Name: 기능 학습 다리 세분화 및 추적 (FLLIT)를 사용하여 자유롭게 움직이는 곤충에서 완전 자동화 된 다리 추적 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 학습하세요 FLLIT 기계학습 알고리즘을 활용한 Drosophila melanogaster 다리 움직임 자동 추적 및 보행 패턴 정량 분석 방법. 신경퇴행성 질환 모델의 보행 이상을 연구하는 데 활용됩니다.

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저자는 기술 지원을 위해 무미타 채터지와 앨리스 리우, 그리고 블루밍턴 드로소필라 스톡 센터 (인디애나, 미국)가이 작품에 사용되는 드로 소필라 균주를 사용할 수 있도록 감사드립니다. 이 작품은 분자 및 세포 생물학 연구소에 의해 지원되었다, 싱가포르; 생물 정보학 연구소, 싱가포르; 과학기술연구공동협의회 조직(SA 및 LC에 15302FG149 보조금) 임상 연구 주력 프로그램 (파킨슨 병) 보건부의 국립 의학 연구위원회 (SA에 부여 번호 NMRC / TCR / 013-NNI / 2014), 앨버타 대학 (LC에 스타트 업 보조금), 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC) 발견 보조금 (보조금 번호 RGPIN-2019-045).

1. 시스템 설정
<ol><li>레코딩 스테이션에 고속 카메라와 무대가 있어 아레나 챔버를 고정해야합니다(그림 1). 이에 따라 빠른 셔터 속도로 초당 최소 250프레임(fps)으로 녹화하도록 카메라를 조정합니다(이 경우 셔터 속도가 1ms인 1000fps로 녹화됨). 참고: 비디오가 모든 프레임에서 움직이는 다리의 모션 블러가 최소화되거나 없는지 확인하여 추적에 적합한지 확인합니다. 움직이는 다리가 너무 흐려서 사람의 비터가 추적할 수 없는 경우 카메라 녹화 속도 및/또는 셔터 속도를 높여야 합니다.</li>
	<li>적외선 LED 조명을 카메라와 샘플 사이에 디퓨저(반투명 시트)로 스테이지 상단에 놓습니다(그림1A, B).</li>
	<li>1.6mm 두께의 아크릴 시트를 절단하여 녹음 챔버를 확인합니다. 이 실험에서는 11 mm x 11 mm의 시야각을 사용합니다.Figure 1C</li>
</ol>2. 녹음을위한 파리의 준비
<ol><li>파리를 새로운 음식 바이알로 기록하기 위해 24시간 전에 기록한다. 참고: 녹화 하기 전에 24 시간 미만의 파리에 CO2 (일반적으로 첫 번째 수집 시 파리를 마취 하는 데 사용)를 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>녹화하기 약 40 분 전에 파리를 빈 바이알로 옮기고 5-7 분 동안 얼음을 유지하십시오.</li>
	<li>그 동안, 경기장과 맑은 유리 슬라이드를 물과 닦아 닦아 닦아. 참고: 에탄올을 사용하여 챔버와 슬라이드를 청소하지 마십시오.</li>
	<li>녹음 실을 준비합니다. 테이프로 챔버 아래에 미세한 유리 슬라이드 중 하나를 고정합니다.</li>
	<li>파리가 얼음에 마취되면 깨끗한 브러시를 사용하여 각 챔버에 한 마리의 파리를 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 더합니다. 참고 : 남성과 여성 파리는 이 설정에서 사용할 수 있으며, 가능한 한 남녀 의 파리는 성별 별 편견을 피하기 위해 분석해야합니다.</li>
	<li>테이프로 다른 현미경 유리 슬라이드로 챔버를 고정합니다(그림1C).</li>
	<li>체임버 파리를 실온에서 15 -20 분 동안 보관하십시오.</li>
</ol>3. FLLIT 분석을 위한 비디오 생성
참고: 이 단계는 사용된 비디오 카메라에만 해당됩니다. 이 경우 시판되는 비디오 카메라가 사용됩니다(재료 표참조).
<ol><li>전원을 켭니다. 전원이 공급되고 이더넷 인터페이스 연결이 안정화될 때까지 녹색 LED가 켜지도록 기다립니다. 적외선 LED의 전원을 켭타. 전압이 12.5V로 유지되도록 합니다.</li>
	<li>연결된 컴퓨터 시스템에서 뷰어 응용 프로그램을 엽니다.</li>
	<li>레코딩 프레임 속도를 1000fps로 변경합니다. 셔터 속도를 1/1000s(1ms)로 설정합니다.</li>
	<li>녹음 장에 플라이와 챔버를 배치하고 라이브 버튼을 선택합니다. 비행이 챔버의 바닥에 똑바로 걷고있을 때 카메라가 다리 끝에 초점을 맞추고 있는지 확인하십시오. 다리 끝은 날카로운 초점에 있어야합니다.</li>
	<li>레코드를 클릭합니다(그림 2).</li>
	<li>플라이 워킹을 기록하여 다음을 확인합니다. 플라이는 경기장 가장자리를 건드리지 않고 비교적 직선궤도로 걸었다. 비행은 다리 당 적어도 세 보폭을 걸었다. 비행은 걷는 동안 멈추지 않습니다. 보행 거리는 하나 이상의 바디 길이와 동일합니다. 참고: 배경을 깨끗하게 차감하는 것은 정확한 세분화를 위해 매우 중요합니다. FLLIT에 의해 사용되는 자동 배경 빼기 알고리즘은 이미지 플라이가 거리에서 적어도 하나의 신체 길이를 이동하도록 요구합니다.</li>
	<li>녹화를 중지하려면 완료 완료를 클릭합니다(그림2).</li>
	<li>비디오가 플라이의 직선 보행만 포함되도록 비디오를 자르기(3.6단계에서 설명한 대로).</li>
	<li>저장을 클릭합니다(그림 2). 파일을 '.mraw' 또는 '.tiff' 형식으로 각 폴더에 저장합니다. 참고: '.mraw' 형식은 '.mraw' 파일 형식에 비해 파일 이름(필요한 경우)을 변경하고 비디오 저장에 더 큰 유연성을 제공합니다.</li>
</ol>4. FLLIT 프로그램의 설치
참고: 최신 지침은 https://github.com/BII-wushuang/FLLIT/blob/master/Compiled/Readme.pdf
<ol><li>모든 운영 체제에서 FLLIT 다운로드<ol>
<li>다음 Github 링크에서 FLLIT을 다운로드합니다: https://github.com/BII-wushuang/FLLIT/archive/master.zip. zip 파일의 내용을 추출합니다.</li>
		<li>다음 Google 드라이브 링크에서 샘플 데이터 세트를 다운로드합니다: https://bit.ly/2EibvNY. FLLIT 마스터/컴파일된 폴더 데이터를 만들고 이 데이터 디렉터리에서 데이터 집합 폴더를 배치합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>우분투에 FLLIT 설치<ol>
<li>FLLIT/컴파일된 디렉토리로 이동합니다.</li>
		<li>마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 터미나 l에서 열기를선택합니다.</li>
		<li>다음 명령을 실행하여 MATLAB 런타임 라이브러리를 다운로드하여 $HOME/MCR에 설치합니다. 배쉬 MCR_2016a.sh
</li>
		<li>MATLAB 런타임 라이브러리 설치가 완료된 후 다음 명령을 실행 권한이 FLLIT에 부여되도록 합니다. chmod +x FLLIT
</li>
		<li>FLLIT/컴파일된 디렉터리에서 터미널을 열고 다음 명령을 실행하여 FLLIT을 실행합니다. bash run_FLLIT.sh $HOME/MCR/v901
</li>
	</ol>
</li>
	<li>윈도우에 FLLIT 설치<ol>
<li>7 및 10 번째 홈 에디션의 경우 다음에서 Docker 도구 상자를 설치하십시오. (https://github.com/docker/toolbox/releases/download/v19.03.1/DockerToolbox-19.03.1.exe)을 참조하십시오.</li>
		<li>윈도우에 대 한 10 프로 또는 엔터프라이즈 에디션, 에 Windows용 도커 데스크톱을 설치: (https://download.docker.com/win/stable/Docker\ Desktop\ Installer.exe).</li>
		<li>Windows의 Docker 컨테이너에서 GUI 응용 프로그램을 실행하려면 먼저 VcXSrV(https://sourceforge.net/projects/vcxsrv)를 설치합니다. VcXsrv를 시작할 때 그림 S1에서와같이 설정을 구성합니다. 참고: FLLIT를 시작하기 전에 Docker 및 VcXsrv가 실행되고 있는지 확인합니다.</li>
		<li>FLLIT.bat을 두 번 클릭하여 FLLIT을 실행합니다. 참고: 처음으로 실행하는 경우 Docker Hub에서 Docker 이미지를 가져오는 데 시간이 걸릴 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MacOS에 FLLIT 설치<ol>
<li>https://download.docker.com/mac/stable/Docker.dmg 맥 OS에 대 한 도커 데스크톱 다운로드
</li>
		<li>터미널을 열고 다음 명령을 실행하여 socat을 설치하십시오. 양조 설치 socat
</li>
		<li>다음을 통해 socat을 시작하십시오. socat TCP-LISTEN:6000, 재사용, 포크 UNIX-클라이언트:\"$DISPLAY\" &amp; disown
</li>
		<li>XQuartz(https://www.xquartz.org)를 설치하여 MacOS의 Docker 컨테이너에서 GUI 응용 프로그램을 실행할 수 있습니다. 그림 S2에표시된 대로 보안 탭에서 네트워크 클라이언트의 연결 허용을 확인하여 XQuartz를 시작하고 기본 설정을 변경합니다. 참고: FLLIT를 시작하기 전에 Docker, socat 및 XQuartz가 모두 실행되고 있는지 확인합니다.</li>
		<li>FLLIT/컴파일된 디렉터리에서 터미널을 열고 다음 명령으로 FLLIT를 실행합니다. 배쉬 FLLIT_Mac.sh 참고: 처음으로 실행하는 경우 Docker Hub에서 Docker 이미지를 가져오는 데 시간이 걸릴 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 자동 다리 추적을위한 FLLIT 실행
<ol><li>세분화<ol>
<li>비디오를 개별 TIFF 파일로 변환하고 FLLIT 데이터 폴더에 복사합니다.</li>
		<li>FLLIT를 실행 (우분투에서, 터미널에서 FLLIT를 엽니 다 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭).</li>
		<li>추적할 비디오의 프레임별 TIFF 이미지가 포함된 폴더를 선택하고 추가 단추를 클릭합니다.</li>
		<li>팝업 창에서 다리 세분화만 수행하기 위해 0을 선택하거나 다리 세분화를 사용하여 다리 추적을 포함하도록 1을 선택합니다.</li>
		<li>완료를 클릭하여 선택한 비디오의 세분화 및 추적을 시작합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>추적<ol>
<li>추적의 정확성을 확인하고 오류 수정(있는 경우)을 수행하려면 데이터 폴더 선택을클릭합니다. 추적할 폴더를 선택하고 열기를클릭합니다.</li>
		<li>[보기] 참고: 추적된 다리 위치를 볼 때 뷰어 모드가 선택된 상태로 유지되도록 합니다. 그렇지 않으면 이전에 수정한 사항이 지나치게 초과됩니다.</li>
		<li>첫 번째 프레임의 모든 다리에 대한 라벨링 확인 참고: 다리 라벨은 화면의 위치에 따라 배치되기 때문에 플라이가 똑바로 걷는 경우 플라이의 오른쪽은 L1(앞다리), L2(중간 다리), L3(뒷다리) 및 플라이의 왼쪽에 R1(앞다리), R2(중간 다리), R3(뒷다리) 표시로 표시되어Figure 3있습니다. 플라이가 거꾸로 걷는 경우 다리 라벨이 올바르게 비고됩니다.</li>
		<li>다리에 레이블이 잘못 지정되어 수정이 필요한 경우 일시 중지 보기를클릭한 다음 예측 조정(그림 3)을클릭합니다.</li>
		<li>오른쪽 패널에서 다리를 조정하고 보정이 필요한 다리를 선택합니다.</li>
		<li>이미지 창에서 이 다리의 올바른 위치를 두 번 클릭한 다음 저장을클릭한 다음 을 종료합니다. 이전 프레임 또는 후속 프레임으로 이동하려면 일시 중지 보기를 클릭한 다음 앞으로 및 뒤로 및 I&gt; 버튼(그림3)을클릭합니다.</li>
		<li>잘못 추적된 비디오를 수정하려면 비디오의 데이터 폴더를 열어 다시 추적하고 수동으로 추적을 선택합니다.</li>
		<li>추적 단추를 클릭하면 레이블이 초기로 변경됩니다.</li>
		<li>예측 조정을 클릭하고 각 다리 팁을 두 번 클릭한 다음 올바른 다리 레이블로 할당하여 다리 레이블을 수정합니다. 저장 및 종료를 클릭합니다.</li>
		<li>추적을 시작하려면 다시 시작을 클릭합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>데이터 처리 및 비디오 생성<ol>
<li>데이터 프로세스를클릭합니다. 팝업 창에서 비디오가 기록된 초당 프레임 수(fps)를 입력합니다(예: 1,000fps).</li>
		<li>다음 방정식을 사용하여 걸음걸이 매개변수를 밀리미터 단위로 측정할 수 있도록 캡처된 비디오의 실제 시야를 계산합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61012/61012eq1.jpg"> 참고: 예를 들어, 실제 챔버 크기가 7 mm인 경우, 이미지 프레임의 폭은 137 mm이고, 컴퓨터 화면상의 이미지 프레임에서 챔버의 폭은 81 mm이고, 시야의 폭은 11.83mm(그림 S3)이다.</li>
		<li>추적 결과를 보려면 결과 폴더 아래의 추적 폴더로 이동합니다.</li>
		<li>추적된 비행 의 비디오를 생성하려면 비디오 만들기를선택합니다. 비디오는 분석된 원본 비디오 데이터와 동일한 결과 폴더에 저장됩니다. 참고: 비디오의 시작(첫 번째) 및 끝(마지막) 프레임을 선택할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>각 플라이의 바디 길이로 정규화합니다. 참고: 각 플라이의 크기가 약간 다를 수 있으므로 비교를 용이하게 하기 위해 특정 보행 매개변수를 각 비행의 몸길이로 정규화해야 합니다(예: 보폭 길이는 더 큰 파리에서더 길고 작은 파리에서는 더 짧을 수 있음).<ol>
<li>이미지 소프트웨어를 사용하여 각 플라이(일반적으로 첫 번째, 중간 및 마지막 프레임)의 비디오에서 3개의 스틸 이미지를 엽니다.</li>
		<li>각 이미지 프레임을 800%로 확대하고 밝은 색상(예: 노란색)을 사용하여 중간선의 머리 및 후방 최다 픽셀에 레이블을 지정합니다.</li>
		<li>ImageJ에서 레이블이 지정된 이미지를 엽니다.</li>
		<li>축척 설정 사용하여 그에 따라 축척입력: 거리 설정(픽셀: 512) 알려진 거리: 5.3.2단계에서 측정된 실제 시야(mm); 길이 단위: mm.</li>
		<li>표시된 머리와 복부 팁 픽셀 사이에 직선을 그려 바디 길이를 얻습니다.</li>
		<li>설정 축척을 다시 열어 알려진 거리의 값을 가져오고, 이는 바디 길이mm입니다.</li>
		<li>3개의 이미지 각각에서 결정된 길이의 평균을 취하여 mm의 평균 신체 크기를 얻었다.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+leg+tracking+of+Drosophila+neurodegeneration+models+reveals+distinct+conserved+movement+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Fully automated leg tracking of Drosophila neurodegeneration models reveals distinct conserved movement signatures.</a> PLoS Biology. 17 (6), 3000346(2019).</li>
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<li>Pereira, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+animal+pose+estimation+using+deep+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast animal pose estimation using deep neural networks.</a> Nature Methods. 16 (1), 117-125 (2019).</li>
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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 원고에서는 자동화 된 기계 학습 프로그램 인 FLLIT1을사용하여 자유롭게 걷는 Drosophila에서걸음걸이를 분석하는 단계를 자세히 설명합니다. 추적 및 데이터 분석 후 FLLIT은 신체 및 다리 발톱의 위치 정보에 대한 원시 데이터를 자동으로 생성하여 20개의 신체 및 걸음걸이 기능과 추적된 비행 비디오를 생성하여 걸음걸이 시각화를 가능하게 합니다.
현재, 1, ,12,3,34,,4,14,15,16의다리 운동 추적을 위한 여러 가지 방법이 있으며, 실험의 목표에 따라 다양한 옵션을 연구자들에게 제공하고 있다. 이들 중 일부는 매우 정확하지만 검출 표면4,,14와만 발톱 접촉점을보고 발 인쇄 기반 접근 방식입니다. 한편, 최근 딥 러닝 접근 방식2,,3,,16은 매우 다재다능하여 모든 동물의 다리 관절 및 기타 신체 부위를 추적해야 하는 행동을 분석할 수 있으며, 알고리즘이 먼저 사용자 에추가 추가된 데이터 집합으로 학습되어야 한다는 경고와 함께. 세 번째 유형의 접근 법은 형태 또는1이미지 대비 기반 방법1,15,,17을 사용하여 각 다리의 윤곽을 찾아 발톱 위치를 식별합니다. 일반적으로 이러한 방법은 다리가 교차하는 동작(예: 그루밍 중)을 제대로 처리하지 않습니다. FLLIT은 형태학적 매개변수를 사용하여 다리 세분화를 위한 부스팅 알고리즘을 학습하는 두 번째 및 세 번째 접근 방식을 결합합니다. 이를 통해 FLLIT은 사용자 별표의 까다로운 작업을 우회하여 학습 데이터 집합을 생성하는 동시에 기계 학습을 사용하여 정확도를 향상시킬 수 있습니다. FLLIT에 대한 향후 개선 사항은 다리가 교차하는 인스턴스를 처리하여 보다 복잡한 동작을 분석할 수 있도록 해야 합니다.
FLLIT은 조명, 레코딩 해상도 및 프레임 속도1의약간의 변화에 견고합니다. 그러나 녹화된 비디오의 프레임 속도는 250fps 미만으로 떨어지지 않아야 하며 FLLIT은 1000fps로 녹화된 비디오에 대해 최적으로 실행됩니다. 이미지에 모션 블러가 있는 경우, 사람의 개그 위치를 식별하기 어려운 경우 FLLIT은 해당 프레임에서 다리 팁을 정확하게 식별할 수 없습니다. 이에 비추어 볼 때, 카메라는 다리 끝에 날카롭게 초점을 맞추어야 합니다. 세분화 아티팩트를 방지하기 위해 경기장을 철저히 청소해야 하며 녹화 중에 이동해서는 안 됩니다. 정확한 배경 빼기 및 깔끔한 세분화를 위해 플라이는 일시 중지하지 않고 기록 중에 하나 이상의 바디 길이를 이동해야 합니다. 자동 세그미테이션 및 모든 다리의 라벨을 추적 한 후 확인해야합니다. 플라이 보행이 잘못 추적되지 않으면 수동으로 추적 시작 옵션(5.2.7 – 5.2.10 단계)을 사용하여 파일을 수동으로 다시 추적해야 합니다.
신경 퇴행성 질환과 운동 장애는 우리의 노화 사회에서 점점 더 널리 퍼져 있습니다. 신경 변성의 비행 모형은 질병 병리생리학의 분자 그리고 세포 양상에 관하여 진보가 이루어진 동안 2 년 이상 동안 공부되었습니다. 그러나, 질병의 특정 행동 결과는 기술적으로 평가하기 어려웠습니다. 예를 들어, 비행 중의 떨림 움직임에 대한 보고가18,,19로이루어진 반면, 이들은 최근1일까지정량적으로 연구되지 않았다. 등반 분석은 유용하고 양적, 아직 상대적으로 거친 측정6되었습니다. 이 기술적 적자는 마찬가지로 다른 동물 모델에서 고해상도 운동 분석을 방해하고있다. 행동 분석을 위한 새로운 공구의 출현은, 그러므로, 신경 근육 질병의 분자 및 세포 기계장치가 동물 모형에 있는 특정 행동 결과로 이끌어 내는 방법을 연구하는 연구원을 가능하게 하기 위하여 운동 무질서의 필드를 젊어지게 하는 것을 약속했습니다. 본 논문과 전작1에서는SCA3의 플라이 모델이 초운동적 무택 걸음걸이를 나타내는 FLLIT을 사용하는 것으로 나타났으며, PD 플라이 모델은 저운동성 강체 걸음걸이를 나타내며, 각 인간 질병의 운동 특징을 재차재현합니다 1. 걸음걸이 분석은 또한 특정 운동 역기능의 근본적인 명백한 신경 인구를 확인하는 가능하게 했습니다. 앞으로, 상세한 운동 분석, 비행에서 사용할 수있는 강력한 이미징 및 기능 도구와 결합, 우리는 회로 메커니즘에 대한 신경 퇴행성 질환의 우리의 이해를 조명, 운동 기능 장애의 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다.
FLLIT은 이전에 거미 다리의 움직임을 추적하기위한 매우 정확한 것으로 입증 된 바와 같이, 다른 작은 절지 동물에서 보행을 연구하기 위해 널리 적용되어야한다1. 우리는 병원성 걸음걸이와 그 기본 회로를 정량화하기위한 상세한 운동 자형교의 사용에 초점을 맞추고 있지만, 운동 추적의 발전은 이미 혁명을 일으켰으며, 정상적인 보행 조정 및 걸음걸이및 그 기본 회로, 특히 진화 나무의 무수한 다른 가지에 대한 이해에 지속적인 영향을 미칠 것입니다.

지난 수십 년 동안, 신경 퇴행성 질환과 운동 장애는 우리의 노화 인구에서 더 널리 성장했다. 많은 신경 퇴행성 질환에 대한 우리의 이해가 분자 및 세포 수준에서 진행되었지만, 영향을받는 신경 회로의 근본적인 특징은 제대로 이해되지 않습니다. 최근에 개발된 행동 추적 도구1,,2,,3,,4는 이제 분자, 세포 및 회로 dysregulation 기본 질병을 확인하기 위해 동물 질병 모델의 운동 이상을 연구할 수 있게 되었습니다.
많은 신경퇴행성 질환에 관여하는 분자경로는 열매파리에 보존되어 초파리멜라노가스터,및 초파리질환 모델은 신경변성 기저의 근본적인 기전을 해명하는데 도움을 주었다5,,6. 우리는 최근에 파킨슨 병 (PD)와 척추 세포 자 운동 실조 3 (SCA3)의 비행 모델이 각각의 인간 질병과 유사한 뚜렷하고 보존 된 보행 시그니처를 나타낸다는 것을 보여주었습니다1,비행 모델이 특정 운동 장애에서 운동 기능 장애의 기본 회로 메커니즘을 이해하는 데 사용될 수 있음을 입증. 단일 유전자 및 단일 세포 레벨7,,8,,9,,10에서 뉴런의 표적 조작 및 시각화를 위한 플라이 모델에서 풍부하고 지속적으로 성장하는 도구는 비행이 생체 내에서 질병 경로, 신경 회로 및 행동 표현형 발현 사이의 관계를 탐구하는 이상적인 모델입니다. 정밀하고 자동화된 곤충 보행 분석을 가능하게 하기 위해, 우리는 최근에 기계 학습 방법, Feature L수입 기반 LIMB 세분화 및 T랙팅 (FLLIT)1을개발했습니다.
FLLIT은 먼저 다리 픽셀을 분할하는 완전 자동화된 다단계 알고리즘으로 구성되어 있으며, 이 알고리즘은 이후에 해당 다리 발톱을 찾고 추적하는 데 사용됩니다. FLLIT은 최근 작업2,,3에서사용되는 딥 러닝 알고리즘과 는 달리 세분화를 위한 부스팅 알고리즘을 사용합니다. 두 프레임워크 모두에 대해 기능 추출이 컨볼루션 커널 학습을 통해 자동으로 수행된다는 점에서 컨볼루션 신경망과 몇 가지 유사점이 있습니다. FLLIT의 첫 번째 단계는 형태학적 작업(가장자리 및 골격화)을 사용하여 자동으로 포지티브(다리의 픽셀) 및 음수(플라이 바디의 배경 또는 픽셀) 학습 샘플을 높은 신뢰도로 생성하는 것입니다. 따라서 FLLIT는 완전히 자동화되어 있으며 사용자에게 추가된 교육 샘플이 필요하지 않습니다. 위의 학습 샘플을 사용하여 분류기는 증폭 알고리즘의 프레임워크에서 학습됩니다. 약한 분류기의 앙상블은 반복적으로 학습되며, 각각 기능 추출 및 의사 결정 트리를 위한 컨볼루션 커널 세트로 구성됩니다. 최종 학습 분류기는 다음 다리 세분화에 사용되며 형태 학적 작업보다 어려운 영역 / 하드 샘플을 더 잘 분별 할 수 있으며 추적1을위해 전반적으로 훨씬 더 정확한 세분화를 생성합니다. 분할된 다리에서 팁을 찾아 헝가리 알고리즘을 사용하여 추적합니다. FLLIT은 마지막으로 본 위치(플라이 중심 좌표)를 기억하여 다리 끝이 더 이상 폐색되지 않도록 하여 오클루전 케이스를 처리할 수 있습니다.
우리는 이전에 FLLIT가 자동으로 정확하게 다리의 움직임을 추적하고 고속 비디오1에서표시되지 않은 자유롭게 움직이는 비행 또는 거미에서 걸음걸이를 분석 할 수 있음을 보여 주었다; 따라서 FLLIT은 절지동물 다리 추적에 광범위하게 적용되어야 합니다. 형태학적 매개 변수를 사용하여 기계 학습 교육 세트를 추출함으로써 FLLIT은 대부분의 딥 러닝 방법에 필요한 까다로운 수동 추가 없이 곤충 다리를 세그먼트화하고 추적하도록 자동으로 학습합니다. 따라서 FLLIT은 완전히 자동화되어 있습니다. 다리 세분화 및 추적 후 FLLIT은 모든 비디오 프레임에서 원시 추적 된 신체 및 다리 위치, 20 걸음걸이 매개 변수, 5 플롯 및 걸음걸이 움직임의 걸음걸이 분석 및 시각화를위한 추적 된 비디오를 자동으로 생성합니다. 이 프로토콜은 FLLIT 사용에 대한 단계별 가이드를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>아크릴 시트</td><td>Dama</td><td>1.6mm 두께, 투명 시트</td><td>싱가포르, 싱가포르</td></tr><tr><td>투명 유리 슬라이드</td><td>Biomedia</td><td>BMH 880101</td><td>싱가포르, 싱가포르</td></tr><tr><td>고속 카메라</td><td>Photron</td><td>Fastcam MC2.1</td><td>도쿄, 일본. 캡처된 이미지의 모션 블러를 줄이는 데 1msec 이상의 셔터 속도가 이상적입니다</td></tr>. <tr><td>Infra Red LED</td><td>Any - Generic from hardware store</td><td>940nm Infrared Light Board</td><td>Singapore, Singapore</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155-01LS</td><td>Irving, Texas, USA</td></tr></tbody></table>

기능 학습 다리 세분화 및 추적 (fllit)를 사용하여 자유롭게 움직이는 곤충에서 완전 자동화 된 다리 추적

Fully Automated Leg Tracking in Freely Moving Insects using Feature Learning Leg Segmentation and Tracking (FLLIT)

Drosophila 모형은 신경 기능의 연구 결과및 신경 변성의 기초가 되는 분자와 세포 기계장치를 이해하기를 위해 귀중했습니다. 신경 부집합의 조작 그리고 연구 결과를 위한 비행 기술은 점점 더 정교해지는 동안, 결과적인 행동 표현형의 풍요로움은 유사한 세부사항에서 포착되지 않았습니다. 돌연변이 간의 비교를 위해 미묘한 플라이 다리 움직임을 연구하려면 고속 및 빠른 다리 움직임을 자동으로 측정하고 정량화할 수 있는 능력이 필요합니다. 따라서, 우리는 자유롭게 걷는 파리에서 자동 다리 발톱 추적을위한 기계 학습 알고리즘을 개발, 기능 학습 기반 의 사지 세분화 및 추적 (FLLIT). 대부분의 딥 러닝 방법과 달리 FLLIT은 학습 알고리즘에 내장된 형태학적 매개 변수를 사용하여 사용자 추가 없이 완전히 자동화되고 자체 교육 세트를 생성합니다. 이 문서에서는 FLLIT를 사용하여 보행 분석을 수행하기 위한 심층 프로토콜에 대해 설명합니다. 카메라 설정, 경기장 건설, 비디오 녹화, 다리 세그미테이션 및 다리 발톱 추적 절차를 자세히 설명합니다. 또한 모든 비디오 프레임에서 원시 추적 된 몸과 다리 위치, 20 걸음걸이 매개 변수, 5 플롯 및 추적 된 비디오를 포함하는 FLLIT에 의해 생성 된 데이터의 개요를 제공합니다. FLLIT의 사용을 입증하기 위해, 우리는 Spinocerebellar 운동 실조 3의 플라이 모델에서 관련 병이 걸음걸이 매개 변수를 정량화.

다리 세분화, 추적 및 데이터 처리에 이어 FLLIT은 바디와 각 다리 발톱, 20걸음걸이 매개변수, 5개의 플롯 및 추적된비디오(표 1)의위치에 대한 원시 데이터를 자동으로 생성합니다.
여기서는 Spinocerebellar 운동 실조 3 (SCA3)의 플라이 모델을 사용하여 이러한 분석을 보여줍니다. 범뉴뉴런 드라이버인 Elav-GAL4는 폴리Q 관부에서 27글루타민을 가진 전신 야생형 인간 SCA3(UAS-SCA3-flQ27) 또는 폴리Q 관내 84글루타민을 이용한 전신 돌연변이 인간 SCA3(UAS-SCA3-flQ84)를 구동하는데 사용되었다11. SCA3는 몸 을 베는, 불규칙한 발 배치 및 짧은, 숨막히는 단계12,,13 (표 2)와과세 걸음걸이로 대표된다. 돌연변이 SCA3 파리의 걸음걸이를 특성화하고 인간 환자의 보행과 유사한 걸음걸이를 표시하는지 여부를 조사하기 위해 FLLIT에 의해 생성된 관련 보행 매개변수, 즉 신체 회전 수, 발자국 규칙성, 다리 도메인 중복 및 크기 및 다리 보폭길이(표 2)를분석했습니다.
우리는 SCA3-Q84 파리가 더 많은 회전을 나타냈다 것으로 나타났습니다(그림 4A, A'),낮은 풋 프린트 규칙성에 의해 전시 된 불규칙한 발 배치 (AEP14의확대 표준 편차)(그림 4B) (그림 4C-D), 증가 다리 도메인 오버랩(그림 4C-D),길이 및 면적의 다리 도메인 확대(그림 4E,F), 및 보폭 감소 길이(그림 4E,F).
FLLIT은 또한 경기장 중심 및 바디 중심 뷰, 바디 궤적 및 방향 방향, 각 다리의 수직 및 측면 변위에서 추적된 비행 및 다리를 보여주는 비디오를 생성합니다(그림5). 추적된 동영상은 서로 다른 파리의 다리 움직임을 나란히 비교할 수 있습니다. Elav-GAL4&gt; SCA3-flQ27 (비디오 1)및 Elav-GAL4&gt; SCA3-flQ84 (비디오 2)의대표 동영상은 비행에 비해 Elav-GAL4&gt;UAS-SCA3-flQ27 파리 (그림 5A), Elav-GAL4&gt;UAS-SCA3-flQ84 (그림 5A), Elav-GAL4&gt;UAS-SCA3-flQ84 서로 다른 크기의 다리 도메인을 교차, 숨막히는 나타내는, ataxic 걸음걸이.Figure 5AFigure 5B
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61012/61012fig1.jpg"> 그림 1. 녹음 스테이션 및 경기장 의 설정. (A)전면 및(B)측 보기에서 녹음합니다. (C)FLLIT 추적을 위한 플라이 레코딩을 만드는 데 사용되는 경기장의 예입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61012/61012fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61012/61012fig2.jpg"> 그림 2: 두 개의 파리를 동시에 기록할 수 있는 듀얼 헤드 카메라를 사용하여 플라이 보행 녹화 중 활성 창보기. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61012/61012fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61012/61012fig3.jpg"> 그림 3: 분할 및 추적 후 버튼 패널과 레이블이 지정된 다리를 보여주는 활성 FLLIT 창입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61012/61012fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61012/61012fig4.jpg"> 도 4: 야생형을 발현하는 파리의 관련 걸음걸이 파라미터에 대한 대표적인 FLLIT 생성 데이터(SCA3-flQ27) 대 돌연변이체(SCA3-flQ84) SCA3. (A)신체 궤적의 회전 수. (B)다리 중피트선 규칙성은 신체 길이로 정규화됩니다. (C-C') 각 다리의 다리 영역을 통과했습니다. (D)다리 사이에 도메인이 겹칩니다. (E)중족 도메인 길이가 체내 길이로 정규화됩니다. (F)중족 도메인 영역이 체내 길이2로정규화되었습니다. (G)다리 중간 보폭이 체감에 정규화 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61012/61012fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61012/61012fig5.jpg"> 그림 5: 대표적인 FLLIT 생성 비디오의 스냅샷입니다. (A) Elav-GAL4&gt;UAS-SCA3-flQ27 및(B) Elav-GAL4&gt;UAS-SCA3-flQ84 파리. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61012/61012fig5large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/61012/61012video1.jpg"> 비디오 1: 범 뉴런 야생형 인간 전신 SCA3(Elav-GAL4&gt;UAS-SCA3-flQ27)를 표현하는Elav-GAL4&gt;UAS-SCA3-flQ27비행의 대표적인 비디오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61012/Video_1_Elav-GAL4_SCA3-flQ27_22d.mp4" target="_blank">이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/61012/61012video2.jpg"> 비디오 2: 범뉴런 돌연변이 체형 의 전체 길이SCA3(Elav-GAL4&gt;UAS-SCA3-flQ84)를표현하는 비행의 대표적인 비디오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61012/Video_2_Elav-GAL4_SCA3-flQ84_22d.mp4" target="_blank">이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)</a>
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/61012/61012supfig1.jpg"> 추가 그림 1: VcXSrv에 대한 구성입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61012/61012supfig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/61012/61012supfig2.jpg"> 추가 그림 2: Xquartz에 대한 구성. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61012/61012supfig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/61012/61012supfig3.jpg"> 추가 그림 3: 시야 계산에 필요한 치수로 레이블이 지정된 이미지입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61012/61012supfig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>범주</td>
			<td>매개 변수</td>
			<td>설명</td>
			<td>파일/플롯(해당하는 경우)</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">원시 데이터</td>
			<td>바디 위치</td>
			<td>각 프레임의 바디 중심의 위치 좌표</td>
			<td>CoM.csv의 처음 두 열</td>
		</tr><tr><td>차체 탄도</td>
			<td>도의 바디 축 회전 각도(y축에 상대)</td>
			<td>CoM.csv의 세 번째 열</td>
		</tr><tr><td>아레나 중심의 다리 발톱 위치</td>
			<td>아레나 좌표를 기반으로 각 프레임의 각 다리 발톱의 위치 좌표</td>
			<td>궤적.csv</td>
		</tr><tr><td>바디 센터 레그 클로 위치</td>
			<td>각 프레임의 각 다리 발톱의 위치 좌표 아레나 좌표를 기반으로</td>
			<td>norm_trajectory.csv</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">바디 모션</td>
			<td>본체 길이(mm)</td>
			<td>각 프레임에서 추정된 샘플 동물의 길이(머리에 가장 많은 위치가 후방까지 날개에 위치)</td>
			<td>바디길이.csv</td>
		</tr><tr><td>순간 체속 (mm/s)</td>
			<td>샘플 동물의 신체의 순간 속도 (중심)</td>
			<td>바디벨로시티.csv; 바디벨로시티.pdf</td>
		</tr><tr><td>신체의 터닝 포인트 궤적</td>
			<td>터닝 포인트를 찾기 위해 더글 라스파푸커를 사용하여 궤적을 조각선형 곡선으로 줄입니다. 두 이웃 사이의 각도 &gt; 50 도프와 관련된 것으로 식별되는 선회 이벤트가 다음 알고리즘 단순화된 궤적을 구성하는 선형 세그먼트</td>
			<td>바디 궤도.pdf</td>
		</tr><tr><td rowspan="9">개별 보폭 매개변수</td>
			<td>보폭 지속 시간(ms)</td>
			<td>보폭 이벤트의 기간</td>
			<td>스트라이드매개 변수.csv</td>
		</tr><tr><td>보폭 기간(ms)</td>
			<td>한 보폭 이벤트에서 다음 보폭 이벤트까지의 지속 시간</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>보폭 변위(mm)</td>
			<td>보폭 이벤트 중 다리 발톱변위</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>보폭 적용 경로(mm)</td>
			<td>보폭 이벤트 중 다리 발톱으로 덮인 총 경로</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>전방 극단적 인 위치 (mm)</td>
			<td>보폭 이벤트가 끝날 때 다리 발톱의 계단참 위치(본체에 상대적)</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>후방 극단적 인 위치 (mm)</td>
			<td>보폭 이벤트 시작 시 다리 발톱의 이륙 위치(본체별)</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>보폭 진폭(mm)</td>
			<td>보폭 이벤트의 모션 방향을 따라 변위</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>스탠스 선형성(mm)</td>
			<td>해당 전방(20ms 간격)을 통해 스무딩된 곡선으로부터보폭의 편차로 정의 보폭의 후방 극단적 인 위치</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>보폭 스트레치(mm)</td>
			<td>보폭 이벤트 중간에 있는 바디 센터에서 다리 발톱 위치의 거리</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="10">다리 동작</td>
			<td>레그 속도(mm/s)</td>
			<td>각 다리의 순간 속도</td>
			<td>레그스피드.csv; 걸음걸이.pdf</td>
		</tr><tr><td>걸음걸이 지수</td>
			<td>이것은 운동 중에 (6다리) 샘플 동물에 의해 전시된 보행 조정의 유형을 측정한다. 걸음걸이 인덱스 1은 삼각대 걸음걸이에 해당하며_1은 테트라포드 보행에 해당하며 0은 비표준 보행을 구성합니다. 구현에서 걸음걸이 지수는 120 ms 창을 통해 이동 평균에 의해 얻어진다</td>
			<td>걸음걸이 인덱스.csv; 걸음걸이 지수.pdf</td>
		</tr><tr><td>이동 백분율</td>
			<td>다리가 움직이는 시간의 백분율</td>
			<td>레그파라미터.csv</td>
		</tr><tr><td>평균 보폭(ms)</td>
			<td>한 보폭 이벤트에서 다음 보폭 이벤트까지의 평균 지속 시간</td>
			<td>레그파라미터.csv</td>
		</tr><tr><td>발자국 규칙성(mm)</td>
			<td>후방의 표준 편차로 측정및</td>
			<td>레그파라미터.csv</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>다리의 전방 극단적 인 위치</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>다리 궤적 도메인 영역 (mm2)</td>
			<td>레퍼런스 프레임의 전체 다리 궤적을 포함하는 최소 볼록 선체 영역</td>
			<td>레그파라미터.csv; 레그도메인.pdf</td>
		</tr><tr><td>길이와 폭은 레그 탄도 도메인(mm)</td>
			<td>주요 (도메인 길이) 및 마이너에 발톱 위치의 최대 예상 거리를 통해 얻은 (도메인 너비) 주 축</td>
			<td>레그파라미터.csv</td>
		</tr><tr><td>다리 도메인 교차/겹침 (mm2)</td>
			<td>가능한 각 교차/겹침</td>
			<td>레그도메인오버랩.csv</td>
		</tr><tr><td>스탠스 폭(mm)</td>
			<td>왼쪽 다리와 중간 다리의 AEP와 PEP 사이의 평균 거리</td>
			<td>스탠스폭.csv</td>
		</tr></tbody></table>표 1: FLLIT에 의해 생성된 걸음걸이 매개변수.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="4">걸음걸이 기능</td>
		</tr>
<tr>
<td>척추 주의자 운동 실조의 걸음걸이 기능 3 (SCA3)</td>
			<td>기울고</td>
			<td>불규칙한 발 배치 및 다리 교차</td>
			<td>숨막히는 걸음</td>
			<td>짧은 보폭</td>
		</tr>
<tr>
<td>측정 파라미터</td>
			<td>바디 턴 이벤트 수</td>
			<td>발자국 규칙성</td>
			<td>다리 도메인의 크기, 도메인 중복 정도</td>
			<td>보폭 길이</td>
		</tr>
<tr>
<td>FLLIT 파일</td>
			<td>바디 궤도.pdf</td>
			<td>레그파라미터.csv</td>
			<td>레그도메인오버랩.csv</td>
			<td>스트라이드매개 변수.csv</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 해당 FLLIT 파라미터 및 출력 파일을 가진 인간 환자에서 특징적인 SCA3 보행 특징을 보여주는 표.

우리는 FLLIT, 자유롭게 움직이는 Drosophila 멜라노가스터 및 기타 곤충에서 다리 발톱 운동 추적을위한 완전 자동화 된 기계 학습 방법을 사용하기위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 야생 형 파리, 돌연변이 파리 및 신경 변성의 비행 모델에서 미묘한 보행 걸음 걸이 움직임을 정량적으로 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

기능 학습 다리 세분화 및 추적 (FLLIT)를 사용하여 자유롭게 움직이는 곤충에서 완전 자동화 된 다리 추적

The Drosophila model has been invaluable for the study of neurological function and for understanding the molecular and cellular mechanisms that underlie ...

FLLIT는 추적 된 동물의 신체 와 다리 구성을 계산하는 알고리즘입니다. 그리고 이것은 정상 및 질병 걷기 행동 둘 다근하는 회로를 특성화하는 데 유용합니다. FLLIT의 독특한 점은 교육을 위해 사용자 에 추가 된 데이터 집합이 필요하지 않으므로 완전히 자동화된다는 것입니다.또한 일련의 걸음걸이 측정, 시각화를 위한 걸음걸이 플롯 및 트랙 비디오를 생성하는 트랙 데이터를 자동으로 분석합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 후 동료인 애니메쉬 배너지(Animesh Banerjee)가 될 것입니다. 실험을 시작하기 전에, 녹음 스테이션이 경기장 챔버를 유지하기 위해 무대 위에 고속 카메라가 있음을 확인합니다.적외선 LED 조명을 카메라와 샘플 사이에 디퓨저로 스테이지 상단에 배치합니다. 녹음을 시작하기 약 40분 전에 파리를 얼음 위에 있는 빈 사악한 사악으로 5~7분 간 옮는다. 파리가 진정되는 동안 물과 닦기를 사용하여 챔버의 경기장과 유리 슬라이드를 지우고 챔버 아래 유리 슬라이드 중 하나를 테이프로 표시하십시오.깨끗한 브러시를 사용하여 마취 된 플라이 하나를 챔버로 옮기고 두 번째 슬라이드와 테이프로 챔버를 고정하십시오. 그런 다음 챔버 가 15 ~20 분 동안 실온에서 적응하도록 챔버 비행을 허용합니다. FLLIT 분석을 위한 비디오를 생성하려면 먼저 전원을 켜고 연결된 컴퓨터 시스템에서 뷰어 응용 프로그램을 엽니다.레코딩 프레임 속도를 초당 1, 000 프레임으로 변경하고 셔터 속도를 1밀리초로 설정합니다. 녹음 경기장에 플라이로 챔버를 놓고 LIVE 버튼을 클릭합니다. 비행이 챔버의 바닥에 똑바로 걷고 있을 때 카메라가 다리 팁에 초점을 맞추고 있음을 확인하고 기록을 클릭합니다.녹화하는 동안, 비행이 경기장의 가장자리를 건드리지 않고 상대적으로 직선 궤도에서 걷고, 다리 당 적어도 세 걸음을 걷고, 걷는 동안 멈추지 않으며, 걷는 거리가 적어도 하나 반 의 몸 길이와 동일하도록합니다. 분석이 끝나면 레코드 완료를 클릭하여 녹음을 중지하고 파일을 mraw 또는 tiff 형식으로 적절한 폴더에 저장합니다. FLLIT를 설치하려면 먼저 모든 운영 체제에 프로그램을 다운로드합니다.zip 파일의 내용을 추출하고 샘플 데이터 세트를 다운로드합니다. 우분투에 FLLIT를 설치하려면 FLLIT/컴파일된 디렉토리로 이동한 후 오른쪽 단추를 클릭하여 터미널에서 열기를 선택합니다. 샘플 데이터 집합을 다운로드하고 데이터 집합 폴더가 배치되는 FLLIT 마스터/컴파일아래에 폴더 데이터를 만듭니다.홈/MCR에 MATLAB 런타임 라이브러리를 설치합니다. MATLAB 런타임 라이브러리 설치가 완료되면 명령을 실행 권한이 FLLIT에 기록되도록 명령이 실행됩니다. 그런 다음 명령을 입력하여 FLLIT를 실행합니다.비디오 의 세분화를 위해 파일을 개별 TIFF 파일로 변환하고 변환된 파일을 FLLIT 데이터 폴더에 저장합니다. 모든 파일이 전송되면 FLLIT를 실행합니다. 팝업 창에서 다리 분할만 수행하기 위해 0을 선택하거나 다리 분할을 사용하여 다리 추적을 포함하도록 1을 선택합니다.추적할 비디오의 프레임별 TIFF 이미지가 포함된 폴더와 관심 파일및 추가를 클릭합니다. 그런 다음 완료를 클릭하여 선택한 비디오의 세분화 및 추적을 시작합니다. 추적의 정확성을 확인하고 오류 수정을 수행하려면 데이터 폴더 선택을 클릭한 다음 추적할 폴더를 선택합니다.추적 보기를 클릭하고 첫 번째 프레임의 모든 다리에 대한 라벨링을 확인합니다. 다리가 잘못 표시되고 수정이 필요한 경우 일시 중지 보기를 클릭하고 예측을 조정합니다. 다리를 조정하여 패널을 조정하려면 보정이 필요한 다리를 선택하고 이미지 창에서 이 다리의 올바른 위치를 두 번 클릭합니다.그런 다음 저장 및 종료를 클릭합니다. 세분화되고 추적된 데이터를 처리하려면 데이터 프로세스를 클릭합니다. 먼저, 게이트 매개 변수를 측정할 수 있도록 캡처된 비디오의 실제 시야필드를 계산합니다.팝업 창에서 비디오가 녹화되는 초당 프레임 수를 입력하고 계산된 뷰 필드를 밀리미터 단위로 입력합니다. 추적 결과에 액세스하려면 결과를 열고 폴더를 추적합니다. 추적된 비행 비디오를 생성하려면 비디오 만들기를 선택합니다.레그 세분화, 추적 및 데이터 처리에 따라 FLLIT는 신체의 위치와 각 레그 클로, 20개의 걸음걸이 매개 변수 및 함께 제공되는 플롯및 추적된 비디오에 대한 원시 데이터를 자동으로 생성합니다. SCA3은 몸을 굽히기, 불규칙한 발 배치 및 짧은 숨막히는 계단으로 탁트한 보행로를 대표합니다. 돌연변이 SCA3 파리의 걸음걸이를 특성화하고 인간 환자의 것과 유사한 걸음걸이를 나타내는지 여부를 조사하기 위해 FLLIT에 의해 생성된 관련 걸음걸이 파라미터를 분석할 수 있다.SCA3-Q84 플라이는 더 많은 회전, 낮은 발자국 규칙으로 나타나는 불규칙한 발 배치, 다리 영역 중복 증가, 길이 및 면적의 다리 영역 확대, 보폭 감소 등을 나타낸다. FLLIT는 또한 경기장 중심및 신체 중심보기, 신체 궤적, 방향, 각 다리의 수직 및 측면 변위에서 추적된 비행과 다리를 보여주는 비디오를 생성할 수 있습니다. SCA3-Q27 파리와 비교하여 SCA3-Q84는 다양한 크기의 불규칙한 교차 다리 영역을 나타내며, 이는 숨어 있는 아탁스 보행을 나타냅니다.신체 및 다리 발톱 위치에 대한 원시 데이터는 관심의 특정 움직임에 대해 더 분석 할 수 있습니다. 예를 들어, FLLIT의 사용은 파킨슨 병의 Drosophila 모델에 의해 표시되는 경직된 표현형이 도파민성 신경 기능 장애에 기인한다는 것을 결정하는 것을 저희 단을 허용했습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Behavior

행동

에서 복잡한 운전하는 동작의...

성인 Drosophila Melanogaster의 로코의 고해상도 비디오 추적

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곤충의 적응 운동력이있는 사람의 행동의 신경 기초를 공부

이 비디오는 자유롭게 걷는 파리를 추적하여 일반적인 운동 능력을 평가하는 방법을 설명합니다. 주요 프로토콜은 비디오 추적 소프트웨어를 사용한 분석의 설정 및 데이터 분석을 보여줍니다.

자유롭게 걷는 파리 추적: 초파리의 이동을 평가하는 방법

우리는 이전에 우리가 닿는 바퀴벌레의 개별 단위의 활동을 모니터링 할 수 있습니다 바퀴벌레 뇌의 중심 단지로 사극 전선을 주입하는 기술을 개발했다. 여기에서 우리는 우리가 자유롭게 곤충을 움직이는 뇌 활동을 기록 할 수 있도록하는 기술의 수정 된 버전을 제시한다.

자유롭게 곤충 워킹 뇌 세포 와이어 사극 기록

우리는 자동으로 그리고 정확하게 검출 카운트, 그리고 그들의 비행 사운드에 기초하여 곤충 비행 분류 저렴 비침 가상 음향 광학 센서를 사용하는 시스템을 제안 하였다.

저렴한 센서와 곤충 검출 및 분류 플라잉

FIM은 C. 작은 이동 물체를 추적하도록 설계된 신규 한 비용 효율적인 이미징 시스템 엘레, planaria 초파리 애벌레. 첨부 FIMTrack 프로그램은 빠르고 효율적인 데이터 분석을 제공하도록 설계되었습니다. 이 도구들을 함께 행동 특성의 높은 처리량 분석을 할 수 있습니다.

FIM 이미징 및 FIMtrack : 높은 처리량 및 비용 효율적인 로코 분석을 허용하는 두 가지 새로운 도구

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곤충 - 기계 하이브리드 시스템 : 자유롭게 비행 비틀의 원격 무선 제어 (<em&gt; Mercynorrhina의 torquata</em&gt;)

냄새 소스 지역화하는 능력 벌레의 생존에 필요한 인공 냄새 추적에 적용될 것으로 기대된다. 곤충 제어 로봇은 실제 silkmoth에 의해 구동 로봇 플랫폼을 통해 곤충의 냄새 추적 능력을 평가하기 위해 우리가 할 수있다.

곤충 제어 로봇 : 이동 로봇 플랫폼은 곤충의 냄새 추적 능력을 평가하는

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SwarmSight: 곤충 안테나와 일반적인 준비와 기존 하드웨어를 사용 하 여 코 확장 반사의 실시간 추적

이 프로토콜은 딥러닝 기반 다중 관절 궤적 자동 라벨링과 함께 마커리스 러닝머신 테스트를 사용하여 쥐 하지의 운동학 평가 파이프라인을 구축하여 재현 가능한 동작 정량화를 가능하게 합니다.

쥐의 후肢 운동 운동학을 객관적으로 정량화하기 위한 딥러닝 기반 다중 관절 동기 추적

학습하세요 FLLIT 기계학습 알고리즘을 활용한 Drosophila melanogaster 다리 움직임 자동 추적 및 보행 패턴 정량 분석 방법. 신경퇴행성 질환 모델의 보행 이상을 연구하는 데 활용됩니다.

기능 학습 다리 세분화 및 추적 (FLLIT)를 사용하여 자유롭게 움직이는 곤충에서 완전 자동화 된 다리 추적

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