Name: 혈관 을 위한 신장 오르가노이드 및 Organotypic 문화의 최적화, 확장된 발달 및 향상한 현미경 검사법 화상 진찰 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: 배우세요 닭 배아 CAM을 이용한 신장 오르가노이드 혈관화 및 고해상도 현미경 검사법. 이 방법은 신장 발달 메커니즘 연구와 질병 모델링에 활용됩니다.

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이 작품은 수오멘 아카테미아 (핀란드 아카데미)에 의해 재정적으로 지원되었다 (206038, 121647, 250900, 260056; 우수 교부금 센터 2012-2017 251314), Munuaissätiö - 핀란드 신장 및 간 협회, 시그리드 주셀리우크센 Sätiö, 빅토리아스티프텔센, 핀란드의 스웨덴 문화 재단, 노보 노디스크, Syöpäjärjestöt (핀란드 암 학회), 유럽 공동체의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013; FP7-HEALTH-F5-2012-혁신-1 EURenOmics 305608), 및 H2020 마리 Sklodowska-Curie 혁신적인 행동 "6" RE2. 저자는 파울라 하이퍼스, 요한나 케콜라티-리아스, 하넬 레크만에게 기술 지원을 해주셔서 감사합니다.
그림 3, 4 및 무비 2는 개발의허가를 받아 재인쇄됩니다.

동물 관리 및 절차는 실험실 동물의 사용을위한 핀란드 의 국가 법률, 실험 및 기타 과학적 목적으로 사용되는 척추 동물 보호를위한 유럽 협약 (ETS 123), EU 지침 86/609 / EEC에 따라 시행되었습니다.
1. 닭 CAM에 마우스 배아 신장 및 신장 오르가노이드의 재배를위한 미니 저수지의 제조 및 이종이식 실험을 설정
<ol><li>6웰 또는 12웰 플레이트용으로 설계된 트랜스웰 세포 배양 인서트를 사용하십시오. 참고: 특정 실험에 따라 크거나 작은 미니 저장소를 사용할 수 있습니다. 최대 8개의 배아 신장을 이식하거나 동일한 닭 배아에 여러 개의 미니 저장소를 놓을 때(예: 동일한 닭 CAM에서 실험 및 대조군 샘플을) 작은 미니 저장소를 사용하는 것이 가장 좋습니다.</li>
	<li>원형 톱날 또는 핸드 톱이 달린 회전식 멀티툴을 사용하여 인서트 의 측면을 잘라내어 투과성 멤브레인이 부착된 2mm 높이의 플라스틱 링을 만듭니다.</li>
	<li>메스 나 날카로운 칼로이 미니 저수지의 가장자리를 연마.</li>
	<li>미니 저장소를 70% 에탄올로 1시간 이상 살균합니다.</li>
	<li>미니 저수지를 오토클레이브 이중 증류수로 세척하고 층상 후드에서 건조시키십시오.</li>
	<li>PBS 및 배양 매체 (고혈당 DMEM / 10 % FBS / 1 % 페니실린 - 스트렙 토미신)에서 미니 저장소를 헹구고 있습니다.</li>
	<li>페트리 접시에 저수지를 놓고, 멤브레인이 위를 향하여 배양 배지의 한 방울(600 μL/400 μL) 위에 놓습니다.</li>
	<li>파이펫 또는 유리 모세관의 도움으로 멤브레인에 골고루 해부 된 생체 내 배아 신장 또는 신장 오르가노이드를 배열하십시오. 신장 주위에 액체를 많이 남기지 마십시오.</li>
	<li>샘플을 37°C 및 5%CO2에서세포 배양 인큐베이터에서 2-24시간 동안 멤브레인에 부착시키십시오. 참고: 최대 8개의 E11.5 배아 마우스 신장 또는 신장 오르가노이드를 작은 삽입에 배열할 수 있습니다. 큰 삽입은 배아 조직의 더 큰 조각이 CAM의 더 큰 지역에 xenotransplant 또는 세포 하이드로겔 혼합물을 위해 사용될 경우에 추천됩니다.</li>
	<li>세포 배양 인큐베이터12,,13에서이전에 공표된 방법에 따라 제조된 8일된 전 오보 배양 배아 닭을 복용한다.</li>
	<li>접목이 CAM을 향하도록 미니 저장소를 CAM으로 옮기고 멤브레인이 오버레이되도록 합니다. 닭 배아를 덮지 않도록 CAM 주변에 미니 저장소를 놓습니다. 참고: 12개의 웰 플레이트용 트랜스웰 인서트에서 제작된 소형 미니저장소를 사용할 경우 하나의 CAM에 최대 3개의 미니 저장소를 배치할 수 있습니다.</li>
	<li>500 μL (6 웰 인서트를) 또는 300 μL (12 웰 삽입)의 배양 배지를 미니 저장소에 추가합니다.</li>
	<li>치킨 CAM에서 샘플을 최대 9 일 동안 재배하십시오. 매일 미니 저수지의 배양 매체를 교체하십시오. 참고 : 시료의 혈관 화는 이식 후 24-48 시간 즉시 관찰 할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 맞춤형 플레이트 제작 및 FiZD 문화 설정
<ol><li>6 웰 플레이트의 바닥에 20mm 직경 구멍을 뚫습니다. 참고: FiZD 실험의 경우 깊이가 16mm인 6개의 웰 플레이트를 사용합니다(재료 표에명시됨).</li>
	<li>카운터싱크 드릴 비트, 메스 또는 날카로운 칼이 있는 전기 드릴을 사용하여 구멍의 테두리(특히 위쪽)를 연마합니다.</li>
	<li>플레이트를 70% 에탄올로 살균하여 1시간 이상 살균합니다.</li>
	<li>오토클레이브 이중 증류수로 플레이트를 세척하고 멸균 조건에서 건조시키십시오.</li>
	<li>철저하게 70 % 에탄올로 22mm x 22mm 유리 커버 슬립을 세척하거나 Saarela 등11에의해 게시 된 프로토콜에 따라 청소합니다.</li>
	<li>무독성 조직 접착제를 사용하여 6 웰 플레이트의 구멍의 상부에 덮개 입술을 붙입니다. 구멍 주위에 접착제를 바르고 커버슬립을 가볍게 두어 덮습니다. 접착제를 말리십시오.</li>
	<li>스테레오현미경으로 플레이트를 검사하고 필요한 경우 커버슬립 표면에서 여분의 건조 접착제를 제거합니다. 참고: 커버슬립 위에 접착제가 없는지 확인하여 시료를 균일하게 압축합니다.</li>
	<li>폴리스티렌 비드(70 μm 입자 크기)를 동일한 양의 하이드로겔과 혼합합니다. 웰당 50-100 μL의 부피는 충분합니다. 참고 : 하이드로 겔과 폴리스티렌 구슬의 혼합물을 얼음에 보관하십시오.</li>
	<li>트랜스웰 삽입을 해부 현미경 아래에 멤브레인을 위로 배치합니다.</li>
	<li>시료(예를 들어, 생체내 배아 신장 또는 신장 오르가노이드)를 막에 고르게 배열한다.</li>
	<li>연약한 조직에 손상을 방지하기 위해 조심스럽게 샘플 옆에 하이드로겔 / 폴리스티렌 비드 혼합물을 추가합니다.</li>
	<li>트랜스웰 인서트를 뒤집어 서식샘플이 있는 멤브레인이 아래를 향할 수 있도록 합니다.</li>
	<li>수정 된 6 웰 플레이트의 웰에 삽입을 부드럽게 놓고 샘플이 구슬 수준으로 압축되도록 부드럽게 누릅니다. 참고 : 현미경을 사용하여 압축의 진행 상황을 따르십시오.</li>
	<li>인서트를 한 손으로 우물에 살짝 누르고 인서트 주변의 3점에서 납땜 인두로 플라스틱을 녹여 플레이트에 고정시십시오.</li>
	<li>인서트가 플레이트에 고정되면 배양 배지 2 mL (DMEM / 10 % FBS / 1 % 페니실린 - 스트렙 토마이신)을 웰에 추가하고 동일한 방법으로 플레이트에 남아있는 우물을 계속 조립하십시오.</li>
	<li>시간 경과 이미징을 위해 반전 된 현미경의 무대 인큐베이터에 완성 된 플레이트를 전송합니다.</li>
	<li>적절한 실험 설정을 사용하여 샘플의 타임랩스 이미징을 수행합니다. 참고: 타임랩스 실험 중에 플레이트의 우물에서 배양 배지를 변경하는 것은 필요하지 않지만 인서트가 있는 구멍을 통해 쉽게 수행할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Saxen, L., Wartiovaara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+contact+and+cell+adhesion+during+tissue+organization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell contact and cell adhesion during tissue organization.</a> International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).</li>
<li>Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchungen+%C3%BCber+die+tubulogenese+der+niere%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+F%C3%BCr+Naturforschung%22%5BJournal%5D)">Untersuchungen über die tubulogenese der niere.</a> Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).</li>
<li>Saxen, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaxen%2C+L+%22Organogenesis+of+the+Kidney.+1st+ed%22">Organogenesis of the Kidney. 1st ed</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (1987).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 536 (7615), 238(2016).</li>
<li>Halt, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD146%2B+cells+are+essential+for+kidney+vasculature+development%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">CD146+ cells are essential for kidney vasculature development.</a> Kidney International. 90, 311-324 (2016).</li>
<li>van den Berg, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+Subcapsular+Transplantation+of+PSC-Derived+Kidney+Organoids+Induces+Neo-vasculogenesis+and+Significant+Glomerular+and+Tubular+Maturation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).</li>
<li>Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+vascularization+of+the+metanephric+kidney+grafted+on+the+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane.</a> Developmental Biology. 96 (2), 427-435 (1983).</li>
<li>Sariola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incomplete+fusion+of+the+epithelial+and+endothelial+basement+membranes+in+interspecies+hybrid+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli.</a> Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).</li>
<li>Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+the+glomerular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The origin of the glomerular endothelium.</a> Cell Differentiation. 11 (1), 35-39 (1982).</li>
<li>Short, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Quantification+of+Tissue+Dynamics+in+the+Developing+Mouse+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney.</a> Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).</li>
<li>Saarela, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+fixed+z-direction+%28FiZD%29+kidney+primordia+and+an+organoid+culture+system+for+time-lapse+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging.</a> Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).</li>
<li>Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex-ovo+Chicken+Embryo+Culture+System+Suitable+for+Imaging+and+Microsurgery+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, e2154(2010).</li>
<li>Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+ex+ovo-cultivation+of+developing+chicken+embryos+for+human+stem+cell+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts.</a> Stem Cells International. 2013, 960958(2013).</li>
<li>Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt4+coordinates+directional+cell+migration+and+extension+of+the+M%C3%BCllerian+duct+essential+for+ontogenesis+of+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract.</a> Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).</li>
<li>Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie-1-directed+expression+of+Cre+recombinase+in+endothelial+cells+of+embryoid+bodies+and+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice.</a> Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).</li>
<li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).</li>
<li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

2개의 상세한 프로토콜은 고전적인 신장 organotypic 문화 방법을 구체화하고, 전 생체 내 배아 신장 및 오르가노이드의 혈관 세포화, 확장된 발달 및 최적 4D (즉, 3D 심상 및 시간) 화상 진찰을 가능하게 합니다 제시됩니다. 이 섹션에서는 메서드의 중요한 단계를 중대하고 문제 해결에 대해 설명합니다.
다른 CAM 배양 방법과 이 개선된 치킨 CAM 배양 방법의 유의한 차이점은 CAM에 배아 신장 및 신장 오르가노이드의 이종이식에서 맞춤형 미니저장소를 사용하는 것입니다. 수정된 트랜스웰 삽입의 멤브레인 바닥은 닭 CAM에 대한 샘플을 누르고 제자리에 유지합니다. 인서트의 측면은 접목을 건조로부터 보호하는 배양 배지의 저장소 역할을 합니다. 이 방법은 미니저장소를 배치할 수 있는 CAM의 더 큰 영역을 노출시키고 혈관화과정(12,,13)을시각적으로 쉽게 따를 수 있도...

배아 신장의 오르가노티픽 배양은 수십 년 전신발생을연구하는 중요한 모델이 되었다1,2,,3. 신장 오르가노이드는 건강하고 병에 걸린 신장의 발달을 연구하기위한 고급 모델 시스템을 나타냅니다4. 그러나 두 방법의 주요 단점은 두 방법 모두 신장의 주요 기능인 혈액 여과를 다시 요약하지 않는다는 것입니다. 네프론과 신장 혈관 구조는 생체 내 발달의 초기 단계와 유사하게 신장 오르가노이드 및 organotypic 문화에서 개발; 그러나, 시험관내에서 형성된 사구체는 avascular5. 생체내 배아 신장 및 신장 오르가노이드의 혈관화는 생체내 조건 하에서만 이식 실험에서 이전에 입증되었다. 예를 들어, 마우스 신장 캡슐 하에 인간 다능성 줄기 세포 유래 신장 오르가노이드의 이식은 기능적 단계6에오르가노이드에서 네프론의 발달을 허용한다.
순전히 생체외 배양과 생체 내 이식 방법 사이의 중간 접근법은 조류 배아의 CAM에 대한 이종이식이다. 그대로 마우스 신장 프리모르디아의 혈관화는 이전에 이 시스템을 사용하여 입증되었다7,,8. 그러나, 또한, 이종이이식된 뮤린 신장에서의 신장 혈관구조는 이식편9가아닌 숙주 내피로부터 유래된 것으로 나타났다. 이러한 관찰은 실험 조건이 공여자 유래 내피 세포의 생존을 위해 허용되지 않기 때문에 신장 혈관구조의 개발을 연구하기 위해 배아 신장의 키메라(조류-포유류) 모델의 잠재력을 현저히 감소시켰습니다.
이 프로토콜의 첫 번째 부분에서 제시 조류 계란의 CAM에 마우스 배아 신장의 재배에 대 한 향상 된 방법, organotypic 문화와 이종 이식의 미세 환경 조건을 결합. 이전 방법의 주요 개선은 마우스 배아 신장과 신장 오르가노이드를 CAM에 직접 배치하는 대신 이식 된 조직을 공급하는 배양 배지로 채워진 투과성 미니 저장소로 겹쳐져 있다는 것입니다. 영양분과 함께 건조로부터 보호합니다. 실험의 성공률은 크게 증가하고 기증자 유래 혈관 구조의 개발을위한 조건이 향상됩니다. 이 방법을 이방법에서 이방법 으로 이식 배양하는 것은 공여자 신장으로부터 내인성 내피 세포로 구성된 사구체 혈관구조의 발달을 초래한다.
세포 형태 형성의 상세한 분석은 신장 문화 모형의 또 다른 중요한 응용입니다. 신장 배양의 타임랩스 이미지 획득의 이전에 보고된 방법은 배아 신장의 전반적인 형태 및 패터닝의 분석에만 충분하지만, 개별세포(10)를추적하는 것은 아니다. 최근, 신장 오르가노이드 및 오르노티픽 배양의 고해상도 공초점 3D 타임랩스 영상을 겨냥한 새로운 고정 Z-Direction(FiZD) 방법을11개기하였다. 이 방법에서, 오르가노이드와 배아 기관은 샘플의 두께가 70 μm에 도달 할 때까지 맞춤형 설계 플레이트에 트랜스 웰 삽입의 유리 커버 슬립과 투과성 멤브레인 사이에 부드럽게 압축되어 이미징을위한 최적의 광학 조건을 제공합니다. 방법의 두 번째 부분에서는, 장기 오르가노이드 화상 진찰을 위한 사용자 정의 디자인한 격판덮개 및 FiZD 실험의 설치를 위한 상세한 프로토콜이 기술됩니다.

<table><tbody><tr><td>조정 가능한 스페이드 드릴 비트</td><td>Bosch</td><td>2609255277</td><td>직경 20mm 구멍 드릴링용</td></tr><tr><td>자동 에그 터너</td><td>OLBA B.V., 네덜란드</td><td>AT-42</td><td>전 OVO 설정 전 알의 부화용.</td></tr><tr><td>세포 인큐베이터</td><td>Panasonic</td><td>13090543</td><td>온도는 37°C로 설정되었습니다. C, 90% 습도, 5% CO2</td></tr><tr><td>Cell Incubator</td><td>SANYO</td><td>10070347</td><td>Chicken CAM 배양 인큐베이터. 온도는 37°C로 설정되었습니다. C, 습도 90%, CO2</td></tr><tr><td>Cellstar 6웰 플레이트</td><td>Greiner</td><td>M9062</td><td>인서트와 일치하는 16mm 웰 깊이</td></tr><tr><td>Dremel Rotary Tool</td><td>Dremel</td><td>SC690</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell 다중 웰 플레이트(투과성 폴리카보네이트 멤브레인 인서트 포함)</td><td>Corning</td><td>10301031</td><td>6웰 플레이트용. 40 & 마이크로; m 기공 크기</td></tr><tr><td>카운터 싱크 드릴 비트</td><td>Craftomat, Bauhaus</td><td>22377902</td><td>연마 용 (20.5mm, 1/4 ", HSS)</td></tr> <tr><td>일회용 유리 모세관</td><td>Blaubrand</td><td>7087 33</td><td></td></tr><tr><td>일회용 메스</td><td>Swann-Morton</td><td>0501</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>드릴링 머신</td><td>Bosch</td><td>GSR 18 V-EC Professional</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Sigma</td><td>D777</td><td>고포도</td></tr>당 <tr><td>난자 인큐베이터 컴팩트 S84</td><td>Grumbach, Germany</td><td>8012</td><td>ex ovo setup 전 난자 배양용. 온도는 38°C로 설정되었습니다. 상대 습도가 60% 이상으로 설정된 C</td></tr> <tr><td>에탄올(70%)</td> <td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수정란</td><td>Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland</td><td></td><td>Hy-Line White and Nick Chick</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>HyClone</td><td>SH3007003HI Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Forceps DUMONT #5 Dumont</td><td></td><td>#5SF</td><td></td></tr><tr><td>Glass Coverslips</td><td>Menzel-Gl&Auml; ser</td><td>Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0##</td><td>22x22 mm</td></tr><tr><td>Histoacryl Glue</td><td>Braun</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>무대 위 인큐베이터</td><td>Okolab</td><td></td><td>Boldline, 맞춤 제작</td></tr><tr><td>PBS -/-</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS +/+</td><td>Biowest</td><td>X0520-500</td><td>미니 저수지 세척.</td></tr><tr><td>페니실린 및 스트렙토마이신</td><td>시그마</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 비즈</td><td>코퍼스큘러</td><td>1000263-10</td><td>70 &마이크로; 직경 m</td></tr><tr><td>로터리 멀티 툴 시스템</td><td>Dremel</td><td>4000</td><td></td></tr><tr><td>납땜 인두</td><td>웰러</td><td>TCP S</td><td>가열 유리 모세관도 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Thincert 12 웰 세포 배양 인서트 0.4 &micro; m-pore 폴리스티렌 멤브레인</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665641</td><td></td></tr><tr><td>Thincert 6-well 세포 배양 인서트 0.4 &micro; m-pore 폴리스티렌 멤브레인</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657610</td><td></td></tr></tbody></table>

혈관 을 위한 신장 오르가노이드 및 organotypic 문화의 최적화, 확장된 발달 및 향상한 현미경 검사법 화상 진찰

Optimization of Renal Organoid and Organotypic Culture for Vascularization, Extended Development, and Improved Microscopy Imaging

배아 성 신장 organotypic 문화, 특히 다능성 줄기 세포 유래 신장 오르가노이드는 발달 과정을 따르고 신장 질환을 모델링하기위한 훌륭한 도구입니다. 그러나, 모델은 혈관화 및 기능의 부족에 의해 제한된다. 이를 해결하기 위해, 조류 배아의 융모란투막(CAM)에 세포 및 조직을 이식하는 방법에 대한 개선된 프로토콜이 개발되어 혈관을 혈관화하고 혈류의 회복을 얻었다. 접목은 샘플을 CAM에 고정하고 접목을 건조로부터 보호하는 배양 배지를 공급하는 맞춤형 미니 저장소로 오버레이됩니다. 개선된 배양 방법은 이종이식을 최대 9일 동안 자랄 수 있게 합니다. 원고는 또한 이전에 간행된 고정 Z 방향 (FiZD) 방법을 사용하여 신장 오르가노이드 및 orgnotnotypic 문화의 장기 공초점 화상 진찰을 위한 최적 조건을 제공하는 방법을 기술합니다. 이 방법은 유리 커버슬립과 멤브레인 사이에 배아 장기 또는 오르가노이드를 다량의 배지로 부드럽게 압축하고 최대 12일 동안 이미징을 위한 우수한 조건을 제공합니다. 함께, 이 방법은 향상한 공초점 화상 진찰을 가진 신장 오르가노이드 및 organotypic 신장 문화에 혈관화 그리고 혈류량을 허용합니다. 여기에 설명 된 방법은 생체 내 신장의 기본 및 적용 기능을 연구하는 데 매우 유용합니다. 두 방법 모두 다양한 유형의 조직 및 오르가노이드에 적용 가능합니다.

여기에 제시된 CAM 배양 프로토콜은 닭 CAM에 대한 이종이식의 결과로 신장 오르가노이드 및 배아 신장의 고효율 혈관을 가능하게하였다(그림 1, 영화 1). 배양 배지를 함유한 미니저수지는 기증자 조직에 영양분을 공급하고 적절한 혈관을 지정하기 전의 기간 동안 건조로부터 보호하였다. 이 방법은 기증자 유래 내피 세포가 성장하기 위한 관대한 조건을 제공했다. 따라서, 이식된 신장 및 오르가노이드에서 신장 혈관구조는 주로, 전적으로는 아니지만, 공여자 특이적 세포에 의해나타났다(도 2B,C,F). 더 성숙한 사구체 혈관구조는 신장 오르골형 배양보다 CAM에 이식된 신장 및 신장 오르가노이드에서 수득되었다(도2D,E).
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이 작품은 장기 발달을 연구하기위한 두 가지 방법, 배양 배아 장기 및 오르가노이드의 혈관 을 허용하는 조류 배아에서 융모난성 막 (CAM)에 개선 된 이종이식 설정및 새로운 고정 z 방향을 설명합니다. 고해상도 시간 경과 공초점 이미징을 허용하는 수정 된 실험 조건을 가진 장기 배양 방법.

혈관 을 위한 신장 오르가노이드 및 Organotypic 문화의 최적화, 확장된 발달 및 향상한 현미경 검사법 화상 진찰

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental ...

프로그램된 줄기 세포에서 파생되는 신장 기관 배양 및 세포기관은 신장 발달과 질병 뒤에 기계장치를 공부하는 훌륭한 방법을 제공합니다. 현재 장기 배양 시스템은 신장에 혈류를 제공하지 않습니다, 그러나. 이 때문에, 현재 모델은 불완전하고 혈액 여과인 신장의 주요 기능을 다시 수피하지 못하는 이유.이 간행물에서는, 우리는 닭 태아의 chorioallantoic 막에 배아 신장 및 오르가노이드의 재배 그리고 가시화를 위한 향상한 프로토콜을 제시합니다. 우리의 새로운 실험 설정에서, 우리는 문화 매체로 채워진 투과성 의미 저수지와 CAM에 이식 신장 기초를 오버레이. 이 프로토콜은 신장 기초의 생존과 또한 본질적인 내피 세포의 생존을 현저하게 증가시킵니다.이 방법은 개발 사구체에 혈액 흐름을 가능하게. 최근에는 고해상도 공초점 3D 타임랩스 이미징을 제공하는 새로운 고정 설정 방향 장기 배양 방법도 발표했습니다. 이 방법은 오르가노이드와 장기 기초의 장기 공초점 화상 진찰을 위한 최적 조건을 제공했습니다.접근에서, 우리는 유리 덮개 전표와 투과성 막 사이 조직을 부드럽게 압축합니다. 여기에서는 맞춤 설계된 플레이트가 어떻게 만들어지는지, 문화 실험이 어떻게 설정되는지 보여줍니다. 따라서, 이 출판물에서 우리는 향상된 신장 세포기관 튜브 문화 기술을 제시합니다.이 방법은 세포기관 기원을 모델링하고 배아 신장과 신장 오르가노이드 ex vivo를 연구하기 위해 고해상도 이미징을 수행하는 더 나은 방법을 제공합니다. 실험에 따라 6웰 또는 12웰 플레이트용으로 설계된 전송 셀 콘트라 인서트를 복용합니다. 드레멜 도구를 사용하여 인서트 측면을 잘라 투과성 멤브레인이 부착된 2mm 높이의 플라스틱 링을 만듭니다.메스나 날카로운 칼로 스와프에서 링의 가장자리를 연마합니다. 미니 저수지를 70% 에탄올로 최소 한 시간 동안 살균합니다. 그런 다음 증류수로 오토클레이브로 미니 저수지를 씻고 라미나르 후드로 말리십시오.PBS 및 문화 매체에서 미니 저장소를 헹구는 것입니다. 저수지를 배양 매체 한 방울 위에 놓고 멤브레인이 위쪽으로 향합니다. 해부된 전 생체 배아 신장 또는 신장 오르간로이드를 막에 배치합니다.샘플 주위에 많은 액체를 두지 말고 세포 배양 인큐베이터에서 2 시간에서 24 시간까지 부착하십시오. 각종 이식은 8일 된 전 오보 배아 닭의 초라알란토아막에 수행된다. 멤브레인이 접목을 덮을 수 있도록 미니 저장소를 이송합니다.그들은 배아를 커버하지 않도록 CAM의 주변에 배치. 그런 다음 미니 저장소에 배양 매체를 추가합니다. 최대 9 일 동안 치킨 CAM에 샘플을 재배.매일 미니 저수지의 배양 매체를 교체하십시오. 시료의 혈관화는 이식 후 이미 24~48시간 후에 관찰될 수 있다. 고정 된 문화에 대한 사용자 정의 디자인 된 6 웰 플레이트를 만들 수 있습니다.적절한 드릴 비트가 있는 드릴 머신을 사용하여 플레이트 바닥에 20mm 구멍을 뚫는 것으로 시작해야 합니다. 다음으로 플레이트 의 상부에 있는 구멍의 테두리를 연마합니다. 마지막으로, 플레이트를 70% 에탄올로 적어도 한 시간 동안 살균합니다.그런 다음 증류수로 오토클레이브로 접시를 씻고 레미어 후드로 말립니다. 22x22 밀리미터 커버 슬립을 70% 에탄올로 세척하고 완전히 건조시다. 조직 접착제를 사용하여 우물 의 바닥에 구멍 의 상단에 커버 슬립을 접착제.건조 후, 멸균 현미경으로 플레이트를 검사하고 과도한 접착제를 제거합니다. 첫째, 폴리스티렌 구슬의 알리쿼트와 동일한 양의 수소를 섞는다. 막이 위를 향하고 멤브레인을 향하고 있는 해부 현미경 아래에 트랜스필 삽입서를 놓고 멤브레인에 신장을 정렬합니다.신장 다음에 하이드로 젤 비드 혼합물 한 방울을 조심스럽게 넣습니다. 막과 신장이 아래로 향하고 있도록 트랜스필 삽입을 뒤집습니다. 그런 다음 신중하게 사용자 정의 디자인 6 웰 플레이트의 우리의 우물에 삽입을 배치합니다.삽입을 우물에 매우 부드럽게 밀어 넣습니다. 신장이 구슬과 수준에 있을 때까지 현미경에서 평탄화의 정도를 따르십시오. 한 손으로 우물에 약간 눌러 인서트를 유지하고 납땜 철로 인서트 주변의 3 점에서 플라스틱을 녹여 접시에 고정하십시오.측면에 있는 개구부를 통해 2밀리리터 배양 배지를 웰에 넣습니다. 시간 경과 이미징을 시작할 때 플레이트를 반전 된 현미경의 무대 인큐베이터로 옮기습니다. 당사의 수정된 CAM 포획 프로토콜은 신장 오르가노이드와 배아 신장의 고효율 혈관화를 가능하게 합니다.배양 배지를 함유한 많은 저수지는 기증자 조직을 공급하고 혈관을 진행하는 초기 기간 동안 건조로부터 보호합니다. 이 영화는 닭 CAM에 이식하고 7 일 동안 배양 배아 마우스 신장 센터에서 닭 혈구의 흐름을 보여줍니다. 이 그림 패널은 우리의 향상된 CAM 배양 방법이 신장 유래 내피 세포에 대한 허용 조건을 제공한다는 것을 보여줍니다.피규어 A와 B는 5일 간격 배양시 5일 동안 자라나는 배아 신장을 5일 동안 닭캠에 접목시켰다. 마우스 특이성 CD-31 항체를 염색하는 것은 CAM에 접목된 신장 센터의 내피 세포 네트워크가 좌측 대조군보다 더 광범위하다는 것을 보여준다. 그림 C에서 우리는 마우스 특정 CD-31 항체로 염색된 마우스 혈관이 닭 혈관으로 가장 많은 것을 봅습니다.피규어 D와 E는 5일 동안 여행 문화 또는 치킨 CAM에서 자라서 CD-31및 Hoechst로 염색된 마우스 배아 신장의 극저섹션을 보여줍니다. 사구질리 혈관은 제어 배양에서보다 닭 CAM에서 배양 신장에서 더 성숙합니다. 도F는 7일 동안 형질전환 GFP 닭의 CAM에서 배양된 마우스 배아 신장을 나타낸다.마우스 내피 세포는 CD-31 항체로 염색되고 우리는 xeno 이식 마우스 신장에 있는 혈관이 주로 그러나 독점적으로 파생되지 않다는 것을 관찰할 수 있습니다. 새로운 고정 설정 방향 문화는 제한된 설정 거리에서 배아 신장과 오르가노이드의 배양을 배양 할 수 있습니다. 전통적인 여행 문화에서 배양 된 장기는 금속 그리드에 의해 공기 중간 인터페이스에 보관되는 필터에 배치됩니다.이 방법은 개발 및 성장에 좋은 조건을 허용하지만 이미징에 최적이 아닙니다. 고정 된 설정 방향 문화에서, 배양 기관은 접시의 유리 바닥과 멤브레인 사이에 압착되고 그 두께는 여기에 스페이서로 작동하는 폴리스티렌 구슬에 의해 제어된다. 개발 기관은 기관의 향상된 보기를 주는 커버 유리를 통해 바로 이미지될 수 있습니다.이 그림 패널은 배아 신장과 신장 오르가노이드가 고정 된 방향 배양 방법으로 배양 될 수 있음을 보여줍니다. 배아 신장과 신장 오르가노이드의 밝은 필드 이미지는 7 일째에 정상적인 발달을 보여줍니다. 도 C에서, GFB 발현은 신장 오르가노이드의 발달 네프론에서 활성화되어 있으며, 신장 싹에 염색한 외상1개와 네프론 전구세포를 표시하는 6개의 2개의 염색이 있는 신장을 나타낸다.수치는 E와 F가 12일 동안 배양된 마우스 신장을 제시한다. 외상 하나와 nephron 염색은 유망싹과 podocites를 보여줍니다. 영화도 대만 크리가 내피 세포에서 GFB 발현을 유도하는 대만 크리 기원 MTMG의 배아 신장을 제시합니다.우리는 신장 내피 세포가 발전하는 배아 신장에서 존재하고 내피 망도 배양 방법에서 발전할 수 있다는 것을 알 수 있다. 오른쪽 패널에서 내피 세포가 S 자형 단계 nephron의 혈관 갈라진으로 이동하는 방법을 볼 수 있습니다. 여기에서 우리는 닭 CAM에 신장 오르가노이드와 배아 신장의 xeno 이식을 위한 향상된 프로토콜을 제출했습니다.이 프로토콜은 신장 기초의 생존과 또한 그들의 본질적인 내피 세포의 생존을 현저하게 증가시킵니다. 이 방법은 개발 사구체에 혈액 흐름을 가능하게. 여기에 제시된 그밖 프로토콜은 화상 진찰 질을 향상하고 단 하나 세포 수준에서 세포구 창세기를 공부하는 것을 돕는 고정된 설정된 방향 기관 배양 방법입니다.고해상도 이미지는 신장 오르가노이드 및 신장 배양에서 세포 행동의 자동화 된 세포 세분화 및 컴퓨터 기반 연구에 적합합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오는 조류 배아의 융모막막막(CAM)에 대한 개선된 이종 이식 설정을 사용하여 장기 발달을 연구하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 완전히 혈관화된 배양 배아 기관 및 오가노이드의 발달을 가능하게 합니다.

닭 CAM에 대한 신장 유기형 배양: 신장 혈관 구조의 형성을 유도하기 위해 닭 CAM에 쥐 신장 이식 기술

이 프로토콜에 기재된 삼차원 배양법 분지 기관에 자신의 상당한 팽창, 분화 및 형태 발생을 포함한 분산 배아 마우스 췌장 전구 세포로부터 췌장 개발 되풀이되었습니다. 이 방법은 영상, 틈새 시장의 기능 장애 및 조작에 대한 의무입니다.

분산 된 마우스 배아 전구 세포에서 생체 췌장 기관 형성에

장기의 전체 3D 구조 및 세포 함량뿐만 아니라 원래 조직과 의학적 유사성은 여기에 설명된 단세포 분해능 3D 이미징 프로토콜을 사용하여 포획될 수 있다. 이 프로토콜은 원기, 크기 및 모양이 다양한 광범위한 오르가노이드에 적용할 수 있습니다.

단세포 분해능 3차원 알래기 알코노이드

이 프로토콜은 환자 유래 제노이식(PDX)의 시험관 내 배양을 확장가능하게 하는 방법을 보여 줍니다. 한 단계는 실행 불가능한 단일 셀을 간단하게 제거하여 3D 하이드로겔에서 다세포 클러스터 배양의 전반적인 생존력을 향상시킵니다. 보조 단계는 PERfused 된 미세 유체 플랫폼에서 PDX 문화에 대한 모범 사례를 보여줍니다.

Perfused 마이크로 유체 플랫폼에서 환자 유래 제노이식의 Ex vivo 3D 하이드로겔 배양에 대한 향상된 생존력

여기서 우리는 인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)로부터 신장 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 두 주 이내에 신장 오가노이드를 생성합니다. 생성된 신장 오가노이드는 병렬 약물 테스트 접근법을 위해 대규모 스피너 플라스크 또는 다중 웰 자기 교반 플레이트에서 배양될 수 있다.

인간 다능성 줄기 세포로부터 신장 오가노이드를 생성하는 단순화된 방법

이 논문은mm2당 수백 개의 마이크로컨테이너를 사용하는 새로운 유형의 배양 기질에 대한 제조 프로토콜을 제시하며, 이 배양에서 오가노이드는 고해상도 현미경을 사용하여 배양 및 관찰할 수 있습니다. 세포 파종 및 면역 염색 프로토콜도 자세히 설명되어 있습니다.

오가노이드의 배양 및 3D 이미징을 위한 고처리량 플랫폼

여기에서 우리는 닭 배아의 celomic cavity에서 신장 오가노이드의 이식을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 8일 이내에 오가노이드의 혈관 형성 및 성숙 향상을 유도하고 이러한 과정을 효율적인 방식으로 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

닭 배아에서 Intracelomic Transplantation을 통한 신장 오가노이드의 효율적인 혈관 형성

이 프로토콜은 현탁 배양 조건을 사용하여 유도만능줄기세포(iPSC)에서 신장 오가노이드를 생산하기 위한 포괄적이고 효율적인 방법을 제시합니다. 이 연구의 주요 초점은 초기 세포 밀도와 WNT 작용제 농도의 결정에 있어 신장 오가노이드 연구에 관심이 있는 연구자에게 도움이 됩니다.

유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells)에서 현탁액의 신장 오가노이드 생성

여기에서는 여러 성숙 단계에서 인간 뇌 오가노이드를 병아리 융모막(CAM)에 생착하는 프로토콜을 제시합니다. 뇌 오가노이드는 유도되지 않은 표준화된 프로토콜에 따라 성장했습니다.

초기 비유도 인간 뇌 오가노이드 신경 혈관 틈새 모델링을 허용 병아리 배아 맥락막으로 모델링

이 프로토콜은 인간 만능 줄기세포를 사용하여 혈관 오가노이드를 생성하는 방법을 제시합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포(Human-Induced Pluripotent Stem Cells)에서 혈관 오가노이드 생성

배우세요 닭 배아 CAM을 이용한 신장 오르가노이드 혈관화 및 고해상도 현미경 검사법. 이 방법은 신장 발달 메커니즘 연구와 질병 모델링에 활용됩니다.

혈관 을 위한 신장 오르가노이드 및 Organotypic 문화의 최적화, 확장된 발달 및 향상한 현미경 검사법 화상 진찰

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