Name: 교모세포종을 위한 3D 스페로이드 모형 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 배우세요 교모세포종 침윤을 연구하기 위한 3D 스페로이드 기반 침윤 분석법을 사용하는 방법을. 이 기법은 종양의 다세포 구조와 이질성을 재현하여 약물 효과를 더 정확하게 평가할 수 있게 합니다.

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이 작품은 트랜스 칸 에 의해 지원되었다 2017, ARC 2017, 리그 콘트르 르 암 (코미테 드 라 지롱드 에 드 라 샤랑테 - 해양). 조리스 가이온은 툴루즈 대학 병원 (CHU 툴루즈)에서 펠로우십의 수혜자입니다.

통보 된 서면 동의는 모든 환자 (지역 윤리위원회 규정에 따라 노르웨이 베르겐 하우켈랜드 병원에서) 얻었습니다. 우리의 프로토콜은 우리 기관의 인간 연구 윤리위원회의 지침을 따릅니다.
1. 균일 한 크기의 종양 스페로이드의 생성
참고: 줄기형 세포는 이전 기사12에기재된 바와 같이 B27 보충제, 헤파린, FGF-2, 페니실린 및 스트렙토마이신을 보충하는 신경기저 배지에서 배양된다. 이 세포는 문화에서 자발적으로 스페로이드를 형성합니다.
<ol><li>종양 세포를 5 mL 인산 완충 식염수 (PBS)로 세척하고 0.5-1 mL 해리 효소로 세포를 인큐베이팅 (재료 표참조)에서 5 분 동안 37 °C에서 배양하십시오.</li>
	<li>4-4.5 mL PBS로 세척하고 완전한 성장 배지 (완전한 신경 기저 배지, cNBM)의 10 mL를 추가합니다.</li>
	<li>트라이판 블루와 셀 카운팅 챔버 슬라이드와 자동 카운팅 기술을 사용하여 세포를 계산합니다.</li>
	<li>스페로이드 당 10개의 4 세포 (바람직한 크기에 따라)로 100 개의 스페로이드를 생성하려면 NBM 8 mL에서 106 세포를 2 % 메틸 셀룰로오스 2 mL과 혼합하십시오.</li>
	<li>서스펜션을 멸균 시스템 용기로 옮기고 멀티채널 파이펫으로 100 μL/well을 96개의 잘 둥근 바닥 판에 분배합니다.</li>
	<li>플레이트를 37°C, 5%CO2 및 95% 습도에서 배양합니다. 동일한 크기의 스페로이드가 형성되며 3-4 일 후에 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 3차원 실험
<ol><li>확산<ol>
<li>준비<ol>
<li>억제제(예를 들어, 도4A에서와같이 로테네)와 화학물질을 배지의 100 μL에 첨가하고 각 웰(즉, 웰당 1개의 스페로이드)에 배지의 100 μL을 첨가한다.</li>
			<li>플레이트를 37°C, 5%CO2및 95% 습도에서 배양합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>이미지 수집 및 분석<ol>
<li>밝은 필드에서 비디오 현미경으로 사진을 찍어 T0과 다음 시간에 일련의 조건을 만듭니다.</li>
			<li>피지를 사용하여 수동으로 또는 반자동 방식으로 사진을 분석할 수 있습니다. 수동으로 사용하려면 자유형 선택 도구를 사용하여 스페로이드 코어 주위에 원을 그리고 각 스페로이드의 면적을 측정합니다. 이미지를 반자동화된 방식으로 분석하려면 //Core 영역만 사용하여 보충 문서 1에 표시된 매크로를 사용합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>침공<ol>
<li>준비<ol>
<li>1 mg/mL 최종 농도에서 I형 콜라겐, 1x PBS, 0.023xV콜라겐,1 M 수산화 나트륨, 멸균H2O. 용액을 얼음 위에 30분 동안 인큐베이션하여 얼음 위에 콜라겐 매트릭스를 준비시다.</li>
			<li>500 μL 튜브에서 둥근 바닥 웰 플레이트에서 스페로이드를 수집하고 200 μL 1x PBS로 2x를 세척합니다.</li>
			<li>스페로이드를 콜라겐 매트릭스의 100 μL로 조심스럽게 파이펫하고 정상 96 웰 플레이트의 웰 중앙에 삽입합니다.</li>
			<li>콜라겐 젤을 37°C에서 30분 동안 배양한 다음 젤 위에 cNBM을 추가합니다. 억제제 또는 활성제(예를 들어, 도 4B, 4C에도시된 염화수소)는 이 단계에서 배지에 첨가될 수 있다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>이미지 수집 및 분석<ol>
<li>콜라겐 포함 후 24시간 동안 브라이트필드 모드에서 비디오 현미경으로 순차적으로 사진을 찍습니다.</li>
			<li>피지를 사용하여 수동으로 또는 반자동 방식으로 사진을 분석할 수 있습니다. 수동으로 사용하려면 자유형 선택 도구를 사용하여 스페로이드의 코어 및 전체 영역을 그리고 코어 영역을 뺀 값으로 각 스페로이드의 침습 영역을 측정합니다. 반자동화 된 방식으로 이미지를 분석하려면 보충 문서 1에 표시된 대로 매크로를 사용하여 침습 영역을 결정합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>마이그레이션<ol>
<li>준비<ol>
<li>37°C에서 30분 동안 NBM에서 마트리겔(0.2 mg/mL)으로 6개의 웰 플레이트를 코팅한 다음, 마트리겔을 제거하고 cNBM 2 mL을 추가합니다.</li>
			<li>원형 바닥 웰 플레이트로부터 6웰 플레이트로 50 μL의 cNBM으로 스페로이드를 옮김을 전달한다.</li>
			<li>37 °C에서 플레이트를 배양하고 스페로이드가 부착 될 때까지 30 분 기다립니다.</li>
			<li>배양 24시간 후, Hoechst의 10 ng/mL로 얼룩을 내고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>이미지 수집 및 분석<ol>
<li>밝은 시야에서 비디오 현미경을 사용하여 이미지를 가져옵니다. 405 nm 레이저는 Hoechst 염색의 시각화에 사용됩니다.</li>
			<li>피지 소프트웨어를 사용하여 사진을 분석하고 보조 문서 1에표시된 대로 매크로를 실행합니다. 참고 : 우물의 바닥을 만지거나 상급체를 완전히 제거하면 스페로이드가 손상됩니다. 콜라겐 타입 I 젤 취급의 경우, 콜라겐 중합을 피하기 위해 얼음 위에 젤을 보관하고, pH의 변화가 젤의 소형화에 영향을 미치기 때문에 산성 성분을 첨가하지 말고, 피펫 세포를 콜라겐내로 급속히 주입하여 세포 사멸 및 겔의 분해를 방지한다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 피지 매크로
참고 : 피지는 이미지 분석 속도를 매크로의 개발을 할 수 있도록 공개 도메인에서 개발 된 이미지 분석 프로그램입니다. 수동 분석도 가능하지만 이는 느린 프로세스이며 편향을 유발할 수 있습니다. 이미지는 소프트웨어의 끌어서 놓기로 가져오고 ROI 관리자 도구 플러그인으로 정량화할 수 있습니다. 이 연구에서 사용되는 절차는 아래에 설명되어 있습니다.
<ol><li>매크로 창 열기: 플러그인 | 매크로 | 대화 형 인터프리터.</li>
	<li>다음에 적용된 보라색 루프를 복사하여 붙여넣습니다. 보라색 문장을 유지하고 관심의 녹색 문장을 추가(보충 문서 1).</li>
	<li>전체 계열을 분석하려면 특정 정량화를 위해 매개 변수를 빨간색으로 조정하고 매크로를 사용하여 매크로를 실행합니다 | 매크로를 실행하거나 Ctrl+R을 누른다.</li>
	<li>필요한 경우 ROI(관심 영역)를 수동으로 조정합니다.</li>
</ol>4. 스페로이드의 전자 현미경 검사법
참고: 다음 단계의 대부분은 화학 적 후드에서 수행해야합니다.
<ol><li>고정 단계<ol>
<li>절단 피펫 팁으로 스페로이드를 수집하고 1.5 mL 튜브에 넣고 0.1 M 인산 완충제 (PB)로 1x를 씻습니다.</li>
		<li>0.1 M PB에서 2% 글루타랄데히드/2% 파라포름알데히드(PFA)에서 4°C에서 하룻밤 동안 스페로이드를 고정시다.</li>
		<li>고정 용액을 0.1 M PB에서 1% PFA 의 용액으로 교체한 다음 샘플 전공을 수행합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플 준비<ol>
<li>스페로이드를 스트레이너로 옮기고 스페로이드 손상을 피하기 위해 유리 비커에 넣습니다.</li>
		<li>0.1M PB로 3x 조심스럽게 씻으소서.</li>
		<li>어둠 속에서 2 시간 동안 오스뮴으로 배양하십시오. 1% 0.1 M PB 완충액에서 4%로 오스뮴을 희석한다.</li>
		<li>0.1M PB로 3x 조심스럽게 씻으소서.<ol>
<li>다음과 같이 탈수: 10분 동안 50% 에탄올, 10분 동안 70% 에탄올, 15분 동안 2x 90% 에탄올, 20분 동안 2x 100% 에탄올, 30분 동안 2x 아세톤에 담가 주세요.</li>
		</ol>
</li>
		<li>샘플을 아세톤/수지 의 50/50 혼합물에서 2 시간 동안 배양합니다. 이 단계에서, 에폰 수지 (포함-812 : 11.25g; DDSA: 9 g; NMA: 4.5 g).</li>
		<li>아세톤/수지 혼합물을 버리고, 갓 준비한 수지로 대체하고 밤새 배양하십시오.</li>
		<li>수지의 새 것으로 교체하고 2-6 시간 사이에 배양하십시오.</li>
		<li>48-72 시간 동안 60 °C에서 금형에 수지의 스페로이드를 추가합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Pelissier, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+dysfunction+in+mechanotransduction+impairs+differentiation+of+human+mammary+epithelial+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors.</a> Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).</li>
<li>Ishiguro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+spheroids%3A+Relevance+to+cancer+stem+cells+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications.</a> Cancer Science. 108, 283-289 (2017).</li>
<li>Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+environment+interactions+in+tumor+microregions%3A+the+multicell+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model.</a> Science. 240, 177-184 (1988).</li>
<li>Desoize, B., Jardillier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+resistance%3A+a+paradigm+for+clinical+resistance%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance?</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36, 193-207 (2000).</li>
<li>Corbet, C., Feron, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+acidosis%3A+from+the+passenger+to+the+driver%27s+seat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour acidosis: from the passenger to the driver's seat.</a> Nature Reviews Cancer. 17, 577-593 (2017).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).</li>
<li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cancer+Cell+Spheroid+Assay+to+Assess+Invasion+in+a+3D+Setting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53409(2015).</li>
<li>Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+Spheroid+Model+as+a+More+Physiological+System+for+Cancer-Associated+Fibroblasts+Differentiation+and+Invasion+In+Vitro+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), e60122(2019).</li>
<li>Boye, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+CXCR3%2FLRP1+cross-talk+in+the+invasion+of+primary+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors.</a> Nature Communications. 8, 1571(2017).</li>
<li>Dejeans, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+control+of+glioma+cells+adhesion+and+migration+through+IRE1alpha-mediated+cleavage+of+SPARC+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Autocrine control of glioma cells adhesion and migration through IRE1alpha-mediated cleavage of SPARC mRNA.</a> Journal of Cell Science. 125, 4278-4287 (2012).</li>
<li>Golembieski, W. A., Ge, S., Nelson, K., Mikkelsen, T., Rempel, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+SPARC+expression+promotes+U87+glioblastoma+invasion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).</li>
<li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+complex+role+of+thrombospondin-1+in+glioblastoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development.</a> Nature Communications. 10, 1146(2019).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tube+travel%3A+the+role+of+proteases+in+individual+and+collective+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion.</a> Cancer Research. 68, 7247-7249 (2008).</li>
<li>Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP+proteolytic+activity+regulates+cancer+invasiveness+by+modulating+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins.</a> Scientific Reports. 7, 14219(2017).</li>
<li>Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+migration+and+invasion+uncoupled%3A+increased+migration+is+not+an+inexorable+consequence+of+epithelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition.</a> Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).</li>
<li>de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Experimenter%27s+Guide+to+Glioblastoma+Invasion+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">An Experimenter's Guide to Glioblastoma Invasion Pathways.</a> Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).</li>
<li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+invasive+proteome+of+glioblastoma+revealed+by+laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology+Advances%22%5BJournal%5D)">The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection.</a> Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029(2019).</li>
</ol>

저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

종양 스페로이드 세포 반응은 세포 사멸 및 약물 반응뿐만 아니라 증식, 침습 및 이동을 포함한 종양 특성을 연구하기 위해 잘 적응된다. 암세포는 그림 4B,C에서볼 수 있듯이 침습성 미세 종양을 형성하는 3D 매트릭스를 침범합니다. 침습 적 과정 동안, 매트릭스 금속 단백질 효소 (MMP) 종양 세포(13)및 MMP 억제제 (예를 들어, GM6001 또는 Rebimastat)를 둘러싼 다이제스트 매트릭스는 세포 침략을 손상시킬 수 있지만 이동(14). 이주와 침략은 우리의 스페로이드 분석에서 공부될 수 있는 겹치지 만 별도의 분자 사건15를관련시킵니다. 이렇게 하기 위하여는, 특정 신호 통로는 유전 수준에서 또는 약리학적인 금지를 통해 표적으로 할 수 있습니다.
교모세포...

1 차 또는 상업적으로 이용 가능한 세포주를 사용하여 대부분의 연구 결과에서는, 단층 배양으로 플라스틱 표면에 성장한 세포에 공아학은 수행됩니다. 2D에서 세포 배양을 관리하는 것은 생체 내 3D 세포 환경을 모방하지 않기 때문에 단점을 나타낸다. 2D 배양물에서, 전체 세포 표면은 배지와 직접 접촉하여 세포 성장을 변화시키고 약물 가용성을 수정한다. 또한, 비 생리학적 플라스틱 표면은 세포 분화를 유발한다1. 이러한 어려움을 극복하기 위해 3차원 배양 모델이 개발되었습니다. 그(것)들은 종양2의다세포 건축 및 이질성을 모방하는 이점이 있고, 따라서 고형종양3를위한 더 관련성 있는 모형으로 여겨질 수 있었다. 스페로이드의 복잡한 형태는 약물 침투및 내성을 더 잘 평가하는 데기여합니다 4. 스페로이드에서의 종양 이질성은 산소 및 영양소의 확산에 영향을 미치고, 약리작용제에 대한반응(도 1A). 산소의 확산은 스페로이드 크기가 300 μm에 도달하면 변경되어 스페로이드 의 중심에 저산소 환경을 유도합니다(그림 1A,C). 대사 산물은 또한 세포 층을 통해서 더 적은 관통및 보상 신진 대사 반응이 일어난다5. 스페로이드의 직경이 증가하면, 괴사 코어가 관찰될 수 있고, 공격적인 뇌암 교모세포종(GBM)을 포함하여 많은 고형암에서 발견되는 특성을 더욱 모방한다6.
교모세포종에 대한 몇몇 2D 또는 3D 침략 검칙은 문헌7,,8에보고되었다. 2차원 분석실험은 주로 얇은 매트릭스 층 또는 보이든 챔버 분석기에서 수평 평면에서 침략을 연구하기 위한 것이다9. 3차원 실험은 고전적인 교모세포종세포주(10)를사용하여 3D 스페로이드 배양물로 기재되었다. 보다 복잡한 변이체는 대립배양체 11에서종양 스페로이드에 의한 뇌 오르가노이드의 침입으로 표현된다. 그러나, 어떤 실험실든지 에 유효한 사용하기 쉬운 및 재현가능한 분석분석기를 개발하는 것이 아직도 중요합니다. 우리는 환자 샘플에서 교모세포종 줄기 와 같은 세포를 생성하는 프로토콜을 개발했습니다. 이러한 분석법의 정량화는 쉽게 관리할 수 있으며 개방형 온라인 소프트웨어만 필요합니다. 간단히, 종양 조각은 작은 조각으로 절단하고 효소 소화. 소화에서 파생 된 단일 세포는 신경 기 저 기 에서 재배 됩니다. 4-7 일 후에 스페로이드 구조가 자발적으로 형성됩니다. 마우스 모델에서 두개내 이식 시, 그들은 의사 팔리사딩 세포(12)에둘러싸인 괴사 코어를 나타내는 종양을 형성한다. 이것은 GBM 환자에서 찾아낸 특성과 밀접하게 유사합니다.
이 문서에서는, 우리는 재현성을 보장하기 위해 결정된 수의 세포에서 스페로이드를 생산하는 우리의 프로토콜을 설명합니다. 두 개의 상보적인 행렬이 이 목적을 위해 사용될 수 있습니다: Matrigel 및 콜라겐 모형 I. Matrigel는 성장 인자에 풍부하고 세포 부착 및 이동을 위해 요구되는 포유류 기저 막을 모방합니다. 다른 한편으로는, 기질의 구조적인 요소인 콜라겐 타입 I은, 가장 일반적인 섬유질 세포외 매트릭스이고 세포 침략 검정에 이용됩니다. 본 명세서에서, 우리는 이동 및 증식 아세술을 수행함으로써 GBM 스페로이드 모델을 설명한다. 분석은 고정된 시점에서뿐만 아니라 라이브 이미징에 의한 스페로이드 팽창 및 세포 움직임을 모니터링하여 수행되었습니다. 또한, 전자 현미경 검사는 형태학적 세부 사항을 시각화하기 위하여 행해졌습니다.

<table><tbody><tr><td>96 웰 라운드 바닥 플레이트</td><td>Falcon</td><td>08-772-212</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td>4 &deg에 보관; C, 구 해리 효소</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587</td><td>-20 &deg에 저장; C, 사용 전 해동</td></tr><tr><td>기본 섬유아세포 성장 인자</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>-20 &deg에 저장; C, 사용 전 해동</td></tr><tr><td>Countess 세포 계수 챔버 슬라이드</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 10X</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53-500</td><td>4°C에 보관; C</td></tr><tr><td>피지 소프트웨어</td><td>ImageJ</td><td></td><td>사진 분석에 사용</td></tr><tr><td>Flask 75 cm2</td><td>Falcon</td><td>10497302</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>-20 &deg에 저장; C, 저온 NBM</td></tr><tr><td>메틸셀룰로오스</td><td>시그마</td><td>M0512</td>에서 최종 농도 0.2 mg/mL로 희석<td>, NBM에서 2% 최종 농도</td></tr><tr><td>NBM</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td>, <td>4°C에 보관; C</td></tr><tr><td>Neurobasal 매체</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>4 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>페니실린 - 스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td> 4°C<td>에 저장; C</td></tr><tr><td>Trypan 블루 0.4%</td><td>ThermoFisher</td><td>T10282</td><td>세포 계수에 사용</td></tr><tr><td>유형 I 콜라겐</td><td>코닝</td><td>354236</td><td>4°°C에 저장; 씨</td></tr></tbody></table>

교모세포종을 위한 3d 스페로이드 모형

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

2차원(2D) 세포 배양은 생체 내 종양 성장을 만족스럽게 모방하지 않는다. 따라서 3차원(3D) 배양 스페로이드 모델이 개발되었습니다. 이 모형은 신경 종양학의 필드에서 특히 중요할지도 모릅니다. 실제로 뇌종양은 건강한 뇌 환경을 침범하는 경향이 있습니다. 본명은 종양 침범을 연구하기 위해 개발한 이상적인 3D 교모세포종 스페로이드 기반 분석기를 기술한다. 우리는 이 분석방법을 성공적으로 수행하기 위해 모든 기술적 세부 사항과 분석 도구를 제공합니다.

스페로이드는 프로토콜 섹션에 설명된 대로 제조되었고 이동, 침략, 증식 및 현미경 검사법에 관한 관찰이 이루어졌다. 구형 구조의 별개의 영역에서 저산소증을 측정하기 위해, 카르복식 아히드라아제 IX 염색을 저산소 활성을 결정하는 데 사용하였다(도1A-C). 더 많은 CAIX 양성 세포가 스페로이드 센터에서 관찰되었다(그림1A-C). 스페로이드 코어에 위치한 저산소 세포는 주변 세포보다 더 당화성인 경향이 있습니다. 미토콘드리아는 전자 현미경검사법에 의해 도시된 바와 같이 추가 분석을 위해 이미지화될 수있다(그림 1Ba-1Bb). 2.5 x 103,5 x 103,104,</su...

여기에서는 교모세포종에 대한 사용하기 쉬운 침략 분석방법을 설명합니다. 이 분석은 교모세포종 줄기 와 같은 세포에 적합합니다. 침략, 마이그레이션 및 확산의 쉬운 정량화를 위한 피지 매크로도 설명되어 있습니다.

교모세포종을 위한 3D 스페로이드 모형

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...

2차원 세포 배양은 생체 종양 성장에서 적절히 모방하지 않습니다. 개선하기 위해 스페로이드를 사용하여 3D 절차가 개발되었습니다. 우리의 3D 교모세포종 스페로이드 기반 분석은 건강한 뇌종양 환경에 뇌종양 침입을 조사하는 데 특히 적합합니다.3차원 배양 모델은 약물 효과의 보다 엄격한 평가를 허용하는 종양의 다세포 아키텍처, 이질성 및 대사 상태를 재구성하는 데 사용될 수 있다. 우물의 바닥을 만지거나 상퍼를 완전히 제거하여 얼음에 젤을 유지하고 세포를 젤에 신속하게 추가하지 않도록하십시오. 균일하게 크기의 종양 스페로이드를 생성하기 위해 먼저 PBS의 5 밀리리터로 관심있는 종양 세포 배양을 세척하고 세포를 0.5 내지 1 밀리리터의 해리 효소로 치료한다.섭씨 37도에서 5분 후, PBS의 4~4.5밀리리터로 반응을 멈추고 분리된 세포를 완전한 성장 배지 10밀리리터를 함유한 15밀리리터 원컬튜브로 이송한다. 카운트 후, 완전한 성장 배지의 8 밀리리터 당 1회 10에서 여섯 번째 세포로 세포를 다시 중단하고 2%의 메틸셀룰로오스 농도의 2밀리리터로 보충하고 서스펜션을 멸균 시스템 용기로 옮길 수 있다. 그런 다음 96웰 라운드 하단 플레이트의 각 웰에 100 마이크로리터의 셀을 추가하고 플레이트를 37도 5% 이산화탄소 인큐베이터에 3~4일 동안 넣습니다.침입 분석을 수행하기 위해 종양 세포가 균일하게 크기의 스페로이드를 형성했을 때 각 세포 구조를 500 마이크로 리터 튜브로 옮기고 PBS의 200 마이크로 리터로 스페로이드를 한 번 씻으십시오. 두 번째 세척 후, 새로 준비된 콜라겐 매트릭스의 100 마이크로리터로 스페로이드를 조심스럽게 옮기고 각 스페로이드 현탁액을 평평한 바닥 96웰 플레이트의 중앙에 넣습니다. 섭씨 37도에서 30분 간 배양한 후, 각 웰의 젤 위에 100마이크로리터의 완전한 성장 매체를 추가합니다.종양 세포 침략의 제일 화상 진찰을 위해 각 우물의 중앙에 모든 스페로이드를 두십시오. 이온 분석을 수행하기 위해 종양 세포가 균일하게 크기의 스페로이드를 형성했을 때, 섭씨 37도에서 30 분 동안 성장 배지에서 트리겔의 밀리리터 당 0.2 밀리그램으로 6 웰 플레이트를 코팅합니다. 인큐베이션이 끝나면, 교유를 제거하고 각 우물에 완전한 성장 매체의 2 밀리리터를 추가하십시오.50 마이크로리터 부피로 둥근 바닥 플레이트에서 스페로이드를 6웰 플레이트의 개별 우물로 옮기고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 24시간 동안 배치한다. 다음 날, 37섭씨에서 30분 동안 Hoechst 밀리리터당 10나노그램으로 스페로이드를 얼룩지게 합니다. 침입 또는 마이그레이션 분석 후 이미지 수집의 경우, 비디오 카메라가 장착된 브라이트필드 공초점 현미경의 무대에 판을 배치하고 적절한 실험 기간 동안 이미지를 얻을 수 있습니다.반자동 방식으로 이미지를 분석하려면 이미지를 피지로 가져오고 플러그인, 매크로, 대화형 통역사를 클릭합니다. 적응된 보라색 루프를 복사하여 붙여넣습니다. 보라색 문장을 유지하고 필요에 따라 관심의 녹색 문장을 추가합니다.그런 다음 각 스페로이드의 영역을 측정하려면 분석 및 측정을 클릭합니다. 구형 구조의 뚜렷한 영역에서 저산소증을 측정하기 위해, 탄산 안수제 IX 염색은 저산소 활성을 결정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 대표적인 분석에서, 더 많은 탄산 안수제 IX 양성 세포가 스페로이드 센터에서 관찰되었다.스페로이드 코어에 위치한 저산소 세포는 코어를 둘러싼 세포보다 더 당화적인 경향이 있다. 미토콘드리아는 추가 분석을 위해 전자 현미경 검사법에 의해 심화될 수 있다. 스페로이드 직경은 3D 세포 구조를 구성하는 세포의 밀도와 직접 상관관계가 있으며 피지 매크로는 각 스페로이드 내의 세포의 증식, 침입 또는 이주를 정량화하는 데 사용될 수 있다.스페로이드 코어의 증가는 세포 증식의 자극을 반영한다. 미토콘드리아 호흡기 사슬의 복잡한 I의 억제시, 미토콘드리아내 ATP 생산의 대부분은 72시간 후에 20%까지 증식을 감소시키는 손상된다. 염화수소 치료는 콜라겐 타입 I의 침입을 24시간 동안 향상시키지만, 처리되지 않은 스페로이드를 조절하는 것에 비해 스페로이드의 철새 면적을 1.5배 감소시킨다.라이브 이미징에 의해 평가된 바와 같이, 스페로이드는 높은 내부 역학을 보여주고 빨리 움직입니다. 스페로이드의 크기는 상대적으로 균일해야하며 최상의 이미징 결과를 위해 우물의 중심으로 스페로이드를 조작하기 위해주의를 기울여야합니다. 이 방법은 또한 종양 세포 증식, 이주 및 죽음뿐만 아니라 세포 외 매트릭스, 세포 수용체 또는 관심의 세포 내 단백질의 발현을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.상기 스페로이드는 캡슐을 제거하면 세포 표면 장력 증가의 효과를 캡슐화할 수 있고, 세포 표면 장력의 효과를 조사할 수 있다.

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 동영상은 뇌종양에서 유래한 신경교종구(gliomasphere)가 어떻게 단세포로 분리되어 히알루론산 기반 하이드로겔에 캡슐화되는지 보여줍니다. 이 과정은 세포-세포 상호 작용을 촉진하여 구조화된 3차원 교모세포종 모델을 형성합니다.

교모세포종 세포의 3차원 배양을 위한 히알루론산 기반 하이드로겔

출처: Guyon, J., et al. 교모세포종에 대한 3D 스페로이드 모델. J. Vis. Exp. (2020)이 비디오는 종양 세포 침입의 3차원 스페로이드 모델의 생성을 보여줍니다. 스페로이드는 인간의 뇌종양 세포에서 형성되며 콜라겐 매트릭스에 내장되어 있습니다. 스페로이드 말초의 종양 세포는 침습적 표현형을 채택하여 프로테아제를 분비하여 콜라겐을 분해하고 전진하여 주변 기질을 침범합니다.

종양세포 침입의 3차원 스페로이드 모델 생성

혈청이 없는 신경권 배지에서 해리된 고급 신경종 수술 용 시편을 전파하여 암 줄기 세포 표현형을 가진 세포를 선택한다. 신경구로 성장하지 못하는 표본의 경우 대체 프로토콜이 제안됩니다. 면역 세포화학을 위한 3D 신경구 아키텍처를 유지하기 위한 파라핀 임베딩 기술이 설명된다.

임상적으로 관련동물 모델 및 3D 면역화학에 사용하기 위한 외과 표본에서 고학년 신경교종 세포 배양의 최적화

주변 정상 조직의 침입은 악성 종양을 정의하는 특징입니다. 우리는 여기에서 여러 진행성 인간 암 모델로 예시된 자연 3D 바이오매트릭스로의 침입에 대한 간단한 반자동 마이크로 플레이트 분석을 제공합니다.

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

여기에서 우리는 유전자 조작 마우스 모델 종양에서 파생된 세포의 두개내 주입에 의해 확립된 GBM에 대한 전임상 동소 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델은 인간 GBM의 질병 특징을 표시합니다. 중개 연구를 위해 마우스 뇌종양은 생체 내 MRI 및 조직병리학에 의해 추적됩니다.

다형성 교모세포종의 번역 동소 모델

병아리 배아는 ovo에서 인간 교모세포종(GBM) 뇌종양을 연구하는 데 사용되며 생체 외 뇌 절편 공동 배양. GBM 세포 거동은 생체 외 공동 배양에서 타임랩스 현미경으로 기록할 수 있으며, 두 제제 모두 상세한 3D 공초점 분석을 통해 실험 종점에서 분석할 수 있습니다.

병아리 배아 뇌를 인간 교모세포종 세포 행동의 생체 내 및 생체 외 분석을 위한 모델로 사용

여기에서는 종양 스페로이드를 빠르고 강력하며 저렴하게 제조한 후 하이드로겔 캡슐화를 수행할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 특수 장비가 필요하지 않기 때문에 널리 적용 가능합니다. 스페로이드 매트릭스 상호 작용을 탐색하고 체외 조직 생리학 또는 병리학 모델을 구축하는 데 특히 유용할 것입니다.

스페로이드-매트릭스 상호 작용 연구를 위한 폴리에틸렌 글리콜 하이드로겔의 종양 스페로이드 제조 및 캡슐화

간질액 흐름을 포함하는 침습적 전면부에서 신경교종 종양 미세환경을 복제하는 방법을 제시합니다. 이 모델은 유체 압력 헤드를 적용할 수 있는 조직 배양 삽입물에 포함된 히알루론산-콜라겐 I 하이드로겔입니다. 침입을 정량화할 수 있으며 세포를 분리하거나 용해할 수 있습니다.

간질 흐름이 있는 침습적 신경교종 미세환경의 광중합 가능한 히알루론산-콜라겐 모델

여기에서 우리는 세포외 플럭스 분석을 통해 3차원(3D) 신경아교종 스페로이드와 이미징 기반 정규화를 통합하는 대사 프로파일링 플랫폼을 구축합니다. 이 접근법을 통해 약물 치료에 대한 종양 대사 반응을 보다 정확하게 평가할 수 있으며 잠재적인 내성 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

약물 스크리닝을 위한 3차원 뇌종양 스페로이드의 대사 프로파일링의 발전

우리는 새로 진단되고 재발한 종양에서 생성된 환자 유도 자기 교모세포를 이용한 3D 교모세포종 이동 모델을 제시합니다. 이 플랫폼은 환자별 이동 역학을 시각화하고 치료 효과 평가를 가능하게 합니다. 이 분석법은 이동 후 다중화되어 단백질 위치와 발현 패턴을 평가할 수 있습니다.

저산소 조건에서 자기 나노입자를 이용한 구형 위치 측정을 이용한 재현 가능한 3D 교모세포종 이동 검사

배우세요 교모세포종 침윤을 연구하기 위한 3D 스페로이드 기반 침윤 분석법을 사용하는 방법을. 이 기법은 종양의 다세포 구조와 이질성을 재현하여 약물 효과를 더 정확하게 평가할 수 있게 합니다.

교모세포종을 위한 3D 스페로이드 모형

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