Name: 자유롭게 움직이는 마우스에 있는 행동을 조절하기 위하여 신경 활동의 광유전학 조작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: 학습하세요 광유전학을 이용하여 자유롭게 움직이는 마우스의 특정 신경 세포를 정밀하게 조작하고 행동을 변화시키는 방법을. 이 기술은 신경 회로 연구와 행동 신경과학에 필수적인 도구입니다.

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클라우스-아르만 나르브 교수와 산드라 괴벨스 박사(막스 플랑크-실험 의학 연구소, 괴팅겐, 독일)에게 감사드리며 넥스-크레마우스를 친절하게 제공합니다. 또한, 이 기사에 대한 JoVE 비디오의 녹화 및 처리에 대한 비디오 팀 유누스 디키치와 루벤 비스너에게 감사드립니다. 또한, 크리스틴 클라우센이 보이스오버를 한 것에 대해 큰 감사를 표하고 킴벌리 앤고는 원고를 교정해 주셔서 감사합니다.
제시된 결과는 보훔의 루르 대학교에서 입수되었으며 비디오는 브레멘 대학교에서 녹화되었습니다.
이 작품은 도이치 포르충스게마인샤프트(DFG, 독일 연구재단)-프로제크트넘머 122679504 - SFB 874 및 DFG MA 4692/3-2에 의해 지원되었다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

신경 신호를 조작 하기 위해 빛을 사용 하 여 지금 거의 10 년 동안 선택의 방법 되었습니다. 2005년 이후, 새로운 광유전학 적,도구,,,4,6,8,814,49,,50, 51 및 이러한 도구가 뇌 회로21, 23,,,50,40,,43,52,높게 증가한 뇌 회로를 조사하는 데 사용되는 연구 결과에 대한 출판 된 기사의 수가 매우 증가했습니다.43 한편으로는 주 사용 가능한 광유전학 도구, 이식 변형, 형질전환 마우스 라인 및 행동 실험의 엄청난 다양성으로 실험 가능성은 다양하고 무제한입니다. 다른 한편으로는, 실험 조건을 선택에 있는 결함을 만드는 가능성은 아주 높고 실험은 너무 구체적입니다, 수시로 그밖 연구 결과와 비교하기 어렵습니다.
중요한 단계 이 프로토콜의 중요한 한 가지 중요한 단계는 적절한 계획입니다. 광유전학 적 도구의 선택은 과학적 질문과 일치해야합니다. 뉴런이나 시냅스의 전반적인 활동을 조작하는 것만 필요합니까? 그런 다음 상업적으로 ChR221,,25, 27,및 아치37과 같은 도구를 제공하는 것이 좋습니다.37 그러나 그 외에도 하나의 특수 신경 전달 물질 시스템 또는 단일 수용체를 조작해야하는 경우 개별 수용체 키메라는 종종 더 나은 선택3,,6. GPCR을 가진 몇몇 수용체 키메라, 소위 Opto-XRs 및 그(것)들을 생성하는 지침은 이미4유효4,50입니다. 광유전학 적 도구의 선택 이외에, 행동 실험과 함께 마우스 라인도 중요합니다. C57Bl/6 및 BALB/cByJ와 같은 다른 배경 균주는 어떤 면에서 다른 행동 표현형을표시53,,54. C57Bl/6 마우스는 낮은 기준선 불안을 가지고 있고 완화성 조작에 사용될 수 있는 반면, BALB/cByJ는 더 높은 불안 수준을 보이고 따라서 완화제에 더 민감합니다. 또한, 이러한 배경 균주의 형질 변형은 또한 자신의 표현형(48)에서다를 수 있습니다. 광유전학 공구 및 형질전환 마우스 선과 더불어 특정 프로모터의 적당한 조합으로, 거의 모든 원하는 세포 인구는 표적으로 할 수 있습니다.
수술 중 중요한 단계는 올바른 위치를 대상으로하는 것입니다. 마우스 뇌 아틀라스의 도움으로 전방 후방 축및 내측 축및 구조의 깊이에 대한 적절한 좌표가45를확립할 수 있다. 현실에서, 모든 두개골은 약간 다른 형태와 크기를 가지고있다. 따라서, 입체 좌표를 조정하는F-factor(46)는 입체 수술 중 코와 귀 고정이 올바른 것과 마찬가지로 매우 중요하다. 마우스의 머리가 기울어지면, 사출 카눌라가 원하는 관심 영역을 대상으로 하지 못합니다.
또한, 사출 카누의 직경도 중요합니다. 너무 작으면 조직이 너무 넓으면 카눌라가 관심 지역으로 가는 길에 바이러스 용액을 누출할 수 없습니다. 이식된 광섬유가 표적 영역 바로 위에 종료되면 위의 피질 영역에서의 바이러스 발현은 중요하지 않습니다. 그러나 임플란트가 축삭 단자자극을 다른 부위 위에 배치하면 상부 피질 영역의 축삭도 빛에 의해 활성화되고 얻어진 데이터를 위조한다. 예를 들어: IL 영역과 전두엽(PrL) 영역은 모두 기저편도체(55)56, 56으로 진행되지만불안(26),57의변조에 완전히 다른 기능과 역할을 가지고 있다., 임플란트가 IL 영역에서 축축단을 활성화하기 위해 편도체 위에 배치되고 주사 바이러스 용액이 잘못된 주입 카눌라로 인해 PrL에 배치된 경우 PrL에서 축축 단자가 활성화될 위험이 매우 높다.
임플란트의 고정을 위해 두개골을 준비하는 동안, 프라이머와 결합의 희소한 사용은 안정적이고 내구성있는 고정에 매우 중요합니다. 2성분 접착 시스템이 얇게 적용되지 않으면 치과 시멘트가 며칠 또는 몇 주 후에 두개골에서 분리될 수 있습니다. 또한, 두개골은 그렇지 않으면 시멘트가 두개골에 제대로 부착되지 않기 때문에 임플란트를 고정하기 전에 완전히 건조해야합니다.
중요한 단계는 이 프로토콜의 동작 부분에도 존재합니다. 첫째, 미로의 건설은 매우 중요합니다. 모든 행동 설정에서, 몇몇 변종은 크기와 양식에 관하여 문헌에 존재할 뿐만 아니라 절차 자체58,,59,,60에대해 존재한다. 데이터를 비교하고 재현할 수 있도록 하는 변형을 선택하는 것이 중요합니다. 또한, 활용 마우스 라인에 대한 특별한 요구 사항은고려43,,48. EPM에 대한 대표적인 데이터에서 몇몇 넥스-Cre 마우스가 미로에서 떨어졌거나 여러 번 미끄러졌다는 것을 알 수있다(도 2b). 이 마우스를 위해, 열린 팔 주위에 작은 벽이 있는 미로는 더 나은 대안이었을 것입니다.
둘째, 모든 외부 실 조건을일정하게유지하는 것이 중요하며, 그렇지 않으면 다른 마우스 그룹은 전혀 비교할 수 없을 것이다. 이와 관련하여 실험 용 설정이 비어 있고 실험자가 항상 존재하는 것으로 실험 시간을 선택하는 것이 매우 중요합니다. 또한, 수집된 데이터와의 간섭을 피하기 위해 시공 작업, 시스템(화재 경보) 또는 마우스 시설의 청소일과 같은 건물의 사건을 고려해야 합니다.
마지막으로, 처리 및 주거 조건은 행동 실험에 매우 중요합니다. 이식이 수행될 때, 마우스는 그밖 마우스에서 상해의 리스크 때문에 단 하나 수용될 필요가 있습니다. 그룹 간의 비교도가 좋고 한 그룹 내에서 낮은 오류를 보장하기 위해 모든 마우스는 동일한 케이지 크기와 보강이 필요합니다. 불안 관련 실험에 대 한, 단일 하우징 은 singe 집 수 컷 쥐 낮은 기준선 불안 수준을 보여 으로 몇 가지 장점이 있다, 그들의 불안 수준에 적은 변화, 덜 우울 같은 증상15,,16. 그룹 수용 남성 마우스 쥐 쥐 중 계층 구조 때문에 그들의 불안 수준에서 강하게 다를 수 있습니다. 하우징 외에도 모든 마우스와 그룹의 상수 및 동등한 취급도 중요합니다. 임플란트의 광섬유를 연결하기 위해 마우스를 잡는 것은 매우 스트레스가 됩니다. 따라서 이 절차는 동일한 기술과 동일한 실험자가 의미하는 모든 마우스에 대해 동일해야 합니다. 또한, 스트레스가 많은 연결 절차에서 마우스를 진정시키기위한 대기 케이지의 습관 시간은 미로에 지속 시간, 쓰레기 및 위치의 동일한 조건이 필요합니다. 마우스 시설 내의 처리는 이후 행동 성능에도 중요합니다. 실험 및 제어 동물은 다른 일 또는 다른 사람들에 의해 청소 해서는 안, 이것은 또한 쥐에 대 한 스트레스. 또한, 청소 일은 행동의 차이를 피하기 위해 실험적인 날이 되어서는 안됩니다.
문제 해결 프로토콜 중에 발생할 수 있는 몇 가지 문제가 있습니다. 예를 들어, 스테레오테틱 수술 중 두개골 전체를 드릴링하면 혈관이 손상될 수 있습니다. 일반적으로, 강한 출혈이 발생, 특히 bregma와 람다 위에. 이 경우, 그들은 그들의 흡수성 때문에 용기에서 더 많은 출혈을 확장 하는 경향이 면 스틱으로 출혈을 중지 하려고 하지 마십시오, 대신, NaCl와 직접 헹구는.
또한 바이러스 용액의 압력 주입이 작동하지 않는 것을 발생할 수 있습니다. 이 경우, 버 구멍이나 뇌 조직에서 딱지 인 파라 필름이 카눌라의 끝을 막고있을 수 있습니다. 이 경우 x 축 또는 y축을 변경하지 않고 뇌에서 천천히 카누를 제거하고 트위저를 사용하여 카눌라 팁의 앞부분의 1-2mm를 제거합니다. 카누라를 다시 낮추기 전에 소량의 압력을 가하여 바이러스가 카눌라 팁에서 나오는지 확인하여 기능을 테스트합니다. 변비를 피하기 위해, 일정한 속도로 카누라를 낮추고 주입 측의 깊이에 도달 할 때까지 움직임을 중지하지 않습니다. 카눌라 팁의 너무 많은 제거 하 고 직경이 너무 큰 경우, 카눌라 조직을 손상 하 고 한 번에 바이러스를 적용의 위험이 증가 될 것 이다. 따라서 팁의 막힌 부분만 신중하게 제거되었는지 확인합니다.
행동 실험 중에 비디오 추적 소프트웨어(예: Ethovision XT)에서 실험을 설정하면 문제가 발생할 수 있습니다. 예를 들어 광 출력이 제대로 작동하지 않으면 여러 가지 이유로 인해 이 때문일 수 있습니다. 펄스는 Ethovision XT가 열리기 전에 열고 프로그래밍하고 시작해야 합니다. 하드웨어는 "실험 설정"(단계 3.2.2.4)에서 올바르게 선택해야 합니다. 잘못된 IO-Box 또는 "의상 하드웨어"이외의 다른 항목이 선택된 경우 Pulser 장치는 Ethovision에서 제어할 수 없습니다. 라이트 출력 테스트가 성공했지만 "평가판 제어 설정"의 프로그래밍된 라이트 프로토콜이 획득 하는 동안 작동하지 않는 경우 하위 규칙 또는 하위 규칙 참조가 잘못 위치하거나 조건 및 작업이 명확하지 않을 수 있습니다. 예를 들어 참조가 올바른 하위 규칙에 속하는가? 참조가 올바르게 프로그래밍되었습니까(예: 하위 규칙이 실행되는 빈도)?
또한 "탐지 설정"중에 동물이 적절하게 추적될 수 있지만 수집 중에 피사체가 발견되지 않는 샘플이 있습니다. 이 경우 실험실의 조명이 변경되었는지 또는 미로 내에서 원치 않는 그림자가 생성되었는지 확인하십시오. 미로의 전체 하단은 하나의 특정 조합에 대해서만 작동하므로 동일한 색상을 가져야 합니다. 다른 바닥 색상이나 그림자를 피할 수 없는 경우 미로의 가장 어두운 부분에서 감지 설정을 정의합니다.
첫 번째 동물을 수집한 후 설정을 변경하려면 이미 사용된 설정에 이러한 변경 내용을 적용하지 마십시오. 그들을 복제하여 조정합니다. 이는 이미 기록된 평가판이 데이터 분석을 위해 더 이상 유효하지 않다는 것을 의미합니다. 이러한 경우 이 실험 그룹에 대한 모든 동물을 원래 설정으로 기록하고, 나중에 녹화된 비디오가 실시간 추적 대신 분석되는 새로운 실험을 만듭니다. 이 "비디오에서" 실험에서는 동물이나 데이터 간의 비교도를 잃지 않고 분석에 여러 설정을 사용할 수 있습니다.
제한 사항 및 향후 응용 프로그램 자유롭게 움직이는 동물에 있는 광유전학으로 행동을 조작하는 이 방법은 또한 한계를 포함합니다. 수술 중에는 두 임플란트의 근접이 제한됩니다. 이중 이식의 경우, 두 임플란트 사이의 거리는 임플란트를 보유하기 위한 장치의 폭이어야 한다. 장치는 첫 번째 임플란트가 이미 고정되어있는 동안 두 번째 임플란트를 버 구멍으로 낮출 필요가 있습니다. 이를 위한 해결책은 유리 섬유의 끝이 매우 가까우며 두개골 위의 세라믹 ferules는,23,55,,56,57,,62,,63의거리가 더 큽니까., 각진 이식의 단점은 빛이 퍼지는 것입니다. 섬유 팁이 바로 위에서 비스듬히 기울어지면 자극 영역이 다릅니다. 근접한 두 대상 영역의 경우 빛 자극의 변경된 위치를 고려해야 합니다.
행동 실험 중에 미로의 시공이 동물에 연결된 광 케이블을 방해할 수 있습니다. 밝은 어두운 상자와 같은 일부 행동 테스트에는 실내 영역64,65및기타 미로에는 마우스가 입력해야 하는 구획이 포함되어 있습니다. 이러한 실험은 이 설정으로 수행할 수 없습니다. 또는 무선 시스템이 옵션22,,26,,66이될 수 있습니다. 그러나 다행히 반스 미로와 같은 일부 미로는 마우스가 관련구획(67)에들어갈 수 있도록 이러한 방식으로 배열될 수 있다.
닫힌 구역이있는 것 외에도 너무 넓은 미로도 문제가 발생할 수 있습니다. 미로 영역이 클수록 케이블이 길어질수록 동물이 미로의 모든 위치로 이동하도록 허용해야 합니다. 동물이 케이블을 밟거나 잡아 서 그것을 물린 수 없습니다 주의 해야 합니다. 이에 대한 해결책은 중복 케이블을 롤업하는 구성일 수 있습니다. 단점은 케이블을 풀기 위해 드래그가 마우스에 대해 어렵다는 것입니다. 이 해결책은 쥐에게 더 적합할 것입니다. 또 다른 가능한 옵션은 실험 중에 아니라 사전에 빛 자극을 수행하는 것이 가능할 수 있으며, 물론 빛 자극으로 인한 장기적인 효과가23으로인해 발생할 경우에만 가능합니다.
기존/대체 메서드와 비교 대체 방법은 동작8,,18동안 화학적 또는 전기 자극이 될 것이다. 화학 작용제 또는 길항제는 특정 수용체를 통해 뉴런을 활성화하거나 침묵시킬 수 있으며 단일 신경 전달 물질 시스템38,,68을조작할 수도 있다. 한편으로는, 수용체 특이성은 화학물질에 대해 매우 높다, 특정 고뇌주의자 또는 길항제만 특정 수용체를 활성화하기 때문에(39). 한편, 동일한 신경전달물질 그룹의 수용체 특수형에 대한 특이성은 종종 불충분하다. 대부분의 화학 물질은 서로 다른 확률69를가진 적어도 두 개의 하위 유형에 결합합니다. 추가적으로, 화학 물질은 같은 수용 체 유형을 소유 하는 한 신경 세포 유형 사이 구별할 수 없습니다. 이 외에도, 시간적 및 공간 적 해상도는 광유전학에 비해 화학 적 조작에 대한 가난한. 작용제 또는 길항제는 종종 구두로투여35 또는 전신 주사를 통해57,,70. 화학 물질의 주입이 뇌 조직에서 직접 수행되는 경우, 효과는 구강 응용 프로그램보다 빠르게 나타납니다, 하지만 여전히 가벼운 자극보다 느린 기간에. 투여 된 화학 물질은 뇌에서 확산되고 신경 유형 이나 뇌 영역에 특이 하지 않은, 특정 뇌 회로의 조작 은 불가능.
전기 자극은 화학 자극9,,14보다더 높은 측두성 분해능을 가지게 한다. 신경 조직 내의 확산은 화학 자극보다 적으며 공간 해상도는 화학 자극보다 낫습니다. 그러나, 전기 자극은 전극에 근접한 모든 뉴런이 전기 자극에 반응하기 때문에 다른 뉴런 세포 유형 또는 수용체 유형을 구체적으로 해결할 가능성이 부족하다.
마우스를 자유롭게 움직이는 마우스의 행동에 대한 대체 방법은 예를 들어 뇌 슬라이스의 전기 생리학적 기록이며, 여기서 단일 뉴런 또는 축축은 광유전학으로 변조될 수 있고 유도된 효과는 전극6,,71을기록하여 측정될 수 있다. 시험관 내 실험은 광유전학 자극의 분자 및 세포 기초를 조사할 가능성을 제공하지만 다른 뇌 영역의 본질적인 연결성 및 입력이 누락되는 한계가 있습니다. 또 다른 옵션은 다광 화상 진찰1,,72와함께 광유전학을 사용하는 것입니다. 이 경우 마우스는 머리를 고정하고 마취하거나 간단한 작업을 해결하기 위해 깨어있을 수 있습니다.
성공적인 광유전학 실험을 수행하기 위해, 도구와 응용 프로그램의 넓은 범위는 요즘 사용할 수 있습니다. 광유전학 적 도구의 선택과 행동 설정은 특정 연구 질문에 대답하는 데 중요합니다. 도구와 실험의 올바른 조합을 선택하면 광유전학은 높은 시간적 및 공간 해상도를 가진 신경 회로에 대한 전례없는 심층조사를 허용합니다. 이것은 정신과 질병 및 인식에 대한 새로운 치료 전략을 이해하고 개발하는 데 도움이 될 것입니다.

중추 신경계의 신경 회로와 행동 결과의 변조는 뇌가 어떻게 작동하는지 이해하는 데 중요합니다, 특히 정신 질환과 학습 및 기억과 같은 인지 작업. 광유전학을 사용하면 단일 세포 또는 전체 회로까지의 세포 집단이 빛에 의해 변조 될 수 있습니다. Channelrhodopsin2 (ChR2) 또는 Archaerhodopsin (아치)와 같은 일반적인 광유전학 적 도구는 뉴런을 활성화하거나 침묵시킬 수 있으며, 또는 뚜렷한 뇌영역으로투사되는 축산 단자에서 송신기 방출을 증가 또는 억제 할 수 있습니다1,2,,3,,4. 그러나, 아치는 사전 시냅스 단자에서의 활성화가 자발적인 송신기 릴리즈5를증가시킨다는 것을 보여주었기 때문에 신중하게 사용되어야 한다. 아치는 셀 내부의 pH 값을 변경하는 바깥쪽 정류 양성자 펌프입니다. 이 알칼리성 밀리유는 칼슘 유입을 유도하고 송신기 방출을 향상시킵니다5. 세포내 신호 경로를 구체적으로 조절하기 위해, 류독신 이나 콘 옵신과 같은 가벼운 활성성 광유전학 적 도구로 구성된 수용체 키메라가 적절한 G 단백질 결합 수용체와 함께6,,7,,8을생성할 수 있다. 사용 가능한 광유전학 공구의 양 그리고 변이는 지난 10년간9일도중 현저하게 증가했습니다.
광유전학의 목적은 행동 도중 신경 회로를 조작하는 것입니다. 광유전학은, 예를 들면, 불안 행동에 있는 변경과 같은 심각한 행동 변경의 측정을 가능하게 합니다. 광유전학 적 도구는 바이러스 벡터를 통해 뇌의 표적 영역으로 전달됩니다. 특수 발기인 및 증강제, 또는 Cre-loxP 시스템의 도움으로 세포 유형 특이성은 광유전학 적 도구(도 1A)의발현을 보장 할 수 있습니다. 특정 세포 유형에서만 효소 Cre-Recombinase를 표현하는 몇몇 유전자 변형 마우스 라인이 있습니다. 예를 들어, 넥스-크레 마우스는넥스-프로모터(10)의제어하에 피질과 해마의 피라미드 뉴런에서 Cre-Recombinase를 발현한다. 이 효소는 loxP측(11)에의해 좌우되는 DNA 서열을 반전시킬 수 있다. 따라서, loxP 측에 의해 반전되고 측면이 있는 이중 플록스 광유전학 적 도구의 DNA 서열은 Cre-Recombinasase를소유하는 뉴런에 의해서만 전사될 수 있지만 다른 뉴런유형(12,,13)에의해서만 전사될 수 있다. 넥스-크레마우스의 경우, 광유전학 적 도구는 피라미드 뉴런에서만 발현될 것이다. 특정 뇌 영역의 빛 자극은 관심 영역 바로 위에 광섬유의 만성 이식을 통해 달성된다. 그런 다음 동물은 적절한 광원에 결합하고 거의 모든 종류의 행동 테스트에서 자유롭게 행동 할 수 있습니다.
<img alt="광유전학 다이어그램: Cre-Recombinase, 바이러스 주입 및 광섬유 설정을 사용한 유전자 편집." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1: 사출 및 이식. A) ChR2-YFP용 Cre-loxP 시스템. 이중 플록스 광유전학 도구는 뇌 조직에 주입을 위한 아데노 관련 바이러스(AAV)에 포장됩니다. B)mPFC의 IL 영역 내/위에 광학 뉴런 인터페이스의 바이러스 주입 및 이식의 적발보기. 주사와 이식은 위에서 수행되었다. 관심의 모든 영역, IL, BLA 및 DRN, 표시됩니다. C)이식된 광섬유, 슬리브 및 광원의 상세한 보기. D)200 μm 광 섬유 (Yizhar et al. 2011)에서 회색 물질 뇌 조직에서 파란색과 빨간색 레이저 빛 자극의 확산. 청색광은 최대 0.5mm의 티슈로 확산되어 붉은 빛이 약 1mm 나아갑니다. 색상 코딩: 빨간색 50%, 노란색 10%, 녹색 5%, 파란색 1% 빛이 이 영역에 도달하면. E)200 μm 광섬유를 가진 좌측 IL 바로 위에 일방적 이식의 관상적 시각. IL 영역의 폭은 각 반구에 0.25mm이고 깊이는 0.2 mm입니다. 파란색과 빨간색 전구는 5% 광 확산의 보더이며 Yizhar 등에서 올바른 크기로 전송됩니다. LoxP: X 오버 P1의 궤적; ChR2: 채널로독신; YFP: 황색 형광 단백질; dflox: 이중 플로스; IL: 인프라 피질; BLA: 바소포탈 편도체; DRN: 등쪽 라페 핵; PrL: 전두엽 지역. 이 수치는 Berg 201948에서수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
광유전학적 접근법은 높은 측두및 공간 분해능14 및 세포형 특이적 변조를 가능하게 하기 때문에 활용된다. 또한, 추가 치료 없이 이식된 장치를 반복적으로 사용할 수 있다. 관제수술 후, 광섬유의 광유전학적 도구와 이식을 운반하는 아데노 관련 바이러스의 주입이 수행되고, 마우스는 2주 동안 회복될 수 있다. 우리는 단지 2 주의 회복 시간을 선택했습니다, 이것은 수술에서 복구하고 바이러스가 표현하기에 충분한 시간이기 때문에. 행동 실험은 면역 조직 화학에 선행되기 때문에, 우리는 마우스가 실험 도중 너무 오래되지 않도록 해야합니다; 그렇지 않으면 조직 품질이 저하됩니다. 그(것)들은 임플란트에서 명백한 행동 손상을 보여주지 않으며 일반적인 케이지 행동에 관여합니다. 물론, 이식은 중요한 외과 병변을 동반한다; 따라서, 마우스는 집중적으로 모니터링된다. 수술 후, 마우스는 그룹 수용 마우스가 서로의 신선한 상처와 임플란트를 다치게하는 경향이 있기 때문에, 단일 보관해야합니다. 그러나, 주거 조건은 남성 마우스의 불안 수준에 큰 영향을 미칠, 단일 집 쥐 낮은 불안 수준을 보여 으로15 일반적으로 덜 우울 같은 증상16.
뇌 회로의 화학적 또는 전기적 조작은 광유전학의 높은 세포형 특이성이 결여되어 있으며, 낮은 측두및 공간분해능(14,,17,,18)을갖는다. 실험적 질문에 따라 전기 또는 화학 자극은 다른 장점을 가질 수 있습니다. 특정 영역에서 섬유 단자통과도 자극해야 할 때, 전기 자극이 가장 좋은 방법입니다. 화학 자극은 전체 영역에서 송신기 특정 수용체가 작용제에 의해 활성화되어야 할 때 좋은 선택입니다. 화학적 또는 전기 자극에 비해 광유전학의 또 다른 큰 장점은 내인성, 뉴런은 부작용의 발생을 피하는 빛에 민감하지 않다는것입니다(19). 실제로, 높은 빛 강도는 가열 효과를 유도 할 수있다8,,20,하지만 적절한 대조군으로 인해, 광유전학 적 조작으로 인한 행동 효과를 제거 할 수 있습니다.
설치류 행동을 조사하는 것은, 특히 정신 질환에 관해서, 그것은 특정 세포 인구까지 단일 수용체의 직접 변조를 가능하게하기 때문에, 자유롭게 움직이는 동물에 있는 광유전학으로 크게 향상되었습니다21 회로22. 이러한 변조의 급성 효과뿐만 아니라 정의 된 시간23 또는 만성 자극24후 장기 행동 효과를 측정 할 수있는 가능성은 실험 설계의 넓은 유연성을 가능하게하고 뇌 회로에 대한 매우 상세한 통찰력을 제공합니다. 광 자극은 광유전학 적 도구의 주사 부위에 위치한 뉴런을 조절하는 데 사용할 수 있습니다. 주사와 이식이 모두 동일한 뇌 영역을 다룰 때, 세포 체 및 이 지역에서 원리 뉴런및 인터뉴런의 축축을 투사하는 후3,6,,8을표적으로 할 수 있다.3 그러나, 광섬유는 또한 주입된 것과 다른 부위에 이식될 수 있다. 이 경우,,광 자극은 주입된영역(25,26,27)의투영 영역에서 축산 단자에서 송신기 방출을 조절할 수 있다.,
여기에서 연구 결과에서는, 광유전학은 불안 관련 행동을 분석하기 위하여 실험과 조합에서 이용됩니다. 불안 관련 정신질환은 세계 인구의 3분의 1이상에영향을 미치고28,29,,30으로 경제적 부담이 높은31명이다. 그 영향 받은 사람들은 각성, 긴장 및 걱정의 감각때문에 손해를 입습니다 회피 행동32,,33뒤에. 이러한 만성 발생 부정적인 감정, 주로 미래 이벤트에 초점을 맞추고있다 34,강하게 환자의 일상 생활을 방해. 벤조디아제핀 또는 선택적 세로토닌 재uptake 억제제 (SSRIs)와 같은 일반적인 치료는 일부 환자에서만 성공적입니다. 많은 양의 사람들이35전혀 치료에 반응하지 않으며, 그러한 질병의 기본 메커니즘이 아직 완전히 이해되지 않는다는 것을 보여준다. 내측 전두엽 피질(mPFC)은 불안21,,25,,27,36,,,37,,38의발달 및 증상에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.37 구체적으로, mPFC에서 의 적외선 피질(IL) 부위의 과잉활성화는 불안 관련장애(39,,40)의일부가 될 수 있다. 여기에 설명된 예제 실험은 mPFC의 IL 영역에서 변조가 불안 행동에 미치는 영향을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 추가적으로, 불안 관련 정신 질병을 위한 새로운 치료 전략의 발달은 또한 잠재적으로 지원될 수 있습니다.
2-6개월 된 수컷 넥스-Cre 마우스는mPFC(41)의IL 영역 내의 피라미드 뉴런에서 특별히 ChR2를 발현하는 데 사용된다. 넥스-Cre 마우스는 C57Bl/6 배경을 가지고 있으며, 피라미드 뉴런에서 특별히 효소 Cre-recombinase를 표현한다. 입체 수술 중, 이중 플로스 ChR2-DNA는 아데노 관련 바이러스 벡터를 통해 IL 부위에 주입된다. 광학 임플란트는 관심영역(도 1B)바로 위에 배치되며 임플란트는 치과 시멘트로 고정됩니다. 대조군 동물은 세포 특이적 발현을 모방하기 위해 동일한 부위에 이중 플록스 tdTomato-DNA의 주사를 받는다.
동물은 수술 일까지 그룹 보관되며 그 후 다른 마우스의 부상을 피하기 위해 단독 으로 보관됩니다. 마우스는 단일 수용 마우스를 위한 TypI-L 케이지에 있는 개별 환기 케이지 (IVC) 랙에 보관됩니다. 밝은 어두운 주기는 오전 10시부터 시작되는 12:12 h 리듬을 따릅니다. 모든 행동 실험은 설치류의 활성 단계와 유사한 어두운 단계에서 수행됩니다. 물과 표준 식품 펠릿은 광고 리비툼을 사용할 수 있습니다. 피라미드 뉴런에서 ChR2의 충분한 발현을 보장하는 2 주 간의 회복 후 마우스는 행동 실험에 사용됩니다.
오픈 필드 (OF)는 모래가 40cm 높이의 벽으로 50cm x 50cm 제곱 미로입니다. 지면은 내부 4가 중심을 나타내는 16 개의 사각형으로 나뉩니다. 측정된 동작은 중앙에서 소요되는 시간 1, 센터 항목 2개 수 및 3) 총 거리 이동입니다. 이 실험 중에는 총 20분 동안 4번의 시험이 있습니다. 시험 1과 3에서는, 빛 자극이 발생하지 않으며, 시험 2 및 4에서는, 5 ms 광 펄스와 473 nm의 1 mW 광 강도로 20 Hz 자극이 수행된다(그림2A). 이후 시험에서는 시험 영역에 대한 습관이 고려되었지만, 샴 주입 대조군 동물의 사용은 습관이 어떻게 표현되는지를 나타냅니다.
반즈 미로는 학습과 기억을 위한 실험입니다. 직경 92cm의 원형 플랫폼으로 둘레 주변에 20개의 등거리 구멍이 들어 있습니다. 구멍의 19개는 닫혀 있고 1개 구멍 아래에 이스케이프 박스가 제시됩니다. 4일 연속, 마우스는 탈출 상자의 위치를 배우기 위해 4개의 훈련 시험을 가지고 있다. 5일째에는 이스케이프 박스가 제거되고 마우스는 올바른 구멍을 찾는 데 필요한 시간을 테스트합니다. 측정된 동작은 : 1) 이스케이프 박스/올바른 구멍이 발견될 때까지의 시간, 2) 대상 방문 및 오류 수, 3) 이스케이프 박스까지 이동된 거리. 다른 그룹의 빛 자극은 1-4 일 훈련 일 또는 테스트 당일 검색 중에 이루어지는 수집 또는 통합 중에 수행됩니다(그림 2D).
<img alt="행동 실험 다이어그램: 오픈 필드(OF), 고가 플러스 미로(EPM), 반스 미로(BM)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2: 광유전학 프로토콜을 가진 행동 실험. A)해당 광 자극 프로토콜을 가진 오픈 필드 실험의 회로도 도면. C)해당 광 자극 프로토콜을 가진 고가-플러스 미로 실험의 회로도. D)반즈 미로의 회로도는 해당 광 자극 프로토콜을 가지고 실험한다. EPM: 고급 플러스 미로; OF: 오픈 필드; BM : 반즈 미로 테스트. 이 수치는 Berg 201948에서수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
광유전학 자극의 경우, 광강도와 주파수는 조사 중인 광유전학 도구 및 신경 유형에 적응해야 합니다. 가능한 가장 낮은 광 강도는 조직에 손상을 피하기 위해 사용되어야한다, 여러 연구는 강한 빛 강도로 인해 가능한 가열 효과가 있음을 보여주었다으로 8,,20. ChR2의 경우 5ms 광 펄스가 있는 20Hz 자극이 일반적으로2로사용됩니다. ChR2는 매우 가볍기 때문에 1 mW 광 강도가 충분합니다. 빛 자극 프로토콜은 라이트 오프와 시험 을 번갈아 가며 행동 변화를 직접 측정합니다. 행동 실험을 위한 외부 방 조건은 동물의 전체 단에 대한 안정상태를 유지해야 합니다. 고려해야 할 중요한 조건은 소음(장치 자체가 소음을 낼 수 있음), 냄새(항상 에탄올로 행동 설정을 청소), 광 강도 및 실험자입니다. 실험자는 항상 같은 사람이어야합니다. 또한, 실험의 하루 시간은 한 그룹의 모든 동물에 대해 동일해야하며, 시설에서 어두운 단계가 시작된 후 몇 시간 후에 바람직하다.
이 실험의 목적은 흥분 피라미드 뉴런의 강력한 활성화를 통해 IL 영역에서 흥분/억제(E/I) 비율을 증가시키는 것이다. 이 특별한 피질 지역에서 향상된 E/I 비율은 마우스40,,42,,43,44에서불안 수준을 증가시키는 것으로 알려져있다.

<table><tbody><tr><td>Ketamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2753-64</td><td>Anestasia</td></tr><tr><td>20 % 포도</td>당 <td>AlleMan Pharma Injection</td><td></td><td>s.c. 빠른 회복을 위한</td></tr> 행동 <tr><td>미로</td><td>Costum made</td><td></td><td>불안 측정</td></tr><tr><td>Bepanthen</td><td>Bayer</td><td></td><td>안과 연고</td></tr><tr><td>Betaisodona</td><td>Monodipharma</td><td></td><td>요오</td></tr><tr>드를 함유한 살균제<td>Betaisodona</td><td>Monodipharma</td><td></td><td>요오드 연고</td></tr><tr><td>쌍안</td><td>Olympus</td><td>SZ52, 110AL0.62x WD160</td><td></td></tr><tr><td>수술 세라믹 페룰</td><td>Thorlabs</td><td>CFLC230-10</td><td>임플란트</td></tr><tr><td>세라믹 섬유 스크라이브</td><td>Thorlabs</td><td>CSW12.5</td><td>유리 섬유</td></tr><tr><td>절단 Channelrhodopsin2-YFP 바이러스</td><td>Penn Vector Core</td><td>Addgene 20298</td><td>Optogenetic 도구</td></tr><tr><td>압축 공기</td><td>Kontakt Chemie</td><td>Druckluft 67</td><td>두개골 건조</td></tr><tr><td>좌표계</td><td>스톨팅</td><td></td><td>수술을 위한 정위 좌표</td></tr><tr><td>Correl Draw</td><td></td><td></td><td>그래픽 소프트웨어 버전 13</td></tr><tr><td>Cryoslicer</td><td>MICROM</td><td>HM500OM</td><td>염색용 뇌 절편 생산</td></tr><tr><td>Ethovision XT 14</td><td>Noldus</td><td></td><td>행동 추적을 위한 소프트웨어</td></tr><tr><td>Exel</td><td></td><td></td><td>통계 소프트웨어</td></tr><tr><td>페룰 연마 퍽</td><td>Thorlabs</td><td>D50-F</td><td>연마 임플란트 원형</td></tr><tr><td>파이버 패치 코드 듀얼</td><td>Prizmatix</td><td>Optogenetics-Fiber 500, 1,20m, 페룰 코어 1,25mm</td><td>케이블, 양측 임플란트의 두 임플란트와 연결</td></tr> 섬유 <tr><td>패치 코드 단일</td><td>Prizmatix</td><td>광유전학 - 섬유 500, 1,20m, 페룰 코어 1,25mm</td><td>케이블, 슬리브를 통해 임플란트와 연결</td></tr><tr><td>섬유 섬유 스트리핑 도구</td><td>Thorlabs</td><td>T06S13</td><td>임플란트 용 유리 섬유 스트리핑</td></tr><tr><td>VWR</td><td>유럽</td><td>516-0300</td><td>참신함 억제 공급 테스트를 위해 조각으로 절단</td></tr><tr><td>식품 펠릿</td><td>M &uuml; hle 레버</td><td>H&ouml; veler Nagerfutter</td> 생<td>쥐를 위한 영양</td></tr><tr><td>유리 피펫</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC150-10</td><td>주입 피펫</td></tr><tr><td>Gradia direct-Flo</td><td>Henry Schein</td><td>103322</td><td>유체 치과 시멘트</td></tr><tr><td>가열 램프</td><td>efbe-Schott/Phillips</td><td>R95E</td><td>수술 후 마우스 냉각 방지</td></tr><tr><td>가열판</td><td>Stoelting</td><td></td><td>좌표에 통합 시스템</td></tr><tr><td>주입 canula</td><td>Braun</td><td>100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20</td><td>모든 주입 및 두개골에 구멍을 뚫기</td></tr><tr><td>위해 Litter</td><td></td><td>T 1350</td><td>Grounding for the Novelty-Supressed Feeding test</td></tr><tr><td>Mouse cages</td><td>Zoonlab</td><td>405 cm ^ 2</td><td>Single housing for experiments</td></tr><tr><td>Optibond FL</td><td>Kerr</td><td>26684E</td><td>이식</td></tr><tr><td>을위한 두개골 준비광학 유리 섬유</td><td>Thorlabs</td><td>FT200EMT</td><td>임플란트용 광섬유</td></tr><tr><td>, Optogenetics-LED.STSI,</td><td>Prizmatix</td>, <td>행동 실험 중 광 자극을 위한 Prizmatix, 광유전학 도구 상자,</td>파라포름알데히드, 시그마-알드리치, 16005-1KG-R, 뇌를 제거하기 위한 생쥐의 관류 연마 시트 0.02 &마이크로;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> m grit</td><td>Thorlabs</td><td>LFCF</td><td>연마 임플란트 원형</td></tr><tr><td>연마 시트 1 &micro; m grit</td><td>Thorlabs</td><td>LF1D</td><td>연마 임플란트 원형 연마</td></tr><tr><td>시트 30 &micro; m 그릿</td><td>Thorlabs</td><td>LF30D</td><td>연마 임플란트 원형</td></tr><tr><td>연마 시트 6 &micro; m grit</td><td>Thorlabs</td><td>LF6D</td><td>연마 임플란트 원형</td></tr><tr><td>펄서 소프트웨어</td><td>조명 장치 제어를 위한</td><td>Prizmatix</td><td></td> 소프트웨어</tr><tr><td>Rimadyl-Carprofen</td><td>Zoetis</td><td></td><td>Analgesia</td></tr><tr><td>통계 용 시그마 플롯</td><td></td><td></td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>슬리브</td><td>Thorlabs</td><td>FT200EMT</td><td>임플란트와 광 케이블 연결</td></tr><tr><td>SodiumCloride ( NaCl)</td><td>Braun</td><td>3570410</td><td>두개골 헹굼</td></tr><tr><td>Superglue</td><td>Pattex Henkel</td><td></td> 페룰 td-토마토 바이러스<td>에 유리 섬유를 고정하기 위해</td></tr><tr><td></td><td>Penn Vector Core</td><td>Addgene 51503</td><td>광유전학 도구</td></tr><tr><td>자외선</td><td>KoQGHJ</td><td>무선, 1200 mW/cm^2</td><td>치과 시멘트용 중합 램프</td></tr><tr><td>Xylavet-Xylazin</td><td>cp pharma</td><td></td><td>마취</td></tr></tbody></table>

자유롭게 움직이는 마우스에 있는 행동을 조절하기 위하여 신경 활동의 광유전학 조작

Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

자유롭게 움직이는 마우스에 있는 신경 회로의 광유전학 변조는 급성 및 장기 행동에 영향을 미칩니다. 이 방법은 중추 신경계의 전체 뉴런 회로까지 단일 뉴런 및 지역 별 송신기 방출의 조작을 수행할 수 있으며 행동 결과의 직접 측정을 허용합니다. 뉴런은 채널로돕신2(ChR2)와 같은 선택의 DNA를 운반하는 바이러스 벡터의 주입을 통해 광유전학 적 도구를 표현한다. 빛은 표적 영역 바로 위에 종료 만성 광학 임플란트를 통해 특정 뇌 영역으로 가져온다. 회복과 적절한 도구 발현의 2 주 후에, 마우스는 관심있는 뉴런의 광유전학 자극을 가진 행동 시험에 반복적으로 사용될 수 있습니다.
광유전학 변조는 화학적 또는 전기 자극과 같은 일반적으로 사용되는 방법에 비해 높은 세포 특이성으로 달성 될 수있는 높은 측두및 공간 해상도를 가지고 있습니다. 빛은 신경 조직에 해를 끼치지 않으며 따라서 한 마우스에 있는 다중 행동 실험뿐만 아니라 장기 실험에 사용될 수 있습니다. 광유전학 적 도구의 가능성은 거의 무제한이며 전체 뉴런의 활성화 또는 침묵, 또는 빛에 의해 특정 수용체 유형의 조작을 가능하게합니다.
통합 된 광유전학 자극을 가진 이러한 행동 실험의 결과는 조작으로 인한 행동의 변화를 직접 시각화합니다. 기준선과 같은 자극이 없는 동일한 동물의 동작은 유도된 변화에 대한 좋은 제어입니다. 이 특정 행동에 관련 된 신경 유형 또는 신경 전달 물질 시스템의 자세한 개요를 허용, 불안 등. 신경 네트워크의 가소성은 또한 광학 자극 후에 장기 자극 또는 행동 관측을 통해 중대한 세부으로 조사될 수 있습니다. 광유전학은 신경 질환의 여러 종류에서 계몽 신경 신호에 도움이 될 것입니다.

이 프로토콜의 목적은 광유전학 실험 도중 유전자 변형마우스의 행동에 있는 변경을 측정하는 것입니다. 광유전학 적 조작은 아데노 관련 바이러스 벡터의 주입에 의해 수행됩니다. 자유롭게 움직이는 마우스의 빛 자극은 관심 영역 바로 위에 광섬유의 이식을 통해 가능하다.
도 4에서,광유전학 실험의 결과가 제시된다. ChR2를 통해 IL 지역에서 흥분 피라미드 뉴런의 강력한 활성화는 오픈 필드에서 불안 관련 행동을 증가. ChR2는 피라미드 뉴런에서 발현을 위해 넥스-Cre 마우스에서 mPFC의 IL 부위에 주입되었다(도4A). 두 가지 불안 테스트 동안, 오픈 필드(그림 4B,C)및 참신 억제 먹이 테스트(그림 4F, G),ChR2는 청색 빛으로 자극하고 피라미드 뉴런을 활성화합니다. 대조군으로서, 다른 마우스군은 ChR2 대신 플루오로포레 tdTomato의 주사를받았다(도 4D, G). 이러한 실험에서 불안은 더 밝은 중앙 영역의 회피로 정의됩니다. 마우스는 포식자의 염려 때문에 열린 지역의 본질적인 회피를 보여줍니다.
도 4B에도시된 오픈 필드 실험에서 마우스는 각각 5분의 4의 시험을 실행하였다. 시험에서 1 및 3에서는 빛 자극이 발생하지 않았고(Off1,2) 및 시험 2 및 4에서는 20Hz(5ms 광 펄스) 및 1mW 강도(On1,2)로 청색광 자극이 수행되었다. 히트맵은 실험 그룹에서 오프와 온 시험 사이에 중심 기간이 다르다는 것을 보여줍니다. 빛 자극 동안, 마우스는 우선 국경 영역에 머물. 제어 동물은 또한 국경을 선호하지만, 빛 자극에 자신의 행동을 변경하지 않습니다. 도 4C에서,개방 필드 실험 중 의 주요 행동 측정은 실험 군에 대해 도시된다. 데이터가 정상성을 위해 Shapiro-Wilk 테스트를 통과한 경우, 통계는 독립적인 두 꼬리 t-test로 수행되었습니다. 정상 시험에 실패하면 Mann-Whitney-Rank Sum 테스트가 비 파라메트릭 대안으로 사용되었습니다. 이러한 종류의 실험에 대해, 그룹 내 비교는 빛 자극이 실험 및 대조동물의 기준선 불안과 는 무관하게 시간이 지남에 따라 불안 행동을 직접적으로 바꿀 수 있는지 조사하기 위해 선택되었다. 센터 기간은 두 빛 자극 시험 도중 현저하게 감소했습니다, 증가한 불안 수준을 나타내는. 이동된 총 거리는 변경되지 않았으며, 운동 동작이 영향을 받지 않음을 보여 주어. 센터 엔트리수는 크게 증가하지는 않았다. 도 4D에서제어 그룹의 데이터가 표시됩니다. 대조군 동물은 분석된 매개변수중 Off와 On 예심 사이에 어떠한 행동 변화도 표시하지 않았으며, 빛 자극이나 이식이 관찰된 효과를 일으키지 않았다는 것을 보여준다. 요약하자면, 이 시험은 ChR2를 통해 IL 피라미드 뉴런의 빛 자극 도중 증가한 불안을 보여줍니다.
도 5에서,실패한 광유전학 실험의 데이터는 고상승 플러스 미로를 위해 도시된다. 도 5A에제시되는 고액 플러스 미로 실험 동안, 마우스는 각각 3 분의 6 시험을 완료했다. 시험 1, 3 및 5 에서 빛 자극이 수행되지 않았다 (Off1, Off2, Off3) 및 시험에서 20 Hz (5 ms 빛 펄스) 및 1 mW 강도 (On1, On2, On3)와 청색 광 자극이 수행되었다. 이러한 예시적인 결과에서, 광유전학 프로토콜의 길이와 미로 자체의 시공은 형질형 마우스 라인에 적합하지 않았다. 도 5B에서,몇몇 마우스가 그들의 뒤발로 미로에서 미끄러졌거나 심지어 아래로 떨어졌다는 것을 볼 수 있습니다. 이런 일이 일어났을 때, 마우스는 하루 후에 EPM을 능력을 발휘할 수 있는 두 번째 기회를 얻었습니다. 만약 그들이 다시 쓰러졌다면, 그들은 분석에서 제외되었다. 마우스가 여러 번 미끄러졌지만 미로에 머무를 수 있었던 경우, 데이터는 정상적으로 분석되었습니다. 그럼에도 불구하고, 데이터는 매우 신중하게 해석되어야하고 제어 동물은 더 큰 중요성을 얻을 수있다. 넥스-Cre 마우스는 좁은 열린 팔에 머무르는 데 어려움을 겪었습니다. 이를 피하기 위해 높이가 1cm인 작은 벽은 미로의 팔에 뒷발을 안전하게 잡는 데 도움이 되었을 것입니다. 히트맵과 그래프 모두 실험뿐만 아니라 대조마우스가 시험 2(On1)에서 열린 팔을 피하기 시작했다는 것을보여준다(그림 5C-E). 열린 팔 항목과 마찬가지로 두 그룹 모두에 대해 두 그룹의 경우 팔을 벌리는 시간이 크게 줄어듭니다. On1 시험 기간 동안 개방팔 및 개방암 항목에 대한 시간이 현저히 감소함에 따라 광 자극의 큰 항불안 효과를 연루시키는 데이터만 을 획득한 실험군을 분석한다. 그러나, 이 데이터를 동일한 동작을 보이는 대조군에 비교할 때, 관찰된 동작은 광유전학 자극에 의해 중재되지 않고, 미로에 대한 습관으로 인해 일반적으로 열린 팔의 회피에 의해 서두르는 것이 분명해진다. 이 데이터는 광유전학 자극및 가능한 행동 적응에 의해 매개되는 행동 효력을 구별하기 위하여 적당한 통제 단의 중요성을 강조합니다. 또한 이 데이터는 특정 무스 라인과 실험 적 질문에 맞게 실험 설정을 올바르게 조정하는 것의 중요성을 조명합니다.
수집된 행동 데이터를 검증하고 강화하기 위해 마우스의 뇌는 올바른 주입 및 이식을 제어하기 위해 마지막 실험 후에 제거됩니다(도6). 뇌는 4% 파라포름알데히드로 고정되어 두개골에서 제거됩니다. 뇌는 1-2 일 동안 30 % 자당에서 탈수되고 나중에 냉동 슬라이스됩니다. 40 μm 두께의 관상 동맥 뇌 슬라이스는 세포 핵을 얼룩지게 하는 DAPI를 함유한 마운팅 배지를 사용하여 슈퍼프로스트 객관적 슬라이드에 세척및 장착됩니다. 이를 통해 관상 슬라이스의 대상 영역을 식별할 수 있습니다. YFP 태그 또는 tdTomato 자체의 형광은 바이러스 주입의 위치를 나타냅니다. 도 6B에서 왼쪽(노란색)에 ChR2-YFP의 예시주입 부위를 제시하고, 오른쪽에 있는 tdTomato(빨간색)이 제시된다. Paxinos와 프랭클린45 마우스 뇌 아틀라스에서 적응 된 템플릿의 도움으로 IL 영역을 식별 할 수 있습니다. 두 슬라이드에서, 광유전학 공구는 IL 지구에서, 그러나 또한 인접한 두뇌 지구에서 표현됩니다. 적절한 해석을 위해 뇌 조직에서 청색광의8 확산을8(도 1D, E)에상담한다. 청색광이 섬유 팁(도 1D의블루 라인) 8에서 초기 1mW 광강도의 5% 미만만으로 IL 아래 DP 영역에 도달할 것으로 볼 수있다. 또한, 소량의 빛은 백산란(47)으로인해 PrL 영역으로 위쪽으로 올라갈 수 있다. 따라서 IL 영역이 가장 강하게 조명되고 있다고 말할 수 있지만 DP 및 PrL 지역과 같은 인접 지역도 약간 자극될 수 있습니다. 따라서, IL-세포 특이적 자극은 보장되지 않으며 인접한 지역의 면역히스토화학적 분석이 수행되어야 하며, PrL 및 DP 세포의 활성이 빛을 통해 변조되는지 확인한다. 도 6C에서,또 다른 중요한 컨트롤이 나타난다: 넥스-크레 마우스 라인의 특이성. IL 영역에서 두 세포 유형에 대 한 염색 항 체를 통해, 글루타머지 원리 뉴런과 GABAergic interneurons, 그것은 볼 수 있습니다., ChR2-YFP 발현 은 글루타머기 뉴런에서만 발생 하 고 GABAergic 것 들.
모두 모두, 우리의 실험은 행동 테스트 도중 광유전학 조작으로, 불안 관련 행동에 있는 변경이 관찰될 수 있었다는 것을 보여줍니다. 동일한 동작에 대해 두 개 이상의 테스트를 사용하면 신뢰할 수 있는 결론을 도출할 수 있습니다. 또한, 면역히토화학 분석은 얻어진 데이터를 확인한다. 우리의 실험은 제안, 인프라 피질에서 피라미드 뉴런의 특정 활성화는 특정 연구약에서 불안 관련 행동을 증가.
<img alt="IL, DRN, BLA 영역의 뇌 주사 실험; 행동 데이터, 광유전학적 효과 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig04v4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 그림 4: IL 피라미드 뉴런의 광유전학 활성화는 불안 행동을 증가시킵니다. 실험 중 빛 자극: 473 nm, 1 mW, 20 Hz 자극. A)ChR2-YFP 또는 tdTomato을 위한 주입 및 이식 부위의 회로도 도면이 IL에 들어갑니다. 실험 중, mPFC의 IL 영역에서 피라미드 뉴런은 ChR2에 의해 활성화된다. Paxinos와 프랭클린 마우스 뇌 아틀라스에서 적응 된 처진 뇌 조각, 처진 : 측면 o,6. B)빛 자극 프로토콜 (20 분 4x5 분 교대 및 시험; 왼쪽) 및 예시 ChR2 주입 (EXP)의 열지도 및 tdTomato 주입 (모든 실험). EXP 동물은 파란색 레이저 빛으로 자극 할 때 OF의 중심에 적은 시간을 보낸다. CT 동물의 경우, 센터에서 보낸 시간은 빛 끄기와 시험 중사이에 다르지 않습니다. C)OF, n=11내의 EXP 동물에 대한 그룹 데이터. 마우스는 청색광으로 자극할 때 OF의 중앙에 훨씬 적은 시간을 소비합니다 (Off1 39.49±6.9 s, On1 19.87±4.47 s, Off2 28.13±8.55 s, On2 23.42±9.32 s, Off1:On1, t-test, p =0.03* Off1:On2, MWRS, p=0,049, *). 이동거리는 영향을 받지 않는다(Off1 2703.09±292.65cm, On1 3113.4±491.15cm, Off2 3331.86 ±482.62cm, On2 3082.17±658,61cm). # 센터 항목은 시간에 따라 감소하지만, 큰 차이를 표시하지 않습니다 (오프 1 22.36±3.78, On1 18.45±3.95, Off2 17.36±1.99, On2 13.27±2.64). D)OF, n=15에서 CT 동물에 대한 그룹 데이터. 시간 마우스는 OF의 중심에 지출, 거리 이동, 센터 항목의 #은 빛 온과 오프 시험 사이에 변경되지 않습니다 (센터 Off116.73±2.65 s, On1 16.02±1.89 s, Off2 12.02±1.76 s, On2 13.04±2.58 s; 거리 Off1 3399.69±296.77cm, On1 3210.6±446.9cm, Off2 3030.28±513.83cm, On2 2955±617.7cm; # 센터 엔트리 Off1 14.2±1.98, On1 13.6±2.02, Off2 10.8±1.88, On2 11.67±2.5). CT 마우스는 상당히 높은 기준선 불안을 보여줍니다 (Off1 EXP:CT, MWRS, p=0.005, **). 값은 평균±S.E.M. * 상당한 차이 (p≤0.05)를 나타내며, ** 상당한 차이 (p≤0.01)를 나타냅니다. t-테스트 항상 두 꼬리, MWRS: Mann-Whitney 랭크 합계 테스트; IL: 인프라 피질; BLA: 바소포탈 편도체; DRN: 등쪽 라페 핵; OF: 오픈 필드; CT: 동물 제어; EXP: 실험 동물; L: 빛. 이 수치는 Berg 외. 2019, PLoS One43 및 Berg 201948에서수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="높은 미로 실험, 성능 메트릭, 통계 데이터 및 결과를 보여주는 다이어그램입니다." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig5v4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 그림 5: EPM 실험은 넥스-Cre 마우스에서 행동 효과를 보여주지 못했습니다. 실험 중 빛 자극: 473 nm, 1 mW, 20 Hz 자극. A)빛 자극 프로토콜 (18 분, 6x3 분, 교대 및 시험)과 높은 플러스 미로. B)"미끄러짐"이 데이터, 총 n=23에 포함된 마우스에 대한 그룹 데이터가 포함된다. 넥스-Cre 마우스는 실험군(왼쪽)과 는 별개로 등발로 열린 팔에서 미끄러지는 경향이 있었다. 모든 6 예심을 위한 미로에 머물렀던 마우스만 나중에 분석에서 고려되었습니다. 첫 번째 Off1 단계에서 슬립 오프는 오픈 암의 나중에 회피하는 이유입니다 (Off1 EXP 1.63±0.6, CT 2.2±0.79, Off2+3 EXP 0.125±0.125, CT 0±0, On1+2+3 EXP 0.625±0.26, CT 0.± 10). 원형 차트(오른쪽)는 42.42%로 18분 동안 미로에서 떨어지는 마우스를 나타낸다. 57.57%만이 실험을 마쳤습니다. C)실험의 모든 6 시험에서 모범적인 EXP 및 CT 마우스의 열지도. 두 그룹 모두 Off1 재판 후 열린 팔 지속 시간이 감소하는 것으로 나타났습니다. D)EPM, n=12에서 EXP 동물에 대한 그룹 데이터. 첫 두 번의 시험 에서 팔을 벌려 보낸 시간은 크게 감소했으며 그 후 지속적으로 감소했습니다 (Off1 73.91±12.22 s, On1 36.15±14.65s, Off2 15.61±6.23 s, On2 19.49±7.51 s, Off3 9.36±4.44s, On3 7.96±3.47 s. Off1:On1, t-test, p=0,041, *). 이동거리는 영향을 받지 않는다(Off1 679.96±71.63cm, On1 712.24±12.82cm, Off2 717.49±97.39cm, On2 782.51±81.11cm, Off3 722.11±68±.60cm, 66.66cm). 오픈 암 엔트리의 양은 Off1에서 On1로 크게 감소한 다음 일정하게 유지됩니다(Off1 8.08±1.08, On1 3.33±0.76, Off2 2.16±0.69, On2 2.91±1.09, Off3 1.73±0.75, On3 1.73±0.66. Off1:On1, t-테스트, p=0.002, **). EPM의 중심에 소요된 시간은 시련을 따라 감소하지만 오프에서 온 시험(Off1 41.71±5.34s, On1 31.2±4.59s, Off2 19.89±3.44s, On2 24.49±3.38s, Off3 20.37±4.07.± 07)에서 큰 차이를 보이지 않습니다. EPM,n=11에서 CT 동물에 대한 그룹 데이터. CT 데이터는 실험이 제대로 작동하지 않았다는 것을 나타내는 EXP 데이터와 동일한 현저한 감소를 나타낸다(열린 팔의 시간 Off1 86.92±12.74s, On1 33.78±14.38 s, Off2 18.01±11.61 s, On2 16.41±9.61 s, Off3 11.36±4.01 s, On3 5.43±2.07 s. Off1:On1, MWRS, p=0.009; 거리 Off1 705.11±88.36 cm, On1 789.45±77.53 cm, Off2 724.74±80.49cm, On2 676.57±11.99 cm, Off3 716.99±132.47cm, On3 66.99±132.47cm, On3 663.03.03.03± 오픈 암 엔트리 Off1 7.09±1, On1 3.72±1.17, Off2 1.45±0.47, On2 1.36±0.58, Off3 0.91±0.43, Off3 1.64±0.59. Off1:On1, MWRS, p=0.01, *; 센터 Off1 35.89 s, On1 29.25±3.96 s, Off2 22.17±3.58 s, On2 15.9±2.57s, Off3 13.86±4.2s, On3 16.89±5.75 s). 값은 S.E.M. * ± 의미하며 상당한 차이(p≤0.05)를 나타내며, ** 상당한 차이(p≤0.01)를 나타냅니다. t-테스트는 항상 두 꼬리, MWRS: Mann-Whitney 랭크 합계 테스트; EPM: 고급 플러스 미로; CT: 동물 제어; EXP: 실험 동물; OA: 팔을 벌려. 이 수치는 Berg 외. 2019, PLoS One43 및 Berg 201948에서수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="뇌 절편도 및 현미경 이미지. 단백질 발현 및 DAPI 염색 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 그림 6: IL 및 넥스-Cre 특이성에서 ChR2 및 tdTomato의 주입 측. A)AP + 1.66mm, mL 0.3mm, DV -1.8mm의 관상 동맥 에 이식 부위의 회로도 도면, 일방적인 주입 및 이식(마우스 뇌 아틀라스, 팍시노스 및 프랭클린, 브레그마 +1.54mm에서 적응). B)넥스-크레마우스에서 DAPI 염색 세포 핵(blue)과 합병된 ChR2-YFP(왼쪽, 노란색) 및 tdTomato(오른쪽, 빨간색)의 예시적인 주사 부위. 스케일 바 1mm. 인셋은 IL 영역의 높은 배율을 보여줍니다. 스케일 바 150 μm. 흰색 상자는 인셋의 위치를나타냅니다. C)상단 행: Nex-Cre 마우스의 왼쪽 IL 영역의 공초점 이미지는 Nex-Cre 마우스의 GABAergic 뉴런(green)에 대한 마커로서 CamKII로 염색된 글루타머기뉴런(blue), ChR2-YFP(노란색) 또는 Gad67을 위한 마커로 염색했다. 맨 아래 줄: CamKII (왼쪽, 파란색)와 ChR2-YFP (노란색)의 공동 지역화(왼쪽, 파란색),하지만 Gad67(오른쪽, 녹색)과는 달리 글루타마테어릭 뉴런용 넥스-크레 마우스의 특이성을 나타낸다. 스케일 바 50 μm. PrL: 전두엽 피질; IL: 인프라 피질; DP: 등받이 받침대 피질. 이 수치는 Berg 외. 2019, PLoS One43 및 Berg 201948에서수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

특정 신경 인구 또는 뇌 영역의 광유전학 적 조작으로, 행동은 자유롭게 움직이는 동물에 있는 높은 시간 및 공간 해상도로 수정될 수 있습니다. 만성 이식 된 광섬유와 함께 다른 광유전학 도구를 사용하여 다양한 신경 변조 및 행동 테스트를 수행 할 수 있습니다.

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

특정 신경 인구 또는 뇌 영역의 광유전학 적 조작으로, 행동은 자유롭게 움직이는 동물에 있는 높은 시간 및 공간 해상도로 수정될 수 있습니다. 만성 이식 된 광섬유와 함께 다른 광유전학 도구를 사용하여 다양한 신경 변조 및 행동 테스트를 수행 할 수 있습니다. 광유전학의 궁극적인 목표는 행동하는 동물에 있는 높은 시간적 및 공간 해상도를 가진 신경 회로의 변조입니다.약리학적 또는 전기 적 조작과는 달리, 광유전학은 신경 회로에 특정 세포 모형의 정확한 통제를 허용합니다. 광유전학은 거동 중에 특별히 정의된 영역에서 특정 세포 유형을 표적으로 하고, 그러한 미세 회로의 변화의 직접적인 영향을 면밀히 조사하는 완벽한 방법입니다. 우리는 이제 자유롭게 움직이는 마우스에서 광유전학을 준비하고 심고 수행하는 방법을 단계 안내하는 단계를 제시할 것입니다.광학 임플란트의 준비를 위해 세라믹 페룰 플랫 사이드를 벤치 비스에 올려 놓습니다. 섬유 스트리핑 도구로 200 마이크로미터 직경의 유리 섬유의 코드를 제거하고 세라믹 섬유 서기관으로 2~3센티미터 의 비조각을 잘라냅니다. 유리 섬유 조각을 세라믹 페룰에 넣은 다음 주사 캐넌트 캐넌트로 평평한 면에 슈퍼 글루를 떨어 뜨립니다.세라믹 페룰의 둥근 면에 유리 섬유를 가능한 한 짧게 자르고 프리 임플란트를 ferrule 연마 퍽에 배치하여 4개의 다른 출판 용지에서 둥근 면을 연마합니다. 그 후, 세라믹 페룰의 평평한 면에 유리 섬유를 절단, 이식에 필요한 길이로. 마우스 뇌 아틀라스를 사용하여 임플란트의 길이를 계산합니다.임플란트는 관심 영역 바로 위에 끝나야 합니다. 이식 전에 마취가 적용됩니다. 정확하고 미적 기법은 원고에 설명되어 있습니다.마우스가 마취의 깊은 상태에 도달하면 가열 판에 놓고 고정 프레임에 머리를 고정합니다. 앞면의 코와 치아를 고정하고 양쪽의 귀를 고정합니다. 컵로 폰을 마우스 뒤쪽에 미묘하게 바르고 양눈에 불투명한 눈 연고를 바르면 건조로부터 보호하십시오.젖은 종이 타월로 두피에 머리카락을 적신 다음 가위를 사용하여 잘라냅니다. 젖은 종이 타월로 느슨한 모든 머리카락을 제거하십시오. 면 스틱을 사용하여 요오드가 함유 된 팅크로 두피를 소독하십시오.트위저로 관심 지역에 대한 두피를 올리고 중간선을 따라 1센티미터를 자른다. 이식을 위해 두개골을 거칠게 하려면 흉터에 소량의 인산을 바르고 15초 동안 효과를 발휘하십시오. 면 봉으로 모든 산을 제거하고 염화 나트륨으로 흉터를 두 번 헹구습니다.적절한 주입을 위해 개별 좌표에 대한 F 계수를 계산합니다. 스테레오틱 프레임에 유리 통을 놓고 브레그마 바로 위에 배치합니다. 이제 좌표 계열이 0이고 유리 캐뉼라를 람다로 옮습니다.다음 수식으로 F 계수를 계산합니다. 브레그마 마이너스 람다가 4.2로 나눈 것은 F 계수와 같습니다. 정확한 좌표는 주입 및 이식에 매우 중요하기 때문에 그렇지 않으면 잘못된 구조가 자극되면 행동 효과가 특이하지 않습니다.모든 마우스는 두개골 의 크기에 최소한의 편차를 가지고, 따라서, 계수는 절대적으로 필수입니다. 조정된 좌표를 사용하여 흉터의 위치를 관심 구조 바로 위에 찾습니다. 주입 캐뉼라를 사용하여 그 자리에서 캐뉼라를 회전하여 두개골에 구멍을 뚫습니다.주사기에 연결된 유리 캐뉼라에 바이러스 용액을 넣려면 두개골에 염화 나트륨 한 방울과 피로펜 한 조각을 위에 놓습니다. 피로펜에 두 개의 마이크로 리터 바이러스 용액을 떨어 뜨리고 유리 캐뉼라의 끝을 바이러스로 낮춥니다. 음의 압력을 적용하고 바이러스 솔루션이 캐뉼라에 의해 채택 될 때까지 기다립니다.캐뉼라를 가진 바이러스의 끝이 두개골의 수준에 있을 때 그 좌표에 0은 천천히 주입 측의 가장 낮은 위치로 시추공으로 낮춥니다. 반월 상 연골이 낮아질 때까지 주사기로 소량의 양압을 적용하십시오. 유리 캐뉼라를 다음 위치로 위로 이동하기 전에 바이러스가 2~ 3분 동안 확산됩니다.유리 캐뉼라를 매우 천천히 제거하고 최종 주입 후 폐기하십시오. 이제 이식을 위해 두개골을 준비합니다. 압축 공기로 두개골을 건조,이 해당 스틱프라이머를 적용하고 15 초 동안 건조하게.동일한 스틱으로 결합을 적용하고 UV 빛으로 20 초 동안 치료하십시오. 임플란트를 해당 홀더에 넣고 유리 섬유의 끝을 시추공 바로 위에 배치하고 조심스럽게 하급합니다. 수퍼글루의 나머지 판막이 두개골에 닿으면 임플란트를 낮추는 것을 중단하십시오.광섬유의 이식은 또한 해마와 같은 양자 구조물을 위해 만들어질 수 있습니다. 이를 통해 두 반구모두에서 동시에 약간의 자극을 주거나 두 개의 서로 다른 구조를 자극할 수 있습니다. 또한 광섬유 임플란트와 다른 위치에서 바이러스를 주입할 수도 있다.사출 및 이식이 다른 지역에서 수행되는 경우, 인산을 적용 한 후 그러나 두 성분 접착 전에 필요한 모든 구멍을 드릴. 두개골이 여전히 완전히 건조한지 다시 확인한 다음 임플란트 주변과 주변 지역에서 유체 치과 시멘트를 적용한 다음 UV 빛으로 20 초 동안 치료하면 완전히 털이 없고 말린 두개골 부위에 두 개의 더 적은 시멘트를 적용하십시오. 자외선으로 모든 층을 치료합니다.수술을 마치려면 전체 상처에 요오드 주석을 적용합니다. 코와 귀 고정을 해제하고 마우스를 신선한 케이지에 넣고 체온손실을 피하기 위해 가열 램프 아래에 놓습니다. 적어도 하루에 한 번 건강 상태를 확인하고 필요한 경우 3 일 후에 수술 과 대수 후 퇴역합니다.2 주 간의 회복 후, 마우스는 행동 실험에 사용할 수 있습니다. 펄스 소프트웨어소프트웨어를 열고 광원이 연결된 USB com 포트를 선택합니다. 외부 소프트웨어가 광원을 제어할 수 있도록 작동 모드 3을 선택합니다.5밀리초 광 펄스로 20 헤르츠 자극에 대한 올바른 조정을 선택합니다. 펄스와 통신할 분할을 찾으려면 시작 시퀀스를 누릅니다. 이 상태는 실험이 완료될 때까지 유지됩니다.이제 EthoVision XT에서 새 실험을 만들고, 파일로 이동하고, 템플릿에서 새 를 선택하고 미리 정의된 템플릿을 선택합니다. 라이브 트래킹을 선택하고 소스로 카메라를 선택하고 연결된 Puslar Gen-Eye 캠을 확인합니다. 기록해야 하는 동물로 마우스를 선택합니다.아레나 템플릿, 열린 필드 사각형 및 영역 템플릿 센터, 테두리, 모서리를 선택합니다. 추적해야 하는 하나의 피사체를 확인하고 중심점, 코점 및 꼬리 베이스를 선택합니다. 배경에 비해 동물의 색이 어둡고 단계를 완료하는 데 권장되는 샘플 속도를 확인합니다.실험의 이름을 적절히 지정하고 저장할 위치를 선택합니다. 경기장 설정을 찾을 때까지 카메라가 자동으로 배경 이미지를 엽니다. 미리 정의된 영역을 화살표와 오른쪽에 있는 두 개의 기호를 사용하여 실제 영역에 적응합니다.일부 영역이 필요하지 않으면 삭제합니다. 그리기 스케일을 눌러 미로의 한 구석에서 다른 쪽 구석으로 선을 정립합니다. 센티미터에 실제 거리의 길이를 입력합니다.다른 축에 대해 반복합니다. 평가판 제어 설정을 정의하려면 조건 시간을 20분으로 조정하여 기본 규칙을 준비합니다. 스타 트렉의 조건은 피사체가 경기장에 있을 때 2초 동안 경기장에 있을 때 마우스가 경기장에 있을 때 추적의 자동 상태를 위해 해야 합니다.라이트 자극에 대한 하위 규칙을 만들려면 구조로 이동하여 하위 규칙을 선택합니다. 기본 규칙 아래에 놓고 두 상자를 분산시보세요. 조건에 가서, 시간을 주고 하나에 빛같은 이름을 주고, 조건을 조정하면 5 분 후에 충족됩니다.하위 규칙의 시작 상자 뒤에 상자를 직접 놓습니다. 사용자 지정 하드웨어를 사용하여 하나의 조명으로 이름을 지정합니다. 수행 할 작업을 선택 : 나는 하나를 높게 넣어 것입니다.상자를 조건 상자 바로 뒤에 놓습니다. 스텝을 반복하여 빛을 가볍게 프로그래밍합니다. 이제 구조, 하위 규칙 참조로 이동하여 참조가 올바른 하위 규칙에 속하는지 확인합니다.시작 조건에 따라 지체 없이 시작 조건을 선택하고 시작 조건에 따라 한 번 실행되는 상태로 시작하는 조건을 선택합니다. 참조 상자를 추가 책 1권과 조건 부 책 두 가지 주요 규칙 사이에 놓습니다. 이제 감지 설정을 정의하여 시스템에서 추적할 내용을 표시합니다.테스트 마일을 경기장에 배치하고 자동화된 설정을 선택합니다. 설치류를 동물 유형으로 선택하고 마우스 커서를 사용하여 경기장에서 마우스 주위에 상자를 그립니다. 예로 치료 질문의 결과를 확인합니다.오픈 필드 실험의 경우 실험 용 마우스를 실험 직전에 행동실에 가져와 적절한 수준의 불안을 보장하십시오. 마우스를 케이지의 격자에 부드럽게 눌러 광원의 슬릿이 될 수 있습니다. 10분 동안 신선한 쓰레기가 있는 대기 케이지에 넣고 라이트 케이블에 적응합니다.정지 버튼을 눌러 인수를 시작하고 XT를 비전합니다. 대기 케이지에서 마우스를 열린 필드의 왼쪽 상단 모서리로 옮습니다. 실험 중에 마우스의 시야를 그대로 두고 침착하게 하십시오. 20분 후 실험이 끝나면 미로에서 마우스를 제거하고 라이트 케이블을 분리하여 자체 케이지에 다시 넣습니다.검사 시각화를 통해 라이트 오프와 얼굴의 라이트 사이의 중심 시간의 차이를 직접 볼 수 있습니다. 마우스는 빛이 켜져 있을 때 중앙에서 보내는 시간을 줄입니다. 반즈 미로 실험의 경우, 실험 1시간 전에 모든 실험마우스를 행동실에 넣습니다.반즈 미로를 제외한 모든 구멍을 닫고 이제 이스케이프 박스가 놓여 있는 것을 준비한다. 임플란트의 광원에 마우스 한 개를 연결하고 반즈 미로 의 중간에 직접 놓습니다. 시작 을 누르고 다음 T를 방문하고 판지 상자를 제거해야합니다.소프트웨어가 전체 전환을 인식하지 못하는 경우에 대비하여 수동으로 평가판을 중지할 준비를 하십시오. 미로에서 마우스를 꺼내 라이트 케이블에 대한 연결을 제거합니다. 수행, 학습 및 메모리 작업을 수행할 때 조작의 즉각적인 효과뿐만 아니라 획득, 통합 또는 검색 중에 조작의 장기적인 효과를 조사합니다.데이터 분석을 위해 치료 또는 제어된 치료 조건을 찾고 중첩으로 이동하여 예심 제어 상태를 선택합니다. 요소 액션 스타 트렉에서 요소 액션 라이트가 하나에 가는 상태 간격을 선택합니다. 중첩 상자를 필터 상자 처리와 해당 결과 상자 사이에 배치합니다.이 정의된 간격은 하나입니다. 대조군과 마찬가지로 두 개 중 하나와 둘 에 간격에 대한 단계를 반복합니다. 또한 분석 프로파일에서 분석할 매개 변수를 정의합니다.영역에서 종속 변수를 선택하고 영역 중심, 본문 점, 중심점을 선택하고 평가판 통계를 선택합니다. 주파수, 누적 지속 시간을 선택하고 첫 번째 를 볼 수 있습니다. 또한 거리 이동을 변수로 추가합니다.이 프로필을 사용하면 중앙, 센터 항목 및 거리 이동에 소요되는 시간에 대한 데이터를 사용할 수 있습니다. 각 부서에서 데이터를 추출하려면 결과로 이동하여 통계 및 차트를 선택하려면 계산을 눌러 분석된 데이터를 확인합니다. 내보내기 데이터를 누르고 평가판 통계와 저장할 위치를 선택합니다.내보낸 데이터는 엑셀 파일로 저장되며 모든 마우스에 대한 개별 값입니다. 또한, 열지도 시각화및 플롯 히트 맵을 눌러, 모든 마우스와 평가판에 대한 개별 열지도를 볼 수있는 오른쪽에 시험을 선택합니다. 마우스를 마우스오른쪽 으로 클릭하고 열지도를 이미지로 내보냅니다.나중에, 엑셀 파일을 컴퓨터를 열고 네 가지 시험과 모든 측정 된 컨디셔닝 그룹에 대한 평균 및 표준 유로 SCM을 계산합니다. 그래프와 시그마 플롯을 생성하려면 수단과 SCM을 추가 파일에서 시그마 플롯에 올바른 순서로 복사합니다. 행은 하나 에서 하나에 대한 데이터를 포함해야하며 열에는 평가판, 평균 및 SCM hertz가 포함되어 있습니다.세 열을 모두 선택하고 그래프를 작성합니다. 막대 상자를 선택하고 화살표로 그룹화되지 않은 상자를 선택합니다. 전체 그래프에 레이블을 지정하고 집으로 이동하여 그래프 상자를 선택하고 내보내기를 누릅니다.대상 폴더를 선택하고 메타 파일을 형식으로 선택합니다. 획득된 데이터에 대한 통계를 계산하려면 Xcel에서 오른쪽 데이터를 하나, 등 세테라 및 시그마 플롯의 단일 열에 복사합니다. 비교할 열을 표시하고 분석으로 이동하여 T 테스트 및 실행 중기를 선택합니다.마지막으로, 행동 데이터는 추가 히트 맵 전문화로 해제 및 시험판에 나눌 수 있습니다. 오픈 필드 실험에서, Channelrhodopsin2 및 피라미드 뉴런의 빛 자극 도중, 센터 기간은 감소합니다, 증가된 불안 수준을 나타내는. 면역히스토케를 통해, 바이러스의 주사 부위 및 발현이 결정될 수 있으며, 또한 특수 Cre-의존하는 마우스 라인의 특이성에서도 검증될 수 있다.하나는 명확하게 Channelrhodopsin2의 빛 자극이 특정 피질 지역의 마음 뉴런을 향상 불안 수준을 증가 것을 볼 수 있습니다, 그 자극 전에 기준선 불안에 비해. 행동에 조작의 이 즉각적인 효력은 편유전학이 행동에 관하여 이렇게 많은 연구 질문에 오늘 이용되는 이유입니다. 이 절차는 마우스 두뇌에 있는 어떤 원하는 세포 모형 또는 신경 회로의 Optogenetic 변조를 위해 이용될 수 있습니다.이 절차를 연구에 적합한 행동 테스트와 결합함으로써 행동과 관심 있는 질병에 관련된 신경 회로에 대한 심층적인 통찰력을 얻을 수 있습니다.

optogenetic-manipulation-neuronal-activity-to-modulate-behavior

Research

연구

JoVE Journal

Behavior

행동

출처: Kodani, S., et.al. 마우스의 수면/각성 상태를 모니터링하는 동안 신경 회로의 광유전학적 조작. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 생쥐의 수면에서 각성으로의 전환에 관여하는 신경 회로의 광유전학적 조작을 보여줍니다. 이 절차에는 광섬유와 전극을 뇌와 근육에 외과적으로 이식하여 빛 자극과 전기생리학적 기록을 가능하게 하는 것이 포함됩니다. 말단 줄조선(BNST)의 침대 핵에서 빛에 민감한 양이온 채널을 활성화하기 위해 빛을 전달함으로써 신경 활동이 조절되어 연구자들은 각성 유도와 관련된 뇌 및 근육 신호를 분석할 수 있습니다.

마우스의 수면에서 각성으로의 전환을 위한 신경 회로의 광유전학적 조작

이 비디오는 GABAergic 내측 중격 뉴런에 빛에 민감한 이온 채널이 있는 유전자 조작 마우스 모델에서 세타 진동을 조절하는 프로토콜을 보여줍니다. 이 프로토콜은 광 펄스를 해마에 전달함으로써 뉴런 활동을 동기화하고 국소 자기장 전위로 기록되는 세타 진동을 생성하는 것을 목표로 합니다.

마우스 모델에서 Theta Oscillations의 선택적 조작

신경 질환의 유전자 변형과 녹아웃 마우스 모델은 정상 및 비정상 신경 생리학에있는 유전자의 역할을 공부하는 데 유용합니다. 이 문서는 장기 상승 작용, 유전자 변형에, 학습과 기억의 기초 및 신경 병리학의 마우스 모델을 행동 자유롭게 녹아웃 수있는 세포 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수있는 방법에 대해 설명합니다.

자유롭게 마우스를 동작에 문제가있는 Perforant 통로 - 치아 이랑 (dentate gyrus) 시냅스의 장기 강화 작용

우리는 시험관 내에서 신경 세포 집단을 광자극하기 위해 광유전학적 접근 방식을 사용하여 전뇌 회로의 기능적 지형 및 시냅스 특성을 특성화하는 방법을 설명합니다.

광유전학적으로 표적화된 전뇌 회로의 레이저 스캐닝 광자극

광유전학은 행동 신경과학 실험에 사용할 수 있는 강력한 도구가 되었습니다. 이 프로토콜은 레이저 시스템의 설계 및 설정에 대한 단계별 가이드를 제공하며, 대부분의 설치류 행동 테스트 패러다임과 호환되는 다중 및 동시 생체 내 광유전학적 자극을 수행하기 위한 전체 프로토콜을 제공합니다.

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

우리 동작 쥐에서 hippocampal 세타 진동 (5-10 Hz)의 선택적 조작에 대 한 optogenetics 및 electrophysiological 기록의 사용을 설명합니다. 리듬 유입의 효능은 사용 하 여 로컬 필드 가능성을 모니터링 하 고 있다. 광학-및 pharmacogenetic 저해의 조합 해결 hippocampal 동기화의 원심 판독 합니다.

Optogenetic 쥐 행동에 Hippocampal 세타 진동의 유입

이 작품은 optogenetic 단일-단위 맞춤 유리 optrode를 사용 하 여 깨어 마우스에서 안정적으로 녹화를 수행 하는 방법을 소개 합니다.

깨어 있는 쥐에 유리 Optrode 신경 형식의 Optogenetics 식별

여기에서, 우리는 마우스에 있는 잠/각성 상태의 감시 도중 뉴런의 특정 모형의 광유전학 조작의 방법을 기술합니다, 예를 들면 stria 말단의 침대 핵에 우리의 최근 일을 제시하.

마우스에서 수면/각성 상태를 모니터링하는 동안 신경 회로의 광유전학 적 조작

여기에서 우리는 마우스에 있는 optogenetics를 사용하여 장소 환경 설정 패러다임에 대한 2개의 따르기 쉬운 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이러한 두 가지 설정을 사용하여, 선호도 및 회피 거동은 높은 공간 및 시간 선택성을 가진 동일한 장치 내에서, 그리고 간단한 방식으로 단단히 평가될 수 있다.

마우스의 복부 테그멘탈 영역 내에서 광유전학을 사용하는 두 가지 실시간 장소 선호 패러다임

본 프로토콜은 자유롭게 움직이는 마우스에서 숙련 된 운동 거동의 성능에 관여하는 신경 회로를 특성화하기 위해 단일 펠릿 도달 - 투 - 파악 작업에서 고속 비디오 그래피와 결합 된 무선 광유전학을 사용하는 방법을 설명합니다.

생체 내 숙련 된 운동 행동의 무선 광유전학 제어

이 논문은 CsChrimson 및 GtACR2를 활용하여 특정 뉴런을 활성화하고 침묵시키는 Drosophila melanogaster의 광유전학적 조작 방법을 제시합니다. 광유전학을 활용하여 열택 및 미각 행동을 탐구하고 이러한 과정을 제어하는 기본 신경 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 네 가지 실험이 설명됩니다.

Drosophila melanogaster에서 신경 회로의 광유전학적 조작을 위한 행동 분석

학습하세요 광유전학을 이용하여 자유롭게 움직이는 마우스의 특정 신경 세포를 정밀하게 조작하고 행동을 변화시키는 방법을. 이 기술은 신경 회로 연구와 행동 신경과학에 필수적인 도구입니다.

자유롭게 움직이는 마우스에 있는 행동을 조절하기 위하여 신경 활동의 광유전학 조작

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