시분큘러스 누두스 Coelomic 유체에 대한 시투 혼성화

시상 혼성화는 조직에 있는 특정 유전자의 mRNA 및 IncRNA 발현 패턴을 제시하는 아주 유익한 기술입니다. 이 문서에서 우리의 목적은 중요한 어업 자원인 시펀큘러스 나체의 동체 유체에서 특정 mRNA 국소화를 검출하는 민감한 방법을 개발하는 것입니다. 우리는이 방법을 사용하여 성공적인 실험에서 얻은 대표적인 결과를 제시했습니다.

그것은 우리의 방법은 coelomic 액체에 있는 특정 mRNA 및 IncRNA의 발현 패턴을 확인하기 위한 그밖 Sipuncula 종에 적용될 것이라는 점을 희망합니다. 해부 테이블에 시펀큘러스 나체를 수정합니다. 작은 오토클레이브 가위로 시펀큘러스 나체의 몸을 엽니다.

그런 다음 파이펫으로 코로믹 유체를 폴리-D-리신 처리 현미경 슬라이드로 수집하고 전달하여 약간 퍼집니다. 37도에서 슬라이드를 1시간 동안 공기 건조시합니다. 부드러운 동요로 세척당 3회, 5분간 DEPC-PBS로 슬라이드를 씻으십시오.

PBS를 배출하고, 실온에서 5분 동안 슬라이드에 단백질제 K 용액을 추가합니다. 단백질Ae K 용액을 배출합니다. 실온에서 20분 동안 슬라이드에 PFA 솔루션을 추가합니다.

PFA 솔루션을 배출합니다. 부드러운 동요로 세척당 3회, 5분간 DEPC-PBS로 슬라이드를 씻으십시오. PBS를 빼내십시오.

50 마이크로리터 리보프로브를 추가합니다. 커버슬립을 추가합니다. 젖은 상자에 슬라이드를 넣고 파라핀 필름으로 잘 밀봉하십시오.

섭씨 60도에서 하룻밤을 혼성화하십시오. 슬라이드를 세척 버퍼에 담그고 커버슬립이 자동으로 미끄러질 때까지 놓습니다. 예열된 세척 버퍼로 슬라이드를 섭씨 65도에서 2회, 부드러운 교반으로 세척당 30분 간 세척합니다.

예열된 SSC 용액으로 슬라이드를 섭씨 65도에서 2회, 부드러운 교반으로 세척당 30분 간 세척합니다. 실온에서 두 번 MABT 솔루션으로 슬라이드를 세척하십시오. 부드러운 동요로 세척당 30 분.

MABT를 빼내십시오. 차단 버퍼를 추가합니다. 실온에서 슬라이드를 3~4시간 동안 배양합니다.

차단 버퍼를 빼내십시오. 항체를 추가하고 밤새 섭씨 4도에서 슬라이드를 배양합니다. 항체 용액을 배출합니다.

부드러운 동요로 세척당 4회, 25분 간 MABT 용액으로 슬라이드를 씻으십시오. MABT를 빼내십시오. 알칼리성 인산염 버퍼를 인큐베이션당 5분 동안 3회 추가합니다.

알칼리성 인산염 버퍼를 제거합니다. BCIP-NBT 염색 솔루션을 추가합니다. 슬라이드를 어둠 속에서 유지합니다.

염색 시간은 신호 강도에 따라 달라지는 야간에도 분에서 몇 시간으로 다양합니다. 염색 상태는 염색의 시작 부분에서 더 자주 확인해야 합니다. 예를 들어, 몇 분 간격으로, 그리고 스테인링의 최신 시간.

검사 시간은 빛에 노출되어 높은 배경 신호를 도입하지 않도록 하는 것만큼 짧아야 합니다. 시투 혼성화의 대표적인 신호가 표시됩니다. dmrt1을 표적으로 하는 안티센스 리보프로브를 가진 시툰큘러스 나체 동체 유체의 시투 혼성화에서 정자의 트로포블라스트 세포에 농축된 보라색 염색을 나타내고, 도 2A 및 B.센스 리보프로브는 혼성화 신호, 도2C를 검출하지 못했다.

이 비디오를 시청한 후에는 시펀큘러스 나체의 동체 액에서 표적 mRNA 또는 IncRNA의 발현 패턴을 시각화하는 방법에 대해 매우 잘 이해할 수 있습니다.