골관절염 모델에서 뮤린 비장, 골수, 림프절 및 치압 조직 내의 면역 세포 하위 집합의 흐름 세포 분석

우리의 프로토콜은 단핵구및 대식세포 및 T 세포 및 그들의 관련 서브셋의 상세한 식별 그리고 분석이 신경세포 및 ovium 및 면역 계통의 각종 그밖 조직 내의 그 관련 서브세트를 가능하게 합니다. 우리의 기술은 골관절염 면역 반응의 포괄적인 특성화를 위해 synovium 및 그밖 관련 조직에서 생명 면역 세포의 믿을 수 있는 수확을 촉진합니다. 골관절염 모델 마우스로부터 관심 있는 조직의 격리를 위해 마우스를 supine 위치에 놓고 가슴, 복부 및 다리를 70%에탄올로 닦아냅니다.

가위를 사용하여 복강을 그대로 유지하면서 복부의 중간선을 따라 피부를 조심스럽게 엽니다. 그리고 동물의 오른쪽 피부를 기본 근육에서 부드럽게 당겨 피부에 부착된 피하 지방 조직을 남깁니다. 해부 현미경 아래에 마우스를 놓고 두 개의 곡선된 미세 포셉을 사용하여 허벅지에 있는 지방 조직을 부드럽게 애타게 합니다.

3개의 교차 혈관을 확인한 후에는 미세해부스팅 포셉을 사용하여 혈관의 교차점에 위치한 잉구림프절을 제거하고 캡슐을 파열시키지 않도록 주의하십시오. 집게를 사용하여 림프절 표면에서 남은 지방을 제거하고 복강을 엽니다. 남은 지방을 볼 수 없는 경우, RPMI 미디어의 0.5 밀리리터로 채워진 6개의 웰 플레이트에 림프절을 즉시 배치합니다.

그 후, 복강을 엽니다. 미세 한 가위를 사용하여 비장을 소비하고 내장을 부드럽게 추출하여 대자와 그 분기를 노출하십시오. 이후, 비장을 이전에 준비하고 RPMI 미디어의 0.5 밀리리터로 채워진 6개의 잘 연주된 라벨에 즉시 배치합니다.

복부 대동맥의 말단 세그먼트와 일반적인 장악 동맥의 기원에 위치한 일강 림프절을 제거하고 두 뒷다리에서 피부를 조심스럽게 제거합니다. 즉시 이전에 준비되고 표시 된 6 개의 우물 플레이트 빌드에 림프절을 두 동물의 모든 림프절을 풀링 하는 RPMI 미디어의 0.5 밀리리터로 표시. 미세 한 가위 또는 메스를 사용 하 여 부착 된 근육 조직의 왼쪽 대퇴골을 청소 하 고 신중 하 게 대퇴골을 제거 하는 동안 전체 뼈를 그대로 떠나, 억제와 엉덩이 관절을 모두 분리.

그런 다음 대퇴골을 이전에 준비된 6개의 우물 판에 배치하여 RPMI 미디어의 0.5 밀리리터로 채워졌습니다. 오른쪽 의 슬개골 힘줄을 식별하고 슬개골에 사두근 근면의 약 5 밀리리터가 노출 될 때까지 관절에 인접한 근육 조직 근위를 제거하기 위해 좋은 가위를 사용합니다. 사두근 힘줄을 통해 약 3~ 4밀리미터 의 슬개골을 잘라 핸들을 형성하고 미세 한 집게를 사용하여 관절에서 긴장을 부드럽게 당겨 조인트 캡슐 부착물의 가장자리를 노출시합니다.

대퇴골에서 시작하여 경골을 향해 이동하면 메스를 사용하여 양쪽의 조인트 캡슐 가장자리를 따라 조심스럽게 잘라내고 사두근 힘줄에 부드러운 견인력을 유지합니다. 활액 조직 블록이 경골에만 부착되면, 관절 내 지방 패드는 슬개골에 명확하게 보일 수 있어야하며 민스키의 관절 및 전방 측면에서 부드럽게 분리 될 수 있습니다. 이어서, 조인트 캡슐의 나머지 부분을 따라 잘라 서 조개 조직 블록을 제거하고 즉시 이전에 준비되고 RPMI 매체의 1.5 밀리리터로 채워진 6개의 웰 플레이트에 즉시 부착하였다.

모든 조직이 수집되면 상태당 2개의 풀링비렌을 15밀리리터 튜브에 70 마이크로미터 세포 스트레이너에 배치하고 멸균 3밀리리터 주사기 플런저를 사용하여 총 6밀리리터의 RPMI 1640 보충 미디엄으로 스트레이너를 자주 플러시하는 메쉬 필터를 통해 조직을 부드럽게 대량으로 평가합니다. 정산에 의해 세포를 원심분리하고, 적혈구 용해 용액의 5밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 5 분 후, PBS의 10 밀리리터와 반응을 중지하고 세포를 원심 분리.

더 이상 적혈구가 관찰되지 않는 경우, 계산을위해 신선한 PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 림프절 처리의 경우 새로운 15 밀리리터 튜브에 70 마이크로미터 세포 스트레이너에 4 개의 림프절을 모두 배치하고 메쉬를 통해 림프절을 부드럽게 애타게하는 새로운 멸균 3 밀리리터 플런저를 사용하여 5 분 동안 500 회 G에서 세포를 원심분리한 다음 500 회 G에서 세포를 원심분리한 다음 500 회 마이크로리터를 폐기하고 미세 리터를 다시 중단합니다. 골수를 분리하려면 조직 엄지 손가락 집게를 사용하여 손상되지 않은 대퇴골을 조심스럽게 잡고 날카로운 가위를 사용하여 근위 대퇴골의 끝을 차단합니다.

23 게이지 바늘을 대퇴골의 인터콘딜라 노치 중간에 삽입하고 바늘을 회전시키면서 부드러운 압력을 가하여 구멍을 노치로 뚫습니다. 필요에 따라 바늘을 변경, 새로운 15 밀리리터 튜브에 70 마이크로 미터 세포 스트레이너에 10 %의 FBS로 보충 RPMI의 6 밀리리터와 뼈 내용을 플러시하고 부드럽게 메쉬를 통해 골수를 눌러 새로운 3 밀리리터 주사기 플런저를 사용합니다. 이하, 비장에 대해 입증된 대로 RBC 단계를 수행한다.

더 이상 적혈구가 관찰되지 않는 경우, 계산을위해 신선한 PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 용액 조직의 처리를 위해 미세 한 수술 가위를 사용하여 두 개의 용액 조직 블록을 작은 조각으로 주사위로 만들고 샘플을 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮긴다. 수집 용기를 500 마이크로리터의 배지로 헹구어 남은 세포와 축약 조직을 수집하고 샘플 수집 튜브에서 세척을 당깁니다.

다음으로, 밀리리터 최종 농도당 1단위에서 달성하고 2시간 동안 인큐베이터에서 37°C에서 연유 조직 샘플을 소화할 수 있는 충분한 양의 효소를 첨가한다. 회전에 튜브를 배치할 때 충분한 움직임을 보장합니다. 인큐베이션이 끝나면 10%의 FBS로 보충된 RPMI 8밀리리터로 소화를 중단하고 70마이크로미터 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 새로운 15 밀리리터 튜브로 필터링합니다.

오래된 15 밀리리터 튜브를 5밀리리터의 중간 크기로 헹구고 필터를 세척하는 데 사용합니다. 그런 다음, 원심분리에 의한 세포를 퇴적시키고 계산을 위해 PBS의 500 마이크로리터에서 펠릿을 재중단한다. 격리된 면역 세포의 생존성 염색을 수행하기 위해, 각 세포 현탁액의 5개 세포에 5회 10번을 추가하여 2개의 다른 96개의 U-바닥 플레이트의 적절한 웰에 추가하고 각 우물의 바닥으로 세포를 수집한다.

항상 부정적인 대조군으로 각 조직 유형의 충분한 얼룩이없는 세포를 포함한다. PBS의 200 마이크로리터로 세포를 세척하고 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에서 15 분 동안 잘 당 100 마이크로 리터의 셀에 펠릿을 다시 중단합니다. 인큐베이션의 끝에서 세척당 FACS 버퍼 200 마이크로리터에서 세포를 두 번 세척하고 적절한 관심 항체 또는 제어 칵테일의 100 마이크로리터에서 각 펠릿을 다시 중단한다.

세포 내 염색과 세포 외 염색이 동일한 방식으로 수행되면 지금 세포 외 염색 단계를 수행합니다. 30분 간 광으로부터 보호된 분수는 4도당 FACS 버퍼 200마이크로리터로 세포를 두 번 세척하고 1밀리알러 EDTA로 보충된 FACS 버퍼 250마이크로리터에서 세포및 단핵구 서브셋 패널 플레이트를 다시 중단한다. 세포 내 염색이 계획되지 않은 경우에만이 단계를 수행, 그렇지 않으면 프로토콜의 세포 내 염색 측면으로 이동.

그런 다음 각 단핵구 서브셋 샘플을 빛으로부터 보호된 얼음 에 해당하는 해당 FACS 튜브로 전송합니다. T 세포 서브셋 패널 세포의 세포 간 염색을 위해, 빛으로부터 보호되는 섭씨 40도에서 적절한 고정 및 투과화 키트로부터 고정 버퍼 200 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 인큐베이션의 끝에서 200 마이크로리터의 충류 세척 버퍼로 세포를 두 번 세척하고 적절한 관심 항체의 100 마이크로리터에서 펠릿을 재중단하여 40분간 의용액을 빛으로부터 보호한다.

이어서, 세척당 충혈 세척 버퍼의 200 마이크로리터에서 세포를 두 번 세척한다. 그리고 빛으로부터 보호되는 얼음에 해당하는 해당 FACS 튜브로 샘플을 전송하기 전에 FACS 플러스 EDTA 버퍼의 250 마이크로리터에서 세포를 다시 중단합니다. 여기서, DMM 처리된 동물의 골수로부터 수집된 면역 세포상에 단핵구 서브셋 패널을 위한 계층적 게이팅 전략을 관찰할 수 있다.

스테인드 트롤은 죽은 살아있는 얼룩에 대한 진정한 네거티브를 결정하는 데 사용할 수 있으며, 필요에 따라 실험을 수행 할 때마다 게이트를 조정할 수 있습니다. 이 대표적인 분석에서, 면역 세포는 synovial 조직에서 격리되고 세포외 표면 마커로 염색되었습니다, DMM 또는 sham 통제 수술 후에 6 주. 리-SC 양성 MHC2 음성 및 M2 대식세포의 높은 비율은 가짜 수술 마우스에서 관찰되는 세포 집단에 비해 DMM 처리동물에서 관찰된다.

여기서, DMM 처리된 동물의 비장으로부터 분리된 면역 세포에 대한 추가 및 세포 내 T 세포 패널에 대한 계층적 게이팅 전략을 관찰할 수 있다. TH1 세포의 더 높은 백분율은 DMM 동물의 림프절 및 경부 조직뿐만 아니라 T 조절 세포및 TH17 세포의 더 높은 수에서 관찰됩니다. 고품질 샘플을 획득하려면 신속하고 세심하며 일관된 방식으로 조직을 수확해야 합니다.

일단 면역 세포가 고립되면, 그밖 다운스트림 분석은 RTPCR와 같은, 세포 배양 및 관심의 분자 프로세스에 빛을 비추기 위하여 혈액에 휴식과 같은 실행될 수 있습니다.