Name: 골격 근육 생검에서 Myofibrils를 분리하고 나노 뉴턴 해상도 포스 트랜스듀서로 수축 기능을 결정합니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 배우세요 골격 근육에서 분리된 myofibril의 수축 기능을 측정하는 방법을. 나노뉴턴 해상도의 광학 간섭력 프로브를 사용하여 근육 약화의 원인이 되는 sarcomere 기능 장애를 식별하고 근육 생리학 연구에 활용할 수 있습니다.

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<ol><li>Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcomere+Dysfunction+in+Nemaline+Myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuromuscular.+Disease%22%5BJournal%5D)">Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy.</a> J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).</li>
<li>Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+and+passive+forces+of+isolated+myofibrils+from+cardiac+and+fast+skeletal+muscle+of+the+frog%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog.</a> Journal of Physiology. 500, Pt 2 535-548 (1997).</li>
<li>Kulke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+major+source+of+myofibrillar+stiffness+in+Drosophila+indirect+flight+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle.</a> Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).</li>
<li>Stehle, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isometric+force+kinetics+upon+rapid+activation+and+relaxation+of+mouse%2C+guinea+pig+and+human+heart+muscle+studied+on+the+subcellular+myofibrillar+level%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level.</a> Basic Research in Cardiology. 97, Suppl 1 127-135 (2002).</li>
<li>Iorga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromechanical+function+of+myofibrils+isolated+from+skeletal+and+cardiac+muscles+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish.</a> Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).</li>
<li>Ribeiro, P. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractility+of+myofibrils+from+the+heart+and+diaphragm+muscles+measured+with+atomic+force+cantilevers%3A+Effects+of+heart-specific+deletion+of+arginyl-tRNA-protein+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase.</a> International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).</li>
<li>Joureau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+sarcomere+contractility+contributes+to+muscle+weakness+in+ACTA1-related+nemaline+myopathy+%28NEM3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3).</a> Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).</li>
<li>de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+perfusion+shows+intersarcomere+dynamics+within+single+skeletal+muscle+myofibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).</li>
<li>Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+force+enhancement+is+regulated+by+titin+in+skeletal+and+cardiac+myofibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils.</a> Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).</li>
<li>Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increase+in+non-cross-bridge+forces+after+stretch+of+activated+striated+muscle+is+related+to+titin+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).</li>
<li>Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+detection+system+for+probing+cantilever+deflections+parallel+to+a+sample+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface.</a> Review of Scientific Instruments. 82, 013701(2011).</li>
<li>Chavan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferrule-top+nanoindenter%3A+an+optomechanical+fiber+sensor+for+nanoindentation%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation.</a> Review of Scientific Instruments. 83, 115110(2012).</li>
<li>Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metrological+approach+for+the+calibration+of+force+transducers+with+interferometric+readout%5BTitle%5D)+AND+%22Surface+Topography%3A+Metrology+and+Properties%22%5BJournal%5D)">A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout.</a> Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).</li>
<li>van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+dynamic+mechanical+analysis+for+heterogeneous+soft+matter+using+ferrule-top+indentation%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation.</a> Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).</li>
<li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KBTBD13+is+an+actin-binding+protein+that+modulates+muscle+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2019).</li>
<li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation-specific+effects+on+thin+filament+length+in+thin+filament+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy.</a> Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).</li>
<li>Ottenheijm, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleting+exon+55+from+the+nebulin+gene+induces+severe+muscle+weakness+in+a+mouse+model+for+nemaline+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy.</a> Brain. 136, 1718-1731 (2013).</li>
<li>Ribeiro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractility+of+myofibrils+from+the+heart+and+diaphragm+muscles+measured+with+atomic+force+cantilevers%3A+effects+of+heart-specific+deletion+of+arginyl-tRNA-protein+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase.</a> International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).</li>
<li>Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+Myosin-II+Inhibitor+%28N-benzyl-p-toluene+Sulphonamide%2C+BTS%29+on+Contractile+Characteristics+of+Intact+Fast-twitch+Mammalian+Muscle+Fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cell+Motililty%22%5BJournal%5D)">Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).</li>
<li>Stehle, R., Krüger, M., Pfitzer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+kinetics+and+individual+sarcomere+dynamics+in+cardiac+myofibrils+after+rapid+Ca%282%2B%29+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes.</a> Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).</li>
<li>Najafi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-diastolic+force+pre-activates+cardiomyocytes+and+determines+contractile+force%3A+role+of+titin+and+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium.</a> Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).</li>
</ol>

미치엘 헬름스는 IONOptix Inc.의 주주이자 공동 소유주입니다.

설명된 것은 인간 또는 동물 골격 근 조직으로부터 분리된 myofibrils의 수축 기능을 평가하는 프로토콜입니다. 이 설정의 힘 해상도는 Chavan 외12에의해 이전에 설명되었습니다. 요컨대, 검출 섬유와 캔틸레버 사이에 형성된 파브리-페로 캐비티의 길이의 임의변동에 의해 결정되며, 이는 판독값(V로 발현됨)의 출력에서 소음의 지배적인 부분을 생성하며, 편향 감도(m/V로 표현)와 캔틸레버의 스프링 상수(N/m로 표현됨)에 의해 배합하여 배분하게하여 잡음(N/m으로 표현됨)을 제공한다. 우리의 설정의 경우, 판독값의 출력시 공기 중의 루트 평균 정사각형(rms) 노이즈는 1,000개의 데이터 포인트/s(샘플/s)로 샘플링되어 약 2mV입니다. 일반적인 myofibril 측정의 경우, ferrule-top 프로브는 ~0.7 N/m의 스프링 상수(편향 감도 300 nm/V)와 함께 사용됩니다. 이 rms 값은 0.6nm의 캔틸레버 편향 해상도에 해당하며, 이는 ~0.37 nN의 힘 감도...

줄무늬 근육 세포는 일상 생활 활동에 필수적입니다. 사지 운동, 호흡 기능 및 심장의 펌핑 운동은 근육 세포에 의해 생성 된 힘에 의존한다. 골격 근은 단일 근육 섬유의 번들을 포함하는 근육 매심으로 구성됩니다(그림 1A). 이러한 근육 섬유는 직렬로 연결된 사코머(그림1B,D)에의해 형성되는 근시브릴로 구성됩니다. 사혜성에는 얇고 두꺼운 필라멘트가 들어 있습니다. 이들은 주로 액틴과 미오신 분자의 사슬로 구성되며, 각각(도 1B). 액틴-미신 상호 작용은 근육의 힘 생성 능력에 대한 책임이 있습니다. 성운, 액틴 및 트로포닌 T와 같은 육종 단백질을 코딩하는 유전자에 돌연변이가있는 환자는 수축 기능 장애1로인한 근육 약화로 고통받고 있습니다.
근육 수축의 품질 조직의 다양 한 수준에서 공부할 수 있습니다., 생체 전체 근육에서 체 외 운동 성 애사에서 actin-myosin 상호 작용에 이르기까지. 지난 수십 년 동안, 몇몇,연구 단은 개별 myofibrils,,2,3,4,45,,5,6,7,8,9,10의수축을 결정하기 위하여 설치를개발했습니다. 이러한 설정은 근시릴의 수축에 의해 유발된 캔틸레버(즉, 광학 빔 편향)로부터 레이저 편향의 변화를 검출하는 데 기초한다(자세한 내용은 라부다 외11참조). 근시 의 수축 기능을 결정하는 데는 몇 가지 한계가 있지만 (예를 들어, 근시 의 상류인 흥분 수축 커플링 프로세스의 역학이 부족함), 이 접근법에는 여러 가지 장점이 있습니다. 여기에는 사메메레스의 기하학적 제약이 있는 경우 액틴-미오신 상호작용을 평가하는 능력; 2) 손상된, 인접한 근막의 잠재적 인 혼동 효과없이 액틴 - 미오신 상호 작용을 평가 할 수있는 능력 (단일 근육 섬유의 수축을 측정 할 때 초구조적 손상과 myofibrils의 정렬 불량에 기여할 수 있음)(그림 1D); 3) 근시 (~1 μm, 도 2A)의작은 직경과 멤브레인의 부족은 사마페에 거의 즉각적인 칼슘 확산을 허용한다. 더욱이, 구조적 손상이 myofibrils에 존재하는 경우에, 그(것)들은 확률이 그들의 격리 도중 또는 실험 도중 끊어질 것입니다. 따라서, myofibril 수축을 평가하는 것은 근육 수축의 기본 기계장치를 공부하고 방해된 액틴-미신 상호 작용이 육종 단백질에 있는 돌연변이에 기인한 근육 질병의 주요 원인인지 이해하는 우아한 방법입니다.
이 프로토콜은 나노 뉴턴 해상도 (즉, Optiforce)와 캔틸레버 힘 프로브를 통합 근시 릴의 수축을 결정하기 위해 새로 개발 된 설정을 제공합니다. 이 힘 프로브는 간섭법의 원리를 기반으로 합니다. 간섭측정을 통해 비교적 딱딱한 캔틸레버를 사용할 수 있습니다. 이를 통해 칸틸레버의 편향이 거의 없는 힘을 측정하여 근시 브릴리브릴의 이소메트릭 수축에 접근할 수 있습니다. 프로브는 높은 신호 대 잡음 비율로, 인간 과목에서 그 를 포함하여 다른 근육 생검에서 격리 된 단일 근시릴에 의해 생성 되는 낮은 수동 및 활성 힘의 평가에 대 한 수 있습니다. 이 설정에 통합된 광학 캔틸레버 힘 프로브는 Fabry-Pérot 간섭계12를기반으로 합니다. 간섭계는 발효에 장착된 광섬유와 금코팅 캔틸레버 사이의 작은 변위를 감지합니다(그림3). 광섬유와 캔틸레버 사이의 간격을 파브리 페로 캐비티라고 합니다. Myofibrils는 두 개의 접착제 코팅 유리 장착 섬유를 사용하여 프로브와 압착 모터 사이에 장착됩니다. 근시브릴에 의해 생성된 힘은 간섭계 데이터로부터 수학적으로 도출될 수 있다. 간섭측정은 두 개 이상의 파도의 중첩 또는 간섭을 기반으로 합니다(이 설정에서 세 개의 광파). 1,528.77-1,563.85 nm 사이의 파장을 가진 레이저 광은 간섭계에서 방출되고 광섬유를 통해 전송됩니다. 프로브에서 광섬유와 배지 사이의 인터페이스에서 빛이 1) 반사된다(도3A); 2) 매체와 캔틸레버의 인터페이스에서(도 3B); 및 3) 캔틸레버의 금속과 금 코팅 사이의 인터페이스에서(도 3C). 인터페이스 A 및 B의 반사는 프로브가 침수되는 매체의 굴절률(n)에 의존한다.n 세 개의 중첩 된 반사로 구성된 빛은 간섭계의 포토다이오드로 돌아갑니다. 포토다이오드는 빛의 강도를 측정하며, 이는 세 개의 중첩된 반사의 간섭 패턴의 결과입니다. 근시릴을 활성화하거나 스트레칭하여 수축력이 생성되면 근시릴이 캔틸레버를 끌어당깁니다. 이 움직임은 캐비티크기(d)를 변경하고 결과적으로 캐비티에 맞는 파장의 수를 변경합니다. 캔틸레버에 반사되는 빛은 다른 위상을 가지며, 그 결과 다른 간섭 패턴이 생성됩니다. 포토디오드는 볼트의 변화로 간섭 패턴 강도의 변화를 기록합니다. 그 후, myofibril 힘 생성은 이 변경에서 계산됩니다, 고려 캔틸레버 강성을 고려. 포스 프로브는 제조업체에 의해 보정되며, 캔틸레버의 자유 전달 끝에 부착된 마운팅 바늘의 끝을 밀어내고, 계량 스케일에 대해, 캔틸레버의 굽힘은 레아웃레이저(13)의파장의 배수와 동일하게 유지한다. 따라서 간섭법은 거리의 작은 변화를 감지하여 나노 뉴턴 분해능으로 힘을 측정할 수 있는 매우 민감한 방법입니다. 이 해상도를 통해 높은 신호 대 잡음 비율로 myofibrillar 힘 생산을 평가할 수 있습니다. 기존의 간섭 측정은 간섭 곡선의 선형 부분으로 측정 범위를 제한하지만, 레이저 파장의 잠금 증폭기 및 변조를 사용하여 이한계(14)를극복한다. 이 내용은 토론 섹션에서 보다 자세히 설명되어 있습니다.
myofibril 활성 장력을 측정하기 위해, 빠른 단계 관혈 시스템이 통합되어 myofibril을 칼슘 용액(그림4A)에노출시켰다. 빠른 단계 관류 시스템을 통해 10ms 이내에 솔루션 변경이 가능합니다. 직경이 작기 때문에 근비릴로 칼슘 확산이 거의 즉각적입니다. 따라서, 이 시스템은 활성화 및 휴식 중에 방출하는 동안 액틴-미오신 결합의 비율을 측정하는 데 특히 적합하다. 활성화(kACT)및 이완(kREL)의속도는 활성화-이완 곡선으로부터 결정될 수 있다. 또한, 농도가 증가하는 칼슘 용액에 myofibrils를 노출시킴으로써, 힘-칼슘 관계 및 칼슘 민감성을 결정할 수 있다.
또한, 압전 길이 모터는 myofibril의 빠른 스트레칭과 단축을 가능하게합니다. 이는 근시의 점탄성 특성(즉, 수동장력)을 연구할 수 있을 뿐만 아니라, 미오피브릴의 급속한 단축 및 재스트레칭을 수행하여 장력 재개발(kTR)의속도를 결정할 수 있는 가능성을 제공한다. 활성 및 수동 장력 실험모두에서 회수된 파라미터는 육종 단백질의 유전자 돌연변이에 의해 변경될 수 있다.
이 맞춤형 설정은 건강한 인간, 환자 및 마우스 골격 근육으로부터 분리된 myofibrils의 활성 및 수동 수축 특성을 측정하는 데 사용되었습니다.

<table><tbody><tr><td>바이오 사양 제품, Inc.</td><td>985370-XL</td><td>근섬유</td><td></td>를 분리하려면</tr><tr><td>사용자 정의 코딩</td><td></td><td>Matlab</td><td></td></tr><tr><td>사용자 정의 제작</td><td></td><td>직렬 연결을 제어하는 Labview 프로그램이 포함되어 있습니다. 밸브</td><td></td>를 제어하려면</tr><tr><td>맞춤형 제작</td><td></td><td>펠티에 모듈을</td><td></td>냉각시키기 위해</tr><tr><td>맞춤형 제작</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>맞춤형 알루미늄 조직 챔버</td><td></td></tr><tr><td>맞춤형 제작</td><td></td><td>밸브를 제어하기 위해; USB</td><td></td></tr><tr><td>IonOptix</td><td></td> 시스템 컨트롤러 소프트웨어를 제어할 수 있는 PC 소프트웨어 포함<td>: 피에조 및 패스트 스텝</td><td></td></tr><tr><td>IonOptix</td><td>MCS100</td>을 위한 고급 신호 발생기가 있는 데이터 기록 소프트웨어 <td>IonOptix</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td>는 다음을 <td>포함합니다: Optiforce(간섭계), Micromanipulators, 신호 인터페이스, Piezo 모터 및 컨트롤러. MyoStretcher</td><td></td></tr><tr><td>IonOptix</td><td></td><td>Force 프로브</td><td></td></tr><tr><td>Koolance</td><td>ADT-EX004S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koolance</td><td>EX2-755</td><td>기반 펠티에 모듈</td><td></td>냉각</tr><tr><td>Microsoft</td><td></td><td>데이터 등록</td><td></td></tr><tr><td>올림푸스</td><td>IX71</td><td></td><td></td></tr><tr><td>올림푸스</td><td>TH4-200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>시그마-알드리치</td><td>529265</td><td>폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트); 조직의 고착을 방지하기 위한 현미경 슬라이드 코팅</td> Sigma-Aldrich 78471 결정이 에탄올에 용해되어 접착제를 생성함 TE Technology, Inc.<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>TE-63-1.0-1.3</td><td>조직 유동 챔버</td><td></td>냉각용</tr><tr><td>TE Technology, Inc.</td><td>TC-720</td><td>에는 USB</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Trading AG</td><td>20736652</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecan Trading AG</td><td>20739263</td><td>주사기 펌프를 제어하여 빠른 단계 관류 시스템과 함께 배경 흐름을 유도하는 PC 소프트웨어가 포함되어 있습니다. 조직 유동 챔버</td><td></td>에서 유출</tr><tr><td>Thermo scientific</td><td>2441081</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)</td><td>단종된</td><td>대안: SF-77CST/VCS-77CSP</td><td></td></tr><tr><td>Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)</td><td>TG150-4</td><td>조직을</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> 관류하려면 <td>IonWizard용 PC 1대, 기타 소프트웨어</td><td></td>용 PC 1</tr></tbody></table>대

골격 근육 생검에서 myofibrils를 분리하고 나노 뉴턴 해상도 포스 트랜스듀서로 수축 기능을 결정합니다.

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

줄무늬 근육 세포는 인간과 동물의 활동에 필수적입니다. 단일 근육 섬유는 근육에서 가장 작은 수축 단위인 직렬로 연결된 사마페로 구성된 myofibrils로 구성됩니다. 육종 장애는 육종 단백질을 코딩하는 유전자에 있는 돌연변이를 가진 환자에 있는 근육 약점에 기여합니다. myofibril 역학의 연구는 단일 근육 섬유의 수축도 측정 할 때 손상, 인접한 myofibrils의 잠재적 인 혼란 효과없이 액틴 - myosin 상호 작용의 평가를 할 수 있습니다. 근비릴의 초구조적 손상과 정렬 불량은 손상된 수축에 기여할 수 있습니다. 구조적 손상이 myofibrils에 존재하는 경우, 격리 절차 중 또는 실험 중에 파손 될 가능성이 있습니다. 또한, 근시릴의 연구는 사메메레스의 기하학적 제약이 있는 액틴-미오신 상호작용의 평가를 제공한다. 예를 들면, myofibrils에 있는 측정은 근시릴라 기능 장애가 육종 단백질에 있는 돌연변이의 1 차적인 효력인지 를 해명할 수 있습니다. 또한, 칼슘 솔루션 또는 화합물이 있는 관류는 근시릴의 작은 직경으로 인해 거의 즉각적이다. 이것은 myofibrils가 힘 생산 도중 활성화 그리고 이완의 비율을 측정하기 위하여 탁월하게 적합하게 만듭니다. 이 논문에 설명된 프로토콜은 압전 길이 모터와 빠른 단계 의 관류 시스템에 결합된 나노 뉴턴 범위에서 힘을 측정할 수 있는 Fabry-Pérot 간섭계의 원리에 기초하여 광학 력 프로브를 사용합니다. 이 설정을 통해 고해상도 힘 측정을 통해 myofibril 역학을 연구할 수 있습니다.

데이터 추적은 시스템 컨트롤러 소프트웨어로 기록되고 열렸습니다(재료 표참조). 전체 추적 또는 선택한 세그먼트는 원하는 소프트웨어로 추가 분석을 위해 클립보드 또는 텍스트 파일로 내보냈습니다. 다양한 솔루션의 흐름을 제어하는 밸브는 사용자 지정 소프트웨어 또는 수동으로 전환되었습니다. 사용자 지정 MATLAB 스크립트는 활성화 속도 분석하는 데 사용되었습니다, 긴장 재개발, 및 휴식. 수동력 실험의 최대 활성력과 피크 및 고원력은 시스템 컨트롤러 소프트웨어 힘 추적으로부터 직접 촬영하였다. 마이오피브릴(도2)을장착한 후 원하는 프로토콜을 선택했습니다.
최대 활성 력과 칼슘-마우스와 인간의 골격 근육 생검에서 분리 된 근안의 힘의 감도 도 4A에서 활성 힘 실험에 사용되는 실험 용...

여기에 제시 나노 뉴턴 해상도와 스트라이드 근육 myofibrils의 수축 특성을 평가하는 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 간섭 계기반 광학 힘 프로브를 사용하여 설정을 사용합니다. 이 설정은 높은 신호 대 잡음 비율로 데이터를 생성하고 myofibrils의 수축 운동의 평가를 가능하게합니다.

골격 근육 생검에서 Myofibrils를 분리하고 나노 뉴턴 해상도 포스 트랜스듀서로 수축 기능을 결정합니다.

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

수축된 근육으로부터 분리된 myofibrils의 수축 특성을 평가하는 것은 sarcomere 기능 장애가 육종 단백질의 돌연변이로 인한 근육 약화의 주요 원인인지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있습니다. 이 기술은 나노 뉴턴 해상도를 가진 매우 높은 신호 대 잡음 비율로 데이터를 획득하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 투과성 심근세포에서 수축을 측정하기 위하여 적당합니다.힘 변환기가 매우 취약하다는 것을 명심하십시오. 따라서 장착 바늘에서 접착제를 제거하거나 myofibril을 붙일 때 꾸준한 손, 많은 연습 및 많은 인내심이 필요합니다. 조직을 장착하기 전에 근육 조직을 포함하는 튜브에 균질화 막대를 놓습니다.튜브를 얼음 위에 보관하고 5번 속도에서 로터를 15초 동안 회전합니다. 균질화의 끝에서, 결과 myofibril 현탁액의 50 마이크로 리터와 250 개의 편안한 용액을 티슈 욕조의 폴리 HEMA 코팅 슬라이드에 옮기. 뚜껑으로 목욕을 덮고 혼합물을 먼지로부터 보호하고 5-10분 간 기다려 미오피릴이 낙하의 바닥으로 가라앉을 수 있도록 합니다.myofibrils의 침몰 하는 동안, 열 쉘락 에탄올 접착제 에탄올 접착제 65 섭씨 60 받는 시간 동안 30 받는 시간 60 초 전에 코팅되지 않은 유리 슬라이드에 접착제의 약 6 마이크로 리터를 추가. 접착제층이 보일 때까지 각 장착 바늘의 끝을 접착제에 반복적으로 담급다. 그런 다음 마이크로 조작기를 사용하여 프로브와 압전을 수직으로 이동하여 현미경 단계에서 조직 목욕을위한 공간을 만들고 접착제를 포함하는 유리 슬라이드를 제거하십시오.근시 브릴을 장착 한 후, 사커 머 길이를 측정하기 위해, 압조 및 / 또는 힘 프로브를 이동하여 myofibril의 초기 사커 길이를 2.5 마이크로미터로 설정합니다. 시스템 컨트롤러 소프트웨어의 선박 기능을 사용하여, 마이오비브릴 길이와 폭을 측정합니다. 현미경 스테이지를 사용하여 비디오 이미지의 중앙에 myofibril을 배치하고 myofibril의 한쪽에서 다른 쪽으로 사각형을 스트레칭하여 접착제 방울의 어두운 가장자리를 포함하도록 주의하십시오.데이터 녹화를 시작하려면 시작하려면 먼저 클릭합니다. 5초 후 일시 중지를 클릭합니다. 길이가 기록되었습니다.폭을 측정하려면 카메라를 90도 회전하여 myofibril 자체의 가장자리의 대비를 확인합니다. 사각형을 조정하고 클릭하여 시작하여 데이터 기록을 시작합니다. 5초 후 일시 중지를 클릭합니다.너비가 기록되었습니다. 세타 유리를 배치하려면, 안면과 조작기를 사용하여 세타 유리를 myofibril쪽으로 조심스럽게 이동합니다. 테타 유리의 상단 채널을 myofibril과 정렬하고 위치를 확인하기 위해 빠른 단계를 수행합니다.배경이 이완 흐름을 켜서 테타 유리 정렬을 확인하고 Luer 밸브 레버를 사용하여 유량 챔버의 유입을 켭니다. 이어서 유동 챔버를 배수하기 시작하고 유량 챔버의 범람을 방지하기 위해, 배스 밸브 2, 마이크로 스텝 모드, 플런저 타겟을 48, 000으로 설정하고 플런저 속도를 38 에서 40으로 설정한다. 장력 재개발 속도를 측정하려면 근시브릴을 15% 느슨하게 하는 데 필요한 압전 움직임을 계산하여 신호 발생기에 이 값을 입력합니다.이력서를 클릭하여 데이터를 계속 기록하고 1및 6개의 밸브를 열어 이완용액의 흐름과 테타 유리를 통해 서로 다른 칼슘 농도의 흐름을 시작합니다. 간섭계에서 리셋 범위를 선택하여 기준힘이 0볼트가 되도록 간섭계의 범위를 재설정합니다. 힘 추적이 안정되면 100 마이크로미터 스텝 크기로 테타 유리 의 빠른 단계를 수행하십시오.힘 고원에 도달하면 압소로 단축 다시 스트레칭을 수행합니다. 활성화 완화 추적이 기록됩니다. 일시 중지를 클릭합니다.단계별 스트레치를 수행하려면 기준힘이 0볼트가 되도록 간섭계의 범위를 시작하고 재설정합니다. 신호 발생기와 함께 단계별 스트레칭을 수행합니다. 스트레치가 끝나면, 압전을 사용하여 미오피브릴을 여유 길이로 단축시하십시오.그런 다음 일시 중지하고 중지하고 데이터를 저장합니다. 여기서, 건강한 인간 사두근 근육으로부터 분리된 근위 력 실험의 힘 흔적이 나타난다. myofibril는 다양한 칼슘 농도를 가진 솔루션으로 5번 활성화되었으며, 평방 밀리미터당 약 123밀리톤의 모든 미오비릴의 평균 최대 힘이 있습니다.5개의 칼슘 곡선각각에서 각 활성화 시 도달한 고원력으로부터의 힘 칼슘 농도 곡선을 시공하면 최대 력 생산의 50%에서 칼슘 농도를 계산할 수 있습니다. 본 대표적인 분석에 도시된 바와 같이, myofibrils는 myofibril 타입에 관하여 추가 질문에 대답하기 위하여 단 하나 실험에서 다중 화합물로 취급될 수 있습니다. 활성 력과 사커풀 길이는 또한 재개발, 활성화 및 이완의 비율을 계산할 수 있도록 측정될 수 있습니다.점선 된 빨간 상자에 표시된 가파른 상승은 점도와 탄력 모두에 의해 발생합니다. 고원은 탄성 성분과유사합니다. 점도가 변형에 선형적으로 저항함에 따라 변형이 제거된 후 힘이 떨어졌습니다.세타 유리를 배치 할 때, 당신은 myofibril에 제대로 정렬해야합니다. 그렇지 않으면 활성 용액이 광섬유와 힘 프로브의 캔틸레버 사이에 들어올 수 있으며 이로 인해 데이터에서 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 또한, 마이오미브릴이 제대로 활성화되지 않을 수 있습니다.관류의 이 방법은 또한 근위부비릴의 근육 섬유 유형을 결정하는 데 적합하다. 예를 들어, 먼저 동일한 용액의 관류 에 이어 정상적인 칼슘 용액으로 myofibril을 견딜 수 있지만 근육 섬유 형 특정 힘 강화 화합물을 추가 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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생쥐의 6개 뒷다리 근육의 효소 해리로 얻은 온전한 짧은, 중간 및 긴 골격근 섬유: Beyond Flexor Digitorum Brevis

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산화성 근섬유 거동 평가를 위한 단일 섬유 분리 분석

배우세요 골격 근육에서 분리된 myofibril의 수축 기능을 측정하는 방법을. 나노뉴턴 해상도의 광학 간섭력 프로브를 사용하여 근육 약화의 원인이 되는 sarcomere 기능 장애를 식별하고 근육 생리학 연구에 활용할 수 있습니다.

골격 근육 생검에서 Myofibrils를 분리하고 나노 뉴턴 해상도 포스 트랜스듀서로 수축 기능을 결정합니다.

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