Name: 아실-PEGyl 교환 젤 시프트 분석은 뇌막 단백질의 팔미토일화의 정량적 측정을 위한 것입니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 배우세요 뇌 조직에서 막 단백질의 팔미토일화 상태를 정량 분석하는 APEGS 분석법을 사용하는 방법을. 친화성 정제 없이 겔 이동도 변화를 활용하여 신경과학 연구에 필수적인 단백질 수정을 효율적으로 측정합니다.

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저자는 APEGS 분석에 대한 조언과 입력K. 울프리 감사합니다. 이 연구 결과는 화이트홀 재단과 NIH-NIMH (1R01MH119347)에서 E.D.에 연구 보조금에 의해 투자되었습니다.

모든 동물 절차는 국립 보건원 (NIH)에 의해 명시된 지침을 따르고 캘리포니아 대학, 데이비스에 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 마우스 뇌막의 준비
<ol><li>기요틴 장치를 사용하여 마우스를 참수하고 뇌를 빠르게 해부하십시오 (<1 분, 가능하면 해부 절차 중에 발생할 수있는 팔미토일화 변화를 최소화하십시오). 얼음 에 유리 균질화 제 (~12 스트로크)에서 균질화 완충제(표 1)의10 mL에서 즉시 균질화.</li>
	<li>원심분리기는 4°C에서 1,400 x g에서 15분 동안 용해됩니다. 상급체를 얼음에 새 튜브로 옮김. 펠릿(~6 스트로크)을 균질화 완충제와 원심분리기의 동일한 부피에서 710 x g에서 4°C에서 10분 동안 재중단합니다.</li>
	<li>4°C에서 20분 동안 40,000 x g에서 1.2단계와 원심분리기를 결합합니다.</li>
	<li>상판(cytosolic 분획)을 폐기하고 균질화 완충제에서 펠릿막(P2) 분획을 재중단한다. 참고: 시료는 플래시 냉동 및 -80°C에서 보관하여 나중에 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>단백질 수준을 정량화하기 위해 비신코닌산(BCA) 분석기를 수행합니다. APEGS 분석의 경우, 1.5 mL 튜브에서 완충A(표1)의부피에서 ~100-200 mg 단백질(최대 250 mg)으로 시작한다. 불용성 단백질을 제거하기 위해 25°C에서 10분 동안 >13,000 x g에서 초음파 및 원심분리기를 제거하였다. 용해된 단백질을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮김.</li>
</ol>2. 아실-PEGyl 교환 젤 시프트 (APEGS) 분석
<ol><li>이황화 결합을 방해하고 무료 시스테인을 차단합니다.<ol>
<li>25 mM 트리스 (2-카르박스체틸)인 포스핀 (TCEP; 25 μL, 주식 용액으로부터 첨가된)에서 배양함으로써 이황화 결합을 중단; 표 1) 55 °C에서 60 분 동안.</li>
		<li>50 mM N-에틸 말레미드와 블록 무료 시스테인 (NEM; 12.5 μL, 주식 용액에서 추가; 표 1) 3 시간 동안 실온에서. 참고 : 반응은 하룻밤 연장 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>클로로포름 메탄올(CM) 침전을 수행합니다.<ol>
<li>1.5 mL 튜브에서 적당한 속도로 스윙 버킷 로터에서 원심 분리 할 수있는 폴리 프로필렌 또는 유리 튜브로 단백질 용액을 옮니다. 5 mL 튜브가 이상적입니다. 메탄올(MeOH)과 와류의 4개 부피(2mL)를 짧게 추가합니다.</li>
		<li>클로로포름과 와류의 두 부피(1mL)를 짧게 추가합니다.</li>
		<li>dH2O와 소용돌이의 3개 볼륨(1.5mL)을 짧게 추가합니다.</li>
		<li>스윙 버킷 로터에서 25°C에서 30분 동안 3,000 x g에서 시료를 원심분리한다.</li>
		<li>조심스럽게 제거하고 상부 단계를 폐기.</li>
		<li>MeOH 3권(1.5mL)을 넣고 불투명한 단백질 팬케이크를 조각하지 않도록 주의하면서 부드럽고 철저하게 섞으세요.</li>
		<li>스윙 버킷 로터에서 25°C에서 3,000 x g에서 10분 동안 원심분리기.</li>
		<li>유리 혈청 학적 파이펫을 사용하여 단백질 팬케이크를 방해하지 않고 가능한 한 상단 위상을 많이 제거하십시오.</li>
		<li>MeOH 1 mL로 펠릿을 조심스럽게 헹구십시오.</li>
		<li>펠릿을 적어도 10분 동안 공기 건조시. 참고 : 건조 된 펠릿은 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>하이드록실라민 (NH2OH, HAM)과 팔미토일 티에스터 링키지의 분열을 수행합니다.<ol>
<li>완충A의 125 μL에서 단백질 침전을 재중단하고 잠시 초음파 처리한다. 불용성 물질을 제거하기 위해 25 °C에서 10 분 동안 >13,000 x g에서 원심 분리기. 용해된 단백질을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮김.</li>
		<li>버퍼 H의 375 μL추가 (HAM +; 표 1) 또는 버퍼 T(HAM-; 표 1) 25 °C에서 60 분 동안 샘플을 배양하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2.2단계에서 기재된 CM 강수량을 반복한다. 참고 : 건조 된 펠릿은 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>보호되지 않은 시스테인에 mPEG를 추가합니다.<ol>
<li>100 μL의 완충A에서 펠릿을 10 mM TCEP를 함유한다. 1.5 mL 튜브로 옮김. 참고: CM 강수 단계 동안 단백질의 상당한 손실이 발생하는 것은 정상입니다. 모든 후속 단계는 1.5 mL 튜브에서 수행되어 단백질의 부피를 최대 ~120-130 μL로 제한합니다. 이것은 최종 CM 강수량 도중 단백질 손실을 감소시킬 것입니다.</li>
		<li>20 mM mPEG-5k (25 μL, 재고 용액에서 추가; 표 1) 단백질 샘플에 파이펫팅하여 혼합합니다. 25°C에서 60분 동안 배양하여 엔드 오버-오버-엔드 회전을 합니다.</li>
		<li>통합되지 않은 mPEG-5k를 제거하려면, 이러한 조정된 부피를 사용하여 2.2단계에서 설명한 대로 CM 침전을 수행하십시오: MeOH 4부 볼륨(500 μL), 클로로폼 2부(250 μL), 3개의 dH2O(375 μL). >13,000 x g에서 25°C에서 10분 동안 원심분리기.</li>
		<li>조심스럽게 두꺼운, 응집팬케이크를 피하고, 이전과 같이 상부를 제거합니다. MeOH 1 mL을 넣고 부드럽게 완전히 섞으세요. >13,000 x g에서 25°C에서 10분 동안 원심분리기.</li>
		<li>조심스럽게 상류를 제거하고 MeOH의 1 mL로 펠릿을 헹구십시오. >13,000 x g에서 25°C에서 10분 동안 원심분리기. 공기 건조 펠릿. 참고 : 건조 된 펠릿은 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>완충A의 50 μL에서 건조 된 펠릿을 다시 일시 중단하십시오 (TCEP 또는 환원제없이). BCA 단백질 정량화를 위해 5 μL을 예약하십시오. 정량화 후, 적당한 양의 Laemmli 샘플 버퍼를 추가하고, 관심 있는 단백질에 따라, 잠재적으로 샘플을 70-100°C로 10분 동안 가열한다. 참고: 끓이면 일부 막 단백질이 응집을 일으킬 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. PEGylated 단백질의 서쪽 얼룩 분석
<ol><li>도데실 황산 나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)겔(13)에샘플을 적재한다. 참고:이 프로토콜에서는 10% 폴리아크릴아미드가 사용되었다.</li>
	<li>서양 블로팅14에표준 분리, 전송 및 감지 프로토콜을 사용합니다.</li>
	<li>밀도측정14를 사용하여 PEGylated 대 비PEGylated 단백질의 상대적 양을 결정합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+does+S-palmitoylation+do+to+membrane+proteins%3F%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">What does S-palmitoylation do to membrane proteins?</a> FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).</li>
<li>Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+palmitoylation+in+neuronal+development+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).</li>
<li>Globa, A. K., Bamji, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+palmitoylation+in+the+development+and+plasticity+of+neuronal+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).</li>
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<li>Kalashnikova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SynDIG1%3A+an+activity-regulated%2C+AMPA-+receptor-interacting+transmembrane+protein+that+regulates+excitatory+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development.</a> Neuron. 65, 80-93 (2010).</li>
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<li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).</li>
<li>Percher, A., Thinon, E., Hang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-Tag+Labeling+Using+Acyl-PEG+Exchange+for+the+Determination+of+Endogenous+Protein+S-Fatty+Acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation.</a> Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).</li>
<li>Yokoi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+PSD-95+Depalmitoylating+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes.</a> Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Separating+Protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Science+Education+Database.+The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Science Education Database. The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).</li>
<li>Chenaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+SynDIG1+Reduces+Excitatory+Synapse+Maturation+But+Not+Formation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li>
<li>Matt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SynDIG4%2FPrrt1+Is+Required+for+Excitatory+Synapse+Development+and+Plasticity+Underlying+Cognitive+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function.</a> Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).</li>
<li>Purkey, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKAP150+Palmitoylation+Regulates+Synaptic+Incorporation+of+Ca%282%2B%29-Permeable+AMPA+Receptors+to+Control+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP.</a> Cell Reports. 25, 974-987 (2018).</li>
<li>Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+palmitoyl+acyltransferase+DHHC2+regulates+recycling+endosome+exocytosis+and+synaptic+potentiation+through+palmitoylation+of+AKAP79%2F150%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150.</a> Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

전작에서는 ABE 분석서를 활용하여 SynDIG1이 안정성, 국소화 및 기능6을조절하는 활성 의존적 방식으로 보존된 두 개의 병치-막간 시스 잔류물(모든 SynDIG 단백질에서 발견)에서 팔미토화된다는 것을 입증했습니다. 한계는 ABE 분석이 절차의 마지막 단계로 아비딘 모에티에 공액 된 아가로즈 수지와의 친화정화가 필요하며, 이로 인해 정량적 분석이 복잡해지는 신호의 상당한 손실이 발생한다는 것입니다. 더욱이, ABE 분석은 단백질이 한 번 또는 다중 사이트에 손바닥에 박혀 있는지 구별할 수 없습니다.
여기서 우리는 APEGS8분석8,9,10,,,11,,12...

S-팔미토일화는 안정적인 막 연관성, 단백질 인신 매매 및 단백질-단백질 상호작용을 조절하는 표적 단백질의 가역적 번역 후변형1. 그것은 팔미토일 아실 트랜스퍼 라제 (PAT) 효소에 의해 촉매 티오 에스터 링키지를 통해 시스테인 잔기에 16 탄소 팔미테 모티의 추가를 포함한다. 뇌의 많은 시냅스 단백질은 AMPA-Rs 및 PSD-95를 포함하는, 안정성, 국소화 및 기능2,,3,,4를조절하는 활성 의존적 방식으로 팔미토틸화된다. PSD-95와 같은 시냅스 스캐폴드와 보조 요인의 상호 작용을 통해 PSD에 있는 시냅스 AMPARs의 수준에 있는 변경은 시냅스 가소성을 기초로 합니다; 따라서, 시냅스 단백질의 팔미토일화 상태를 결정하는 방법은 시냅스 가소성의 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공한다.
이전에는 AMPARs5와연관된 뇌 특이적 막 간 단백질을 코딩하는 4개의 유전자(SynDIG1-4)의 SynDIG 제품군을 확인했습니다. 해리된 랫트 해마 뉴런에서 SynDIG1의 과발현 또는 노크다운은 각각 면역세포화학 및전기생리학을사용하여 검출된 바와 같이, AMPA-R 시냅스 크기 및 수 ~50%에 의해 증가 또는 감소한다. 우리는 아실-비오틴 교환(ABE) 분석서를 활용하여 SynDIG1이 안정성, 국소화 및 기능을 조절하는 활성 의존적 방식으로 두 개의 보존된 병치-막간 시스 잔류물(모든 SynDIG 단백질에서 발견)에서 팔미토틸화된다는 것을 입증하였다6. ABE 분석은 변형 및 후속 친화성 정제에 의해 보호 시스테인에 비오틴의 교환에 의존7. 여기서, 우리는 혁신적인 생화학적 접근법, 아실-PEGyl 교환 겔 시프트(APEGS)8분석8,9,10,,11,,12,친화성 정제를 필요로 하지 않고 대신 겔 이동성의 변화를 활용하여 관심 있는 단백질에 대한 수정 횟수를 결정한다., 프로토콜은 적합한 항체가 유효한 마우스 두뇌에서 내인성 막 단백질의 조사를 위해 기술됩니다.

<table><tbody><tr><td>하이드록실아민(HAM)</td><td>ThermoFisher</td><td>26103</td><td></td></tr><tr><td>메톡시-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)</td><td>NOF</td><td>ME-050MA</td><td>MW ~5000 kDa</td></tr><tr><td>Microfuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>또는 동급 장비</td></tr><tr><td>N-에틸말레미드(NEM)</td><td>Calbiochem</td><td>34115</td><td>독성이 강합니다.</td></tr><tr><td>밀도 측정용 광학 이미저</td><td>Azure Biosystems</td><td>Sapphire Biomolecular Imager</td><td>또는 동급 장비</td></tr><tr><td>캡이 있는 폴리프로필렌 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-1D</td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫(유리)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-27D</td><td></td></tr><tr><td>탁상용 원심분리기</td><td>Beckman</td><td>Allegra X-15R</td><td>또는 동급 장비</td></tr><tr><td>트리스 (2- 카르 복시 에틸) 포스 핀 - 염산염 (TCEP)</td> <td>EMD 밀리 포어</td><td>580560</td><td></td></tr></tbody></table>

아실-pegyl 교환 젤 시프트 분석은 뇌막 단백질의 팔미토일화의 정량적 측정을 위한 것입니다.

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

시 냅 스 AMPA 수용 체의 수준에서 활동 의존 변경 (AMPARs) 후 층 내 밀도 (PSD) 학습 및 메모리에 대 한 세포 메커니즘을 나타내는 것으로 생각 된다. 팔미토일화는 AMPA-Rs, 보조 인자 및 시냅스 스캐폴드를 포함한 많은 시냅스 단백질의 국소화 및 기능을 활성 의존적 방식으로 조절합니다. 우리는 4개의 유전자의 시냅스 분화 유도한 유전자 (SynDIG1-4) AMPA와 연관되고 시냅스 강도를 통제하는 두뇌 특정 막 막 단백질을 인코딩하는 것을 확인했습니다. SynDIG1은 활성 의존적 흥분성 시냅스 개발에 중요한 병타-트랜스멤브레인 영역에서 위치하는 2개의 시스테인 잔기에서 191 및 192에 위치한다. 여기에서, 우리는 혁신적인 생화확적인 접근법, 아실-PEGyl 교환 젤 시프트(APEGS) 분석법을 기술하여, 관심 있는 단백질의 팔미토일화 상태를 조사하고 마우스 뇌 용해액에 있는 단백질의 SynDIG 제품군과 그 유용성을 입증한다.

관심 있는 단백질에 대하여 항체를 가진 면역 blotting은 HAM가 포함되지 않은 견본과 비교된 이동성 교대에 의해 결정된 마우스 두뇌에 있는 palmitoylated 상태 (비, singly, 이중 등)를 제시합니다. 이전에는 SynDIG1이 ABE 분석6을사용하여 두 사이트에서 팔미토틸화되었다는 것을 입증했습니다. 그러나, 우리는 두 사이트가 뇌 조직에서 수정되었는지 여부를 확인할 수 없습니다. 여기서 우리는 SynDIG1, SynDIG4/Prrt1 및 Prrt2가 마우스 뇌에서 팔미토화되어 있고 두 개의 잠재적인 팔미토일화 부위가 있다는 것을보여줍니다(그림 1). 흥미롭게도, 각 단백질은 비, 단리 및 이중 팔미토일화 단백질에 대한 신호에 기초하여 마우스 뇌에서 상이한 팔미토일화 상태를 가지고 있다. 블롯의 밀도 측정 분석은 손바닥에 절인 상태에 대한 정량적 정보를 ...

팔미토일화는 가역적인 방식으로 표적 단백질의 시스테인 잔류물까지 16탄소 팔미네이트 모이티의 혼입을 수반한다. 여기서, 우리는 생화학적 접근법, 아실-PEGyl 교환 겔 시프트(APEGS) 분석법을 설명하고, 마우스 뇌 용해액에 관심 있는 임의의 단백질의 팔미토일화 상태를 조사한다.

아실-PEGyl 교환 젤 시프트 분석은 뇌막 단백질의 팔미토일화의 정량적 측정을 위한 것입니다.

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

이러한 생화학적 방법은 적합한 항체가 가능한 뇌에서 발현되는 모든 멤브레인 단백질의 팔미토일화 상태를 판단할 수 있게 한다. 이 기술의 주요 장점은 친화성 정화를 필요로하지 않고 대신 관심있는 단백질의 수정 수를 결정하기 위해 젤 이동성의 변화를 활용한다는 것입니다. 뇌를 해부한 후, 얼음에 유리 균질화에 균질화 완충제의 10 밀리리터에서 즉시 균질화.약 12스트로크를 사용하여 1400회 G에서 15분 동안, 섭씨 4도에서 15분간 용해를 원심분리합니다. 얼음에 새로운 튜브에 상체를 전송합니다. 균일화 완충제의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.약 6개의 스트로크를 사용하여 균질화하십시오. 서스펜션은 710배, 섭씨 4도에서 10분간 분리합니다. 수퍼나티와 원심분리기를 40, 000배, 섭씨 4도에서 20분간 결합합니다.피펫 끝으로 펠릿을 분해하고 위아래로 파이펫을 하여 상체를 버리고 펠릿 막 분획을 균일화 버퍼에서 재연합니다. 단백질 수치를 양량화하기 위해 ABCA 분석기를 수행하십시오. APEGS 분석기를 수행하려면 버퍼 A 470 마이크로리터를 1.5 밀리리터 튜브에 넣고 약 100~200밀리그램의 단백질을 추가합니다.튜브를 초음파 처리한 다음 튜브를 섭씨 25도, 최소 13, 000배 G에서 10분 동안 원심분리하여 불용성 단백질을 분리합니다. 용해성 단백질을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 첫째, 55°C에서 60분 동안 TCEP의 25마이크로리터에서 용액화된 단백질을 배양하여 이황류 결합을 방해합니다.그런 다음, 실온에서 3시간 동안 NEM의 스톡 용액의 12.5 마이크로리터로 용액을 배양하여 무료 시스테인을 차단합니다. 다음으로, 클로로폼 메탄올 강수량 과정을 시작합니다. 1.5 밀리리터 튜브에서 적당한 속도로 스윙 버킷 로터에서 원심분리될 수 있는 폴리프로필렌 또는 유리 튜브로 단백질 용액을 전달합니다.메탄올과 소용돌이의 두 밀리리터를 간단히 넣습니다. 클로로폼과 소용돌이 1밀리리터를 짧게 넣습니다. 그런 다음 1.5 밀리리터의 탈온된 물과 소용돌이를 다시 간략하게 추가합니다.필요한 경우 튜브를 뒤집어 철저한 혼합을 보장합니다. 시료를 G 3000배, 섭씨 25도에서 30분간 스윙 버킷 로터에서 원심분리합니다. 조심스럽게 제거하고 튜브에서 용액의 상층을 폐기.메탄올 1.5 밀리리터를 추가합니다. 튜브의 부드러운 반전으로 부드럽고 철저하게 섞어 불투명한 단백질 팬케이크를 조각하지 않도록 주의하십시오. 원심 분리는 스윙 버킷 로터에서 10 분 동안 3000 배 G 및 섭씨 25도에서 샘플을 원심 분리합니다.유리 세로지 피펫을 사용하여 단백질 팬케이크를 방해하지 않고 가능한 한 많은 용액을 제거하십시오. 펠릿을 메탄올 1밀리리터로 조심스럽게 헹구고 10분 이상 건조시키세요. 클로로폼 메탄올 침전이 완료되면, 완충 A.Transfer의 125 마이크로리터에서 단백질 침전을 재중단하여 팔미토일 티오에스테르 연계의 분열을 시작한다.튜브를 간략하게 초음파 처리한 다음 13, 000배 G 이상, 섭씨 25도에서 10분간 원심분리하여 불용성 물질을 제거합니다. 용액화된 단백질을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 375마이크로리터의 완충 H 또는 버퍼 T.를 실온에서 60분 동안 배양한 후 클로로폼 메탄올 침전을 반복한다. 보호되지 않은 시스테인에 m-PEG를 추가하려면 10mil 이상을 포함하는 완충A의 100 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단하여 시작합니다.그런 다음 서스펜션을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 스톡 m-PEG 5K 용액 25마이크로리터를 추가하고 파이펫팅으로 섞습니다. 끝 회전을 통해 끝과 실온에서 배양.60분 간 인큐베이션을 한 후 클로로폼 메탄올 강수량을 다시 수행하여 통합되지 않은 m-PEG 5K를 제거합니다. 원심분리기는 13배, 000배, 섭씨 25도를 10분 이상 입니다. 두껍고 부풀어 있는 팬케이크를 피하면서 이전과 같이 상판을 조심스럽게 제거하십시오.메탄올 1밀리리터를 넣고 부드럽고 철저하게 섞습니다. 원심분리기는 13배, 000배, 섭씨 25도를 10분 이상 입니다. 상체를 조심스럽게 제거하고 메탄올 1 밀리리터로 펠릿을 헹구십시오.다시 말하지만, 원심분리기는 13배, 000배, 섭씨 25도를 10분 동안 초과합니다. 펠릿을 공기 건조 후, TCEP 또는 환원 제없이 완충 A의 50 마이크로 리터로 다시 중단. BCA 단백질 수량에 대한 용액 의 5 마이크로 리터를 예약하십시오.수량 후 적량의 4배 Laemmli 샘플 버퍼를 추가합니다. 샘플을 SDS 페이지 젤에 로드합니다. 서부 블로팅에 표준 분리 전송 및 감지 프로토콜을 사용합니다.SynDIG 단백질의 팔미토일화 상태를 조사하기 위해 균질화된 마우스 뇌에서 P2 멤브레인 분획은 APEGS 분석기를 실시하였다. 항체와의 분리 및 프로빙은 SynDIG1, SynDIG4 Prrt1 및 Prrt2가 마우스 뇌에서 팔미토이트된다는 것을 입증했습니다. 클로로폼 메탄올 침전의 목적은 NEM과 같은 하나의 화학 물질을 방지하여 프로토콜의 다음 단계를 방해하는 것입니다.적절한 클로로폼 메탄올 강수량은 단백질 손실을 최소화하면서 바람직하지 않은 화학 물질을 제거합니다. 이 방법은 팔미토일화의 공간 측두체 규정을 조사하기 위해 다른 연령대의 마우스 또는 다른 뇌 영역에서 뇌 용액에 적용 할 수 있습니다.

acyl-pegyl-exchange-gel-shift-assay-for-quantitative-determination

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

규제 endocytosis는 막 단백질의 대부분의 세포 표면 발현 수준을 관리합니다. 여기서 우리는 도파민 전송 (DAT), polytopic 멤브레인 단백질의 endocytic 속도를 측정하는 줄이할 수있는, 멤브레인 impermeant biotinylation의 시약을 사용합니다. 방법은 대부분의 플라즈마 막 단백질의 endocytic 속도를 측정하는 직접적인 접근을 용이하게합니다.

가역 Biotinylation에 의해 플라즈마 막 단백질 Endocytic 요금 측정

이 비디오는 마우스 뇌 조직에서 분리된 세포막 단백질의 팔미토일화 상태 분석을 보여줍니다. 이 과정에는 비팔미토일화 시스테인을 노출시키고 차단한 다음 팔미토일화 시스테인에 결합하는 폴리머를 사용하여 분리된 단백질의 팔미토일화 상태를 평가하는 데 도움이 됩니다.

마우스 뇌 조직에서 세포막 단백질의 팔미토일화 상태 평가

단백질 palmitate의 치료뿐만 아니라이 세포 내 단백질 인신 매매의 중요한 조절기입니다. 이것은 많은 시냅스 단백질이 palmitoylated 아르 뉴런에 특별한 관심입니다. 우리는 여러 세포 유형과 조직에 적용 할 수 있습니다 교양 뉴런에 palmitoylated 단백질을 감지하는 간단한 생화학 방법을 사용합니다.

Immunoprecipitation 및 아실-비오틴 거래소 (아베)에 의한 양식 Hippocampal 뉴런의 단백질 Palmitoylation의 감지

신경 세포막 매매 동적 세포막 단백질 가능 크게 영향 신경 전달을 제어한다. 지금까지, 그것은 성인의 신경 세포에서 신경 세포 내 이입 매매를 측정하기 위해 도전하고 있습니다. 여기, 우리는 급성 뇌 조각의 표면 단백질 발현 생체의 급격한 변화를 측정 할 수있는 매우 효과적인, 양적 방법을 설명합니다.

뇌 슬라이스 바이오 티 닐화 :<em&gt; 전의 VIVO</em성인 뉴런에서 지역 고유의 플라즈마 막 단백질 인신 매매를 측정하는&gt; 접근

인간과 쥐의 뇌 조직을위한 요소 / 티오 / SDS 버퍼를 사용하는 일반적인 단백질 추출 프로토콜은 허용 2D-DIGE 미니 2DE의 면역 블롯에 의해 그들의 연속 특성에 의한 단백질의 indentification. 이 방법은 인간의 조직 검사 및 실험 모델에서 더 많은 재현성 및 신뢰성있는 결과를 얻기 위해 하나를 할 수 있습니다.

합의 뇌 유래 단백질, 2D-DIGE 미니 2DE 면역 블롯을 모두 사용하여 인간과 쥐과 뇌 프로테옴 연구를 위해 추출 프로토콜

아실-RAC(Acyl-Resin Assisted Capture)는 다양한 생물학적 샘플에서 시스테인 잔류물(S-acylation)의 가역적 지질 변형을 검출하는 매우 민감하고 신뢰할 수 있으며 수행하기 쉬운 방법입니다.

아실-레신 보조 포획을 이용한 단백질 S-아실레이션 검출

여기에 제시된 것은 클릭 화학을 통해 디아실글리세릴 펩타이드와 알킨-인지질을 기질로 사용하여 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제 활성을 모니터링하기 위한 민감한 형광 분석입니다.

효소 특성화에서 고처리량 스크리닝까지 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제에 대한 클릭 화학 기반 형광 분석

지방 아실화에 대한 연구는 세포 단백질 상호 작용 및 질병에 중요한 영향을 미칩니다. 여기에 제시된 것은 지방 아실화 단백질의 클릭 화학 검출을 개선하기위한 변형 된 프로토콜이며, 이는 다양한 세포 유형에 적용될 수 있으며 펄스 체이스 및 질량 분광법을 포함한 다른 분석과 결합 될 수 있습니다.

클릭 화학을 이용한 지방 아실화 단백질의 검출을 위한 알키닐 지방산 유사체의 최적화된 혼입

여기서, 우리는 단백질 추출물과 트랜스포파디딜리노시톨 4-인산염이 체외에서인산염을 배출하는지 여부를 결정하기 위해 형광 지질 센서와 리포좀을 사용하는 프로토콜을 설명합니다.

형광 기반 측정 인스파디딜세린/포스파디딜리노시톨 4-인산염 교환 막 간

우리는 원형질막의 지질과 외인성 지질 사이의 교환을 매개하기 위해 시클로덱스트린을 사용하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 지질 뗏목과 같은 환경에서 뗏목과 같은 환경이 아닌 뗏목과 같은 환경에서 다르게 행동하는 막관통 단백질을 연구하는 실험과 쌍을 이룰 수 있습니다.

살아있는 세포의 지질 교환 분석

본 연구는 GFAP와 그 병을 유발하는 돌연변이를 생화학적으로 특성화하기 위한 실험적 방법을 개략적으로 제시하며, 필라멘트 조립, 응집, 번역 후 변형에 중점을 둡니다. 고순도 GFAP 단백질을 분석하여 알렉산더병 기전에 대한 통찰을 밝혀내어 잠재적 치료 표적 연구와 GFAP 돌연변이 및 관련 질환 이해에 대한 틀을 제공하였습니다.

교세포섬유산성 단백질 및 그 질병 관련 변이체의 생화학적 분석에 대한 실험적 접근법

배우세요 뇌 조직에서 막 단백질의 팔미토일화 상태를 정량 분석하는 APEGS 분석법을 사용하는 방법을. 친화성 정제 없이 겔 이동도 변화를 활용하여 신경과학 연구에 필수적인 단백질 수정을 효율적으로 측정합니다.

아실-PEGyl 교환 젤 시프트 분석은 뇌막 단백질의 팔미토일화의 정량적 측정을 위한 것입니다.

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