Name: 골관절염 모델에서 뮤린 비장, 골수, 림프절 및 치압 조직 내의 면역 세포 하위 집합의 흐름 세포 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: 학습하세요 골관절염 모델에서 뮤린 비장, 골수, 림프절 및 치압 조직 내 면역 세포 하위 집합을 흐름 세포 분석으로 식별하는 방법을. 이 프로토콜은 단핵구, 대식세포 및 T세포 분석에 활용됩니다.

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우리는 앤드류 림, 박사 와 자일스 베스트, 유동 세포계를 설정하는 데 도움을 주셔서 감사드립니다. 이 프로젝트는 PH에 수여 도이치 포충스게마인샤프트 (DFG) (DFG-HA 8481/1-1)에 의해 지원되었다.

<ol><li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology%2C+treatment%2C+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).</li>
<li>Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cells+in+Osteoarthritis%3A+Alterations+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond.</a> Frontiers in Immunology. 8, 356(2017).</li>
<li>Woolf, A. D., Pfleger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+major+musculoskeletal+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Burden of major musculoskeletal conditions.</a> Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).</li>
<li>Little, C. B., Hunter, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-traumatic+osteoarthritis%3A+from+mouse+models+to+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials.</a> Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).</li>
<li>Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+post-traumatic+OA+with+a+view+to+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research%3A+Clinical+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention.</a> Best Practice & Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).</li>
<li>Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+knee+injuries+and+knee+osteoarthritis%3A+a+meta-analysis+of+observational+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).</li>
<li>Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes+subsets+in+osteoarthritis+versus+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Egyptian+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis.</a> Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).</li>
<li>Yamada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+accumulation+of+activated+Th1+cells+not+only+in+rheumatoid+arthritis+but+also+in+osteoarthritis+joints%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints.</a> Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).</li>
<li>Sakkas, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+and+T-cell+cytokine+transcripts+in+the+synovial+membrane+in+patients+with+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+and+Diagnostics+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis.</a> Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).</li>
<li>Guo, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+CD%284%29%28%2B%29+CD%282%29%285%29%28%2B%29+Foxp%283%29%28%2B%29+Treg+with+the+recovery+of+joint+function+after+total+knee+replacement+in+rats+with+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Research%22%5BJournal%5D)">Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis.</a> Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).</li>
<li>Moradi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29%2FhighCD127low%2F%28-%29+regulatory+T+cells+are+enriched+in+rheumatoid+arthritis+and+osteoarthritis+joints--analysis+of+frequency+and+phenotype+in+synovial+membrane%2C+synovial+fluid+and+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood.</a> Arthritis Research & Therapy. 16 (2), 97(2014).</li>
<li>Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cellular+infiltrate+in+inflammatory+synovia+of+osteoarthritic+knees%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+macrophage+M1+polarisation+exacerbates+experimental+osteoarthritis+partially+through+R-spondin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).</li>
<li>Culemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locally+renewing+resident+synovial+macrophages+provide+a+protective+barrier+for+the+joint%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint.</a> Nature. 572, 670-675 (2019).</li>
<li>Mocellin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantitative+real-time+PCR+to+determine+immune+cell+density+and+cytokine+gene+profile+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).</li>
<li>Ward, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+markers+for+the+rodent+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical markers for the rodent immune system.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).</li>
<li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology%2C+treatment%2C+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).</li>
<li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+%28DMM%29+model+of+osteoarthritis+in+the+129%2FSvEv+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li>
<li>Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Staining+and+Flow+Cytometry+to+Identify+Lymphocyte+Subsets+within+Murine+Aorta%2C+Kidney+and+Lymph+Nodes+in+a+Model+of+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55266(2017).</li>
<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Protocol+for+the+Comprehensive+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+in+Normal+and+Inflamed+Murine+Non-Lymphoid+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).</li>
<li>Lorenz, J., Grassel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+osteoarthritis+models+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Experimental osteoarthritis models in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).</li>
<li>Christiansen, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+mouse+models+of+post-traumatic+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+alteration+of+lymphatic+vessels+in+knee+joints+of+normal+and+osteoarthritic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice.</a> Arthritis & Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).</li>
<li>Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+mapping+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Lymph node mapping in the mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+culture+and+isolation+of+murine+synovial+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Reports%22%5BJournal%5D)">A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts.</a> Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).</li>
<li>Belluzzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+Infrapatellar+Fat+Pad+and+Synovial+Membrane+to+Knee+Osteoarthritis+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain.</a> BioMed Research International. 2019, 18(2019).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 프로토콜에 기술된 방법은 골관절염(OA)의 뮤린 모델에서 모낭/대식세포 및 T세포 모두에서 다양한 하위 집합을 안정적으로 식별하도록 설계 및 테스트되었습니다. 현재 프로토콜은 항체를 교환하여 상이한 조직 모형, 또는 그밖 세포 모형을 조사하기 위하여 쉽게 변형될 수 있고, OA의 대체 뮤린 모형을 위해 이용될 수 있다. 다른 조직 유형을 테스트할 때, 면역 세포의 표면 마커의 발현이 각조직(20)에서변화함에 따라 각 항체의 특이성을 테스트하는 것이 중요하다. 또한, 항체를 교환할 때, 항체의 최적 농도를 확립하고 스펙트럼 중첩의 변화를 해결하기 위해 보상 과정을 반복하기 위해 투여량 적정 곡선을 수행해야 한다.
현재 프로토콜에서, OA는 DMM 마우스모델(18)을사용하여 유도되었다. 가장 일반적으로 사용 되고 확립 된 동물 모델은 마우스에, 이 종은 외상 후 OA의 병리 생리학을 조사에 다가...

골관절염(OA)은 관절1과관련된 모든 조직의 다양한 병리를 포함하는 쇠약하고 고통스러운 질환이다. 전 세계인구의약 3.8%에 영향을 미치는 OA는 가장 널리 퍼진 근골격계 질환 중 하나이며 2020년까지 전 세계적으로4번째로 주요 장애 원인이 될것입니다 3. 외상 후 OA는 관절 부상 후 발생하며 모든 OA의 12 % 이상및 무릎4,,5와같은 취약한 관절에서 OA의 최대 25 %를 차지합니다. 더욱이, 관절 상해는 OA의 일생 리스크를 5배 이상6배이상 증가시킵니다. 분명히 유사한 불안정을 가진 모든 부상은 OA를 개발하기 위해 계속됩니다, 따라서 장기 OA 위험을 구동 요인을 정의하는 것은 도전 남아있다. OA1에걸리기 쉬운 부상 별 병리학, 원인 및 메커니즘을 조사하고 더 잘 정의하기 위해 외상 후 OA를 예방 및 / 또는 치료하는 효과적인 치료법을 개발하기 위해 중요합니다.
OA와 그 정의 연골 파괴는 이전에 기계적 스트레스에 전적으로 기인하고, 따라서, OA는 비 염증성 질환 으로 간주되었다2. 그러나, 최근 연구에 따르면 OA 환자의 혈연 조직 내 의 염증성 침투및 염증성 세포의 증가는 건강한 대조군2에비해, OA의 잠재적 원동력으로서 염증 성분에 빛을 흘리는 것으로 나타났다. 추가 연구는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 프로파일뿐만 아니라 타고난 면역 계통의 단핵구/대식세포 모두에서 이상이 OA2,,7의발병에 기여할 수 있음을 나타냈다. 이러한 이상에 대한 상세한 조사는 Th18,Th29,Th178 및 T 규제(Treg) 인구10,11과같은 다양한 T 세포 서브셋2에대한 관련 역할을 밝혀냈습니다., 이 강력한 증거에도 불구하고, T 세포 반응의 변경과 OA의 개발 및 진행 사이의 인과 관계는 여전히 알 수없는2.
OA에서 역할을 갖는 특정 T 세포 이외에, 최근 연구는 분화 / 활성화 된 대식세포가 OA12의병기와 관련 될 수 있음을 시사한다. 특히, 혈액 단세포에서 유래한 대식세포는 혈중 에서 축적되어 OA 개발 중에 고전적으로 활성화된 대식세포(M1) 또는 대안적으로 활성화된 대식세포(M2)로 편광하여 단세포 유래 대식세포와 OA13사이의 상관관계를 암시한다. 대조적으로, 대식세포의 특정 하위 집합은 개발 도중 일찌기 기관을 채우고 단색 세포 독립적인 물질14에서그들의 수를 자립합니다. 최근에는 이러한 연동 조직-상주 대식세포(STRM)14에대해 단단한 접합 장벽에 의해 중재된 관절 보호 기능이 나타났다. 이 사실 인정은 특히 대식세포 서브셋에 있는 이상이 OA의 발달 도중 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 표시합니다. 그러나, 이 선동적인 세포 반응 및 외상 의 후속 합동에 있는 구조적인 변화 사이 상호 작용은 불명합니다.
역사적으로, 용액 조직에서 면역 세포의 분석은 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의한 면역조직화학(IHC) 또는 mRNA 발현에 제한되었다15,,16. 그러나, IHC와 RT-PCR 둘 다 다중 다른 세포 모형 및 그들의 서브세트를 동시에 식별하는 기능이 부족하여, 따라서, 이 방법의 적용성을 제한합니다. 더욱이, IHC는 조직의 작은 견본의 분석에 국한되고 초점 선동적인 세포 축적을 놓칠 수 있습니다. 지난 몇 년 동안, 다양한 세포 유형에 대한 표면 마커의 무수한 개발되었습니다, 면역 세포의 하위 세트는 이제 안정적으로 이러한 마커의 고유 조합에 의해 식별 될 수있다. 꾸준한 기술적 진보로 인해, 흐름 세포계는 이제 동시에 대형 다중 색 항체 패널의 분석을 가능하게 하는 다양한 다른 형광을 식별할 수 있게 되었다.
유동 세포측정은 조사자에게 단일 세포 수준에서 수많은 면역 세포와 그들의 하위 집합을 동시 식별 및 정량화할 수 있는 강력한 기술을 제공합니다. 우리는 단핵구/대식세포 및 그들의 하위 세트를 확인하기 위하여 세포외 염색 분석물 및 murine 비장, 골수, 림프절 및 교유 조직 내의 T 세포 및 그들의 부세트를 확인하기 위하여 추가/세포 내 염색 분석 둘 다를 개발하고 최적화했습니다. 이 프로토콜의 각 단계는 최적화및 다른 외과 적 OA 마우스 모델(17)에사용할 수있는 매우 재현 가능한 분석의 결과로 테스트되었다.

<table><tbody><tr><td>APC 안티 마우스 CD194 (CCR4)</td> <td>BioLegend</td><td>131212</td><td>T 세포 패널</td></tr><tr><td>브릴리언트 염색 버퍼 플러스 1000Tst</td><td>BD</td><td>566385</td><td>버퍼</td></tr><tr><td>고정 생존도 염색 510, 100 &micro; g</td><td>BD</td><td>564406</td><td>T-Cell Panel</td></tr><tr><td>Fixable Viability Stain 510, 100 &micro; g</td><td>BD</td><td>564406</td><td>Monocyte Panel</td></tr><tr><td>Liberase, 활</td><td>막 조직 용</td>연구 학년 <td>Roche</td><td>5401127001</td> 효소</tr><tr><td>Ms CD11b APC-R700 M1 / 70, 100 &micro; g</td><td>BD</td><td>564985</td><td>단핵구 패널</td></tr><tr><td>Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 &micro; g</td><td>BD</td><td>562454</td><td>단핵구 패널</td></tr><tr><td>Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>742274</td><td>T-Cell Panel</td></tr><tr><td>Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 &micro; g</td><td>BD</td><td>565250</td><td>단핵구 패널</td></tr><tr><td>Ms CD25 BV605 PC61, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>563061</td><td>T-셀 패널</td></tr><tr><td>Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 &마이크로; g</td><td>BD</td><td>557596</td><td>T-Cell Panel</td></tr><tr><td>Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 &micro; g</td><td>BD</td><td>552775</td><td>T-Cell Panel</td></tr><tr><td>Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>565480</td><td>T-셀 패널</td></tr><tr><td>Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 &micro; g</td><td>BD</td><td>565261</td><td>T-셀 패널</td></tr><tr><td>Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 &마이크로; g</td><td>BD</td><td>740664</td><td>T-셀 패널</td></tr><tr><td>Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 &마이크로; g</td><td>BD</td><td>563687</td><td>단핵구 패널</td></tr><tr><td>Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>563332</td><td>T-Cell Panel</td></tr><tr><td>Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>565411</td><td>단핵구 패널</td></tr><tr><td>Ms Foxp3 PE MF23, 100 &micro; g</td><td>BD</td><td>560408</td><td>T 셀 패널</td></tr><tr><td>Ms I-A IE-E BV711 M5 / 114.15.2, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>563414</td><td>단핵구 패널</td></tr><tr><td>Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>560593</td><td>단핵구 패널</td></tr><tr><td>Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>560600</td><td>단핵구 패널</td></tr><tr><td>Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>564143</td><td>T-Cell Panel</td></tr><tr><td>Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 &마이크로; g</td><td>BD</td><td>562894</td><td>T 세포 패널</td></tr><tr><td>적혈구 용해 버퍼</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>버퍼</td></tr><tr><td>전사 인자 버퍼 세트 100Tst</td><td>BD</td><td>562574</td><td>버퍼</td></tr></tbody></table>

골관절염 모델에서 뮤린 비장, 골수, 림프절 및 치압 조직 내의 면역 세포 하위 집합의 흐름 세포 분석

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

골관절염 (OA)은 통증과 신체적 한계로 고통받는 환자에게 영향을 미치는 가장 널리 퍼진 근골격계 질환 중 하나입니다. 최근 증거는 잠재적으로 OA의 병기와 관련된 T 세포와 단낭세포 / 대식세포와 함께 질병의 잠재적 인 염증 성분을 나타냅니다. 추가 연구는 Th1, Th2, Th17 및 T 조절 림프구, M1, M2 및 synovium 조직-상주 대식세포와 같은 염증성 세포 계보의 하위 집합에 중요한 역할을 가정했습니다. 그러나, 국부적 및 전신 염증성 세포 반응과 관절의 구조적 변화 사이의 상호 작용은 알려지지 않았다. T 세포와 단핵구/대식세포가 OA쪽으로 어떻게 기여하는지 완전히 이해하려면, 이러한 세포와 그들의 하위 세트를 동시 적으로 규명할 수 있어야 하며, 이차 림프관 및 체계적으로(비장 및 골수). 요즘, 상이한 염증세포 서브세트는 다색 유동 세포측정법을 이러한 세포 과정을 조사하는 강력한 기술을 만드는 세포 표면 마커의 조합에 의해 규명될 수 있다. 이 프로토콜에서, 우리는 단일 세포 현탁액의 생성뿐만 아니라, 교반 조직 및 이차 림프기관의 수확에 관한 상세한 단계를 설명합니다. 더욱이, 우리는 단핵구/대식세포 및 그들의 서브세트를 확인하기 위하여 세포외 염색 분석둘 다 및 murine 비장, 골수, 림프절 및 교유 조직 내의 T 세포 및 그들의 하위 세트를 확인하기 위하여 추가 세포 내 염색 분석. 이 프로토콜의 각 단계는 최적화되고 시험되어 다른 외과 및 비 수술 OA 마우스 모델에 사용할 수있는 매우 재현 가능한 분석이 발생했습니다.

모노사이클 서브셋 패널과 T셀 서브셋 패널의 대표적인 결과는 아래에 설명되어 있다.
도 1은 DMM 처리동물의 골수로부터 수집된 면역 세포상핵세포 에 대한 단핵제 서브셋 패널을 위한 계층적 게이팅 전략을 도시한다. 동일한 전략이 사용되었고 다른 모든 조직 유형에서 확인되었습니다. 실험을 설정할 때, 전방 분산 영역(FSC-A) 및 측면 분산 영역(SSC-A) 전압은 각 조직 유형에 대해 단핵구/대식세포를 식별하고 T 세포 및 이물질을 제외하도록 결정하였다. 각 실험 동안 각 조직 유형의 미염색 된 컨트롤을 분석하고 필요한 경우 FSC-A 및 SSC-A 전압을 조정했습니다. 매개 변수가 사이토미터의 막힘가능성이 크게 변경되면 전압은 시간이 지남에 따라 유사하게 유지될 것으로 예상됩니다. 더욱이, 미염색된 컨트롤은 실험이 그에 따라 수행될 때마다 죽은/살아있는 얼룩 및 게이트에 대한 진정한 네거티브를 결정하는 데<strong cl...

여기에서, 우리는 뮤린 비장, 골수, 림프절 및 교압 조직 내의 엑스트라 세포 염색 분석체를 모두 사용하여 단세포/대식세포 및 T 세포 하위 세트를 식별하기 위해 상세하고 재현 가능한 유동 세포 측정 프로토콜을 설명하며, 골관절염의 확립된 수술 모델을 활용합니다.

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

우리의 프로토콜은 단핵구및 대식세포 및 T 세포 및 그들의 관련 서브셋의 상세한 식별 그리고 분석이 신경세포 및 ovium 및 면역 계통의 각종 그밖 조직 내의 그 관련 서브세트를 가능하게 합니다. 우리의 기술은 골관절염 면역 반응의 포괄적인 특성화를 위해 synovium 및 그밖 관련 조직에서 생명 면역 세포의 믿을 수 있는 수확을 촉진합니다. 골관절염 모델 마우스로부터 관심 있는 조직의 격리를 위해 마우스를 supine 위치에 놓고 가슴, 복부 및 다리를 70%에탄올로 닦아냅니다.가위를 사용하여 복강을 그대로 유지하면서 복부의 중간선을 따라 피부를 조심스럽게 엽니다. 그리고 동물의 오른쪽 피부를 기본 근육에서 부드럽게 당겨 피부에 부착된 피하 지방 조직을 남깁니다. 해부 현미경 아래에 마우스를 놓고 두 개의 곡선된 미세 포셉을 사용하여 허벅지에 있는 지방 조직을 부드럽게 애타게 합니다.3개의 교차 혈관을 확인한 후에는 미세해부스팅 포셉을 사용하여 혈관의 교차점에 위치한 잉구림프절을 제거하고 캡슐을 파열시키지 않도록 주의하십시오. 집게를 사용하여 림프절 표면에서 남은 지방을 제거하고 복강을 엽니다. 남은 지방을 볼 수 없는 경우, RPMI 미디어의 0.5 밀리리터로 채워진 6개의 웰 플레이트에 림프절을 즉시 배치합니다.그 후, 복강을 엽니다. 미세 한 가위를 사용하여 비장을 소비하고 내장을 부드럽게 추출하여 대자와 그 분기를 노출하십시오. 이후, 비장을 이전에 준비하고 RPMI 미디어의 0.5 밀리리터로 채워진 6개의 잘 연주된 라벨에 즉시 배치합니다.복부 대동맥의 말단 세그먼트와 일반적인 장악 동맥의 기원에 위치한 일강 림프절을 제거하고 두 뒷다리에서 피부를 조심스럽게 제거합니다. 즉시 이전에 준비되고 표시 된 6 개의 우물 플레이트 빌드에 림프절을 두 동물의 모든 림프절을 풀링 하는 RPMI 미디어의 0.5 밀리리터로 표시. 미세 한 가위 또는 메스를 사용 하 여 부착 된 근육 조직의 왼쪽 대퇴골을 청소 하 고 신중 하 게 대퇴골을 제거 하는 동안 전체 뼈를 그대로 떠나, 억제와 엉덩이 관절을 모두 분리.그런 다음 대퇴골을 이전에 준비된 6개의 우물 판에 배치하여 RPMI 미디어의 0.5 밀리리터로 채워졌습니다. 오른쪽 의 슬개골 힘줄을 식별하고 슬개골에 사두근 근면의 약 5 밀리리터가 노출 될 때까지 관절에 인접한 근육 조직 근위를 제거하기 위해 좋은 가위를 사용합니다. 사두근 힘줄을 통해 약 3~ 4밀리미터 의 슬개골을 잘라 핸들을 형성하고 미세 한 집게를 사용하여 관절에서 긴장을 부드럽게 당겨 조인트 캡슐 부착물의 가장자리를 노출시합니다.대퇴골에서 시작하여 경골을 향해 이동하면 메스를 사용하여 양쪽의 조인트 캡슐 가장자리를 따라 조심스럽게 잘라내고 사두근 힘줄에 부드러운 견인력을 유지합니다. 활액 조직 블록이 경골에만 부착되면, 관절 내 지방 패드는 슬개골에 명확하게 보일 수 있어야하며 민스키의 관절 및 전방 측면에서 부드럽게 분리 될 수 있습니다. 이어서, 조인트 캡슐의 나머지 부분을 따라 잘라 서 조개 조직 블록을 제거하고 즉시 이전에 준비되고 RPMI 매체의 1.5 밀리리터로 채워진 6개의 웰 플레이트에 즉시 부착하였다.모든 조직이 수집되면 상태당 2개의 풀링비렌을 15밀리리터 튜브에 70 마이크로미터 세포 스트레이너에 배치하고 멸균 3밀리리터 주사기 플런저를 사용하여 총 6밀리리터의 RPMI 1640 보충 미디엄으로 스트레이너를 자주 플러시하는 메쉬 필터를 통해 조직을 부드럽게 대량으로 평가합니다. 정산에 의해 세포를 원심분리하고, 적혈구 용해 용액의 5밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 5 분 후, PBS의 10 밀리리터와 반응을 중지하고 세포를 원심 분리.더 이상 적혈구가 관찰되지 않는 경우, 계산을위해 신선한 PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 림프절 처리의 경우 새로운 15 밀리리터 튜브에 70 마이크로미터 세포 스트레이너에 4 개의 림프절을 모두 배치하고 메쉬를 통해 림프절을 부드럽게 애타게하는 새로운 멸균 3 밀리리터 플런저를 사용하여 5 분 동안 500 회 G에서 세포를 원심분리한 다음 500 회 G에서 세포를 원심분리한 다음 500 회 마이크로리터를 폐기하고 미세 리터를 다시 중단합니다. 골수를 분리하려면 조직 엄지 손가락 집게를 사용하여 손상되지 않은 대퇴골을 조심스럽게 잡고 날카로운 가위를 사용하여 근위 대퇴골의 끝을 차단합니다.23 게이지 바늘을 대퇴골의 인터콘딜라 노치 중간에 삽입하고 바늘을 회전시키면서 부드러운 압력을 가하여 구멍을 노치로 뚫습니다. 필요에 따라 바늘을 변경, 새로운 15 밀리리터 튜브에 70 마이크로 미터 세포 스트레이너에 10 %의 FBS로 보충 RPMI의 6 밀리리터와 뼈 내용을 플러시하고 부드럽게 메쉬를 통해 골수를 눌러 새로운 3 밀리리터 주사기 플런저를 사용합니다. 이하, 비장에 대해 입증된 대로 RBC 단계를 수행한다.더 이상 적혈구가 관찰되지 않는 경우, 계산을위해 신선한 PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 용액 조직의 처리를 위해 미세 한 수술 가위를 사용하여 두 개의 용액 조직 블록을 작은 조각으로 주사위로 만들고 샘플을 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮긴다. 수집 용기를 500 마이크로리터의 배지로 헹구어 남은 세포와 축약 조직을 수집하고 샘플 수집 튜브에서 세척을 당깁니다.다음으로, 밀리리터 최종 농도당 1단위에서 달성하고 2시간 동안 인큐베이터에서 37°C에서 연유 조직 샘플을 소화할 수 있는 충분한 양의 효소를 첨가한다. 회전에 튜브를 배치할 때 충분한 움직임을 보장합니다. 인큐베이션이 끝나면 10%의 FBS로 보충된 RPMI 8밀리리터로 소화를 중단하고 70마이크로미터 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 새로운 15 밀리리터 튜브로 필터링합니다.오래된 15 밀리리터 튜브를 5밀리리터의 중간 크기로 헹구고 필터를 세척하는 데 사용합니다. 그런 다음, 원심분리에 의한 세포를 퇴적시키고 계산을 위해 PBS의 500 마이크로리터에서 펠릿을 재중단한다. 격리된 면역 세포의 생존성 염색을 수행하기 위해, 각 세포 현탁액의 5개 세포에 5회 10번을 추가하여 2개의 다른 96개의 U-바닥 플레이트의 적절한 웰에 추가하고 각 우물의 바닥으로 세포를 수집한다.항상 부정적인 대조군으로 각 조직 유형의 충분한 얼룩이없는 세포를 포함한다. PBS의 200 마이크로리터로 세포를 세척하고 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에서 15 분 동안 잘 당 100 마이크로 리터의 셀에 펠릿을 다시 중단합니다. 인큐베이션의 끝에서 세척당 FACS 버퍼 200 마이크로리터에서 세포를 두 번 세척하고 적절한 관심 항체 또는 제어 칵테일의 100 마이크로리터에서 각 펠릿을 다시 중단한다.세포 내 염색과 세포 외 염색이 동일한 방식으로 수행되면 지금 세포 외 염색 단계를 수행합니다. 30분 간 광으로부터 보호된 분수는 4도당 FACS 버퍼 200마이크로리터로 세포를 두 번 세척하고 1밀리알러 EDTA로 보충된 FACS 버퍼 250마이크로리터에서 세포및 단핵구 서브셋 패널 플레이트를 다시 중단한다. 세포 내 염색이 계획되지 않은 경우에만이 단계를 수행, 그렇지 않으면 프로토콜의 세포 내 염색 측면으로 이동.그런 다음 각 단핵구 서브셋 샘플을 빛으로부터 보호된 얼음 에 해당하는 해당 FACS 튜브로 전송합니다. T 세포 서브셋 패널 세포의 세포 간 염색을 위해, 빛으로부터 보호되는 섭씨 40도에서 적절한 고정 및 투과화 키트로부터 고정 버퍼 200 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 인큐베이션의 끝에서 200 마이크로리터의 충류 세척 버퍼로 세포를 두 번 세척하고 적절한 관심 항체의 100 마이크로리터에서 펠릿을 재중단하여 40분간 의용액을 빛으로부터 보호한다.이어서, 세척당 충혈 세척 버퍼의 200 마이크로리터에서 세포를 두 번 세척한다. 그리고 빛으로부터 보호되는 얼음에 해당하는 해당 FACS 튜브로 샘플을 전송하기 전에 FACS 플러스 EDTA 버퍼의 250 마이크로리터에서 세포를 다시 중단합니다. 여기서, DMM 처리된 동물의 골수로부터 수집된 면역 세포상에 단핵구 서브셋 패널을 위한 계층적 게이팅 전략을 관찰할 수 있다.스테인드 트롤은 죽은 살아있는 얼룩에 대한 진정한 네거티브를 결정하는 데 사용할 수 있으며, 필요에 따라 실험을 수행 할 때마다 게이트를 조정할 수 있습니다. 이 대표적인 분석에서, 면역 세포는 synovial 조직에서 격리되고 세포외 표면 마커로 염색되었습니다, DMM 또는 sham 통제 수술 후에 6 주. 리-SC 양성 MHC2 음성 및 M2 대식세포의 높은 비율은 가짜 수술 마우스에서 관찰되는 세포 집단에 비해 DMM 처리동물에서 관찰된다.여기서, DMM 처리된 동물의 비장으로부터 분리된 면역 세포에 대한 추가 및 세포 내 T 세포 패널에 대한 계층적 게이팅 전략을 관찰할 수 있다. TH1 세포의 더 높은 백분율은 DMM 동물의 림프절 및 경부 조직뿐만 아니라 T 조절 세포및 TH17 세포의 더 높은 수에서 관찰됩니다. 고품질 샘플을 획득하려면 신속하고 세심하며 일관된 방식으로 조직을 수확해야 합니다.일단 면역 세포가 고립되면, 그밖 다운스트림 분석은 RTPCR와 같은, 세포 배양 및 관심의 분자 프로세스에 빛을 비추기 위하여 혈액에 휴식과 같은 실행될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

골관절염 모델에서 쥐의 비장, 골수, 림프절 및 활막 조직 내 면역 세포 subset에 대한 유세포 분석

본 논문은 aortas의 면역 성분을 조사하기 위해 흐름 cytometry 기반 방법을 제공합니다. 신문은 또한 별도로 주변 adventitia 및 혈관 벽을 검사 수 있습니다 추​​가 기법을 보여줍니다. 이 방법은 대동맥 leukocytes의 phenotypical 분석을 수행하고 죽상 경화증 연구에 대한 몇 가지 면역 assays을 적용하는 가능성을 엽니다.

Murine Aortas 이내에 면역 세포의 흐름 Cytometry 분석

이 비디오는 마우스의 자가면역 관절염에 대한 세포 기반 치료법을 보여줍니다. 오브알부민 특이적 수용체를 발현하는 iPSC 유래 T 조절 세포에 보조제에서 유화된 메틸화된 소 혈청 알부민(mBSA)을 주입합니다. 쥐 항원제시세포(APC)는 mBSA를 처리하여 T세포에 전달하여 T세포가 활성화되고 무릎 관절의 활액막으로 이동하도록 유도합니다. 후속 주사에는 왼쪽 무릎에 mBSA만 투여하고 오른쪽 무릎에 mBSA와 오브알부민을 조합하여 투여합니다. 왼쪽 무릎에서는 mBSA에 대한 면역 반응이 관절염을 유발하는 반면, 오른쪽 무릎에서는 오브알부민과 상호 작용하는 T 조절 세포가 염증을 완화하여 관절염 증상을 개선합니다.

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이 문서 분광 계측법, 형광 색소를 구별하는 발광 스펙트럼의 형상을 사용하여 유동 세포 계측법에서의 새로운 접근 방식을 설명한다. 알고리즘은 보상을 대체하고 독립적 인 매개 변수로 자동 형광을 처리 할 수 ​​있습니다. 이 새로운 접근 방식은 고체 기관에서 분리 된 세포의 적절한 분석을 할 수 있습니다.

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골관절염 모델에서 뮤린 비장, 골수, 림프절 및 치압 조직 내의 면역 세포 하위 집합의 흐름 세포 분석

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