Name: 내분비주주입을 통한 렙토메닝 세포 변형 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: 학습하세요 내분비주주입을 통한 렙토메닝 세포 유전자 편집 기법으로, 구부러진 바늘을 사용하여 신경 조직 손상을 최소화하고 뇌척수액 흐름을 추적하는 방법입니다. 이 기술은 신경발달 및 세균성 수막염 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 스웨덴 연구 위원회, 스웨덴 암 학회, 전략적 연구를위한 스웨덴 재단, 너트 오크 앨리스 발렌 베르첼스와 카롤린스카 연구소에서 줄기 세포와 재생 의학의 전략적 연구 프로그램에서 보조금에 의해 지원되었다 (StratRegen).

이로써 제시 된 외과 절차는 스톡홀름 노라 Djurförsöksetiska Nämnd에 의해 승인및 연구 기관 (카롤린스카 연구소, 스웨덴)에서 제공하는 사양에 따라 수행되었다.
참고: 인종 차별 적 주입은 여러 연구 목적을 위해 유연하게 적응 할 수 있습니다. 우리는 R26R-tdTomato12 및 CreER를 운반하는 형질전환 마우스 라인에서 엔도시펜의 주입에 기초하여 운명 매핑을 위한 렙토메닝 세포를 효율적으로 표지하기 위해 개발된 절차 아래에 제시하고, Cx30프로모터(13)에의하여 후자. 세포의 이 인구의 표시는 아래에 설명된 동일한 절차를 사용하여 바이러스 성 구조의 주입을 통해 달성될 수 있습니다. 마지막으로,이 접근법은 형광 추적기의 주입에 의해 뇌척수액 흐름을 추적하는 데 사용될 수 있습니다.
1. 주입 시스템의 준비
참고: 우리는 적절한 수술실에서, 그리고 무균 조건에서 절차를 수행하는 것이 좋습니다. 수술 도구는 열 (오토 클레이브, 유리 비드 살균기)을 사용하여 살균하거나 열에 민감한 경우 높은 수준의 화학 소독제를 사용하여 살균 할 수 있습니다. 화학 소독을 할 때 사용하기 전에 기기를 헹구거나 열로 소독할 때 식히십시오.
<ol><li>집게를 사용하여 주사기의 바늘을 팁에서 3mm에서 30°로 구부립니다. 참고: 30G 의 베벨 바늘로 해밀턴 주사기를 사용하십시오.</li>
	<li>10% DMSO로 희석한 엔도시펜 용액 1 mg/mL을 준비하고 구부러진 바늘로 주사기를 채웁니다. 참고 : 성인 C57Bl / 6j 마우스 (ca. 25-30g)에서 수막 세포의 광범위한 노출을 보장하기 위해 화합물의 5 μL을 투여하지만 다른 연령과 균주의 동물을 치료할 때 다른 농도와 주사 량을 테스트하는 파일럿 실험이 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>마우스 헤드 홀더를 조정하여 마우스 조각이 수술 테이블 표면에서 약 30°에 있도록 합니다. 참고: 3점 고정이 있는 입체 프레임(즉, 귀와 입)도 이 절차에 사용할 수 있습니다. 그러나 이 경우 동물은 입으로만 고정되는 반면, 이어 바는 동물의 앞다리 아래에 확장될 수 있으며 시술 중에 동물의 신체를 지탱하는 데 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 마취의 유도
<ol><li>주 사용 마 테 에 대 한, 농도 사용 하 고 지역 기관에서 수의 단위에 의해 권장 하는 관리의 모드.</li>
	<li>이소플루란과 같은 흡입 마취제의 경우 제조업체의 사양에 따라 관리 장치를 준비하십시오.</li>
	<li>이소플루란과 함께 마취 유도를 위해 화합물의 농도를 4 %로 설정하십시오.</li>
	<li>400 mL /min의 속도로 공기를 전달합니다.</li>
	<li>마취 장치가 몇 분 동안 마취실로 챔버를 채우고 나중에 챔버에 마우스를 놓습니다. 참고: 본 실험을 위해, 우리는 Cx30-CreER 및 R26R-tdTomato를 운반하는 성인 (>2 개월 및 약 30 g) 수컷 및 여성 형질전환 마우스를 사용하고 C57Bl/6j 배경에서 사육하였다.</li>
	<li>마취의 유도 하는 동안 동물을 모니터링. 마우스가 완전한 마취하에 있을 때 호흡 패턴은 느려져야 합니다.</li>
	<li>챔버에서 동물을 제거하고 뒷발을 섬세하게 꼬집어 발 반사의 억제를 확인합니다. 참고: 반사는 여전히 존재하지만 몇 초 지연 될 수 있습니다. 이 경우, 발 반사의 완전한 억제가 달성 될 때까지 챔버에 다시 동물을 배치합니다.</li>
	<li>진통 (예를 들어, 카프로펜, 피하 주사를 통해 5 mg / kg)을 투여하여 수술 후 통증 관리를 돕습니다.</li>
</ol>3. 절차에 대한 동물의 위치
<ol><li>동물의 머리를 머리 홀더에 고정합니다. 시스터나 마그나에 대한 접근성을 향상시키기 위해, 동물의 몸을 테이블 표면에서 약 30°로 위치시키고 머리 아래쪽을 향하여 몸의 나머지 부분과 120°의 각도를 설정하고 목 뒤쪽을 확장하여 시스테르나 마그나에 쉽게 접근할 수 있도록합니다(그림 1A).</li>
	<li>시술 내내 몸의 지탱을 위해 동물 밑에 종이 타월을 추가하십시오.</li>
	<li>구강 조각을 통해 마취 전달을 확보하고 이소플루란 농도를 2.5%로 낮추고 공기 전달을 200 ml/min로 줄입니다.</li>
	<li>안과 연고를 바르고 있습니다.</li>
</ol>4. 시스테르나 마그나의 노출
<ol><li>동물의 목 뒤쪽을 면도하고 70 % 에탄올과 베타 딘으로 부위를 살균하십시오.</li>
	<li>외과 용 가위를 사용하여 후두 뼈 의 수준에서 시작하여 후방으로 연장하는 중간 선 절개 (길이 7mm)를 수행하십시오.</li>
	<li>미세한 팁 핀셋으로 중간선에서 옆으로 당기는 피상적 결합 조직과 목 근육을 부드럽게 분리합니다. 이것은 거꾸로 된 삼각형모양의 시스터나 마그나를 오버레이하는 경막막을 드러날 것입니다.</li>
	<li>멸균 흡수 창이나 면봉을 사용하여 출혈을 조절하십시오.</li>
	<li>목 근육을 옆으로 당기고 시스터나 마그나의 시각화를 가능하게하기 위해 작은 수술 분리기를 배치하십시오.</li>
</ol>5. 인종 차별 주사
<ol><li>시스터나 마그나에 접근하려면 후두 뼈의 꼬리 끝을 식별하고 이전에 바로 밑에 구부러진 바늘을 삽입하십시오. 참고: 경막이 뚫리면 저항이 갑자기 떨어질 것입니다. 그러나, 바늘의 끝은 수막 표면 의 밑에 약간 관통할 것입니다, 그것의 후크 모양 덕분에.</li>
	<li>경막이 천공되면, 바늘의 구부러진 끝이 주사기를 위쪽으로 부드럽게 당겨 서 경도 표면 아래에 침투하게하고 동물의 몸에 평행하게 하여 바늘을 두개골에 "후크"합니다 (그림 1B참조). 이것은 더 나은 안정성을 보장하고 따라서 근본적인 소뇌 또는 수질손상의 리스크를 피하기 위하여 더 깊은 침투에서 바늘을 방지할 것입니다.</li>
	<li>뇌척수액의 자연적인 흐름과의 간섭을 피하기 위해 화합물을 천천히 주입하십시오. 참고: 실험의 목적에 따라 주입 속도가 다를 수 있습니다. 느리고 꾸준한 주입 속도가 필요한 경우 (예 : 뇌척수액 움직임을 추적하는 절차를 사용할 때), 주사기와 함께 자동 미세 주입 시스템을 사용하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>주입 후 바늘을 1 분 동안 사이트에 놓고 조심스럽게 제거하십시오. 후크 된 위치에서 바늘의 후퇴를 돕기 위해 미세 팁 집게를 사용합니다. 참고: 얇은 바늘 (예를 들어, 30 G)의 사용은 수막막의 실질적인 손상으로 이어지지 않으며 뇌척수액의 결과적으로 유출을 유발하지 않습니다. 더 큰 바늘 크기가 필요한 경우 멸균 면 팁을 사용하여 사출 부위에 압력을 가하여 유체 누출을 중지하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>6. 수술 후 진료의 결말
<ol><li>분리기를 제거하고 근육이 경막을 덮어 원래 위치로 돌아갈 수 있도록 하십시오.</li>
	<li>시아노아크릴레이트 접착제 몇 방울을 사용하여 피부 절개를 닫습니다. 참고: 또는 흡수성 봉합사(예: 5-0 vicryl 봉합사)를 사용하고 중단된 바늘로 피부 절개를 닫습니다.</li>
	<li>절개 부위에 국소 마취제 (예를 들어, 5 % 리도카인 의 100 μL)를 적용하십시오.</li>
	<li>동물을 홀더에서 꺼내 난방 패드에 놓인 깨끗한 케이지에 놓습니다. 동물이 의식을 되찾을 때까지 동물을 모니터링합니다. 참고: 절차는 동물에 있는 오래 지속되는 고통 또는 고민을 일으키는 원인이 될 것으로 예상되지 않습니다. 그럼에도 불구 하 고, 마우스는 첫 번째 수술 후 일 동안 밀접 하 게 모니터링 해야 하 고 통증 완화 조치 필요할 때마다 착수 될 수 있습니다., 그리고 기관에서 수의 단위에서 제공 하는 권고에 따라.</li>
</ol>

<ol><li>Vanlandewijck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+atlas+of+cell+types+and+zonation+in+the+brain+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature.</a> Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).</li>
<li>Whish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inner+CSF-brain+barrier%3A+developmentally+controlled+access+to+the+brain+via+intercellular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The inner CSF-brain barrier: developmentally controlled access to the brain via intercellular junctions.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 16(2015).</li>
<li>Weller, R. O., Sharp, M. M., Christodoulides, M., Carare, R. O., Mollgard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meninges+as+barriers+and+facilitators+for+the+movement+of+fluid%2C+cells+and+pathogens+related+to+the+rodent+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">The meninges as barriers and facilitators for the movement of fluid, cells and pathogens related to the rodent and human CNS.</a> Acta Neuropathologica. 135 (3), 363-385 (2018).</li>
<li>Choe, Y., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cascade+of+morphogenic+signaling+initiated+by+the+meninges+controls+corpus+callosum+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A cascade of morphogenic signaling initiated by the meninges controls corpus callosum formation.</a> Neuron. 73 (4), 698-712 (2012).</li>
<li>Siegenthaler, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+from+the+meninges+regulates+cortical+neuron+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid from the meninges regulates cortical neuron generation.</a> Cell. 139 (3), 597-609 (2009).</li>
<li>Bifari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenic+Radial+Glia-like+Cells+in+Meninges+Migrate+and+Differentiate+into+Functionally+Integrated+Neurons+in+the+Neonatal+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neurogenic Radial Glia-like Cells in Meninges Migrate and Differentiate into Functionally Integrated Neurons in the Neonatal Cortex.</a> Cell Stem Cell. 20 (3), 360-373 (2017).</li>
<li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+angle+on+blood-CNS+interfaces%3A+a+role+for+connexins%3F%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins?</a> FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).</li>
<li>Ramos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisterna+Magna+Injection+in+Rats+to+Study+Glymphatic+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cisterna Magna Injection in Rats to Study Glymphatic Function.</a> Methods in Molecular Biology. 1938, 97-104 (2019).</li>
<li>Xavier, A. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannula+Implantation+into+the+Cisterna+Magna+of+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li>
<li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paravascular+pathway+facilitates+CSF+flow+through+the+brain+parenchyma+and+the+clearance+of+interstitial+solutes%2C+including+amyloid+beta%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta.</a> Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).</li>
<li>Coureuil, M., Lecuyer, H., Bourdoulous, S., Nassif, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+journey+into+the+brain%3A+insight+into+how+bacterial+pathogens+cross+blood-brain+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A journey into the brain: insight into how bacterial pathogens cross blood-brain barriers.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 149-159 (2017).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+for+intersectional+targeting+of+neural+sensors+and+effectors+with+high+specificity+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance.</a> Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).</li>
<li>Slezak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+for+conditional+gene+manipulation+in+astroglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice for conditional gene manipulation in astroglial cells.</a> Glia. 55 (15), 1565-1576 (2007).</li>
<li>Hardy, S. J., Christodoulides, M., Weller, R. O., Heckels, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+Neisseria+meningitidis+with+cells+of+the+human+meninges%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interactions of Neisseria meningitidis with cells of the human meninges.</a> Molecular Microbiology. 36 (4), 817-829 (2000).</li>
<li>Colicchio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meningococcal+ABC-Type+L-glutamate+transporter+GltT+is+necessary+for+the+development+of+experimental+meningitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice.</a> Infection and Immunity. 77 (9), 3578-3587 (2009).</li>
<li>Ricci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+matrix+metalloproteinases+attenuates+brain+damage+in+experimental+meningococcal+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis.</a> BMC Infectious Diseases. 14, 726(2014).</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 이익을 선언하지 않습니다.

여기에 설명된 프로토콜은 운명 매핑을 위해 렙토메닝 세포에 레이블을 지정하는 간단하고 재현 가능한 절차를 제시합니다. 우리는 Tx30-CreER에서 tdTomato 형광 리포터의 발현을 유도하기 위해 타목시펜의 활성 대사 산물인 엔독시펜의 내성 분사술을 사용합니다. R26R-tdTomato 마우스12,,13.
시스터나 마그나9를통해 뇌척수액에 접근하는 데 사용되는 다른 프로토콜과 비교하여, 우리의 접근 법은 두개골의 후두 뼈에 안정될 수 있는 구부러진 바늘의 사용 덕분에 안전한 수동 투여를 보장합니다. 일단 시스터나 마그나의 경막이 천포되면, 저항에 있는 급격한 투하가 있습니다. 이 시점에서 다른 프로토콜은 바늘을 경면에서 최대 1-2mm로 낮추고 절차9전반에 걸쳐 수동으로 일정한 위치에 유...

렙토메닝 세포는 뇌를 오버레이하고 콜라겐 가교(예를 들어, Dcn 및 Lum)에연루된 유전자를 표현하는 얇은 층으로 구성된 섬유아세포와 같은 세포 집단이며, 뇌-수막 장벽(예를 들어, Cldn11)1,,2. 렙토메닝 세포는 뇌척수액배수에 대한 엄격한 통제로부터 뇌의 발달 뇌에서 신경 전구체의 지도에 이르기까지 광범위한 생리 기능에 연루되어4,,5. 최근 연구는 또한 신생아에 있는 leptomeninges 두뇌 자영으로 이동하고 기능적인 피질 신경으로 발전하는 방사형 glia 같이 세포를 항구할 수 있다는 것을 제안했습니다6.
렙토메닝 세포는 표면 성상 세포에 근접하여 위치하며, 그들과 공유하며, 다른 실치형 천체, 코넥신-30(Cx30)의 발현도7. 아래에 설명된 외과 적 절차는 Cx30+ 세포에서 tdTomato를 조건부로 발현하는 형질전환 마우스의 시스터나 마그나로 엔도시펜의 일회성 전달을 통해 이러한 수막 세포의 광범위하고 구체적인 라벨링을 허용합니다 (즉, 운명 매핑을 위한 CreER-loxP 시스템을 사용하여). 엔도시펜은 타목시펜의 활성 대사 산물이며 타목시펜과 같은 방식으로 CreER 발현 세포의 재조합을 유도합니다. 그러나 고농도의 에탄올 대신 5-10% DMSO에 용해되기 때문에 국소 적용에 권장되는 솔루션입니다. 추가적으로, endoxifen는 두뇌 수막 장벽을 교차하지 않으며, 그것으로 근본적인 Cx30+ 천체 집단의 표지 없이 렙토메닝 세포의 특정 재조합을 가능하게 합니다 (대표 결과참조).
여기에 제시 된 기술은 수동으로 안전하게 시스터나 마그나에 직접 액세스를 통해 뇌척수액에 화합물을 주입하는 것을 목표로합니다. 다른 달리, 개두술을 필요로 하는 더 침략적인 절차, 이 접근은 두개골 또는 두뇌 sarenchyma에 손상을 일으키는 원인이 되지 않고 화합물을 주입하는 것을 허용합니다. 따라서, 그것은 실화 신경교 세포의 활성화에 의해 유발 된 염증 반응의 유도와 연관되지 않습니다. 8,9,910이전에 설명된 다른 주사전략과유사하게, 본 접근법은 목 근육을 둔하게 해부한 후, 시스터나 마그나를 덮는 아틀란토 후두막의 외과적 노출에 의존한다. 그러나 다른 절차와 달리 투여 중 후두 뼈에 대해 안정화 될 수있는 팁에 바늘을 구부려 사용하는 것이 좋습니다. 이것은 바늘이 너무 깊게 관통하고 근본적인 소뇌 및 수질손상을 손상하는 리스크를 방지할 것입니다.
이 외과 적 절차는 실치층을 통해 세포 정체성 및 마이그레이션 경로의 변화를 매핑하는 것을 목표로 하는 계보 추적 조사와 호환됩니다. 또한 피질 발달에 대한 그들의 기여또는 세균성 뇌막염의 확산과 같은 건강과 질병에서 렙토메닝 세포의 역할을 탐구하려는 유전적 절제 연구에 적응될 수 있다33,11.5 마지막으로, 야생형 동물의 형광 추적자의 전달과 결합될 때 뇌척수액 의 움직임을 추적하는 데 활용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>마취 장치</td><td>Univentor 410</td><td>8323102</td><td>챔버 및 마우스 헤드 홀더에 연결되는 기화기, 챔버 및 튜빙 완성</td></tr><tr><td>마취 (이소플루란)</td><td>Baxter Medical AB</td><td>000890</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Orion Pharma AB</td><td>014920</td><td>상업명 Rymadil</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate 접착제</td><td>Carl Roth</td><td>0258.1</td><td>실크 5-0 봉합사 사용, 대체</td></tr><tr><td>Medbond Tissue</td><td>Glue Stoelting</td><td>50479</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Endoxifen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8284</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 70%</td><td>Histolab</td><td>01370</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 주사기(30G 경사진 바늘)</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>Aspen Nordic</td><td>520455</td><td></td></tr><tr><td>마우스 헤드 홀더</td><td>Narishige International</td><td>SGM-4</td><td>흡입 무혈 치료용 마우스 피스 포함. 또는 정위 프레임을 사용하십시오</td></tr><tr><td>가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Shaver</td><td>Aesculap</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>멸균 흡수 창</td><td>Fine Science Tools</td><td>18105-01</td><td>멸균 면봉도 좋은 옵션입니다</td></tr><tr><td>외과 분리기</td><td>World Precision Instrument</td><td>501897</td><td></td></tr><tr><td>핀셋</td><td>Dumont</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>바우쉬 & 롬 노르딕 AB</td><td>541760</td><td></td></tr></tbody></table>

내분비주주입을 통한 렙토메닝 세포 변형 유도

Induction of Leptomeningeal Cells Modification Via Intracisternal Injection

여기에 설명된 프로토콜은 기본 자렌치마에 손상을 줄 위험을 제거하면서 시스터나 마그나를 통해 솔루션을 안전하고 수동으로 주입하는 방법을 설명합니다. 이전에 게시된 프로토콜은 경면에서 최대 1-2mm로 낮혀야 하는 직선 바늘을 사용하는 것이 좋습니다. 경막이 뚫리면 저항이 급격히 떨어지면 바늘을 일정한 위치에 유지하기가 어려워집니다. 우리의 방법은 대신, 두개골의 후두 뼈에 대해 안정화 될 수있는 끝에 바늘구부러진 바늘을 사용하여 주사기가 경막 의 천공 후 조직으로 침투하는 것을 방지합니다. 이 절차는 간단하고 재현 가능하며 수술 된 동물에게 오래 지속되는 불편 함을 일으키지 않습니다. 우리는 혈관 렙토메닝 세포의 유전 운명 매핑의 맥락에서 내분비증 주입 전략을 기술합니다. 동일한 기술은, 또한, 신경 발달에 있는 leptomeninges의 역할을 탐구하고 세균성 뇌막염의 퍼짐과 같은 광범위한 연구 질문을, 이러한 현상에 연루된 유전자의 유전 절제를 통해 이용될 수 있습니다. 또한, 절차는 일정한 납품을 위한 자동화된 주입 시스템과 결합되고 형광표지된 분자의 주입을 통해 뇌척수액 운동을 추적하는 데 이용될 수 있습니다.

Cx30프로모터(13)와 유도성 형광 리포터 하에서 CreER를 발현하는 형질전환 마우스에서 엔독시펜의 내분은 피질내의 인접한 Cx30 발현 표면 및 parenchymal 성상세포에 라벨을 붙이지 않고 렙토메닝 세포의 특이적인 재조합을 허용한다(도1). 시스터나 마그나에 접근하기 위해 마취 된 동물은 몸과 머리를 약 120 °의 각도로 배치하여 목 뒤쪽을 뻗을 수 있습니다(그림 1A). 경막의 아틀란토 후두 부분은 목 근육의 무딘 해부를 통해 다음 노출, 따라서 기본 cisterna 마그나에 대한 액세스를 얻고. 안전한 수동 분사는 팁에서 3mm에서 약 30 °로 구부러진 바늘로 수행됩니다. 이것은 두개골의 후두 뼈에 대하여 주사기를 붙일 수 있게 하고, 따라서 투여 도중 안정성을 향상시키다<...

우리는 두개골에 안정될 수 있는 끝에 바늘을 구부린, 따라서 근본적인 자렌치에 손상의 리스크를 제거하는 intracisternal 주입을 기술합니다. 이 접근법은 렙토메닝 세포의 유전적 운명 매핑 및 조작및 뇌척수액 이동 추적에 사용될 수 있습니다.

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the ...

우리의 외과 적 절차는 렙토멘닝 세포의 특정 유전자 편집을 가능하게신경 발달과 세균성 뇌막염의 확산과 같은 많은 생리적 및 병리학 적 조건에서 자신의 기능을 연구할 수 있습니다. 엔독시펜의 인트라디에이터리 전달 중 손상을 최소화하기 위해, 우리는 두개골의 caudal 가장자리에 대해 고정 될 수있는 구부러진 바늘을 사용하여 조직 깊숙이 침투하는 것을 방지합니다. 절차는 기능 실험의 손실 및 이득을 통해 렙토멘딩 세포를 표현하는 유전자의 역할을 탐구하기 위하여 이용될 수 있습니다.또한 뇌척수액 의 흐름을 추적하기 위해 채택 될 수있다. 이 방법의 시각적 데모는 인종 차별 성 주사에 대한 주입 부위의 성공적인 식별을 보장하고 후두 뼈에 대한 바늘을 확보하는 방법에 대한 이해를 보장합니다. 주사를 위해 30 게이지 베벨드 바늘로 해밀턴 주사기를 준비하는 것으로 시작합니다.집게를 사용하여 바늘을 끝에서 3밀리미터까지 구부립니다. 다음으로, 10%DMSO에서 엔독시펜을 밀리리터당 1밀리그램의 농도로 희석시키고 주사기를 백필한다. 이소플루란 챔버에서 동물을 마취한다.그런 다음 마우스피스가 수술테이블 표면으로부터 약 30도 각도로 되도록 마우스 헤드 홀더를 조정하여 동물의 머리를 홀더에 고정시합니다. 시스테나 마그나에 대한 접근성을 향상시키기 위해, 동물의 몸을 테이블 표면에서 약 30도 아래로 기울어 몸의 나머지 부분과 함께 120도 각도를 설정하고 목 뒤쪽을 확장하여 시스테르나 마그나에 대한 접근을 용이하게합니다. 동물이 제대로 배치되면, 안연연을 적용, 목 의 뒷면을 면도하고, 알코올 물티슈와 베타 딘으로 영역을 살균.외과 가위를 사용하여 후두 뼈의 수준에서 시작하여 후방으로 확장하는 중간 선 절개를 하십시오. 피상적 결합 조직과 목 근육을 미세 한 팁 핀셋으로 미드 라인에서 옆으로 당겨 서 피상적 인 결합 조직과 목 근육을 부드럽게 분리하여 시스테나 마그나 위에 있는 듀랄 막을 노출시킵니다. 시술 내내 시스테나 마그나의 시각화를 가능하게 하는 작은 수술 분리기를 배치합니다.목막 뼈의 caudal 끝을 확인하고 바로 아래에 이전에 구부러진 바늘을 삽입합니다. 두라가 천공되면 주사기를 위쪽으로 부드럽게 당겨 서 표면 아래에 바늘의 구부러진 끝이 침투하여 더 나은 안정성을 보장합니다. 뇌척수액의 자연적인 흐름에 대한 간섭을 피하기 위해 화합물을 천천히 주입하십시오.주입 후 바늘이 1 분 동안 내부에 휴식을 취한 다음 미세

induction-leptomeningeal-cells-modification-via-intracisternal

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Zamboni, M., et al., induction of leptomeningeal cells modification by cisternal injection. J. Vis. 경험. (2020년)이 비디오는 마취된 마우스의 수조에 유도 약물을 전달하는 절차를 보여줍니다. 주사는 형광 영상으로 확인된 뇌척수액을 통해 접근할 수 있는 뇌 표면 세포에서 형광 마커 발현을 선택적으로 유도합니다.

Cisterna Magna Injection을 통한 마우스 모델의 표적 약물 전달

이 비디오에서는 인간 유래 종양 세포를 쥐 뇌의 수조 마그나로 전달하는 절차를 설명합니다. 정소성 마우스 모델은 두개골 수막으로의 암의 전이성 확산을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

외과적 수조 마그나 주사: 쥐 모델의 중추 신경계에 종양 세포를 직접 투여하는 방법

이 비디오에서는 Neisseria meningitidis를 마우스 모델로 시추 내 전달하여 수막염 감염을 생성하는 방법을 보여줍니다.

수막구균성 수막염을 유발하기 위해 마우스 모델로 수막구균의 수막구균 내 전달(Intracisternal Delivery of meningococci into mouse models to induce meningococcal meningitis)

이 비디오는 대뇌 피질 탈수초화가 널리 퍼진 쥐 모델을 생성하는 방법을 보여줍니다. 이것은 재조합 미엘린 수초 단백질로 준비된 쥐에 전염증성 사이토카인을 주입하여 혈액-뇌 장벽을 파괴하는 것을 포함합니다. 이 과정은 면역 세포의 침투를 촉진하여 광범위한 대뇌 피질 탈수초를 초래합니다.

쥐 모델에서 광범위한 대뇌 피질 탈수초 발생

이 비디오에서는 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 사용하여 다발성 경화증의 마우스 모델을 구축합니다. 마우스에 뉴런 펩타이드와 보조제가 포함된 에멀젼을 주입하여 자가반응성 T세포를 활성화하는 면역 반응을 유발합니다. 그 다음에는 백일해 독소(PTX)를 주입하여 혈액뇌장벽 투과성을 높여 자가반응성 T세포가 뇌에 침투할 수 있도록 합니다. 이 침투는 궁극적으로 수초성 손상을 초래하는 신호 폭포를 시작하여 다발성 경화증의 탈수초성 상태를 모방합니다.

마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염 유도

여기에 제시 된 프로토콜은 성인 남성 다크 아구티 쥐에서 두 피질 반구의 광범위한 회색 물질 탈모의 재현을 허용합니다. 상기 방법은 카테터의 인트레이스레브레인 이식, 골엘린 올리고드로시테 당단백질에 대한 임상 접종, 이식된 카테터를 통한 프로염증성 사이토카인 혼합물의 인트레이스레브렐 주입을 포함한다.

프로 염증 성 사이토카인의 인트레이스렐 주입에 의해 유도된 광범위한 대뇌 피질 탈량의 쥐 모델

여기에서, 우리는 성인 마우스에 있는 감염의 내성인종 경로를 통해 수막구균 뇌막염을 유도하는 방법을 기술합니다. 우리는 접종의 준비에서 내질 감염에 수막 구균 감염의 단계 프로토콜에 의해 단계를 제시; 그런 다음 동물의 생존을 기록하고 뮤린 조직에서 세균 부하를 평가합니다.

인트스타스타스테어링 전달을 통해 마우스에서 수막구균 수막염 혈청계S C유도

여기에서, 우리는 기능적으로 환자에 있는 Ommaya 저수지를 닮은 murine xenograft 모형을 기술합니다. 우리는 보편적으로 치명적인 렙토멘닝에 대한 새로운 치료법을 연구하기 위해 뮤린 옴마야를 개발했습니다.

렙토메뇌질환의 직접 표적 치료를 연구하는 뮤린 옴마야 제노이식 모델

본 프로토콜은 유전자 편집 및 약물 전달을 위해 신생아 마우스에서 척수강내 주사를 수행하기 위한 단계별 지침을 설명합니다.

게놈 편집 및 약물 전달을 위한 신생아 마우스의 척수강내 주사

이 프로토콜은 경피적 천자 경로를 통해 종양 세포를 수조 마그나로 주입하여 마우스의 연수막 전이를 강력하게 유도하여 외상 및 두개외 종양 부담을 줄이는 방법을 설명합니다.

마우스의 연수막 전이 연구를 위한 최소 침습적 수조 마그나 주입 모델

여기서는 여러 신경학적 질환에서 중요한 역할을 하는 마우스 수막 림프관(MLVs)을 평가하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜의 목표는 추적자 배수의 기능적 평가와 등쪽 MLVs 네트워크의 상세한 형태학적 특성화를 모두 가능하게 하는 통합 방법을 제공하는 것입니다.

수막 림프관 평가를 위한 통합 프로토콜: 흉부 주사, 림프절 영상, 수막 박리, 전면 착색

학습하세요 내분비주주입을 통한 렙토메닝 세포 유전자 편집 기법으로, 구부러진 바늘을 사용하여 신경 조직 손상을 최소화하고 뇌척수액 흐름을 추적하는 방법입니다. 이 기술은 신경발달 및 세균성 수막염 연구에 활용됩니다.

내분비주주입을 통한 렙토메닝 세포 변형 유도

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