Name: 인간 기증자 후방 세그먼트의 내구 및 두개 내 압력 의 변조를위한 트랜스 라미나르 자율 시스템 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 배우세요 인간 후방 세그먼트를 이용한 트랜스 라미나르 자율 시스템(TAS) 모델로 안압과 두개 내 압력을 독립적으로 조절하는 방법을. 이 기술은 녹내장 및 외상성 뇌손상 등의 질병 연구에 활용됩니다.

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이 프로젝트에 대한 자금은 콜린 M. 맥도웰 박사의 임의 기금을 통해했다. 이 작품은 실명을 방지하기 위해 연구에서 무제한 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다, 안과 및 시각 과학의 UW 매디슨 부서에 Inc.. 우리는 관류 기관 문화 모델에 대한 기술 적 지원에 대한 박사 애보트 F. 클라크와 Weiming 마오에게 감사드립니다. 우리는 인간 기증자의 눈을 제공 에 대한 이식 및 연구 (탬파, 플로리다)에 대한 라이온스 눈 연구소 (탬파, 플로리다)에 감사드립니다.

눈은 인간 조직과 관련된 연구를 위해 헬싱키 선언의 규정에 따라 얻어졌다.
참고: 평판 좋은 안구 은행(예: 이식을 위한 라이온스 눈 연구소, 연구, 탬파 FL)의 눈은 6-12h 의 죽음 및 기증자 혈청에서 B형 간염, C형 간염 및 인간 면역 결핍 바이러스 1 및 2에 대해 시험되었습니다. 일단 그들이 수신되면, 눈은 해부하고 24 시간 이내에 TAS 모델에 설정되었다. 배제 기준에는 안구 병리학이 포함되었습니다. 눈은 연령, 인종 또는 성별에 따라 배제되지 않았습니다. 수령 시 망막의 생존가능성을 보장하기 위해 망막 이병은 조직 기증자로부터 수확되어 7일과 14일 동안 배양되었습니다(보충 도 1). 이 망막은 또한 RGC 마커를 위한 긍정적인 염색, 다중 접합 (RBPMS)을 가진 RNA 결합 단백질, 뿐만 아니라 그들의 신경 필라멘트에 염색하는 긍정적인 신경필라멘트 광 사슬 (NEFL)를 가진 7 일 동안 문화에서 건강한 RGCs를 성장시켰습니다 (보충 도 2). .
1. 장비 및 소모품의 준비 및 살균
<ol><li>필요한 전체 소모품 목록과 공급업체 및 카탈로그 번호는 재료 표 에 참조하십시오.</li>
	<li>사용하기 전에, 자동화 또는 에틸렌 산화물 앰플을 사용하여 모든 장비와 장비를 살균.</li>
</ol>2. 관류 매체의 준비
<ol><li>페니실린 연쇄상 구균 1%(U/mL 페니실린 10,000명, μg/mL 연쇄절제술 신 0.85% NaCl) 및 1% L-글루타민(200mMMMM)을 1,000mL 고혈당 DULBecco의 수정된 미디엄 DMEM에 추가합니다.</li>
	<li>0.22 μm 필터를 통과하여 관류 매체를 살균한다.</li>
</ol>3. 트랜스라미나르 자율 시스템(TAS) 설정
<ol><li>인플로 주사기(IOP 및 ICP 저장소)를 설정합니다.<ol>
<li>30mL 주사기에 관류 배지(섹션 2)의 30mL를 추가합니다. 30mL 주사기에 3방향 스톱콕을 부착합니다. 0.22 μm 친수성 필터를 3방향 스톱콕에 부착합니다. 0.22 μm 친수성 필터에 15 G 루어 스텁 어댑터를 부착합니다.</li>
		<li>주사기 설정에서 기포를 제거합니다. 튜브를 15 G Luer 스텁 어댑터에 부착합니다. 발명되지 않은 범용 잠금 캡으로 스톱콕의 측면 포트를 닫습니다. 총 2개의 설정에 대해 반복합니다.</li>
		<li>채널 1 내두근(CH1 ICP) 및 다른 주사기를 채널 2 내혈압(CH2 IOP)으로 표시합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>유출 주사기(IOP 및 ICP 저장소)를 설정합니다.<ol>
<li>30mL 주사기에 3방향 스톱콕을 부착합니다. 15 G 루어 스텁 어댑터를 3방향 스톱콕에 부착합니다. 튜브를 15 G Luer 스텁 어댑터에 부착합니다.</li>
		<li>발명되지 않은 범용 잠금 캡으로 스톱콕의 측면 포트를 닫습니다. 총 2개의 설정에 대해 반복합니다. 하나의 주사기를 CH1 ICP로, 다른 주사기는 CH2 IOP로 레이블을 지정합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 인간 전체 눈 글로브의 준비
참고: 전체 눈이 수신되는 경우 아래 절차를 따라 전방 세그먼트를 눈의 후방 세그먼트에서 분리하십시오. 눈이 양분된 경우 4.4 단계에서 시작합니다.
<ol><li>2 분 동안 포비도네 요오드 솔루션에 전체 눈을 배치합니다.</li>
	<li>멸균 인산염 완충액(PBS)에서 눈을 헹구어 포비도네 요오드를 헹구는다. 2번 반복합니다.</li>
	<li>집게와 가위를 사용하여 전체 눈 글로브에서 아덱사제거합니다. 적도에서 눈을 양분하여 눈의 전방 및 후방 세그먼트를 분리합니다.</li>
	<li>시신경 칼집을 제거합니다. 후부 세그먼트에서 유리체 유머를 제거합니다.</li>
	<li>필요한 경우 후방 세그먼트에서 추가 클레라를 트리밍하여 IOP(아래쪽) 챔버의 둥근 돔에 잘 맞도록 합니다. 집게를 사용하여 망막이 세그먼트의 후방에 고르게 퍼지는지 확인합니다.</li>
	<li>IOP(아래쪽) 챔버 설정<ol>
<li>인간 후방 세그먼트를 TAS의 IOP(아래쪽) 챔버에 놓고 회전 돔 위에 시신경이 위를 향하게 한다.</li>
		<li>에폭시 수지 O 링에 4개의 나사로 후방 세그먼트를 밀봉하여 단단한 씰을 보장합니다.</li>
		<li>튜브를 IOP(아래쪽) 챔버의 IN 및 OUT 포트에 삽입합니다. 튜브가 포함된 튜브가 포함된 IOP 유입 주사기는 IN 포트에 삽입되고 튜브가 있는 빈 IOP 유출 주사기가 OUT 포트에 삽입됩니다.</li>
		<li>푸시/풀 방법을 사용하여 유입 포트에 관류 배지를 천천히 주입하여 후부 안구컵을 채우는 동시에 유출 주사기를 통해 회류 배지를 천천히 당겨 라인에서 기포를 제거합니다. IN 및 OUT 튜브가 기포가 없는 후에 배지 주입을 중지합니다.</li>
		<li>오프 위치에 스톱콕을 잠급. IOP IN 포트 필터 어셈블리에서 30mL 주사기를 제거하고 총 30mL의 매체로 리필하십시오. 30mL 주사기를 필터 어셈블리에 교체합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ICP(상단) 챔버 설정
	<ol>
<li>후부 세그먼트 의 뒷면에 ICP(상단) 챔버/뚜껑을 놓습니다. 시신경이 상부 챔버 내에 있는지 확인하십시오. 상단 챔버를 4개의 나사로 밀봉합니다.</li>
		<li>ICP(상단) 챔버의 IN 및 OUT 포트에 튜브를 삽입합니다. 튜브가 포함된 튜브가 포함된 ICP 유입 주사기는 IN 포트에 삽입되고 튜브가 있는 빈 ICP 유출 주사기가 OUT 포트에 삽입됩니다.</li>
		<li>ICP 챔버를 채우고 푸시/풀 방법을 사용하여 라인에서 기포를 제거하기 위해 IN 포트에 매체를 부드럽고 천천히 주입합니다. ICP 챔버뿐만 아니라 IN 및 OUT 튜브가 기포가 없는 경우 배지 주입을 중지합니다.</li>
		<li>오프 위치에 스톱콕을 잠급. 포트 필터 어셈블리에서 ICP에서 30mL 주사기를 제거하고 총 30mL의 매체로 리필하십시오. 30mL 주사기를 필터 어셈블리에 교체합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 데이터 기록 시스템 설정
참고: 데이터 기록 시스템은 8채널 전원, 멀티채널 브리지 증폭기, 유압 압력 변환기 및 데이터 수집 소프트웨어가 있는 컴퓨터로 구성됩니다( 재료 표 참조). 다음은 시스템을 설정하고 보정하는 방법을 설명합니다.
<ol><li>전원 코드를 8채널 전원 뒷면에 연결하고 배터리 백업 장치에 연결합니다.</li>
	<li>8채널 전원의 USB 케이블을 컴퓨터 뒷면에 연결합니다.</li>
	<li>제공된 I2C 코드를 사용하여 8채널 전원을 다중 채널 브리지 증폭기에 연결합니다.</li>
	<li>Bayonet Neill-Concelman(BNC) 케이블을 8채널 전원 앞의 채널 입력에 연결하고 케이블끝을 멀티채널 앰프 뒷면의 해당 채널에 연결합니다.</li>
	<li>트랜스듀서 케이블을 멀티채널 앰프의 전면에 연결합니다.</li>
	<li>컴퓨터에 데이터 수집 소프트웨어를 설치합니다.<ol>
<li>제공된 소프트웨어 CD에서 데이터 수집 소프트웨어 설치 설치 프로그램을 실행합니다.</li>
		<li>컴퓨터 화면의 지침을 따릅니다.</li>
		<li>설치가 완료되면 마무리를 선택 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>8채널 전원을 켭니다.</li>
	<li>컴퓨터를 켜고 데이터 수집 소프트웨어를 시작합니다.<ol>
<li>파일 | 선택 새로운.
</li>
		<li>설치 | 선택 채널 설정. 세 개의 채널(화면 왼쪽 하단)을 선택합니다. 채널 제목 열에서 다음과 같이 채널의 이름을 변경: CH1 ICP; CH2 IOP; CH3 TLPG (IOP-ICP).</li>
		<li>모든 채널에서 범위에 대해 2mV를 선택합니다. 계산 열에서 채널 1과 2에 대한 계산 없음 을 선택합니다.</li>
		<li>계산 열에서 채널 3에 대한 산술을 선택합니다. 수식 섹션에서: 채널/CH2 를 선택합니다. 산술 "-"를 선택합니다. 채널/CH1을 선택합니다. 출력 섹션에서 mmHg를 선택합니다. 확인을 선택합니다. 확인을 다시 선택합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>정압 변환기를 설정하고 교정합니다. 참고: 다음 방법을 사용하여 실험하기 전에 유수압 변환기를 보정해야 합니다.<ol>
<li>다중 채널 브리지 증폭기에 부착된 트랜스듀서 라인에 수압 변환기를 연결합니다.</li>
		<li>CH1(ICP) 압력 트랜스듀서의 측면 포트에 공기로 채워진 30mL 주사기를 부착합니다. CH1(ICP) 압력 변환기의 바닥에 스피그노미터를 부착합니다.</li>
		<li>차트에서 데이터 수집 소프트웨어의 페이지를 보고 샘플링 시간 옆의 화살표를 클릭하여 샘플링 속도를 설정하고 100을 선택합니다. 그런 다음 페이지의 CH1 (ICP) 영역을 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.</li>
		<li>브리지 앰프를 선택합니다. 메인 필터를 선택합니다. 0을 선택하고 압력 변환기를 이동하지 않도록 주의를 기울여 시스템이 0밖으로 나올 때까지 기다립니다.</li>
		<li>압력 변환기의 흰색 탭을 꼬집어 40 mmHg가 스피그노미터에서 얻을 때까지 트랜스듀서를 통해 공기를 밀어 넣습니다. 흰색 탭을 해제하고 주사기와 스피그노미터를 제거합니다.</li>
		<li>단위 변환 페이지에서 '마이너스(-)' 기호를 선택합니다. 40mmHg를 나타내는 가장 높은 고원을 강조 표시합니다. 점 1에 대한 화살표를 클릭하고 40을 입력합니다.</li>
		<li>0mmHg를 나타내기 위해 가장 낮은 고원을 강조 표시합니다. 점 2에 대한 화살표 를 클릭하고 0을 입력합니다. 단위에 대한 mmHg를 선택합니다. 확인을 선택합니다.</li>
		<li>확인을 선택 합니다 (브리지 앰프 페이지). 가장 높은 고원에 대해 100mmHg, 가장 낮은 고원에 대해 0을 사용하여 CH2(IOP)에 대해 9.1-9.7단계를 반복합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>TAS/후방 세그먼트 단위를 데이터 수집 시스템에 연결합니다.<ol>
<li>TAS/후방 세그먼트 유닛을 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에 넣습니다. OUT 포트에서 ICP 튜브를 CH1(ICP) 압력 변환기에 연결합니다.</li>
		<li>OUT 포트에서 CH2(IOP) 압력 변환기에 IOP 튜브를 부착합니다.</li>
		<li>주사기 설정(ICP 및 IOP)을 IN 포트에서 링 스탠드에 배지로 부착합니다.</li>
		<li>차트 보기 페이지에서 샘플링 시작을 선택합니다. 샘플링 시간 옆의 화살표를 클릭하여 샘플링 속도를 설정하고 천천히 1분 을 선택합니다.</li>
		<li>프로토콜 요구 사항에 대한 ICP 및 IOP 압력을 조절하기 위해 링 스탠드의 주사기를 위 또는 아래로 조정합니다.</li>
		<li>푸시 및 풀 방법을 통해 48-72 h마다 시스템에서 중간 크기의 전신 보충을 수행합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>6. 데이터 검색 및 분석
<ol><li>데이터 수집 소프트웨어에서 데이터 파일을 엽니다.</li>
	<li>데이터 패드 섹션에서 데이터 패드에 여러 추가 아이콘을 클릭합니다. 새 창이 나타납니다.<ol>
<li>사용 찾기 섹션에서 드롭다운 메뉴에서 시간을 선택합니다.</li>
		<li>선택 섹션에서드롭다운 메뉴에서 1시간마다 1시간씩 선택합니다.</li>
		<li>단계 별 섹션에서 전체 파일을 선택한 다음 추가를 클릭합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>데이터 패드 섹션에서 데이터 패드 뷰 아이콘을 클릭합니다. 모든 데이터를 강조 표시하고 스프레드시트에 복사/붙여넣기를 복사/붙여넣습니다.</li>
	<li>24시간마다 IOP, ICP 및 TLPG의 평균 및 표준 편차를 계산합니다. 스프레드시트 프로그램 및 그래프에서 피벗 테이블 옵션을 사용하여 데이터를 집계합니다.</li>
</ol>7. 후부 세그먼트의 면역 히스토화학 및 헤마톡슬린 및 에진 염색
<ol><li>TAS 모델의 다양한 시점을 따라 후방 눈 세그먼트를 제거하고 파라피화 하기 전에 포르말린으로 수정합니다.</li>
	<li>눈을 절제하여 조직 평면을 생성합니다.</li>
	<li>100% 자일렌, 95% 에탄올, 50% 에탄올 용액으로 파라핀 임베디드 세그먼트를 deparaffinize.</li>
	<li>PBS로 슬라이드를 10분 동안 세척하고 실온에서 블로킹 버퍼로 1시간 동안 차단합니다.</li>
	<li>1차 항체를 가진 라벨 섹션: 항 콜라겐 IV (세포외 매트릭스 (ECM) 마커, NB120-6586, 1:100) 및 항 라미닌 (ECM 마커, NB300-144, 1:100, 안티 RBPMS (RGC 마커), GTX118619, 1:50).</li>
	<li>알렉사 플루오 이차 항체를 사용하여 1차 항체를 검출합니다(알렉사 플루오 488 염소 항토끼, A11008, 1:500).</li>
	<li>DAPI 안티 페이드 용액을 사용하여 세포 핵을 카운터스테인.</li>
	<li>형광 현미경을 사용하여 4배 및 10배 의 객관적 렌즈로 스테인드 섹션 및 위상 이미지의 이미지를 캡처 합니다(재료표 참조).</li>
	<li>헤마톡클린과 에오신(H&E) 염색의 경우, 100%, 자일렌 95% 에탄올, 50% 에탄올 용액 및 H&E를 사용한 스테인을 사용하여 데파라핀화를 위해 자동화된 스테인닝 시스템( 재료표 참조)에서 섹션을 처리합니다.</li>
	<li>밝은 필드 광원이 있는 현미경을 사용하여 4x 및 10배 의 객관적렌즈로 이미지를 캡처합니다.</li>
</ol>

원고의 저자는 공개 할 잠재적 인 이해 상충이 없습니다.

인간 사후 조직은 동물 모델에서 개발 된 잠재적 인 약물의 식별이 인간47에 번역 될 필요가 있기 때문에 인간의 신경 퇴행성 질환을 연구하기위한 특히 가치있는 자원입니다. 인간 IOP 고도의 영향은 잘 확립되어 있습니다, 그러나 최소한의 연구는 비정상적인 ONH translaminar 압력 변경에 행해졌습니다. 여러 동물 모델과 인간 ONH의 유한 모델링이 존재하지만, 트랜스 라미나르 압력 변화를 연구하는 전 생체 인간 모델은 없습니다41,54,55,56,57. 현재 충족되지 않은 필요는 IOP와 ICP를 사용하여 질병 병인학 ex vivo를 표적으로 하고 녹내장 병인증과 관련되되나는 각종 병원성 ...

최근 설문 조사에서 전 세계적으로 추정에 따르면 시각 장애가 있는 3,900만 명을 포함하여 2억 8,500만 명이 시각 장애를 앓고 있는 것으로 나타났습니다1. 2010년, 세계보건기구(WHO)는 눈1의 후방 부문에서 실명의 주요 원인 9가지 중 3명이 발생한다고 기록했습니다. 후방 세그먼트 눈 질환은 망막, 코로이드 및 시신경2를 포함한다. 망막과 시신경은 뇌의 중추 신경계 (CNS) 확장입니다. 망막 신경절 세포 (RGC) 축축은 시신경 헤드 (ONH)를 통해 눈을 빠져 서 시신경3를 형성하기 때문에 손상에 취약하다. ONH는 라미나 크리브로사(LC)4라고 불리는 결합 조직 빔의 3D 메쉬워크로 인해 RGC 축축에 가장 취약한 지점으로 남아 있다. ONH는 녹내장5,6,7에서 RGC 축록색에 대한 모욕의 초기 사이트이며, ONH 내의 유전자 발현 변화는 안구 고혈압 및 녹내장 모델8,9,10에서 연구되고 있다. RGC 축축은 내피압력(IOP)이라고 불리는 안구 체획 사이의 압력 차압으로 인해 ONH에서 취약하며, 외부 심방식 수막(ICP)11이라고 불린 공간 내에서 취약하다. LC 영역은 정상 압력 차동을 유지하면서 두 영역을 분리하여 IOP가 10-21 mmHg 및 ICP에서 5-15 mmHg12에 이르는 범위로 유지합니다. 두 챔버 사이의 라미나를 통한 압력 차이는 트랜스라미나 압력 그라데이션(TLPG)13이라고 합니다. 녹내장의 주요 위험 요소는 상승 IOP14.
증가된 IOP는 라미나르 지역 내 및 전체의 균주를 증가6,15,16. 인간과 동물 모델의 실험적 관찰은 ONH를 축상 손상의 초기 부위로 제시17,18. ONH에서 녹내장 손상을 일으키는 IOP 관련 스트레스 및 균주의 생체 역학 패러다임은 또한 녹내장19,20,21의 병리생리학에 영향을 미칩니다. 인간 압력 유도 변화가 기계적으로 RGC 축22에 손상을 입히더라도, 라미나 내의 콜라주노우스 플레이트가 부족한 설치류는 녹내장7,23을 개발할 수 있다. 또한, 높은 IOP는 1 차적인 개방각 녹내장 환자에서 가장 눈에 띄는 위험 요소 남아, 정상적인 긴장 녹내장 환자는 높은 IOP 없이도 녹내장 광학 신경 병증을 개발하는 동안. 게다가, 또한 시신경 손상을 보여주지 않는 안구 고혈압 환자의 부분 집합이 있습니다. 또한 뇌척수액 압력 (CSFp)이 녹내장 병인에 역할을 할 수 있다는 것이 제안되었습니다. 증거는 ICP가 일반 개인에 비해 녹내장 환자에서 ~ 5 mmHg로 낮아져 트랜스라미나 압력을 증가시키고 disease24,25에서 중요한 역할을 한다는 것을 나타냅니다. 이전에는 IOP 및 CSFp 변화를 제어함으로써 광학 디스크26의 큰 변위가 있을 수 있음을 개 모델에서 입증했습니다. 돼지 눈에서 CSFp를 상승시키는 것은 또한 LC 지역 및 레트로라미나 신경 조직 내의 증가된 주체 긴장을 보여주었습니다. RGC와 LC 지역에 대한 부담이 증가하여 축축운송 막힘과 RGCs27 의 손실에 기여합니다. RGC의 점진적 변성은 영양 지원28,29의 손실, 염증 과정/면역 조절의 자극30,31, 및 세포세포 이펙터29,32,33,34,35 와 관련이 있다. 또한 축 상 부상(그림 3)은 RGC에 해로운 영향을 일으켜 재생 실패36,37,38,39를 유발합니다. 비록 IOP의 효과 잘 공부 되었습니다. 녹내장에 대 한 대부분의 치료 IOP 안정화에 초점을 맞추고. 그러나 IOP의 하강은 질병의 진행을 늦추더라도 시각 필드 손실을 되돌리고 RGC의 완전한 손실을 방지하지 못합니다.
현재 의 증거는 외상성 또는 신경 퇴행성 시각 장애로 고통받는 환자의 다양한 기계적, 생물학적 또는 생리적 변화로 인한 트랜스 라미나르 압력 변조가 상당한 시력 손실을 일으킬 수 있음을 나타냅니다. 현재, 전생체 인간 ONH 내에서 녹내장 생체 역학적 손상의 연구를 허용할 수 있는 진정한 전임상 인간 후방 세그먼트 모형이 존재하지 않습니다. 눈의 후방 세그먼트의 관찰 및 치료는 안과27에 있는 거대한 도전입니다. 높은 제거 율, 혈액 망막 장벽 및 잠재적인 면역 학적 반응을 포함하여 후방 눈을 표적으로 하는 물리적 및 생물학적 장벽이 있습니다40. 새로운 약물 표적에 대한 대부분의 효능 및 안전 성 검사는 체외 세포 및 생체 내 동물 모델을 활용하여 수행됩니다41. 안구 해부학은 복잡하고, 체외 연구에서 조직 모델 시스템에 의해 제시된 해부학적 및 생리적 장벽을 정확하게 모방하지 않습니다. 동물 모델이 약동학 연구의 필요성이 있더라도, 인간 후방 눈의 안구 생리학은 망막의 세포 해부학, 혈관 및 ONH41,42를 포함하여 각종 동물 종 사이에서 다를 수 있습니다.
살아있는 동물의 사용은 집중적이고 상세한 윤리적 규정, 높은 재정 적 헌신 및 효과적인 재현성이 필요합니다43. 최근, 실험 연구에서 동물의 윤리적 사용에 대 한 여러 가지 다른 지침 44,45,46 계속. 동물 실험의 대안은 ONH 손상을 보호하기위한 질병의 발병과 약물의 잠재적 분석을 조사하기 위해 전 생체 내 눈 모델의 사용입니다. 인간 포스트모템 조직은 인간 질병 패러다임을 연구하기위한 귀중한 자원이며, 특히 인간 신경 퇴행성 질환의 경우 동물 모델에서 개발 된 잠재적 인 약물의 식별은 인간에게 번역 할 필요가 필요하기 때문에47. 전 생체 인간 기증자 조직은 인간 무질서47,48,49의 연구 결과에 광범위하게 이용되고 있고, 인간 전방 세그먼트 관류 기관 배양 시스템은 이전에 높은 IOP50,51,52의 병리생리학을 연구하기 위하여 유일한 ex vivo 모형을 제공했습니다.
인간의 눈에 IOP 및 ICP와 관련된 트랜스라미나 압력을 연구하기 위해, 우리는 성공적으로 설계및 인간의 기증자 눈에서 후방 세그먼트를 사용하여 독립적으로 IOP와 ICP를 조절 할 수있는 2 챔버 트랜스 라미나르 자율 시스템 (TAS)을 개발. 트랜스라미나 압력을 연구하고 ONH에 TLPG의 생체 역학적 효과를 악용한 최초의 전 생체 인간 모델이다.
이 ex vivo 인간 TAS 모델은 IOP 또는 ICP의 만성 고도로 인해 발생하는 세포 및 기능적 수정을 발견하고 분류하는 데 사용할 수 있습니다. 이 보고서에서는 TAS 휴먼 후방 세그먼트 모델을 해부, 설정 및 모니터링하는 단계별 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 연구원이 생물 기계식 질병 병인을 연구하기 위하여 이 새로운 ex vivo 가압된 인간 후방 세그먼트 모형을 효과적으로 재현하는 것을 허용할 것입니다.

<table><tbody><tr><td>#122, 1-1/8" 내부 x 1-5/16" 외부 직경, Viton O-Ring, 3/32" 두께, 755 경도계 50 팩</td><td>Amazon</td><td>B07DRGPPZJ</td><td></td></tr><tr><td>114 Buna-N O-Ring, 70A 경도계, 검정, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" 너비 (100개 팩)</td><td>Amazon</td><td>B000FMYRHK</td><td></td></tr><tr><td>바늘 없는 30mL 주사기</td><td>Vitality Medical</td><td>302832</td><td></td></tr><tr><td>3-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks, Swivel Male Luer Lock, 통풍 캡</td><td>QOSINA</td><td>2C6201</td><td></td></tr><tr><td>4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & 적절한 크기의 십자 드라이버</td><td>Brikksen 스테인리스 스틸 패스너</td><td>PPMSSSCH4C.5</td><td>&nbsp; </td></tr><tr><td>ANPROLENE 16 대형 앰플</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9085343</td><td>&nbsp; </td></tr><tr><td>Betadine</td><td>퍼듀</td><td>PUR1815001EACH</td><td>&nbsp; </td></tr><tr><td>Corning 100 x 20mm 조직 배양 처리된 배양 접시</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167-100EA</td><<td>strong>&nbsp; </td></tr><tr><td>코닝&nbsp; L-글루타민 솔루션</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25005CI</td><td></td></tr><tr><td>Covidien 3033 Curity 거즈 스폰지, 4" x 4", 12겹, 멸균, 1200/CS</td><td>Med Plus Medical Supply</td><td>COV-3033-CS</td><td></td></tr><tr><td>드레싱 집게 섬세한 곡선(톱니)</td><td>Katena</td><td>K5-4010</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - 미세 집게</td><td>F.S.T.</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>눈 가위 표준 곡선</td><td>Katena</td><td>K4-7410</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 150 x 15mm 일반 멸균 일회용 페트리 접시</td><td>Capitol Scientific</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 4 oz. 표본 용기</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-320-730</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 인스턴트 씰링 살균 파우치</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-54</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 즉석 밀봉 살균 파우치</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-55</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 순간 밀봉 살균 파우치</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-58</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3024302</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>여성 루어 잠금 입구, 남성 루어 슬립 출구, 파란색 및 투명</td><td>Qosina</td><td>28217</td><td></td></tr><tr><td>정수압 트랜스듀서, DELTRAN &reg; II, 카탈로그 # DPT-200 3CC/HR 유량</td><td>AD 기기</td><td>DPT-200</td><td></td></tr><tr><td>JG15-0.5HPX 15 게이지 0.5" NT 프리미엄 시리즈 디스펜싱 팁 50/박스</td><td>젠슨 글로벌</td><td>JG15-0.5HPX 15</td><td></td></tr><tr><td>Keyence B2? X710 현미경</td><td>Keyence</td><td>B2-X710</td><td></td></tr><tr><td>LabChart 8</td><td>AD 기기</td><td>LabChart 8</td><td></td></tr><tr><td>Leica ST5020 멀티 스테인 Leica</td><td>ST5020</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Non-Vented Universal Luer Lock Cap, White</td><td>QOSINA</td><td>65811</td><td></td></tr><tr><td>Octal Bridge Amp (Model # FE228)</td><td>AD instruments</td><td>FE228</td><td></td></tr><tr><td>Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1675398</td><td></td></tr><tr><td>인산염 버퍼 용액 (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 8/35 (모델 # PL3508)</td><td>AD 기기</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water&nbsp; 직선 어댑터, 1/8" 튜브 OD x 1/8 NPT 남성</td><td>McMAster-Carr</td><td>7880T113</td><td></td></tr><tr><td>푸시-투-커넥트 튜브 피팅 유니버설 스레드&nbsp; 공기 및 물용, 어댑터, 1/8" 튜브 OD x 1/8 파이프</td><td>McMAster-Carr</td><td>51235K101</td><td></td></tr><tr><td>Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 플렉시블 튜빙 500피트.</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-171-268</td><td></td></tr><tr><td>Superblock T20</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI37536</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위 - 날카롭고 둔탁한</td><td>FST</td><td>14001-14</td><td></td></tr><tr><td>조직 집게 섬세한 1x2 치아 곡선</td><td>Katena</td><td>K5-4110</td><td></td></tr><tr><td>Translaminar Autonomous System (TAS)</td><td>University of North Texas Health Science Center</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>USA 크기 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 경도계, 검정, Buna-N (NBR, 니트릴, Buna)</td><td>Marco Rubber & 플라스틱</td><td>B1000-030</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 기증자 후방 세그먼트의 내구 및 두개 내 압력 의 변조를위한 트랜스 라미나르 자율 시스템 모델

Translaminar Autonomous System Model for the Modulation of Intraocular and Intracranial Pressure in Human Donor Posterior Segments

녹내장 병원체 발생과 관련된 다양한 병원성 패러다임을 식별할 수 있는 두개내 압력(ICP) 및 내내압(IOP)을 이용하여 질병 병인학 전 생체을 표적으로 삼을 수 있는 새로운 전임상 인간 모델에 대한 현재 충족되지 않은 필요성이 있다. Ex vivo 인간 전방 세그먼트 관류 기관 배양 모델은 이전에 녹내장 병인발생 및 치료법 의 시험을 위한 효과적인 기술로 성공적으로 활용되고 적용되었습니다. 전 생체 인간 장기 시스템에서 수행 된 전임상 약물 선별 및 연구는 임상 연구에 더 이상 번역 될 수 있습니다. 이 문서에서는 트랜스라미나르 자율 시스템(TAS)이라고 불리는 새로운 생체 내 인간 트랜스라미나 압력 모델의 생성 및 작동을 자세히 설명합니다. TAS 모델은 인간 기증자 후방 세그먼트를 사용하여 ICP 및 IOP를 독립적으로 규제할 수 있습니다. 이 모델은 전임상 방식으로 병인을 연구할 수 있습니다. 그것은 안과 연구에서 살아있는 동물의 사용을 줄일 수 있습니다. 시험관 내 실험 모델과 는 달리, 시신경 헤드(ONH) 조직 구조, 복잡성 및 무결성또한 전 생체 내 TAS 모델 내에서 유지될 수 있다.

트랜스라미나르 자율 시스템의 설계 및 생성 트랜스라미나르 압력 차동은 녹내장을 포함한 다양한 질병의 발병기만에 있는 잠재적인 중요한 기계장치입니다. 설명 된 모델에 대 한 용도 포함, 하지만 이한되지 않습니다., 녹내장의 연구 (높은 IOP, 아마도 감소 ICP), 외상성 뇌 손상 (높은 ICP), 그리고 미세 중력 관련 된 시각 장애에 장기 노출 (높은 ICP, 높은 IOP). 인간의 눈에서 트랜스라미나 압력을 대상으로 분자 병발생을 발견하기 위해 TAS 모델을 설계, 생성 및 검증했습니다. 우리의 새로운 ex vivo 인간 모형은 ICP와 IOP 관련 병원성 변경을 독립적으로 연구하기 위하여 유일한 전임상 시스템을 제공합니다. 인간의 전임상 응용 프로그램을 해결하기 위해, 우리의 모델은 트랜스 라미나르 압력 변화로 인한 병증을 연구하는 전 생체 내 패러다임을 제공합니다. 밀폐형 모델 디자인은 모든 유입 및 유출 포트(그림 1C)를 묘사하...

우리는 트랜스 라미나르 자율 시스템의 사용을 설명하고 자세히 설명합니다. 이 시스템은 인간 후방 세그먼트를 사용하여 세그먼트 내부의 압력(내부)과 시신경(원두개)을 둘러싸서 녹내장 신경병증의 특징을 모방한 횡하수압 그라데이션을 생성합니다.

There is a current unmet need for a new preclinical human model that can target disease etiology ex vivo using intracranial pressure (ICP) and intraocular ...

이 새로운 안구 층류 횡단 자율 시스템은 인간 후방 분절을 사용하여 안구 내 및 두개내 압력을 독립적으로 조절하여 층류 압력 구배를 생성합니다. TAS 모델을 사용하면 이전에는 연구할 수 없었던 생체 외 전임상 방식으로 인간 두개내압을 평가할 수 있습니다. 이 모델은 잠재적으로 녹내장, 외상성 뇌 손상, 특발성 두개내 고혈압 및 우주 비행 관련 신경 안구 증후군과 같은 질병을 연구하는 데 사용될 수 있습니다.유입 주사기를 설정하려면 30ml 주사기에 관심 관류 유체 30ml를 로드하고 주사기에 3방향 스톱 콕을 부착합니다. 스톱 콕에 0.22마이크로미터 친수성 필터를 부착하고 15마이크로미터 친수성 필터에 0.22게이지 루어 스터브 어댑터를 부착합니다. 주사기 설정에서 기포를 제거한 후 튜브를 루어 스텁 어댑터에 부착하고 통풍구가 없는 범용 잠금 캡으로 스톱 콕의 측면 포트를 닫습니다.방금 설명한 대로 두 번째 유입 주사기를 설정한 후 하나의 주사기 채널에 하나의 ICP에 레이블을 지정하고 다른 주사기 채널에 2개의 IOP에 레이블을 지정합니다. 그런 다음 방금 시연한 대로 유출 주사기를 설정하되 주입 매체를 주사기에 로드하지 않습니다. 인간 전체 눈 구체 샘플을 준비하려면 시신경초를 제거하고 후안부에서 유리체액을 제거합니다.안압 챔버의 둥근 돔에 잘 맞도록 하려면 필요에 따라 후방 분절에서 추가 공막을 자르고 겸자를 사용하여 망막이 분절의 인간 후방 전체에 고르게 퍼지도록 합니다. 그런 다음 시신경이 위를 향하도록 하여 원형 돔 위의 TAS의 IOP 챔버에 세그먼트를 놓고 에폭시 수지 O-링과 4개의 나사를 사용하여 후방 세그먼트를 밀봉합니다. IOP 챔버를 설정하려면 튜브를 챔버의 입력 및 출력 포트에 삽입하고 IOP 유입 주사기를 입력 포트에 삽입합니다.빈 IOP 배출 주사기 설정을 출력 포트에 삽입하고 푸시/풀 방법을 사용하여 관류 매체를 유입 포트에 천천히 주입하여 후방 아이컵을 채우는 동시에 배출 주사기를 통해 관류 매체를 천천히 당겨 라인의 기포를 제거합니다. 입력 및 출력 튜브 모두에 기포가 없으면 주입을 중지하고 정지 콕을 꺼짐 위치에 잠급니다. IOP 인 포트 필터 어셈블리에서 주사기를 제거하고 주사기에 30mm의 매체를 추가로 채운 다음 실린지 설정을 필터 어셈블리에 다시 삽입합니다.ICP 챔버를 설정하려면 시신경이 상단 챔버 내에 있는지 주의하면서 챔버를 후방 세그먼트 뒤쪽에 배치하고 4개의 나사로 상단 챔버를 밀봉한 다음 튜브를 ICP 챔버의 입력 및 출력 포트에 삽입하고 ICP 입력 주사기를 입력 포트에 삽입하고, 그리고 빈 ICP 유출 주사기를 출력 포트로 주입하여 방금 시연한 바와 같이 매체로 시스템을 플러시합니다. 데이터 기록 시스템을 설정하려면 8채널 전원과 컴퓨터를 켜고 데이터 수집 소프트웨어를 시작합니다. 파일 및 새로 만들기를 선택하고 설정 및 채널 설정을 선택합니다.세 개의 채널을 선택하고 표시된 대로 채널 이름을 바꿉니다. 모든 채널의 범위에 대해 2밀리볼트를 선택하고 계산 열에서 채널 1과 2에 대해 계산 없음을 선택합니다. 채널 3에 대한 산술 선택 수식 창의 채널에서 채널 2를 선택합니다.Function(함수)에서 Math(수학)와 Minus(마이너스)를 선택하고 Channels(채널)에서 Ch 1(채널 1)을 선택합니다. 정수압 트랜스듀서를 설정 및 교정하려면 정수압 트랜스듀서를 다중 채널 브리지 증폭기에 연결된 트랜스듀서 라인에 연결하고 빈 30밀리리터 주사기를 채널 1 ICP 압력 트랜스듀서의 측면 포트에 부착합니다. 채널 1 ICP 압력 트랜스듀서 하단에 혈압계를 부착하고 샘플링 시간 옆의 화살표를 클릭하여 샘플링 속도를 100으로 설정합니다.브리지 선택 Amp, 주전원 필터 및 영점을 선택하고 압력 변환기를 움직이지 않도록 주의하면서 시스템이 영점 조정될 때까지 기다립니다. 그런 다음 압력 변환기의 흰색 탭을 잡고 혈압계에서 40mm의 수은이 나올 때까지 변환기를 통해 공기를 밀어 넣은 다음 흰색 탭을 풀고 주사기와 혈압계를 제거합니다. 단위 변환 페이지에서 빼기를 선택하고 가장 높은 고원을 강조 표시하여 40mm의 수은을 나타냅니다.0.1 화살표를 클릭하고, 100을 입력하고, 가장 낮은 고원을 강조 표시하여 수은 수치가 0mm임을 나타냅니다. 0.2에 대한 화살표를 클릭하고, 0을 입력하고, 단위로 수은 밀리미터를 선택하고, 확인을 클릭합니다. Bridge Amp 창에서 Okay를 클릭하고 방금 설명한 대로 가장 높은 고원에 100mm의 수은을 사용하고 가장 낮은 고원에 0을 사용하여 채널 2 IOP에 대한 정수압 변환기를 보정합니다.TAS 후방 세그먼트 장치를 데이터 수집 시스템에 연결하려면 TAS 후방 세그먼트 장치를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 인큐베이터에 배치하고 채널 1 ICP 압력 변환기의 출력 포트에서 ICP 튜브를 부착합니다. 출력 포트의 IOP 튜브를 채널 2 IOP 압력 변환기에 연결합니다. 차트 보기 페이지에서 샘플링 시작을 선택하고 샘플링 속도를 느리고 1분으로 설정합니다.그런 다음 프로토콜 요구 사항에 따라 ICP 및 IOP 압력을 조절하기 위해 링 스탠드의 주사기를 위 또는 아래로 조정하거나 압력을 조절하기 위해 관류 펌프에 놓습니다. 이 대표적인 분석에서는 IOP 및 ICP 조건의 다양한 매개변수를 통해 두 챔버의 평균 수직 압력 차이의 유지를 테스트했습니다. 조직의 생존력을 보장하기 위해, 조직 내의 배지를 48시간마다 교환하였다.배지 교환 시 최소한의 압력 증가가 발생했으며, 실험 14일과 30일에 면역조직화학 분석 및 콜라겐 IV 발현에 의해 관찰된 바와 같이 시신경두의 생존력이나 형태에 영향을 미치지 않았습니다. 다양한 시점에 걸쳐 IOP를 높이거나 ICP를 낮추면 7일 동안 상승된 층류 압력 구배의 범위를 유지할 수 있습니다. 7일 동안 경층압 구배가 상승했을 때 후분절에서 부항 및 두꺼워짐이 관찰되었으며 콜라겐 IV 발현은 실험 기간 동안 신호 발현이 증가하여 두꺼워진 빔을 보여줍니다.위상 이미징은 대조군에서 부항이 없는 신경절 세포층 내의 건강한 망막 신경절 세포를 보여주며, 상승된 층류 압력 구배 배양의 이미지는 망막 신경 섬유층 내에 망막 신경절 세포가 남아 있지 않고 여분의 세포 기질의 리모델링이 증가한 광범위한 부항을 보여줍니다. 이 기술을 통해 연구자들은 생체 역학적 질병 패러다임을 효과적으로 연구하고 인간 눈에서 분자 발병 기전을 표적으로 하는 층류 압력을 발견할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Sharma, T. P., et al., Translaminar Autonomous System Model for the Modulation of Intraocular and Intracranial Pressure in Human Donor Posterior Segments(인간 기증자 후방 분절에서 안구 및 두개내 압력 조절을 위한 경층류 자율 시스템 모델). J. Vis. 특급 (2020). 이 비디오는 층류 횡단 자율 시스템에서 안구 및 두개내 압력을 시뮬레이션하여 망막 신경절 세포 신호에 대한 층상압의 영향을 연구하기 위해 인간의 눈을 준비하는 절차를 보여줍니다.

 Translaminar Autonomous System을 사용한 Translaminar Pressure 모델 개발

토끼를 대상으로 한 실험적 두개내 압력 조절 혈액 션트 지주막하 출혈(SAH) 모델은 쇄골하 동맥 삽관 및 경피적 수조 마그나 천자라는 표준 절차를 결합하여 SAH 후 인간의 병태생리학적 상태를 밀접하게 모방할 수 있습니다. 단계별 지침을 제시하고 성공적인 실험적 SAH 생성을 위한 주요 수술 포인트에 대해 논의합니다.

지주막 하 출혈의 급성과 늦은 후유증의 연구에 대한 토끼 피 션트 모델 : 기술적 측면

Schlemm의 운하 공간으로 섬유주 (TM) 마이그레이션 ophthalmodynamometer에 의해 급성 압력 상승에 의해 유도 및 스펙트럼 영역 빛 간섭 단층 촬영으로 관찰 할 수있다. 이 방법의 목적은 현장에서 조직 생활에 심각한 압력 상승에 살고 유출 관의 형태 계측 학적 반응을 정량화하는 것입니다.

살아있는 인간의 눈의 압력 상승에 섬유주 응답

만성 안구 고혈압 쥐와 쥐, 일치 녹 내장 망막 신경 절 세포의 기능 및 구조 저하로 이어지는 circumlimbal 봉합을 적용 하 여 유도 된다.

쥐와 쥐에 Circumlimbal 봉합에 의해 유도 된 녹 내장의 모델

비인간 영장류 (NHP)는 해부학적 및 유전적 유사성으로 인해 인간의 망막 세포 치료법을 연구하기위한 이상적인 모델입니다. 이 원고는 NHP 눈의 망막 색소 상피 세포의 피하 학적 이식 방법과 황반 조작과 관련된 수술 내 합병증을 방지하기위한 전략을 설명합니다.

퇴행성 망막 질병을 위한 비인간 영장류 모형에 있는 망막 안료 상피 이식

오픈 글로브 눈 부상은 시골 또는 군사 관련 시나리오에서 며칠 동안 치료되지 않을 수 있으며, 그 결과 실명이 발생할 수 있습니다. 시력 상실을 최소화하기 위해 치료법이 필요합니다. 여기서, 우리는 장기 문화 오픈 글로브 부상 모델을 자세히 설명합니다. 이 모형을 사용하면 이러한 부상을 안정화하기위한 잠재적 인 치료법을 적절하게 평가 할 수 있습니다.

오픈 글로브 부상 및 치료 성능을 추적하기위한 전방 세그먼트 장기 문화 플랫폼

이 프로토콜의 목표는 아급성 안구 고혈압을 유발하는 변연 혈관 신경총의 360° 열 소작을 기반으로 하는 녹내장 신경 퇴행의 새로운 모델을 특성화하는 것입니다.

설치류의 외과적으로 유도된 녹내장에 대한 Limbal Vascular Plexus의 전체 원형 소작

이 프로토콜은 망막 변성이 있거나 없는 마우스 수용자에서 수술 합병증 발생률이 낮은 망막하 세포 이식편을 안전하고 정확하게 전달하기 위한 동공 시야 유도 경공막 접근법을 제시합니다.

망막 변성 마우스 모델에서 망막하 이식편의 Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation

우리는 인간의 연결을 progenitors 및 신경 수리 개발 CNS에의 연결을 세포 유형의 대형 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 neuroblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

우리는 뉴런 형태와 시간 경과에 따른 발달을 시각화하기 위해 전기천공법과 후속 컨포칼 레이저 스캐닝 또는 다광자 현미경에 의한 후각 감각 뉴런의 생체 내 라벨링 프로토콜을 설명합니다.

모델로 후각 시스템은 축삭 성장 패턴 및 형태를 연구하는 생체

배우세요 인간 후방 세그먼트를 이용한 트랜스 라미나르 자율 시스템(TAS) 모델로 안압과 두개 내 압력을 독립적으로 조절하는 방법을. 이 기술은 녹내장 및 외상성 뇌손상 등의 질병 연구에 활용됩니다.

인간 기증자 후방 세그먼트의 내구 및 두개 내 압력 의 변조를위한 트랜스 라미나르 자율 시스템 모델

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