골격 근육 생검에서 Myofibrils를 분리하고 나노 뉴턴 해상도 포스 트랜스듀서로 수축 기능을 결정합니다.

수축된 근육으로부터 분리된 myofibrils의 수축 특성을 평가하는 것은 sarcomere 기능 장애가 육종 단백질의 돌연변이로 인한 근육 약화의 주요 원인인지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있습니다. 이 기술은 나노 뉴턴 해상도를 가진 매우 높은 신호 대 잡음 비율로 데이터를 획득하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 투과성 심근세포에서 수축을 측정하기 위하여 적당합니다.

힘 변환기가 매우 취약하다는 것을 명심하십시오. 따라서 장착 바늘에서 접착제를 제거하거나 myofibril을 붙일 때 꾸준한 손, 많은 연습 및 많은 인내심이 필요합니다. 조직을 장착하기 전에 근육 조직을 포함하는 튜브에 균질화 막대를 놓습니다.

튜브를 얼음 위에 보관하고 5번 속도에서 로터를 15초 동안 회전합니다. 균질화의 끝에서, 결과 myofibril 현탁액의 50 마이크로 리터와 250 개의 편안한 용액을 티슈 욕조의 폴리 HEMA 코팅 슬라이드에 옮기. 뚜껑으로 목욕을 덮고 혼합물을 먼지로부터 보호하고 5-10분 간 기다려 미오피릴이 낙하의 바닥으로 가라앉을 수 있도록 합니다.

myofibrils의 침몰 하는 동안, 열 쉘락 에탄올 접착제 에탄올 접착제 65 섭씨 60 받는 시간 동안 30 받는 시간 60 초 전에 코팅되지 않은 유리 슬라이드에 접착제의 약 6 마이크로 리터를 추가. 접착제층이 보일 때까지 각 장착 바늘의 끝을 접착제에 반복적으로 담급다. 그런 다음 마이크로 조작기를 사용하여 프로브와 압전을 수직으로 이동하여 현미경 단계에서 조직 목욕을위한 공간을 만들고 접착제를 포함하는 유리 슬라이드를 제거하십시오.

근시 브릴을 장착 한 후, 사커 머 길이를 측정하기 위해, 압조 및 / 또는 힘 프로브를 이동하여 myofibril의 초기 사커 길이를 2.5 마이크로미터로 설정합니다. 시스템 컨트롤러 소프트웨어의 선박 기능을 사용하여, 마이오비브릴 길이와 폭을 측정합니다. 현미경 스테이지를 사용하여 비디오 이미지의 중앙에 myofibril을 배치하고 myofibril의 한쪽에서 다른 쪽으로 사각형을 스트레칭하여 접착제 방울의 어두운 가장자리를 포함하도록 주의하십시오.

데이터 녹화를 시작하려면 시작하려면 먼저 클릭합니다. 5초 후 일시 중지를 클릭합니다. 길이가 기록되었습니다.

폭을 측정하려면 카메라를 90도 회전하여 myofibril 자체의 가장자리의 대비를 확인합니다. 사각형을 조정하고 클릭하여 시작하여 데이터 기록을 시작합니다. 5초 후 일시 중지를 클릭합니다.

너비가 기록되었습니다. 세타 유리를 배치하려면, 안면과 조작기를 사용하여 세타 유리를 myofibril쪽으로 조심스럽게 이동합니다. 테타 유리의 상단 채널을 myofibril과 정렬하고 위치를 확인하기 위해 빠른 단계를 수행합니다.

배경이 이완 흐름을 켜서 테타 유리 정렬을 확인하고 Luer 밸브 레버를 사용하여 유량 챔버의 유입을 켭니다. 이어서 유동 챔버를 배수하기 시작하고 유량 챔버의 범람을 방지하기 위해, 배스 밸브 2, 마이크로 스텝 모드, 플런저 타겟을 48, 000으로 설정하고 플런저 속도를 38 에서 40으로 설정한다. 장력 재개발 속도를 측정하려면 근시브릴을 15% 느슨하게 하는 데 필요한 압전 움직임을 계산하여 신호 발생기에 이 값을 입력합니다.

이력서를 클릭하여 데이터를 계속 기록하고 1및 6개의 밸브를 열어 이완용액의 흐름과 테타 유리를 통해 서로 다른 칼슘 농도의 흐름을 시작합니다. 간섭계에서 리셋 범위를 선택하여 기준힘이 0볼트가 되도록 간섭계의 범위를 재설정합니다. 힘 추적이 안정되면 100 마이크로미터 스텝 크기로 테타 유리 의 빠른 단계를 수행하십시오.

힘 고원에 도달하면 압소로 단축 다시 스트레칭을 수행합니다. 활성화 완화 추적이 기록됩니다. 일시 중지를 클릭합니다.

단계별 스트레치를 수행하려면 기준힘이 0볼트가 되도록 간섭계의 범위를 시작하고 재설정합니다. 신호 발생기와 함께 단계별 스트레칭을 수행합니다. 스트레치가 끝나면, 압전을 사용하여 미오피브릴을 여유 길이로 단축시하십시오.

그런 다음 일시 중지하고 중지하고 데이터를 저장합니다. 여기서, 건강한 인간 사두근 근육으로부터 분리된 근위 력 실험의 힘 흔적이 나타난다. myofibril는 다양한 칼슘 농도를 가진 솔루션으로 5번 활성화되었으며, 평방 밀리미터당 약 123밀리톤의 모든 미오비릴의 평균 최대 힘이 있습니다.

5개의 칼슘 곡선각각에서 각 활성화 시 도달한 고원력으로부터의 힘 칼슘 농도 곡선을 시공하면 최대 력 생산의 50%에서 칼슘 농도를 계산할 수 있습니다. 본 대표적인 분석에 도시된 바와 같이, myofibrils는 myofibril 타입에 관하여 추가 질문에 대답하기 위하여 단 하나 실험에서 다중 화합물로 취급될 수 있습니다. 활성 력과 사커풀 길이는 또한 재개발, 활성화 및 이완의 비율을 계산할 수 있도록 측정될 수 있습니다.

점선 된 빨간 상자에 표시된 가파른 상승은 점도와 탄력 모두에 의해 발생합니다. 고원은 탄성 성분과유사합니다. 점도가 변형에 선형적으로 저항함에 따라 변형이 제거된 후 힘이 떨어졌습니다.

세타 유리를 배치 할 때, 당신은 myofibril에 제대로 정렬해야합니다. 그렇지 않으면 활성 용액이 광섬유와 힘 프로브의 캔틸레버 사이에 들어올 수 있으며 이로 인해 데이터에서 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 또한, 마이오미브릴이 제대로 활성화되지 않을 수 있습니다.

관류의 이 방법은 또한 근위부비릴의 근육 섬유 유형을 결정하는 데 적합하다. 예를 들어, 먼저 동일한 용액의 관류 에 이어 정상적인 칼슘 용액으로 myofibril을 견딜 수 있지만 근육 섬유 형 특정 힘 강화 화합물을 추가 할 수 있습니다.