Name: 틸라피아 호수 바이러스의 특이적이고 신속한 검출을 위한 역전사 루프 매개 등온 증폭(RT-LAMP) 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 학습하세요 틸라피아 호수 바이러스(TiLV)를 신속하게 검출하는 RT-LAMP 분석법을 통해 어류 바이러스학 및 수산양식학 연구를 수행하는 방법을 배우세요. 이 기술은 개발도상국에서 질병 관리와 식량 안보를 지원합니다.

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이 프로젝트는 태국 연구 기금 (TRF) 교부금 번호 RDG6050078 및 고급 연구 센터, 고급 연구 연구소, 카세차르트 대학, 방콕, 태국 고등 교육 연구 진흥 및 태국 국립 연구 대학 프로젝트, 고등 교육위원회 사무실, 교육청, 태국에 의해 재정적으로 지원됩니다. 이 연구는 카세사르 대학 대학원의 대학원 프로그램 장학금에 의해 부분적으로 지원됩니다. 저자는 비디오의 이야기 말하기에 대한 박사 Kwanrawee 시리칸차나 감사하고 비디오를 편집 피야 와카라 시카린.

동물 조직의 사용을 관련시킨 이 실험은, 카세셋 대학, 방콕, 태국의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다 (프로토콜 번호 ACKU61-VET-009).
1. 조직 수집
<ol><li>정향 오일의 과다 복용을 사용하여 틸라피아 물고기를 안락사 (즉, 3 mL / L 이상). 트리카인 메탄설포네이트는 정향 오일의 대안으로 사용될 수 있습니다.</li>
	<li>멸균 마요네즈 가위와 집게를 사용하여 포스트 모템 틸라피아의 복부를 열고 간 조직의 약 30-50 mg을 절제하거나 현미경 커버 유리를 사용하여 물고기 피부 층을 세로로 긁어 서 점액 100 μL을 1.5 mL 마이크로 센트리 튜브로 수집하십시오.</li>
	<li>RNA 추출 단계를 즉시 진행하거나 실험전까지 수집된 샘플을 -80°C에서 유지한다. 손상되지 않은 RNA는 DNA보다 더 민감하기 때문에 RNA 추출 중에 RNase 가없는 물질과 시약을 사용하십시오.</li>
</ol>2. RNA 추출
<ol><li>간 조직에서 RNA를 추출하려면 틸라피아 조직의 30-50 mg을 구니디늄 산-페놀 추출 시약 600-1,000 μL을 함유한 1.5 mLTable of Materials미세원심지 튜브에 넣고 휴대용 조직 균질화를 사용하여 균질화될 때까지 시료를 분쇄합니다. 조직 샘플은 구니디늄-산-페놀 추출 시약의 약 10%를 필요로 합니다. 점액 샘플의 경우 구니디늄-산-페놀 추출 시약(3:1)의 300 μL만 사용하십시오. 주의: 구니디늄-페놀 추출 시약은 독성; 따라서 취급은 주의해야 합니다. 안전 안경, 실험실 가운 및 안전 장갑과 같은 보호 장비는 반드시 착용해야 합니다.</li>
	<li>10,000 x g에서 실온에서 30s의 균질화된 샘플을 원심분리하고, 상구체를 새로운 멸균 1.5 mL 마이크로원심지 튜브로 옮긴다.</li>
	<li>튜브에 95 % 에탄올의 동일한 볼륨을 추가하고 잘 혼합.</li>
	<li>실온에서 30s에 대해 10,000 x g에서 수집 튜브 및 원심 분리기에 놓인 스핀 컬럼(재료 표)으로솔루션을 옮니다. 흐름을 취소하고 스핀 컬럼을 새 컬렉션 튜브로 전송합니다.</li>
	<li>400 μL의 RNA 프리 워시 시약(재료 표)을실온에서 30 s동안 10,000 x g의 기둥과 원심 분리기에 넣고 흐름을 폐기하십시오. 이 단계를 한 번 더 반복합니다. 참고: RNA 프리 워시를 준비하려면 RNA 프리 워시 농축액 40 mL에 95% 에탄올 10 mL를 추가하십시오.</li>
	<li>RNA 세척 버퍼(재료 표)의700 μL을 실온에서 2 분 동안 10,000 x g에서 열과 원심 분리기에 추가하십시오. 컬럼을 멸균 된 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮김. 참고: RNA 세척 버퍼를 준비하려면 RNA 워시 버퍼 농축액 12 mL에 95% 에탄올 52 mL를 추가하십시오.</li>
	<li>스핀 컬럼 매트릭스에서 포획된 RNA 샘플을 실온에서 30초 동안 10,000 x g에서 100μL의 뉴클레아제 없는 물과 원심분리기를 사용하여 용해합니다.</li>
	<li>마이크로볼륨 분광광도계를 사용하여 추출된 RNA의 농도를 측정하고 뉴클레아제 없는 물을 사용하여 원하는 농도로 RNA를 희석합니다. 참고: OD260/OD280의 적격 흡광도 값은 1.6에서 1.9 사이로 RT-LAMP 분석에 허용되는 RNA 순도를 나타냅니다.</li>
	<li>즉시 다음 단계로 진행하거나 사용 될 때까지 샘플을 -80 °C로 유지하십시오.</li>
</ol>3. 프라이머 디자인
<ol><li>프라이머 탐색기 버전 4를 사용하여 RT-LAMP의 특정 프라이머를 디자인합니다. 웹 사이트로 이동하여 https://primerexplorer.jp/e/ PrimerExplorer V4 버튼을 클릭합니다.</li>
	<li>FASTA 형식으로 TiLV의 세그먼트 3 시퀀스가 포함된 파일을 선택한 다음 프라이머 디자인 버튼을 클릭합니다. 참고 : 틸라피아 호수 바이러스 TV1 세그먼트 31을나타내는 GenBank 가입 번호 KX631923에서 FASTA 형식으로 시퀀스를 검색합니다.</li>
	<li>프라이머를 디자인하려면 다음과 같은 기본 매개 변수를 입력합니다. - 40%-60%의 GC 콘텐츠 - ≥280 염기 쌍 (bp)의 앰플리온 - 최대 차인 프라이머 간에 5°C의 유사한 용융 온도(Tm) 참고: 프라이머는 서로를 보완해서는 안 됩니다.<ol>
<li>보조 구조물을 형성하는 경향이 있는 서열 영역을 피하십시오.</li>
		<li>가장 큰 ΔG에 대한 최적의 설계를 위해 최소 -3.5의 디머 프라이머 해석을 선택하고 더 작은 ΔG에 대한 최적의 설계를 위해 최대 -4의 프라이머 끝을 선택합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>생성 단추를 클릭합니다. 참고: 소프트웨어가 입력 데이터 처리를 완료하면 프라이머 결과가표시됩니다(그림 1).</li>
</ol>4. RT 램프 분석
<ol><li>1x SD II 반응 완충제 2.5 μL, 6mM MgSO4,1.4 μL의 1.4 μL, 0.8m 베타인 4μL, 0.052 mM 칼세인 혼합물 1.3 μL, 1 μL 의 1 μL을 함유하는 RT-LAMP 마스터 믹스를 준비합니다. 1 μL 의 1.6 μM TiLV-B3 프라이머, 1 μL 의 0.2 μM TiLV-BIP 프라이머, 0.2 μM TiLV-FIP 프라이머의 1 μL, 0.3 U Bst DNA 폴리머의 1 μL, 0.1 U AMV 역전사, 3.8 μL의 핵항염. 참고: 총 반응 량의 10% 이상을 포함하는 과잉 마스터 믹스를 준비한다.</li>
	<li>RT-LAMP 마스터 믹스의 22 μL을 멸균 된 1.5 마이크로 원심 분리 튜브에 분배하십시오.</li>
	<li>추출된 RNA의 3 μL을 반응 튜브에 추가하고, 와류에 의해 샘플을 혼합한다. 부정적인 제어를 위해 RNA 물질 대신 증류수를 사용하십시오.</li>
	<li>65°C에서 60분 동안 인큐베이션한 다음, 80°C를 10분 동안 배양하여 반응을 종료하였다.</li>
	<li>배양 후 육안으로 색채 변화를 시각적으로 관찰하십시오. 긍정적인 결과는 형광 녹색으로 나타납니다.</li>
</ol>5. 아가로즈 젤 전기 동동
<ol><li>1x TAE 완충액 40 mL에 아가로즈 분말 0.6 g을 일시 중단하여 1.5% w/v 아가로즈 젤을 준비합니다. 아가로즈가 완전히 녹을 때까지 3-5분 동안 전자레인지에 가열하여 혼합물을 녹이고 소용돌이를 섞습니다.</li>
	<li>아가로오스가 온도가 65°C에 도달할 때까지 식힙니다. 아가로즈 용액 40 mL을 젤 트레이에 붓고 젤 몰드에 빗을 추가합니다.</li>
	<li>아가로즈 젤이 완전히 굳어지때까지 실온에서 20-30분 동안 설정합니다. 그런 다음 빗을 제거하고 젤 탱크에 젤을 놓습니다.</li>
	<li>겔 탱크에서 겔의 표면을 덮기 위해 실행 버퍼를 추가합니다.</li>
	<li>RT-LAMP 샘플 10 μL과 6x 젤 로딩 버퍼 2 μL을 각 웰에 추가합니다. 기준 차선에 1kb DNA 사다리 의 5 μL을 추가합니다.</li>
	<li>음극과 전원 공급 장치에 연결된 양극에 연결된 뚜껑을 연결합니다. 전원 공급 장치를 켜고 일정한 100V로 설정하고 40 분 동안 실행하십시오.</li>
	<li>겔 분리를 완료한 후, 겔 트레이에서 겔을 제거합니다. 그런 다음 에티듐 브로마이드(EtBr)를 사용하여 배수된 겔을 7분 동안 10 mg/mL의 농도로 염색하고 증류수에서 5분 동안 레스테인합니다. 주의: EtBr은 독성이 있으며 발암 물질로 간주됩니다. 따라서 이 에이전트를 사용할 때는 주의해야 합니다.</li>
	<li>밴드가 나타나는 젤 문서 시스템을 사용하여 자외선에 젤을 노출하고 젤의 사진을 찍습니다.</li>
</ol>6. 상보DNA (cDNA) 합성
<ol><li>5x RT 완충제 2 μL, 프라이머 믹스 0.5 μL, RT 효소 0.5 μL, 반응당 2 μL의 뉴클레아제 없는 물을 함유하는 cDNA 합성 마스터 믹스를 준비합니다. 참고: 파이펫팅 중 잠재적 손실로 인한 반응의 1배를 포함하는 과잉 마스터 믹스를 준비합니다.</li>
	<li>마스터 믹스의 5 μL을 멸균 1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브에 분배합니다.</li>
	<li>희석된 추출 RNA(단계 2.8로부터 수득)의 100 ng를 반응 튜브에 넣고, 혼합하고 아래로 회전하여 모든 혼합물을 용기의 바닥으로 이동시켰다.</li>
	<li>42°C에서 60분 동안 배양한 다음 PCR 기계에서 5분 동안 98°C를 배양하였다. 사용 될 때까지 cDNA를 -20 °C에서 보관하십시오.</li>
</ol>7. RT-qPCR
<ol><li>반응당 0.3 μL의 10 μM 역프라이머, 0.3 μL의 10 μM 포워드 프라이머, 5 μL의 SYBR 그린 DNA 폴리머라제, 0.4 μL의 뉴클레아제 함유물을 함유하는 TiLV qPCR 마스터 믹스를 준비한다. 다음 프라이머 및 컨트롤을 사용합니다. 포워드 프라이머 (TiLV-112F): 5'-CTGAGCTAAgAGAGATATGGATT-3' 리버스 프라이머 (TiLV-112R): 5'-CGTGCGTACTTTTTTCAGTATAAGTTCT-3'</li>
	<li>TiLV qPCR 마스터 믹스의 6 μL을 사용된 실시간 열 사이클러와 호환되는 qPCR 스트립의 각 웰에 분배합니다.</li>
	<li>cDNA 템플릿의 4 μL, 음극 대조물 (뉴클레아제 없는 물), 양성 대조군 (10 pg/μL), 및 pTiLV (플라스미드)10 또는 직렬로 희석 된 TiLV 플라스미드를 웰에 넣고 각 샘플을 쓸어 넘기면서 혼합합니다. 각 샘플을 세 배로 실시합니다.</li>
	<li>qPCR 반응을 프로그래밍된 실시간 열 사이클러에 넣습니다. qPCR 프로그램을 3분 동안 95°C에서 인큐베이션을 수행한 다음, 온도가 0.5°C/5°S 증분에서 65°C에서 95°C로 증가해야 하는 용융 곡선 단계 전에 10s및 60s의 경우 95°C의 40 사이클을 수행합니다.</li>
	<li>증폭 및 용융 곡선을 평가하여 데이터 분석을 수행한 다음 직렬로 희석된 플라스미드를 사용하여 데이터로부터 얻은 표준 곡선을 사용하여 TiLV 복사 수를 계산합니다.</li>
</ol>

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저자는 공개 할 것이 없다.

양식 산업은 지속적으로 상당한 경제적 손실을 일으키는 바이러스 감염에 의해위협9,,,23,28. 예를 들어, 신흥 TiLV는 세계1,,6,,9의많은 지역에서 틸라피아 생산 국가에 큰 위협을 제기한다. 지금까지, TiLVD를 방지 하기 위해 사용할 수 있는 특정 치료 되었습니다. 백신의 개발이 진행되는 동안, 효율적인 백신은 상업적 목적으로 사용할 수 있기 전에 상당한 시간이 필요합니다. 이러한 상황을 감안할 때, TiLVD29,,30의확산을 방지하기 위해 어류 양식장에서 소독제의 적용과 같은 엄...

틸라피아 호수 바이러스 질환(TiLVD)은 아시아1,2,2아프리카 및 미국을 포함한 세계의 많은 지역에서 틸라피아 사망을 유발하는 틸라피아(Oreochromis spp.)의 바이러스 성 질환이다. 이 질병은 2009년 이스라엘에서 틸라피아의 대량 사망률에서 처음 인식되었으며, 키너렛 호수의 야생 틸라피아 수는 연간 257톤에서8톤으로급격히 감소했습니다 2. 이 질병은 틸라피아 호수 바이러스(TiLV)에 의해 발생하며, 이는 새로운 종인 틸라핀바이러스와 새로운 종틸라피네바이러스3로 가족암누온비리대에 할당되었다. TiLV의 유전적 특성은 바이러스가 10개의 단백질을11,2,,4를인코딩하는 10개의 세그먼트를 가지는 새로운 포위, 음성 감각, 단일 가닥 RNA 바이러스임을 보여주었다. 사로테오돈, 오레오로미스, 틸라핀 및 기타 따뜻한 물 물고기(예를 들어, 거대 가라미(Osphronemusgoramy))의다양한 종은 TiLV2,,5에취약한 것으로 나타났습니다. 현재, 이 바이러스는 감염된 살아있는 물고기의 움직임을 통해 아마도 전 세계적으로 확산계속6,,7,냉동 틸라피아 또는 그 제품을 통해 바이러스 전송의 위험이 제한되는 동안8. TiLV 감염으로 인한 실질적인 사망률은 틸라피아 산업에 상당한 해로운 경제적 영향을 미칠 가능성이 있다. 예를 들어, TiLV 감염과 관련된 이집트의 여름 사망 증후군의 경제적 영향은 미화 1억 달러9로계산되었습니다. 따라서, 어류 양식장에서 이 질병의 통제를 용이하게 하기 위해 신속하고 적절한 진단 방법을 개발하는 것이 중요하다.
지금까지 TiLVD의 진단은 분자 분석, 바이러스 격리 및 조직 병리학에 기반을 두고 있습니다. 다른 PCR 프로토콜 및 프라이머는 TiLV 진단10,,11을위해 개발되었습니다. 예를 들어, 바이러스의 2개의 사본/μL만큼 적은 수의 검출을 위한 민감성을 가진 SYBR 녹색 기반 역전사 정량적 PCR(RT-qPCR) 방법은 TiLV 검출을 위해 개발 및 검증되었다10. TiLV 검출을 위한 다른 PCR 방법은 TaqMan 양적 PCR11,RT-PCR2,중첩 된 RT-PCR12및 반 중첩 된 RT-PCR13을포함한다. 그러나 이러한 방법은 반응의 복잡성으로 인해 결과를 산출하기 위해 정교한 실험실 장비와 비교적 오랜 시간이 필요하므로 현장 적용에 적합하지 않습니다.
루프 매개 등등 증폭(LAMP) 분석은 신속하고 간단하며 실용적인 현장 용 어플리케이션14,,15이다. 이 기술은 가닥 변위 반응의 원리를 채택하고 증폭 반응은 정교하고 고가의 열 사이클러(14,,15)없이등온 조건하에서 실행됩니다. 따라서 증폭된 LAMP 제품 또는 RT-LAMP 제품은 DNA 또는 RNA14의 안전한 시각화를 위해 형광 얼룩을 가진 아가로즈 겔 전기영동을 이용한 사다리형 밴드로 분석되거나 탁도 또는 백색 침전물의 존재에 대한 육안으로관찰16,,17,,18. 이러한 이유로, 이 기술은 상이한 어류 병원체17, 18,,19,,20,,19,21,,22,,23,24,,,25,,26,,27의현장 검출에 사용되어 왔다. 이 연구의 목적은 TiLV 검출을 위한 신속하고 민감하며 정확한 RT-LAMP 분석방법을 확립하는 것이었습니다. RT-LAMP 분석기는 30분 이내에 물고기 샘플에서 TiLV에 대한 스크리닝을 제공합니다. 이 기술은 TiLVD의 진단 및 감시를 위해 적용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>Tissue collection:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clove oil</td><td>Better Pharma</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>정향 오일에 대한 대안 옵션</td></tr><tr><td>RNA 추출:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>산성 guanidinium-phenol 기반 시약(TRIzol 시약)</td><td>ThermoFisher Scientific Corp.</td><td></td><td></td>15596026</tr><tr><td>산성 guanidinium-phenol 기반 시약 (GENEzol 시약)Geneaid</td><td></td> <td>GZR100</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Kit:</td><td>Zymo Research</td><td>R2071</td><td></td></tr><tr><td>- Direct-zol RNA PreWash</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>- RNA Wash Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>- DNase/RNase-free water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>- Zymo-spin IIICG 컬럼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>- 수집 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RT-LAMP:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x SD II 반응 버퍼</td><td>Biotechrabbit</td><td>BR1101301</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>dNTP set</td><td>Bioline</td><td>BIO-39053</td><td></td></tr><tr><td>베타 인</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>B2629</td><td></td></tr><tr><td>칼세인 혼합물</td><td>Merck</td><td>1461-15-0</td><td></td></tr><tr><td>Bst DNA 중합 효소</td><td>Biotechrabbit</td><td>BR1101301</td><td></td></tr><tr><td>AMV 역 전사 효소</td><td>Promega</td><td>M510A</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제가없는 물</td><td>Invitrogen</td><td>10320995</td><td></td></tr><tr><td>Elite 건식 수조 인큐베이터, 단일 장치</td><td>주요 과학</td><td>EL-01-220</td><td></td></tr><tr><td>Gel 전기영동:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Vivantis Technologies</td><td>PC0701-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-borate-EDTA (TBE) 버퍼</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRE0062</td><td></td></tr><tr><td>Tris-acetic-EDTA (TAE) 버퍼 :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>- Tris</td><td>Vivantis Technologies</td><td>PR0612-1KG</td><td></td></tr><tr><td>- 아세트산(빙차), EMSURE</td><td>Merck Millipore</td><td>1000632500</td><td></td></tr><tr><td>- 디소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트 이수화물(EDTA), Vetec</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V800170-500G</td><td></td></tr><tr><td>Neogreen</td><td>NeoScience Co., Ltd.</td><td>GR107</td><td></td></tr><tr><td>DNA 겔 로딩 염료 (6X)</td><td>ThermoFisher Scientific Corp.</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>DNA 사다리 및 마커</td><td>Vivantis Technologies</td><td>PC701-100G</td><td></td></tr><tr><td>Mini Ready Sub-Cell GT (수평 전기 영동 시스템)</td><td>Bio-Rad</td><td>1704487</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac HC 전원 공급 장치</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc EZ 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>1708270</td><td></td></tr><tr><td>UV 샘플 트레이</td><td>Bio-Rad</td><td>1708271</td><td></td></tr><tr><td>N&알파; BI 이미저</td><td>Neogene Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cDNA synthesis:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT Kit</td><td>Toyobo</td><td>FSQ-101</td><td></td></tr><tr><td>Viva cDNA Synthesis Kit</td><td>Vivantis Technologies</td><td>cDSK01</td><td>An alternative option for cDNA synthesis</td></tr><tr><td>NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer)ThermoFisher</td> <td>Scientific Corp.</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>RT-qPCR:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725120</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water, sterile water</td><td></td><td>MultiCell 809-115-CL</td><td></td></tr><tr><td>8-tube PCR strips, white</td><td>Bio-Rad</td><td>TLS0851</td><td></td></tr><tr><td>플랫 PCR 튜브 8캡 스트립, 광학</td><td>Bio-Rad</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td>일반 장비 및 재료:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mayo 가위</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2 (와류 믹서)</td><td>과학 산업</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 LM-60</td><td>LioFuge</td><td>CM610</td><td></td></tr><tr><td>Corning LSE 미니 마이크로 원심분리기</td><td>Corning</td><td>6765</td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>Rainin</td><td>Pipete-Lite XLS</td><td></td></tr><tr><td>QSP 여과 피펫 팁</td><td>Quality Scientific Plastics</td><td>TF 시리즈</td><td></td></tr><tr><td>Corning Isotip 여과 팁</td><td>Merck</td><td>CLS 시리즈</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브, NEST</td><td>Wuxi NEST 생명공학</td><td>615601</td><td></td></tr></tbody></table>

틸라피아 호수 바이러스의 특이적이고 신속한 검출을 위한 역전사 루프 매개 등온 증폭(rt-lamp) 분석

Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus

틸라피아 호수 바이러스(TiLVD)는 틸라피아 호수 바이러스(TiLV)에 의한 틸라피아의 새로운 바이러스 질환으로, 전 세계 많은 지역에서 틸라피아의 대량 이환율과 사망률을 초래한 양식 산업에서 지속적인 과제입니다. 따라서 TiLV 감염에 대한 효과적이고 신속하며 정확한 진단 분석법은 초기 감염을 감지하고 양식 농업에서 질병의 확산을 방지하는 데 필요합니다. 본 연구에서, 매우 민감하고 실용적인 역전사 루프 매개 등온 증폭(RT-LAMP) 방법은 어류 조직에서 틸라피아 호수 바이러스를 검출하기 위해 제시된다. 감염된 샘플의 RT-qPCR 및 RT-LAMP 검문 결과를 비교한 결과 63개(100%)에서 긍정적인 결과가 나타났습니다. 51 (80.95%) 각각 샘플을 채취한다. 더욱이, 감염되지 않은 견본의 분석은 모든 63의 감염되지 않은 조직이 RT-qPCR 및 RT-LAMP 분석결과 둘 다에 대한 부정적인 결과를 산출한다는 것을 보여주었습니다. 틸라피아에 있는 5개의 병원체를 가진 교차 반응성은 RT-LAMP를 사용하여 평가되고, 모든 시험은 부정적인 결과를 보여주었습니다. 감염된 물고기에게서 얻은 간 및 점액 견본 둘 다 RT-LAMP 방법을 사용하여 비교 결과를 보여주었습니다, 점액이 물고기를 죽이는 것을 피하기 위하여 비치명적인 분석으로 RT-LAMP에서 사용될 수 있다는 것을 건의합니다. 결론적으로, 제시된 RT-LAMP 분석법은 1시간 이내에 틸라피아 조직에서 TiLV 검출을 위한 효과적인 방법을 제공한다는 것을 입증하였다. 이 방법은 따라서 TiLV의 신속한 진단을 위한 농장에서 검열 공구로 추천됩니다.

이 연구에서는, 틸라피아에서 TiLV 감염을 검출하기 위해 RT-LAMP 분석이 개발되었다. 테스트된 샘플은 2015년과 2016년 사이에 태국의 다른 지역에 위치한 14개의 농장에서 수집되었습니다. 감염되고 감염되지 않은 물고기는 주로 물리적 인 진단과 증상 TiLVD의 출현에 따라 그룹화되었습니다. TiLV 감염은 수집 과정 후 RT-PCR을 사용하여 이후에 확인되었다. 아가로즈 겔 전기동동및 발광 녹색의 검출은 LAMP 앰플리온의 평가 방법으로 선택하였다(도2). 감염된 틸라피아 물고기의 간 및 점액은 피부 침식, 피부 발적, 외피, 복부 부종을 포함하는 TiLV 질환 증상의 임상적 출현을 특징으로 했다. 이전 보고는 TiLV35의존재를 결정하기 위하여 분자 진단 검정에 있는 간 견본의 사용을 설명했습니다. 대안적으로, 점액은 동물을 죽이는 것을 피하는 것을 도울 수 있기 때문에 분석에서 유익할 수 있습니다. 그 결과 감염된 물...

우리는 기존의 RT-PCR 기술에 비해 상대적으로 짧은 기간 동안 간단한 악기를 사용하여 틸라피아 물고기에서 TiLV의 검출을위한 RT-LAMP 분석법을 제시한다. 이 프로토콜은 특히 개발도상국에서 TiLVD의 전염병 확산을 제어하는 데 도움이 될 수 있습니다.

틸라피아 호수 바이러스의 특이적이고 신속한 검출을 위한 역전사 루프 매개 등온 증폭(RT-LAMP) 분석

Tilapia lake virus disease (TiLVD), an emerging viral disease in tilapia caused by the tilapia lake virus (TiLV), is a persistent challenge in the ...

틸라피아 호수 바이러스는 틸라피아와 그 하이브리드 종에서 높은 사망률을 일으키는 신흥 바이러스및 전염성 병원체입니다. 틸라피아는 많은 개발도상국의 주요 단백질 공급원이기 때문에, 새로운 바이러스 감염은 틸라피아 양식에 큰 영향을 미치고, 또한 세계 식량 안보를 위협합니다. 물고기 조직에서 바이러스를 검출하는 빠르고 정확하며 민감한 방법의 개발은 질병 조절에 도움이되며 바이러스의 영향을 줄일 수 있습니다.이 비디오에서는 물고기 샘플에서 틸라피아 호수 바이러스를 신속하게 검출하기 위해 역전사 루프 매개 이더스말 증폭 또는 RT-LAMP 분석방법을 보여줍니다. 2부, RNA 추출. 첫째, 멸균 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브에 간 조직의 3250 밀리그램을 추가, 포함 600 받는 르 1000 마이크로 리터 산 guanidinium-phenol 베이스 시약, 그리고 균질까지 다진.원심분리기는 10, 000 RCF에서 30초 동안 새로운 튜브로 상전자를 전송합니다. 튜브에 95%에탄올의 동일한 볼륨을 추가하고 철저히 섞습니다. 솔루션을 스핀 컬럼으로 옮기고 수집 튜브에 배치한 다음 원심분리기를 10, 000 RCF로 30초 간 전송합니다.흐름을 버리고 컬럼을 새 수집 튜브로 옮습니다. RNA PreWash 400 마이크로리터를 컬럼에 넣고 원심분리기를 10, 000 RCF에서 30초 간 추가합니다. 흐름을 버리고 이 단계를 반복합니다.700 마이크로리터 RNA 워시 버퍼를 컬럼에 넣고 원심분리기를 10, 000 RCF에서 2분간 추가합니다. 그 후, 컬럼을 멸균 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮기다. 마지막으로, RNA를 100 마이크로리터, 뉴클레아제 없는 물 및 원심분리기를 30초 동안 10, 000 RCF로 컬럼 매트릭스로 내다보고 있다.3 부, 프라이머 디자인. 프라이머익스플로러 버전 4는 효율적인 LAMP 또는 RT-LAMP 프라이머를 설계하기 위한 가장 일반적인 생물정보학 도구로, 소프트웨어에 대한 좋은 매뉴얼을 웹 사이트에서 사용할 수 있습니다. 여기서, 네 개의 특정 프라이머, 두 개의 내부와 두 개의 외부 프라이머로 구성, TiLV의 세그먼트 3에서 여섯 개의 별개의 영역을 인식하도록 설계되었습니다, 태국에서 유래.링크가 비디오에 표시되는 웹 사이트를 입력한 후 PrimerExplorer V4를 클릭합니다. TiLV의 세그먼트 3의 시퀀스를 포함하는 파일을 선택, FASTA 형식으로, GenBank 액세스 번호에서 검색, KX631923, 또는 틸라피아 호수 바이러스 TV1 세그먼트 3, 다음 프라이머 디자인 버튼을 클릭합니다. 생성 버튼을 클릭하면 소프트웨어가 처리되고 결과가 표시됩니다. LAMP 증폭을 위한 서열을 최적화한 후, 총 1쌍의 외부 프라이머와 두 쌍의 내부 프라이머가 TiLV 감염을 검출하기 위해 선택되었다.프라이머의이 세트는 여기에 표시됩니다. 4부, RT-LAMP 시연. 틸라피아 호수 바이러스에 특이적인 RT-LAMP용 마스터 믹스는 다음 화학 물질로 구성된다.테이블에 표시된 화학 물질을 사용하여 마스터 믹스를 준비합니다. 멸균 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브에 마스터 믹스 22 마이크로리터를 분배합니다. 그런 다음 반응 튜브에 RNA 템플릿의 3 마이크로 리터를 추가합니다.음의 조절을 위해 RNA 재료 대신 증류수를 사용하고 잘 섞습니다. 60분 동안 65도의 반응에 따라 10분 동안 섭씨 80도가 됩니다. 30 분 동안 잠복 후, 칼로리 변화는 육안으로 시각적으로 관찰됩니다.적절한 경우, 우리는 1.5%의 아가로즈 겔에 겔 전기전도를 수행하여 100볼트 상수로 40분 동안 겔 전기전도를 수행하여 1킬로베이스 쌍 분자 크기의 DNA 사다리가 마커로 적재되어 단편 크기를 결정할 수 있도록 RT-LAMP 분석 결과를 확인할 수 있습니다. 5부, 대표적인 결과 및 해석. 30분 동안 잠복한 후, 물고기 조직에서 TiLV의 양성 증폭을 시사하는 곡물 형광 반응은 365 나노미터의 파장에서 UV 빛 하에서 감염된 샘플에서 명백히 관찰되었으며, 음의 대조군은 명확하고 약간 무색적인 용액을 가졌다.이에 상응하여, RT-LAMP 제품의 증폭은 아가로즈 겔 전기포고에서 확인되었으며, 반전된 DNA 반복의 다중 증폭의 다양한 크기를 나타내고, TiLV-감염된 샘플의 UV 램프 아래에 줄기 루프 구조를 형성하는 반면, 그 결과는 RT-LAMP의 결과에 따라 부정적인 대조군의 우물에 밴드가 표시되지 않았다. 따라서 틸라피아 호수 바이러스의 확산을 줄이기 위해 이러한 감염된 물고기의 즉각적인 검사는 효과적으로 진단 방법을 사용하여 중요한 열쇠 중 하나입니다. 따라서 새로 개발된 RT-LAMP 분석은 생물 보안 측정 과정에서 적용될 신속하고 민감한 진단 도구를 제공해야 합니다.분석은 실험실 또는 현장 시설에서 사용할 수 있습니다. 우리는 틸라피아 호수 바이러스의 확산의 감소로 이어질 수있는 감염된 물고기 인구를 선별하는 방법이 구현되기를 바랍니다.

reverse-transcription-loop-mediated-isothermal-amplification-rt-lamp

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: 돔슬, K. J. 외. 동물성 식품 내 살모넬라 선별과 배양 분리 확인을 위한 루프 매개 등온 증폭.  J. Vis. 경험 (2020).이 영상은 일정한 온도에서 DNA를 증폭하여 목표 박테리아 유전자를 검출하는 루프 매개 등온 증폭(LAMP) 기법을 시연합니다. 반응 혼합물은 등온 마스터 믹스, 표적 유전자에 대한 특정 프라이머, DNA 주형이 포함된 샘플을 첨가하여 준비됩니다. 증폭은 LAMP 기기에서 시작되며, 실시간 형광 모니터링을 통해 표적 유전자의 존재를 확인합니다.

박테리아 유전자 검출을 위한 루프 매개 등온 증폭

이 비디오는 실시간 역전사 PCR을 사용하여 바이러스 감염을 감지하는 정량적 방법을 보여줍니다. 역전사 단계는 RNA를 cDNA로 변환한 다음 PCR 주기를 통해 증폭합니다. 샘플에 바이러스 RNA가 존재한다는 것은 PCR에서 얻은 DNA의 증폭 및 해리 곡선을 분석하여 확인합니다.

바이러스 감염 진단을 위한 Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR

현재 다중화 Zika, chikungunya, 뎅 그 열 바이러스 복잡 한 샘플 준비 및 비싼 장비를 요구 하 고 저 리소스 환경에서 사용 하기 어려운 검출 하는 진단. 우리는 감지 하 여 높은 감도와 특이성이이 바이러스를 차별화 대상 특정 가닥 displaceable 프로브 등온 증폭을 사용 하는 진단을 보여줍니다.

멀티플렉스 등온 증폭 Zika, Chikungunya, 뎅 그 열의 1 감지 진단 플랫폼을 기반으로

이 프로토콜 Zika 바이러스 탐지 또는 반전 녹음 방송 루프 중재 등온 증폭 (RT-램프)에 의해 대상 인간의 소변 및 혈 청 샘플 또는 모기를 제어 하는 효율적이 고 저렴 한 비용 메서드를 제공 합니다. 이 메서드는 RNA 격리는 필요 하지 않습니다 하 고 30 분 이내 할 수 있습니다.

반대로 Zika 바이러스 및 내부 관리 유전자 소변, 혈 청, 그리고 모기 샘플에 대 한 분석 결과 전사 루프 중재 하는 등온 증폭 (RT-램프)

이 프로토콜 tilapia 조직 RT PCR 방법론을 사용 하 여에 Tilapia 호수 바이러스 (TiLV)를 진단 한다. 전체 메서드 총 RNA 추출, cDNA 합성 및 기존의 PCR 또는 양이 많은 PCR dsDNA 염료를 형광 바인딩 바인딩을 사용 하 여 TiLV의 탐지를 조직 해 부에서 설명 되어 있습니다.

Tilapia 호수 바이러스를 사용 하 여 기존의 RT-PCR 및 SYBR의 탐지 RT 정량 그린

dsDNA 인터칼레이팅 염료를 사용하는 이러한 실시간 RT-PCR은 리사바이러스 감염을 진단하는 데 적합합니다. 이 방법은 광견병에서 추출한 RNA로 시작하여 영양분 또는 사후 샘플로 의심되는 데, 마스터 믹스 준비, RNA 추가, 실시간 기계 설정 및 결과의 정확한 해석을 자세히 설명합니다.

광견병 진단을 위한 팬-리사바이러스 실시간 RT-PCR

우리는 뇌 생검 샘플링에서 최종 해석에 이르기까지 신속한 면역 크로마토그래피 진단 테스트 (RIDT)를 사용하여 필드 조건하에서 동물 광견병의 사후 진단을위한 완전한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 분자 분석 및 바이러스 성 지노티핑을 위한 장치를 사용하여 추가 응용을 설명합니다.

추가 분자 응용을 가진 자원 제한 적인 설정을 위한 필드 사후 광견병 급속한 면역학로토그래피 진단 시험

여기에서는 RT-LAMP(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification)를 통해 인간 샘플에서 SARS-CoV-2 바이러스를 검출하는 방법을 표준화하고 구현하기 위한 완전한 프로토콜을 제공합니다. 60분 이내에 완료되는 이 방법은 저렴한 비용과 저렴한 장비를 사용하여 모든 실험실이나 현장 진료에 적용할 수 있습니다.

역전사 루프 매개 등온 증폭을 통한 SARS-CoV-2 바이러스 검출

일반적인 호흡기 바이러스에 대한 두 가지 프로브 기반 원스텝 RT-qPCR 키트를 소개합니다. 첫 번째 분석은 SARS-CoV-2(N), 인플루엔자 A(H1N1 및 H3N2) 및 인플루엔자 B에 대한 것입니다. 두 번째는 SARS-Cov-2(N)와 메르스(UPE 및 ORF1a)에 대한 것입니다. 이러한 분석은 모든 전문 실험실에서 성공적으로 구현할 수 있습니다.

SARS-CoV-2, 인플루엔자 A/B 및 MERS-CoV 검출을 위한 다중 Real-Time RT-qPCR 분석 개발

이 프로토콜은 전체 세포의 급속한 탐지 다음 토마토와 다른 신선한 농산물의 표면 샘플링을위한 간단한 접착제 테이프 기반의 접근 방식을...

접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서</em의 신속한 감지를 위해> 하이브 리다이 제이션 살모넬라균 신선한 농산물에 대한

학습하세요 틸라피아 호수 바이러스(TiLV)를 신속하게 검출하는 RT-LAMP 분석법을 통해 어류 바이러스학 및 수산양식학 연구를 수행하는 방법을 배우세요. 이 기술은 개발도상국에서 질병 관리와 식량 안보를 지원합니다.

틸라피아 호수 바이러스의 특이적이고 신속한 검출을 위한 역전사 루프 매개 등온 증폭(RT-LAMP) 분석

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