 준비용</td></tr><tr><td>에폭시 수지</td><td>Trias Chem S.R.L</td><td>RP 026UV</td><td>에폭시 금형 준비용</td></tr><tr><td>FIJI 소프트웨어</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Alomone Labs</td><td>G-240</td><td>10 &micro로 희석; 0.01% BSA로 필터링된 ddw의 g/mL)</td></tr><tr><td>Glutamax 100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>#35050-038</td><td></td></tr><tr><td>HB9:GFP 마우스 균주</td><td>Jackson Laboratories</td><td>005029</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10X</td><td>Thermo Fisher</td><td>#14185-045</td><td>1% P/S 및 필터</td></tr><tr><td>iQ 소프트웨어</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr> Iris 가위를 추가하여 ddw에서 1:10 희석, <tr><td>곡선, 10cm</td><td>AS Medizintechnik</td><td>11-441-10</td><td></td></tr><tr><td>홍채 가위, 스트레이트, 9cm</td><td>AS Medizintechnik</td><td>11-440-09</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#L-2020</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz의 L-15 Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red</td><td>Thermo Fisher</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Deep-Red FM</td><td>Thermo Fisher</td><td>M22426</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 매체</td><td>Thermo Fisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti micorscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (P / S) 솔루션</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithin (PLO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>#P8638</td> 1X PBS Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트<td>에 1:1000 희석</td></tr><tr><td></td><td></td><td>#3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>소 췌장에서 추출한 트립신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td>재고 25mg/mL 1XPBS</td></tr><tr><td>Vannas 스프링 현저가위, 3mm 블레이드</td><td>FST</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Yokogawa CSU X-1 Yokogawa</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

미세 유체 챔버 시스템을 사용하여 모터 뉴런 배양에서 세포기관의 축축한 수송

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

운동 뉴런 (MN)은 매우 긴 축축을 가진 고도로 편광된 세포입니다. 축 색 수송은 MN 건강에 대 한 중요 한 메커니즘, 신경 성장에 기여, 개발, 그리고 생존. 우리는 MN 축색에 형광 표지된 소기관의 축색 수송을 추적하기 위한 미세 유체 챔버 (MFC)의 사용을 위한 상세한 방법을 기술합니다. 이 방법은 빠르고 비교적 저렴하며 공간과 시간에서 세포내 큐를 모니터링할 수 있습니다. 우리는 단계별 프로토콜을 설명한다: 1) 폴리디메틸실록산(PDMS) MFC의 제조; 2) MFC에서 복부 척수 이식 및 MN 해리 배양의 도금; 3) 미토콘드리아 및 산성 구획의 라벨링 과 라이브 공초점 상상력; 4) 수동 및 반자동 축색 수송 분석. 마지막으로, 우리는 HB9::GFP 복부 척수 의 미토콘드리아 및 산성 구획의 수송에 있는 다름을 시스템 타당성의 증거로 축삭을 심출한다는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜은 다양한 축색 부품의 축색 수송을 연구하기 위한 효율적인 도구와 공간 실험 가능성을 발견하는 데 도움이 되는 MFC 사용에 대한 단순화된 설명서를 제공합니다.

기재된 프로토콜에 따라, 마우스 배아 HB9::GFP 척수 이식은 MFC에서 배양하였다(도4A). 축삭이 완전히 말단 구획으로 교차 할 때 이식은 7 일 동안 재배되었다. 미토콘드리아 및 산성 구획에 라벨을 붙이기 위해 미토트래커 딥 레드 및 리소트래커 레드 염료를 말단 및 근위 구획에 첨가하였다(도4C). 말단 홈내의 축삭을 이미지화하고, 영상을 분석하였다: 먼저, 규극물 분석을 이용한 일반적인 이동 분포를 비교하였다(도4B,D). 이 분석은 산성 구획에서만 역행 방향으로 편향을 나타냈다(무이동 = 77.1±9.5%, 역행 = 16.9±8.3%, 전단등급 = 6±5%; ; 도 4<strong...

축색 수송은 운동 신경 건강을 위한 중요한 기계장치입니다. 이 프로토콜에서 우리는 미세 유체 챔버를 사용하여 운동 뉴런 축축에서 산성 구획및 미토콘드리아의 축산 수송을 추적하기위한 상세한 방법을 제공합니다.

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

축 하 전송 신경 건강 및 생존에 대 한 중요 한. 당사의 프로토콜은 축산 운송을 모니터링하고 분석하는 우아한 방법을 설명합니다. 및 다양한 신경 질환 모델에 적응할 수 있다.미세 유체 챔버의 사용은 축축생물학을 연구하는 데 중요한 정밀한 공간 측두제어를 가능하게 합니다. 축 하 수송 이상은 ALS와 같은 몇몇 신경 퇴행성 질병과 연루됩니다. 미세 유체 플랫폼은 축산 운송 결함을 복구하기 위해 기본 메커니즘뿐만 아니라 테스트 치료법을 연구 할 수 있습니다.미세 유체 챔버 플랫폼은 축산 성장 및 다양한 신경 아류형의 변성을 포함하여 축산 연구의 다양한 측면에 맞게 쉽게 적응 할 수 있습니다. 이 방법은 복잡하고 일반적으로 실습을 가르칩니다. 시각적 데모는 축산 운송을 공부하는 데 관심이있는 과학자에게이 절차의 접근성을 증가시킬 것입니다.기본 금형에서 PDMS를 캐스팅하는 것으로 시작합니다. 가압 공기를 사용하여 웨이퍼 플랫폼에서 먼지를 제거하여 웨이퍼가 진행되기 전에 부드럽고 선명하게 보이도록 하십시오. 다음으로, 액체 질소로 용기를 채우고 23 게이지 바늘로 10 밀리리터 주사기를 준비합니다.화학 연기 후드에 플레이트가 함유된 웨이퍼를 밀봉 용기에 넣고 주사기를 각 웨이퍼당 2밀리리터의 액체 질소로 채웁니다. 클로로트리메틸틸렐틸레인 병을 엽니다. 주사기로 고무 캡을 관통하고 병에 질소를 주입합니다.바늘을 꺼내지 않고 병을 거꾸로 뒤집어 접시가 들어있는 각 웨이퍼에 대해 클로로트리메틸틸레인 2 밀리리터를 빼놓습니다. 클로로트리메틸틸란을 용기에 펴지만 플레이트가 들어 있는 웨이퍼에는 직접 적으로 발라놓지는 않습니다. 컨테이너를 닫습니다.그리고 웨이퍼 당 5 분 동안 배양하십시오. 다음 무게 47.05 50 밀리 리터 튜브에 PDMS 베이스의 그램, 총 50 그램에 대 한 경화 에이전트에 16 대 1 염기의 비율로 PDMS 경화 제를 추가. 저속 회전기에서 10분 동안 PDMS를 혼합한 다음 플레이트를 포함하는 각 웨이퍼에 붓습니다.진공 건조기 안에 플레이트를 두 시간 동안 놓습니다. PDMS 내에 갇힌 공기를 제거하고 명확한 균일 한 금형을 형성합니다. 그 후 오븐에서 접시를 3시간 또는 70°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.미세 유체 챔버 또는 MFC를 만들 수 있습니다. 메스로 접시에서 PDMS 금형을 자르고 제거하여 금형이 깨지기 쉽기 때문에 금형을 강제로 강요하지 않도록 합니다. 실험 설정에 따라 텍스트 원고의 지침을 따라 챔버를 펀치하고 잘라냅니다.척수 절제 문화의 경우, 대형 MFC의 탈경 측에 7mm 우물 두 개를 펀치하여 채널 가장자리와 겹칠 수 있도록 하십시오. 근위 쪽에서는 채널 중앙에 7mm 를 잘 펀치하여 최소한의 겹침으로 충분한 공간을 남겨두게 됩니다. 근동 채널의 두 모서리에 두 개의 1밀리미터 구멍을 추가로 펀치.그리고 PDMS를 단일 챔버로 잘라. 그런 다음 MFC를 위쪽으로 돌리고 20 게이지 바늘을 사용하여 펀치 7 mm의 작은 동굴 세 개를 개척합니다. 해리된 운동 신경 배양을 위해, 작은 MFC의 두 채널의 가장자리에 있는 4개의 6mm 웰을 펀치하고 PDMS를 단일 챔버로 잘라냅니다.MFC를 소독하려면 벤치에 50센티미터 길이의 끈적끈적한 테이프 밴드를 펴보시면 됩니다. 그런 다음 테이프에 있는 챔버의 양면을 누르고 다시 당깁니다. 깨끗한 챔버를 새로운 플레이트에 놓고 분석 등급으로 인큐베이션하여 70%에탄올을 궤도 셰이커에 10분 동안 배양합니다.에탄올을 폐기하고 조직 배양 후드 또는 70섭씨에서 오븐에서 챔버를 건조시다. 그런 다음 조직 배양 등급 유리 바닥 도랑의 중심에 챔버를 배치하고 접시 바닥에 PDMS를 바인딩가장자리에 약간의 힘을 적용합니다. 섭씨 70도에서 10분간 요리를 배양합니다.그런 다음 준수를 강화하기 위해 챔버를 누릅니다. UV 아래에서 10분 동안 접시를 배양한 다음 MFC코딩을 진행합니다. 밀리리터 PLO당 1.5 나노그램을 두 구획에 넣습니다.PLO가 채널을 통해 실행되고 있는지 확인합니다. 채널 입구에서 코팅 매체를 직접 피펫팅하여. 가벼운 현미경으로 MFC를 검사하여 거품을 확인합니다.기포가 마이크로 홈을 차단하는 경우 MFC를 진공 건조기에 2분 동안 배치합니다. MFC 채널에서 과도한 공기를 제거합니다. 그런 다음 PLO와 함께 하룻밤 동안 인큐베이션하십시오.PLO를 라미닌으로 교체하고 MFC를 추가로 배양합니다. 도금 전에, 배양 매체로 라미닌을 씻으라. ICR E12.5 임신 한 마우스를 해부하고 양수 낭에서 배아를 분리합니다.HBSS 실리콘 접시에 배아를 넣습니다. 머리와 꼬리를 제거하고 그의 배에 뒤집어. 배아에서 피상적인 피부를 부드럽게 벗겨 척수를 노출시십시오.부드러운 핀셋을 사용하여 척수를 몸에서 꼬리로 분리합니다. 수막을 제거한 다음 등경을 제거하고 척수를 1mm 두께의 횡단 섹션으로 자른다. MFC의 근동 구획에서 모든 배지를 폐기합니다.총 4개의 마이크로리터로 파이펫으로 척수 한 개를 집어들세요. 그리고 동굴에 가능한 한 가까이 주입. 측면 콘센트를 통해 근위로부터 여분의 액체를 잘 뽑습니다.이전 단계를 두 번 더 반복하고 각별이 근위 채널에 포함되는지 확인합니다. SCEX 배지 150마이크로리터를 근동에 천천히 추가합니다. 도금 후 하루.근위실의 SCEX 배지를 교체하고 풍부한 SCEX 배지를 탈구에 추가합니다. 실산 우물과 근해 우물 사이의 우물 당 적어도 15 마이크로 리터의 체적 그라데이션을 유지합니다. 4~6일 후에축축은 낙후 구획으로 넘어가서 축축운송 영상에 대비해야 한다.미토콘드리아와 산성 구획에 라벨을 부착하려면 100나노몰러 미토트래커 딥 레드 FM과 100 나노몰러 리소트래커 레드로 신선한 SCEX 배지를 준비한다. 그리고 미세 유체 챔버에 추가합니다. 섭씨 37도에서 30~60분 동안 인큐베이션을 사용해 보배하세요.그런 다음 따뜻한 SCEX 매체로 세 번 씻습니다. 축 산 교통의 라이브 이미징진행. 3초 간격으로 100시간 경과 이미지 시리즈를 획득합니다.영화당 총 5분. 미세 유체 챔버에서 7 일 후. 마우스 배아 HB9 GFP 척수 이월.우리는 미토 트래커 딥 레드와 리소 트래커 레드 염료로 얼룩져 있습니다. 미토콘드리아와 산성 구획에 라벨을 부착하십시오. 축삭 홈내의 축삭을 이미지화하고 Kymograph 분석은 일반적인 이동 분포를 결정하기 위해 사용되었다.이것은 산성 도시 구획에서만 역행 방향으로 편향을 드러냈지만 미토콘드리아 수송에서는 그렇지 않았습니다. 입자 밀도는 또한 정량화되어 HB9 GFP 척수 의 산성 구획에 비해 더 많은 수의 미토콘드리아 입자를 드러내며 축삭을 내다녔다. 다음으로, 반자동 소프트웨어를 사용하여 단일 입자 전송 분석을 수행한 다음 사내 코드가 뒤따랐습니다.이 분석은 산성 성분과 미토콘드리아가 유사한 입자 속도를 가지고 있음을 밝혔다. 그러나 산성 구획만이 역행 운동에 대한 편견을 표시합니다. 배아 척수를 고립시키는 것은 처음에는 어려울 수 있습니다.올바른 배아 나이와 적절한 해부 도구를 사용해야하는이 절차를 여러 번 연습하십시오. 미세 유체 챔버의 사용은 우리가 축 축 생물학을 공부하는 방식을 변경합니다. 그것은 우리가 한 번 세포 본문에서만 발생 하는 가설 있어 지역화 된 축 하 과정을 시각화 할 수 있습니다.

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연구

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Neuroscience

신경과학

이 비디오에서 우리는 culturing의 뉴런에 microfluidic 장치를 farbricate을 사용 polydimethyl 실록산 (PDMS)과 소프트 리소그래피의 기술을 보여줍니다.

신경 소마와 Axons의 Compartmentalization위한 Microfluidic 장치의 제작

여기서 우리는 지느러미 루트 신경의 culturing 감각 뉴런에 compartmented 회의소 준​​비 및 유지 관리의 기법을 설명합니다.

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다중 구획 CNS 뉴런 - glia 공동 문화 Microfluidic 플랫폼

이 비디오는 미세유체 챔버 시스템을 사용하여 운동 뉴런의 축삭 수송을 추적하는 방법을 보여줍니다. 여기에는 축삭 성장을 유도하기 위해 영양 배지가 있는 폴리머로 코팅된 웰에서 마우스 배아 척수 조직을 배양하는 것이 포함됩니다. 라이브 이미징에서 형광 염료 염색 소기관의 움직임은 양방향 축삭 수송을 확인합니다.

Tracking Axonal Transport of Organelles in Motor Neurons Using a Microfluidic Device

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교양있는 세포 기관 전송 초파리 셀 : S2 세포주 및 기본 뉴런.

하나의 신경 세포의 미세 유체의으로 배열 및 생체 적합 물질 코팅의 칩 플라즈마 패턴 물 마스킹을위한 프로토콜을 설명합니다. 고도로 상호 공동 배양은 최소 셀 입력을 사용하여 제조 될 수있다.

단일 셀의 정밀도와의 연결을 공동 문화의 준비

소포 또는 세포 소기관과 같은 화물의 세포 내 수송은 편광된 미세소관을 추적하는 분자 운동 단백질에 의해 수행됩니다. 이 프로토콜은 뉴런 내부로 이동하는 개별 화물 입자의 수송 방향성과 관련 운동 단백질의 상대적 양 및 유형의 상관관계를 설명합니다.

사용 축삭화물을 이동하는 분자 모터의 구성을 특성화 &quot;화물 매핑&quot;분석

이 프로토콜은 조직 배양 칩에서 스페로이드에서 확장 된 축축의 강력한 번들의 자발적인 조립을 통해 인간 iPS 세포 유래 모터 신경 오르가노이드를 제조하는 포괄적 인 절차를 제공합니다.

3차원 모터 신경 오르간성 생성

당사는 인간 원발성 메소포스트 유래 근투와 인간 유도만능 줄기 세포 유래 모터 뉴런을 공동 배양하여 상업적으로 이용 가능한 미세유체 장치에서 인간 모터 유닛을 생성하는 방법을 설명하며, 이로 인해 기능적으로 활성 신경 근육 접합이 형성된다.

미세 유체 장치에서 기능성 신경 근육 접합을 갖춘 인간 모터 유닛 생성

본 프로토콜은 미세유체 챔버에서 뉴런 미토콘드리아의 파종 및 염색을 기술한다. 이 챔버의 유체 압력 구배는 축삭에서 미토콘드리아를 선택적으로 처리하여 세포체 구획에 영향을 미치지 않고 약리학적 문제에 대응하여 특성을 분석할 수 있도록 합니다.

축삭 미토콘드리아의 미세 유체 보조 선택적 탈분극

배우세요 미세 유체 챔버 시스템을 활용한 모터 뉴런 축삭 수송 분석 방법입니다. E12.5 마우스 배아 척수에서 분리한 모터 뉴런 배양을 통해 미토콘드리아와 산성 세포소기관의 실시간 이동을 관찰할 수 있습니다. 이 기법은 축삭 생물학 및 퇴행성 신경질환 연구에 활용됩니다.

미세 유체 챔버 시스템을 사용하여 모터 뉴런 배양에서 세포기관의 축축한 수송

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