Name: 암세포 이동 및 침입에 대한 임피던스 기반 실시간 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 학습하세요 임피던스 기반 실시간 측정법으로 교모세포종(U-118MG) 세포의 이동과 침입을 평가하는 방법을. 이 기술은 염색이나 형광 표지 없이 암 전이 역학을 정확하게 분석할 수 있습니다.

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우리는 실시간 세포 분석 시스템 데이터에 대한 그녀의 기술 지원에 대한 올리비아 펑크 에게 감사드립니다. 우리는 또한이 원고를 편집 어린이 자비 캔자스 시티의 의료 쓰기 센터에 감사드립니다. 이 작품은 소아암 연구를위한 톰 Keaveny 부여 기금에 의해 지원되었다 (TP에) 어린이 자비 병원 중서부 암 얼라이언스 파트너 자문 위원회 자금 (TP에).

참고: 모든 세포 배양 물질은 멸균되어야 하며 전체 실험은 멸균 조건하에서 생물 안전 성 캐비닛에서 수행되어야합니다.
1. U-118MG 교모세포종 세포선의 배양 및 전기화
<ol><li>U-118MG 세포주를 5% 태아 소 혈청(FBS)에서 배양하여 덜베코의 변형된 독수리 배지(DMEM)(배양 배지)를 함유하고 5%CO2 인큐베이터(culture conditions)를 함유하는 습한 분위기에서 37°C에서 유지한다.</li>
	<li>전기 천공에 70- 80% 컨립 건강 세포를 사용하십시오.</li>
	<li>수확 세포를 위해, 1x PBS로 배양 접시에서 성장하는 세포를 세척하고 0.05 % 트립신-EDTA의 2 mL을 추가합니다. 인큐베이터에 30 s를 놓고 트립신-EDTA를 제거합니다. 배양 배지에서 세포를 15 mL 튜브로 수집하였다.</li>
	<li>핸드헬드 자동 셀 카운터를 사용하여 세포를 계산하고, 100 x g에서 원심 분리 세포를 5 분 동안 계산하고, 상급을 폐기한다.</li>
	<li>배양 배지에서 세포 펠릿을 중단하고 각 조건에 대해 600,000개의 세포를 미세원원지 튜브로 취합니다. 실험 설계 및 성장 속도에 따라 세포 수를 조정합니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 미세 원심 분리튜브로 옮기고 덜베코의 인산 완충식식염수(DPBS)를 800 μL추가합니다. 30s의 미니 원심 분리기를 사용하여 스핀 다운하고 상급을 버립니다.</li>
	<li>60 μL의 재서스펜션 버퍼 R을 세포 펠릿에 추가하고 siRNAs(즉, 비표적화 siRNA, Crk siRNA, CrkL siRNA, 또는 CrkL siRNA 둘 다)를 각각의 미세원심분리튜브에 6 μM의 농도로 첨가한다. 두드리면 부드럽게 섞으세요.</li>
	<li>전기포레이트 10 μL의 전기포레이트 세포는 1,350V에서 3개의 펄스로 10ms에 대해 배양 배지의 5 mL로 전기포기 세포를 전달한다. 각 조건에 대해 제조된 나머지 세포에 대해 전기 를 반복합니다.</li>
	<li>모든 전기 를 완료합니다. 조건당 2개의 35 mm 접시로 전기 포지셔닝 된 세포를 옮기고 3 일 동안 배양 조건하에서 배양하십시오.</li>
	<li>셋째 날에, 실제 세포 임피던스 측정 전에 6시간 동안 DMEM(low serum 배지)을 함유하는 0.5% FBS로 모든 전기 포이터세포를 치료한다.</li>
</ol>2. 실시간 세포 분석 시스템, 세포 침입 및 이동 (CIM) 플레이트 및 도금용 전기 기재 U-118MG 셀 의 준비
<ol><li>실험 개시 전 5-6시간 의 배양 조건 하에서CO2 인큐베이터에 실시간 세포 분석 시스템을 배치하여 배양 조건에 시스템을 안정화한다.</li>
	<li>침략 분석의 경우, CIM 플레이트의 상부 챔버의 각 웰에서 0.1 μg/μL에서 세포외 매트릭스(ECM) 겔을 함유하는 DMEM(일반 배지)의 플레이트 50 μL. 기포가 발생하지 않도록 하려면 역피펫팅 방법을 사용하십시오. 즉시 ECM 젤 30 μL을 제거하고 20 μL을 우물에 남깁니다.</li>
	<li>ECM 겔 코팅 후, 뚜껑을 닫고 4시간 동안 배양 조건 하에서 인큐베이터에 플레이트를 보관한다. ECM 겔 코팅 및 건조 동안, 판의 상부 챔버의 전극이 손, 생체 안전 성 캐비닛의 표면 또는CO2 인큐베이터와 직접 접촉하지 않도록 예방 조치를 취하십시오.</li>
	<li>임피던스 측정 프로그램을 설정하려면 연결된 소프트웨어 아이콘(재료 표참조)을 두 번 클릭하여 시스템 소프트웨어 응용 프로그램(제어 장치)을 엽니다. 각 크래들은 실험 조건, 임피던스 측정 시간 간격 및 기간 및 데이터 분석을 설정하는 서로 다른 탭이 있는 개별 창이 있습니다.</li>
	<li>레이아웃 탭에서 각 생물학적 조건에 대해 유정을 4배로 설정하고 일정 탭 아래에 2단계 셀 임피던스 측정값을 설정합니다. 첫 번째 단계는 일회성 기준선 측정(1분 간격으로 1회 스윕)을 위한 것이고, 두 번째 단계는 실제 실험을 위해 각각의 개별 크래들에서 세포 임피던스를 측정하는 것이다. 마이그레이션의 경우 10분 간격으로 145개의 스윕을 사용하고, 침공의 경우 각 개별 크래들에서 10분 간격으로 577개의 스윕을 개별적으로 설정합니다.</li>
	<li>세포 임피던스 측정이 시작되기 전에 1h, 플레이트의 하부 챔버의 우물에서 화학력으로 10% FBS로 DMEM의 160 μL을 추가한다. ECM 겔 코팅 웰또는 코팅되지 않은 웰을 포함하는 상부 챔버를 하부 챔버와 함께 조립하여 각각 침략 및 이동을 측정합니다.</li>
	<li>상부 챔버의 우물을 낮은 혈청 배지 50 μL로 채우고 시스템의 요람에 넣습니다. 메시지 탭을 클릭하여 제어 부에서 모든 웰을 인식하는지 확인합니다. 메시지가 확인됨으로표시되면 크래들의 플레이트가 실험에 사용할 준비가 된 것입니다.</li>
	<li>세포 배양 조건에 포장된 플레이트의 적응에 필수적인 실시간 세포 분석 시스템 크래들에서 측정하기 전에 1시간 동안 배양 조건 하에서 완전히 포장된 플레이트를 배양조건하에서 사전 인큐베이터에 서있다.</li>
	<li>낮은 혈청 배지로 처리된 수확 세포의 경우, 1.3단계에서와 같이 세포를 트립시니화하고, 낮은 혈청 배지에서 수집하고, 1.4단계에서와 같이 세포를 카운트한다.</li>
	<li>세기 후, 원심분리세포를 100 x g에서 5분 동안 폐기하고 상한자를 버린다.</li>
	<li>이동 및 침입 세포에 대한 낮은 혈청 배지의 800 μL에서 800,000 개의 세포를 다시 중단시. 또한, 300,000 개의 세포를 배양 배지와 종자 에서 35 mm 접시에 재중단하여 서양 얼룩 분석을 통해 Crk 및 CrkL의 조절 된 녹다운을 확인합니다.</li>
</ol>3. 기준선 판독, 셀 파종 및 세포 임피던스 측정 및 시각화
<ol><li>크래들 시작 버튼을 클릭하여 기준선 판독값을 측정합니다. 기준선은CO2 인큐베이터에서 배양 조건 하에서 실시간 세포 분석 시스템의 요람에서 1시간 동안 플레이트를 사전 인큐베이팅한 후, 상부 챔버내의 각각의 웰에 세포를 파종하기 전에 판독되어야 한다. 참고: 크래들 시작 버튼을 클릭하면 제어 장치가 실험 파일을 저장할지 여부를 묻습니다. 파일을 저장한 후 크래들 분석기는 프로그램에 설정된 대로 기준 셀 임피던스를 측정하고 크래들 시작 버튼을 다시 클릭하여 두 번째 단계에서 셀 임피던스를 측정할 때까지 일시 중지 모드로 들어갑니다.</li>
	<li>베이스라인 측정 후 요람에서 이동 및 침입을 위해 두 플레이트를 모두 꺼내 생체 안전 캐비닛에 보관하십시오.</li>
	<li>종자 100 μL의 세포(100,000 세포)는 기포를 피하기 위해 역피펫팅에 의해 크래들의 제어부에 프로그래밍된 바와 같이 각각의 웰즈에 있는 CIM 플레이트의 상부 챔버내의 각 생물학적 상태에 대해 4배로 증가한다.</li>
	<li>파종 후, 세포가 바닥까지 고르게 정착할 수 있도록 플레이트를 실온에서 30분 동안 생체 안전 성 캐비닛 아래에 보관하십시오. 플레이트를 각 크래들로 다시 전송하고 크래들 시작 버튼을 클릭하여 2.5의 두 번째 단계에서 프로그래밍된 대로 셀 임피던스 측정을 시작합니다.</li>
	<li>마지막 스윕 이 끝나면 실험이 완료되고 결과가 자동으로 저장됩니다.</li>
	<li>데이터 분석 탭에서 실험 을 완료하는 동안 또는 완료 후 시간에 따라 셀 인덱스로 셀 임피던스의 변화를 시각화합니다. 각 쿼드런플리케이트 조건은 평균 및 표준 편차에 대한 옵션 상자를 클릭하여 개별적으로 또는 평균 및/또는 표준 편차로 시각화할 수 있습니다.</li>
	<li>셀 인덱스 데이터를 스프레드시트 파일로 내보내려면 빈 스프레드시트 파일을 열고 데이터 분석 창 중간에 커서를 배치하고 마우스 오른쪽 단추를 클릭합니다. 표시되는 대화 상자에서 데이터 복사 옵션을 목록 형식으로 복사하고데이터를 열린 스프레드시트에 붙여넣습니다.</li>
	<li>원시 데이터의 시간을 조정하여 셀 임피던스 측정의 실제 시작 시간을 나타냅니다. 두 번째 단계 시작 시간은 0으로 설정됩니다. 참고: 제어 부는 정규화 유무에 관계없이 셀 인덱스를 가져오고 시간 의존적 방식으로 결과를 그래픽 프리젠테이션으로 시각화할 수 있는 옵션을 갖습니다. 이 예제에서는 처리 및 그래픽 프레젠테이션을 위해 정규화 없이 셀 인덱스 데이터를 내보내게 됩니다.</li>
	<li>각 크래들에서 릴리즈 버튼을 클릭하여 실험을 해제합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Park, T., Koptyra, M., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+Growth+Requires+CT10+Regulator+of+Kinase+%28Crk%29+and+Crk-like+%28CrkL%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL).</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Mudduluru, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Axl+receptor+tyrosine+kinase+expression+by+miR-34a+and+miR-199a%2Fb+in+solid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer.</a> Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).</li>
<li>Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+zinc+finger+1+induces+migration%2C+invasion%2C+and+in+vivo+metastasis+through+Axl+gene+expression+in+solid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer.</a> Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).</li>
<li>Khalili, A. A., Ahmad, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+Cell+Adhesion+Studies+for+Biomedical+and+Biological+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).</li>
<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Tumor+Models%3A+Advantages%2C+Disadvantages%2C+Variables%2C+and+Selecting+the+Right+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).</li>
<li>Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+xCELLigence+RTCA+Instrument+to+Measure+Cell+Adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion.</a> Bio Protocols. 7 (24), 2646(2017).</li>
<li>Scrace, S., O'Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+xCELLigence+system+for+real-time+analysis+of+changes+in+cellular+motility+and+adhesion+in+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+Tyrosine+Phosphorylation+Regulates+PDGF-BB-inducible+Src+Activation+and+Breast+Tumorigenicity+and+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis.</a> Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).</li>
<li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).</li>
<li>Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+method+for+detection+of+endothelial+cell+shape+change+in+real+time%3A+assessment+of+endothelial+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function.</a> Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).</li>
<li>Collins, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+proteins+transduce+FGF+signaling+to+promote+lens+fiber+cell+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Fathers, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+adaptor+proteins+act+as+key+signaling+integrators+for+breast+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis.</a> Breast Cancer Research. 14 (3), 74(2012).</li>
<li>Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+and+CrkL+are+required+for+cell+transformation+by+v-fos+and+v-ras%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras.</a> Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).</li>
<li>Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+adapter+proteins+promote+an+epithelial-mesenchymal-like+transition+and+are+required+for+HGF-mediated+cell+spreading+and+breakdown+of+epithelial+adherens+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).</li>
<li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+roles+of+Crk+and+CrkL+in+fibroblast+structure+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility.</a> Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).</li>
<li>Rodrigues, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrkI+and+CrkII+function+as+key+signaling+integrators+for+migration+and+invasion+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells.</a> Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).</li>
<li>Feller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+family+adaptors-signalling+complex+formation+and+biological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles.</a> Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).</li>
<li>Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+and+craniofacial+defects+in+Crk-null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).</li>
<li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+and+Crk-like+play+essential+overlapping+roles+downstream+of+disabled-1+in+the+Reelin+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).</li>
<li>Hallock, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dok-7+regulates+neuromuscular+synapse+formation+by+recruiting+Crk+and+Crk-L%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L.</a> Genes & Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

실시간 셀 분석 시스템을 사용하여 세포 이동 및 침입의 실시간 측정은 단일 시점에서 데이터를 제공하는 기존의 방법에 비해 여러 가지 중요한 장점을 가진 간단하고 빠르며 지속적인 모니터링 프로세스입니다. 기존의 방법과 마찬가지로, 각 세포주들은 기질, 성장, 세포 간 접촉, 및 철새에 대한 접착측면에서 다를 수 있기 때문에 실시간 세포 분석 시스템을 위한 각 세포주마다 실험 조건을 최적화해야 하며, 침략적 능력. 이러한 차이로 인해, 각 세포주들은 상이한 세포 역학 및 세포 임피던스를 나타낼 수 있다. 임피던스는 우물에서 시드된 세포의 수, 세포 접착 시간, 세포가 이동또는 침입하기 시작하기 전의 지연 시간, CIM 플레이트에서의 ECM 겔 농도에 의해 크게 영향을 받습니다. 첫째, 실시간 세포 분석은 특정 기간에 걸쳐 실시간으로 결과를 제공하기 때문에 최적화를 쉽게 만들어, 연구원은 제어 세포가 활성 세포 이동 및 침입을 표시할 때 및 제어 할 때 시간을 식별 할 수 있습니다 세포는 이주와 침략의 최대 수준에 도달합니다. 둘째,...

암은 다른 장기로 전이하는 능력으로 인한 치명적인 질병입니다. 암 유전자형 및 표현형을 결정하는 것은 효과적인 치료 전략을 이해하고 설계하는 데 매우 중요합니다. 암 연구의 수십 년은 암 유전자형 및 표현형을 결정하기 위하여 다른 방법의 발달 그리고 적응으로 이끌어 냈습니다. 최신 기술 개발 중 하나는 세포 임피던스에 기초한 세포 이동 및 침입의 실시간 측정입니다. 기질 및 세포 세포 접촉에 대한 세포 접착은 세포 간 통신 및 조절, 개발 및 조직의 유지 보수에 중요한 역할을 합니다. 세포 접착의 이상은 세포 접촉의 손실로 이끌어 내고, 세포외 매트릭스 (ECM)의 저하, 세포에 의한 철새 및 침입 능력의 이득, 모두는 다른 기관에 암세포의 전이에기여1,,2. 세포 이동(상처 치유 및 보이든 챔버 분석)과 침략(Matrigel-Boyden 챔버 분석)3,,4,,5를결정하는 다양한 방법이 사용 가능하다. 이러한 종래의 방법은 세포 표현형을 측정하기 위해 실험 전후에 형광 염료 또는 기타 염료로 표지되어야 하기 때문에 반정적이다. 또한, 기계적 중단은 상처 부위로세포의 이동을 측정하기 위한 상처를 만들기 위한 경우에 필요하다. 또한 이러한 기존 방법은 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이며 한 번에 결과를 측정합니다. 또한, 이러한 방법은 실험절차6 동안 일관되지 않은 취급으로 인해 부정확한 측정을 하는 경향이 있다.
기존의 방법과 달리 실시간 세포 분석 시스템은 세포의 사전 또는 포스트 염색 및 기계적 손상없이 실시간으로 세포 임피던스를 측정합니다. 더 중요한 것은 생물학적 효과가 시간에 따라 결정될 수 있도록 실험 기간을 연장할 수 있다는 것입니다. 실험을 실행하는 것은 시간 효율적이며 노동 집약적이지 않습니다. 데이터 분석은 비교적 간단하고 정확합니다. 다른 방법에 비해,이 방법은 세포 이동 및 침입을측정하는 가장 좋은 실시간 측정 중 하나입니다6,7,,8,,9.
Giaever 및 Keese는전극(10)의표면에 대한 세포 집단의 임피던스 기반 측정을 최초로 기술했다. 실시간 셀 분석 시스템은 동일한 원리로 작동합니다. 각 마이크로 플레이트의 면적은 약 80%가 금 마이크로 전극으로 덮여 있습니다. 전극 표면적이 셀의 준수 또는 확산으로 인해 셀에 의해 점유되면 전기 임피던스가 변경됩니다. 이러한 임피던스는 전극 표면적을 덮는 세포에 정비례하는 세포 지수로서 표시되며, 이는 미세다공성 멤브레인을 관통한 후(이 멤브레인의 중간 기공 크기는 8 μm)11.
Crk 및 CrkL은 SH2 및 SH3 도메인을 포함하는 어댑터 단백질이며 세포골격 조절, 세포 변형, 증식, 접착, 상피-중간엽 전이, 이동, 침략 및 전이와 같은 다양한 세포 기능에서 중요한 역할을 하며 많은 신호 경로에서 단백질-단백질 상호작용을 많이 중재함으로써,,14,1,,,12,,14, 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14 , 14, 14 , 14 , 14 , 14 ,14,1614 18. 따라서, 암세포의 Crk/CrkL 의존적 철새 및 침습적 능력을 결정하는 것이 중요하다. 실시간 세포 분석은 Crk 및 CrkL의 유전자 녹다운 시 교모세포종 세포의 철새 및 침습 능력을 결정하기 위해 수행되었다.
이 방법 논문은 Crk- 및 CrkL 매개 이동 및 인간 교모세포종 세포의 침입의 상세한 측정을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>생물 안전 캐비닛</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1300 시리즈 클래스 II, 유형 A2</td><td></td></tr><tr><td>CIM 플레이트</td><td>Agilent Technologies, Inc의 세포 분석 부서</td><td>5665825001</td><td>세포 침입 및 이동 플레이트</td></tr><tr><td>Crk siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>J-010503-10</td><td></td></tr><tr><td>CrkL siRNA</td><td>Ambion</td><td>ID: 3522 및 ID: 3524</td><td></td></tr><tr><td>둘베코' s 변형된 독수리' 세포</td> <td>배양에 사용되는</td> <td>ATCC</td><td>302002</td> 배양 배지</tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)</td><td>세포 세척에 사용되는 Gibco</td><td></td> <td>21-031-CV</td> DPBS</tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i CO2 인큐베이터</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51030285</td><td>CO2 인큐베이터</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Bioscience</td><td>354234</td><td>세포외 매트릭스 겔</td></tr><tr><td>네온 전기천공법 시스템</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td>전기천공법 시스템</td></tr><tr><td>네온 형질주입 시스템 10 &micro; L kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1025</td><td>Electroporation kit</td></tr><tr><td>Non-targeted siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-01</td><td>non-targated control용 siRNA</td></tr><tr><td>Odyssey CLx (이미징 시스템)</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>웨스턴 블롯 이미징 시스템</td></tr><tr><td>RTCA 소프트웨어</td><td>Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc</td><td></td><td>실험</td></tr><tr><td>에 사용되는 기기Scepter</td><td>Millipore</td><td>C85360</td><td>휴대용 자동 세포 계수</td></tr>기 <tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>U-118MG</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB15</td><td>실험에 사용되는 세포주</td></tr><tr><td>xCELLigence RTCA DP</td><td>세포 분석 부서 Agilent Technologies, Inc</td><td>380601050</td><td>실험에 사용되는 기기</td></tr></tbody></table>

암세포 이동 및 침입에 대한 임피던스 기반 실시간 측정

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

암은 유전 불안정성, 돌연변이 및 환경 및 그밖 긴장 요인에 의해 시작된 세포의 통제되지 않는 증식 때문에 생깁니다. 복잡한, 다층 분자 신호 네트워크에서 이 취득한 이상은 비정상적인 세포 증식 및 생존, 세포외 매트릭스 분해 및 먼 기관에 전이를 유도합니다. 암 관련 죽음의 대략 90%는 전이성 보급의 직접 또는 간접적인 효력에 기인하기 위하여 추정됩니다. 따라서 유전 적 및 환경 적 조작에 따라 암 세포 행동을 특성화하는 매우 신뢰할 수있는 포괄적 인 시스템을 구축하는 것이 중요합니다. 이러한 시스템은 암 전이의 분자 조절에 대한 명확한 이해와 계층화 되고 정확한 치료 전략의 성공적인 개발을위한 기회를 제공 할 수 있습니다. 그러므로, 유전자의 기능의 이득 또는 손실과 가진 이동 및 침략과 같은 암세포 행동의 정확한 측정은 암세포의 공격적인 본질의 평가를 허용합니다. 세포 임피던스를 기반으로 한 실시간 측정 시스템을 통해 연구원은 전체 실험 중에 지속적으로 데이터를 수집하여 다양한 실험 조건에서 결과를 즉시 비교및 정량화할 수 있습니다. 기존의 방법과 달리 이 방법은 마이그레이션하거나 침입하는 셀을 분석하기 위해 고정, 염색 및 샘플 처리를 필요로 하지 않습니다. 이 방법 논문은 교모 세포종 암세포의 이동 및 침입의 실시간 측정을위한 상세한 절차를 강조한다.

Crk 및 CrkL은 상이한 암 세포주13,,17에서세포 이동 및 침입에 중요하다고 제안되었다. Crk 및 CrkL 단백질은 구조적으로 그리고 기능적으로 서로 유사하고 필수적인 중첩함수16,,19,,20,,21을재생하지만, Crk 및 CrkL에 대한 많은 유전자 녹다운 연구는 Crk, CrkL 또는 둘 다에 특이적인지 명확하게 다루지 않았다. 따라서, 두 단백질 중 어느 것이 세포 이동 및 침입에 기여하는지는 불분명하다. 원리 증명 연구로, 우리는 Crk 또는 CrkL에 특정 siRNAs를 사용하고 U-118MG GBM 세포주의 이동 및 침략에 대한 그들의 효력을 공부했습니다. Crk의 녹다운은 C...

암은 다른 장기로 전이하는 능력으로 인한 치명적인 질병입니다. 다양한 치료 조건하에서 암세포가 이동하고 침입하는 능력을 결정하는 것은 치료 전략을 평가하는 데 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 교모세포종 암 세포주들의 실시간 전이성 능력을 평가하는 방법을 제시한다.

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

이 프로토콜을 사용하여, 세포 이동 및 침략은 유전자 기능 및 약물의 손실 또는 이득하에서 세포 역학을 가능하게 하는 실시간 조건하에서 드러나질 수 있다. 다른 방법과 는 달리 염색, 기계적 세포 손상 또는 형광 마커가 필요하지 않습니다. 가장 중요한 것은, 실시간 세포 운동학은 효과적인 방식으로 결정될 수 있다.U-118MG 세포주 배양이 70~80%에 도달하면 PBS로 세포를 세척한 후 0.5%의 트립신-EDTA의 2밀리리터로 세포를 치료한다. 섭씨 37도에서 30초 후, 신선한 배양 배지의 10 밀리리터로 반응을 멈추고 분리된 세포를 15밀리리터 원컬튜브로 옮춥시다. 계산 후, 원심분리에 의해 세포를 수집하고 신선한 배지의 적절한 부피에서 조건 농도당 6회 10에서 다섯 번째 세포로 펠릿을 재연한다.조건당 1개의 미세원심분리기 튜브로 6번 10번 을 옮기고 각 튜브에 덜벡코의 PBS의 800마이크로리터를 추가한다. 원심 분리 후, 각 펠릿을 60 마이크로리터의 재서스펜션 버퍼 R 및 관심 있는 siRNA의 6마이크로몰라로 재보종. 각 튜브를 부드러운 태핑과 혼합한 후 각 셀 서스펜션의 10마이크로리터 알리쿼트10개를 10밀리초 1, 350볼트 펄스로 감식합니다.각 치료 후, 신선한 배양 배지의 개별 5 밀리리터 알리쿼트에서 각 조건에서 전극 된 세포를 풀. 그런 다음 조건당 2개의 35 밀리미터 배양 접시로 세포를 시드하고 3 일 동안 세포 배양 배양 배양에 세포를 놓습니다. 실시간 세포 분석 5~6시간 전에 실시간 세포 분석 시스템을 세포 배양 인큐베이터에 배치합니다.침입 분석서를 설정하려면 역파이프를 사용하여 세포 외 매트릭스 젤의 밀리리터 당 0.1 마이크로그램으로 보충된 DMEM의 50 마이크로리터를 세포 침입 플레이트의 상부 챔버의 각 우물에 배치하십시오. 도금 직후, 각 우물에서 세포외 매트릭스 용액의 30 마이크로리터를 제거하고 4 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 배치합니다. 임피던스 측정 프로그램을 설정하려면, 측정 6시간 전에, 모든 전극형 세포 배양에서 저혈재 배지로 배지를 교체한다.관련 임피던스 측정 소프트웨어의 레이아웃 탭에서 각 생물학적 상태에 대해 4배로 웰을 선택합니다. 일정 탭에서 1분 간격으로 일회성 기준측정 스윕 단계를 설정하고 실제 실험을 위해 각각의 개별 요람에서 셀 임피던스를 측정하는 두 번째 단계를 설정합니다. 세포 임피던스 측정이 시작되기 1시간 전에, 세포 침범 및 이주 판의 하부 챔버의 우물에 화학요법제로 10%의 태아 소 혈청으로 보충된 160마이크로리터를 첨가한다.침략을 측정하기 위해 세포외 매트릭스 젤 코팅 우물을 포함하는 상부 챔버를 조립하십시오. 마이그레이션을 측정하려면 상부 챔버에서 코팅되지 않은 우물을 사용합니다. 두 가지 유형의 실험의 경우, 상부 챔버의 우물을 50 마이크로리터의 낮은 혈청 배지로 채우고 챔버를 시스템의 요람에 놓습니다.소프트웨어의 메시지 탭을 클릭하여 모든 우물이 제어 장치에서 인식되는지 여부를 확인합니다. 메시지가 예상대로 표시되면 요람의 플레이트가 실험에 대한 준비가 되었습니다. 그런 다음 완전히 포장된 플레이트를 세포 배양 조건에 적응하기 위해 1시간 동안 실시간 세포 분석 시스템 요람에 세포 배양 배양배소에 배치한다.플레이트가 평형되는 동안, 각 조건에서 8회 10회에서 낮은 혈청 중간 농도의 800 마이크로리터 당 다섯 번째 세포로 세포를 재보습하는 것으로 진보세포종을 수확한다. 또한, 하류 서양 얼룩 분석을 위한 35밀리미터 접시에 파종하기 위한 배양 배지의 2밀리리터에 5번째 세포에 3번 10번 을 따로 둡니다. 기준선 사전 마이그레이션 판독값을 측정하려면 적응이 끝나면 요람 시작 단추를 클릭합니다.기준선 측정을 획득한 후, 각 요람에서 이주 및 침략 판을 생물 안전 캐비닛으로 옮길 수 있습니다. 역피 피펫 100 마이크로리터는 요람의 제어 부에 프로그래밍된 바와 같이 세포 침입 및 이주 플레이트의 적절한 우물에서 각 생물학적 상태에 대해 상층실 우물을 네 배로 배반한다. 시드 후, 실온에서 30분 동안 생체 안전 캐비닛에 플레이트를 보관하여 각 요람으로 플레이트를 옮기기 전에 플레이트 바닥에 균등하게 정착할 수 있도록 합니다.요람 시작 버튼을 클릭하여 셀 임피던스 측정을 시작합니다. 실험 완료 중 또는 실험 완료 후 시간 종속 방식으로 셀 임피던스의 변화를 시각화하려면 데이터 분석 탭을 엽니다. 각 조건에 대한 데이터를 개별적으로 또는 평균 및/또는 표준 편차로 시각화하려면 평균 및 표준 편차에 대한 옵션 상자를 클릭합니다.셀 인덱스 데이터를 스프레드시트 파일로 내보내려면 데이터 분석 창 중간에 커서를 배치하고 마우스 오른쪽 단추를 클릭합니다. 표시되는 대화 상자에서 복사 데이터를 목록 형식 옵션으로 선택하고 데이터를 열린 스프레드시트에 붙여 넣습니다. 실험을 해제하려면 각 요람의 릴리스 단추를 클릭합니다.Crk 어댑터 단백질 녹다운은 Crk1 및 Crk2 단백질 수치를 Crk와 같은 단백질 수준을 유도하지 않고 각각 85%와 86%씩 감소합니다. Crk와 같은 녹다운은 Crk1 및 Crk2 단백질 수치가 약간 감소하여 Crk와 같은 단백질 발현을 85% 감소시킵니다. 두 siRNA를 결합하면 Crk1, Crk2 및 Crk와 같은 표현을 80% 이상 감소시키며, 빈쿨린이나 알파-투굴린 발현은 Crk 또는 Crk와 같은 넉다운의 조합에 의해 영향을 받지 않습니다.인간의 뇌 교모세포종 세포는 13 시간에서 이동의 최대 수준에 도달 높은 혈청 농도에 대한 응답으로 그라데이션을 따라 마이그레이션. Crk 녹다운 셀에서는 마이그레이션이 처음에는 지연되었지만 세포는 23시간까지 계속 마이그레이션되었습니다. Crk 와 같은 녹다운은 교모세포종 세포주가 암 세포 이동에서 Crk와 Crk와 같은 중요한 중첩 역할을 한다는 것을 제안하는 Crk와 Crk와 같은 두 가지 의 낙폭 시 철새 능력을 완전히 잃어감이면 세포 이동을 실질적으로 감소시킵니다.그러나, 세포 침략이 며칠 동안 감시될 때, Crk knockdown 세포는 Crk 와 같은 세포가 부분적으로 침략능력을 90시간까지 회복하고 40시간 후에 침략하는 감소된 능력을 보여주는 이중 Crk-Crk 세포와 60시간에서 교모세포종 세포를 통제하는 것과 비교되는 유사한 최대 세포 침략 수준에 도달합니다. 결과는 명확하게 세포 침략이 실험의 전체 기간 동안 분석되어야 한다는 제안을 지원합니다. 침략 분석 및 종자 세포에 대한 세포 외 매트릭스를 기록하는 동안 세포의 오른쪽 수를 시드하고 기포를 피하는 것은이 실험의 성공을위한 핵심 포인트입니다.유사한 절차에 따라 그러나 전자 플레이트를 사용하여, 세포 접착 및 세포 증식 운동학은 결정될 수 있습니다.

impedance-based-real-time-measurement-cancer-cell-migration

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

암 세포에 의해 내피 세포 단층의 침략을 측정하는 실시간 전기 임피던스 기반 기술

이 비디오는 전기 임피던스를 기반으로 하는 3챔버 어레이를 사용하는 침입 분석에 대해 설명합니다. 이 기술은 종양 미세환경에서 상주하는 기질 세포가 분비하는 수용성 인자의 영향으로 암세포의 침습 가능성을 측정합니다.

Three-chambered Array-based Impedance Assay: 전기 임피던스를 측정하여 암세포의 침습 가능성을 평가하는 실시간 분석 기법

출처: Mudduluru, G., et. al. 암세포 이동 및 침입의 임피던스 기반 실시간 측정. J. Vis. Exp. (2020)이 비디오는 교모세포종 세포 침입 및 이동을 측정하기 위한 임피던스 기반 분석을 보여줍니다. 세포는 세포외 기질을 분해하고, 미세 다공성 막을 통해 이동하며, 전극에 부착하여 임피던스를 생성합니다. 이 실시간 분석은 암 연구 응용 분야에 대한 침습적 잠재력을 반영합니다.

뇌암 세포 침입의 임피던스 기반 측정

일반적으로 사용되는 체외에서 세포의 이동 및 침윤을 조사하기위한 고도의 접근 방법이 설명되어 있습니다. 첫 번째 방법은 세포 운동성을 측정하는 세포 상처 폐쇄 분석이다. 두 번째 방법은 화성과 세포의 침략적인 능력을 평가하는 트랜스 웰 마이그레이션 및 침입 분석이다.

체외 세포 이동 및 내습 분석 실험에서

이 프로토콜은 전기 세포 기판 임피던스 감지, 세포 부착, 증식, 운동성 및 약리 및 독성 자극에 대한 세포 반응의 정량화에 부착 세포의 임피던스 스펙트럼을 기록하고 분석 할 수있는 방법을 검토합니다. 내피 세포의 투과성과 세포 - 세포 및 세포 - 기질 연락처 평가의 검출이 강조된다.

전기 세포 기판 임피던스 내피 증식, 장벽 기능의 정량화에 대한 감지 및 운동성

복막의 중피 안감에 난소 암 세포의 침공은 시간이 지남에 따라 역동적 인 과정이다. 실시간 분석기를 활용 타원체-중피 세포 공동 배양 모델의 난소 암 세포의 침윤 능력은 전이 과정을 조절하는 인자에 대한 통찰력을 제공하고, 장기간의 시간주기에 걸쳐 정량화 될 수있다.

실시간으로 중피 세포의 난소 암 회전 타원체의 부착과 침략의 평가

HMCA 기반 이미징 접시 침공 분석 결과 성능을 위해 제공 됩니다. 이 접시는 spheroids 3 차원 (3D) 종양의 형성과 기질 (ECM)에 암 세포의 측정을 촉진 한다. 침공 분석 결과 정량화 자동 분석 함으로써 이루어집니다.

암 세포 침입과 반대로 전이성 마약 히드로 마이크로-챔버 배열 (HMCA)를 사용 하 여 심사 분석-플레이트를 기반으로

현재 프로토콜 암 세포 마이그레이션 및 실시간으로 단일 플랫폼에서 침입을 조사 하 고, 세포 이동성 및 형태학 연구를 쉽게 재현할 수 및 시간 효율적인 옵션을 제공 하는 통합된 방법을 설명 합니다.

자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

우리는 침습적 세포 하위집단을 실시간으로 검출하고 포획하는 접근법을 기술한다. 실험 설계는 세포의 전기 임피던스의 변화를 모니터링하여 실시간 세포 분석을 사용합니다. 복잡한 조직에서 침습성 암, 면역, 내피 또는 기질 세포를 포획 할 수 있으며 공동 배양의 영향을 평가할 수 있습니다.

공동 배양물로부터의 침습적 세포 하위집단의 실시간 검출 및 포획

상향 조절된 많은 유전자는 종양 세포의 이동과 침입을 자극하여 예후를 악화시킵니다. 어떤 유전자가 종양 세포의 이동과 침입을 조절하는지 알아내는 것은 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 종양 세포의 이동 및 침입에 대한 유전자 발현 증가의 효과를 실시간으로 조사하는 방법을 제시합니다.

합성 mRNA transfection 후 종양 세포 이동 및 침습의 실시간 정량 측정

여기에서는 뇌 내피 장벽 강도를 측정하기 위해 임피던스 기반 바이오센서인 ECIS 및 cellZscope를 사용하는 기술을 보여줍니다. 우리는 뇌 내피의 체외 모델에 다양한 자극을 추가하는 준비 및 기술에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 결과를 측정, 기록 및 대표 분석을 제공합니다.

암세포와 사이토카인에 대응하는 두 개의 임피던스 기반 바이오센서를 사용한 뇌내피 장벽 무결성 측정

학습하세요 임피던스 기반 실시간 측정법으로 교모세포종(U-118MG) 세포의 이동과 침입을 평가하는 방법을. 이 기술은 염색이나 형광 표지 없이 암 전이 역학을 정확하게 분석할 수 있습니다.

암세포 이동 및 침입에 대한 임피던스 기반 실시간 측정

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