Name: 유동 세포형을 사용하여 개발 중인 제브라피시에서 변경된 혈액 형성을 감지하고 양량화합니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 학습하세요 유동 세포형을 사용하여 Danio rerio 배아에서 혈액 세포를 정량화하고 유전자 변형에 따른 혈액 형성 결함을 감지하는 방법을. 이 프로토콜은 빠르고 경제적이며 자동화가 가능합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

기금은 국립 보건원 (NIH: R15 DK14732-01에서 D.L.S.), 국립 과학 재단 (NSF: MRI 1626406에서 D.L.S.까지), 캘리포니아 주립 대학 치코 (K.F.R.에)의 명예 프로그램에서 제공되었습니다. 저자는 실험실 관리에 대한 벳시 타미에티와 행정 지원을 캐시 존스 감사합니다.

캘리포니아 주립 대학 치코의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 자문위원회는 아래에 설명 된 모든 방법을 승인했습니다.
참고: 1페닐 2-티오레아(PTU)로 배아를 치료하는 것이 좋습니다. 표 1) 24시간 후유증(hpf)에서 유동 세포측정에 의한 형광 차별에 부정적인 영향을 미치는 색소 침착을 방지한다. 아래에 나열된 모든 절차는 유동 세포 측정 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 허용됩니다. 그러나 FACS 후 조혈 세포를 배양하는 것이 목표라면 샘플을 처리 할 때 멸균 관행을 준수하십시오. 멸균 방식으로 배아 샘플을 표백 및 준비하기 위한 프로토콜은 이전에12에기술되었다.
1. 48 hpf 제브라피시 배아의 반향
<ol><li>10cm 플라스틱 페트리 접시에 배아(최소 5개, 배아 200개 이상)를 사용하면 배아가 바닥 가장자리로 가라앉도록 접시를 기울입니다. 참고 : 뚜껑을 제거하고 페트리 접시의 한 가장자리 아래에 뚜껑을 배치하여 접시를 기울이기 쉽습니다.</li>
	<li>제거 및 가능한 한 많은 E3 매체(표 1)를폐기하고 불반향 protease (10 mg / mL)의 500 μL을 추가합니다. 실온에서 5분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>5분 후, 페트리 접시(모든 배아를 접시 의 하단 가장자리에 유지)를 집어 들고 페트리 접시의 측면을 부드럽게 탭하여 배아가 접시 바닥에 부드럽게 문질러 서 채온을 완전히 제거합니다.</li>
	<li>스퀴즈 병으로 E3 배지 ~20mL를 추가하여 프로테아지를 희석시보냅니다. 배아가 해독하여 E3 배지를 정착시키고 제거할 수 있도록 합니다.</li>
	<li>단계 1.4 3x를 반복하여 반향 프로테아제의 모든 흔적을 제거합니다. 참고: 각 개별 샘플을 분석하려면 적어도 5개의 배아가 필요합니다. 이 불반향 절차는 페트리 접시 당 최대 200 개의 배아를 수용 할 수 있습니다. 샘플은 이 단계에서 그룹화하고 원하는 경우 나중에 분리할 수 있습니다. 또는, 수동 비반향은 시계 제작자의 집게로 부드럽게 chorions를 찢어서 수행 할 수 있습니다. 이것은 태아의 작은 숫자가 있을 때 유리합니다. 일반적으로 제브라피쉬는 72hpf로 그들의 chorions에서 부화합니다. 그러나 심하게 기형된 배아는 그렇지 않을 수 있으며, 그 시간 이후에는 비반향(수동 또는 화학 물질)이 필요할 것입니다.</li>
</ol>2. 해리를 위한 배아 샘플 준비
<ol><li>P1000 파이펫을 사용하여 5-10 개의 배아를 단일 1.5 mL 마이크로 센심 분리기 튜브에 놓습니다.</li>
	<li>파이펫으로 E3 매체를 제거하고 폐기합니다. 주의: 배아가 다음 단계에서 쉽게 버릴 수 있기 때문에 주의하는 파이펫.</li>
	<li>10mM 디티오트리톨(DTT)의 1mL를 E3 배지에 추가하여 배아 제브라피시(11,12,13,14)를둘러싼 점액코팅을제거한다. 마이크로센트심분리기 튜브를 수평으로 놓고 실온에서 30분 동안 배양합니다.</li>
</ol>3. 배아 해리
<ol><li>DTT의 흔적을 제거하기 위해 Ca2+ 및 Mg 2+로 덜벡코의 인산완충식염(DPBS)의 1mL로 배아 3배를 세척합니다. 마지막 세척 후 Ca2+ 및 Mg2+ 및 5 μL5 mg/mL (26 U/mL) 해리 프로테아이즈와 DPBS의 500 μL을 추가합니다. 참고: 다른 동소완충액이 사용될 수 있지만 해리 효소가 제대로 작동하려면 Ca2+ 및 Mg2+를 포함해야 합니다.</li>
	<li>60 분 동안 185 rpm에서 수평 궤도 셰이커에 37 °C에서 샘플을 배양합니다. 샘플이 완전히 해리 될 때까지 P1000 파이펫으로 배아를 삼각합니다. 주의: 배아를 과소화하지 않도록 주의하십시오. 일부 고체 조직이 존재해야하며 완전히 균일해서는 안됩니다. 과다 소화가 가능하며, 이는 혈류 세포계(보충도 1)에서관찰되는 표적 혈액 세포를 파괴할 것이다. 참고 : 이 절차는 48-72 hpf 배아에 가장 적합합니다. 이후 단계는 해리 프로테아제와 더 긴 잠복이 필요할 수 있습니다. 다른 단계에 대한 타이밍은 경험적으로 결정해야합니다. 배아 조직을 해리하는 더 빠른 대체 방법이 있지만, 이 방법은 60 분이 걸리지만 살아있는 조혈 세포의 효율적인 격리를 허용 할 만큼 부드럽고 철저하다는 것을 경험적으로 발견됩니다.</li>
</ol>4. 유동 세포종에 대한 해리된 배아의 준비
<ol><li>파이펫 5 해리 배아는 35 μmM 세포 스트레이너 캡을 가진 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브의 상단 저수지에 분리된 배아.</li>
	<li>여과된 세포를 포함하는 5mL 폴리스티렌 튜브의 스트레이너 캡에 Ca2+ 또는 Mg2+가 없는 4mL의 인산염 완충식식염(PBS)을 첨가하여 세포를 헹구는 세포를 헹구는 세포를 헹구는 다. 참고: 다른 동소완충액도 사용될 수 있지만, 해리 효소를 희석하고 비효율적이게 만들기 위해 Ca2+ 또는 Mg2+가 부족해야 합니다.</li>
	<li>원심분리기 튜브는 4°C, 300 x g에서 5분 동안 세포를 펠릿합니다. 파이펫으로 상체를 제거하고 폐기합니다. PBS의 500 μL에서 세포를 다시 일시 중지합니다 (Ca2+ 또는 Mg2 +없음).</li>
</ol>5. 유동 세포측정
<ol><li>셀 현탁액을 부드럽게 소용돌이쳐 1:1,000 개의 붉은 죽은 세포 얼룩(재료 표)을추가합니다. 참고: 적색 세포 얼룩은 표적 세포로부터 죽은 세포와 이물질을 배제할 수 있는 세포 투과성 염료이며, 633nm 레이저에 의해 흥분되기 때문에, 녹색 형광 단백질(GFP) 및 DRed와 같은 일반적인 형광을 자극하는 데 사용되는 488 nm 레이저와 는 다른 것으로 나타났습니다. 이런 식으로, 죽은 세포와 형질 전환 혈액 세포에서 스펙트럼 중복이 없습니다. 1 mg/mL에서 프로피듐 요오드 (PI)는 붉은 죽은 세포 얼룩에 대한 저렴한 대안이지만, 피의 플루오로포어만으로 PI로 얼룩진 일부 샘플을 예약해야합니다. 그렇지 않으면 GFP와 같은 PI 및 형광구의 신호가 겹쳐져 거짓 양성 결과가 발생합니다. 유동 세포계에도 405nm 레이저가 있는 경우, 블루 아빠 세포 얼룩과 같은 다른 염료도 탁월한 선택입니다. 주의: 혈액 세포를 분석할 때, 30 분 후에 특정 세포 모형이 빨간 죽은 세포 얼룩을 phagocytose 하기 시작할 것이라는 점을 주의하십시오. 분석될 때까지 빛과 얼음에서 세포를 보호하고 염료를 첨가한 지 30분 이내에 유동 세포측정을 수행합니다.</li>
	<li>유동 세포측정 분석 참고: 모든 흐름 사이토미터는 약간 다르지만 다음 단계는 대부분의 컴퓨터에서 분석을 위한 샘플을 준비하는 데 도움이 됩니다. 세포측정을 유동하는 사용자를 위해 특정 장비에 대한 전문가인 사람의 조언을 구하십시오. 다음 지침은 BD FACSAria 융합 흐름 세포계에 관련이 있습니다.<ol><li>사이토미터를 켜고 레이저가 20분 동안 따뜻해집니다. 빈 폐기물 탱크, 적절한 솔루션 (흐름 세포계에 따라 다름)와 칼집 탱크를 채우고 유체 시스템을 시작합니다. 참고: 일반적으로 각 유형의 유동 세포계에 대한 특정 시작 절차가 있습니다. 해당 시작 절차를 신중하게 따르십시오.</li>
		<li>분석 소프트웨어에서 5개의플롯(그림 1A)을그립니다.<ol>
<li>y 축의 x 축 및 측면 분산(SSC)에 대한 첫 번째 점 플롯 측정 전방 분산(FSC)을 갖습니다. FSC를 선형으로 설정하고 SSC를 로그로 설정합니다. 참고: FSC는 셀 크기의 측정이며, SSC는 세분성의 측정이다; 이것은 파편에서 세포의 차별을 허용할 것입니다. 배아 제브라피쉬 혈액세포는 이전에 설명된 성인 제브라피시 혈액세포와 동일한 방식으로 크기 및 세분성에 의해 분리되지않는다. 대신 그(것)들은 그밖 모든 소화한 배아 세포를 가진 동일 인구에서 나타날 것입니다.</li>
			<li>두 번째 플롯을 설정하여 FSC 높이(H)와 FSC 너비(W)를 검사합니다. SSC(H)와 SSC(W)를 측정하기 위해 세 번째 플롯을 설정합니다. 참고: 이 단계는 이중(레이저를 통과할 때 함께 붙어 있는 셀)을 제외하는 데 사용됩니다.</li>
			<li>x 축의 적색 죽은 세포 얼룩을 측정하기 위해 네 번째 점 플롯을 설정합니다 (사이토미터에 따라 이는 일반적으로 동종 코시아니닌 [APC]에 사용되는 필터와 동일합니다) 및 y 축의 SSC. 이것은 죽은 세포에서 살아있는 세포의 차별을 허용할 것입니다. 참고: 각 사이토미터의 필터 세트는 다를 수 있습니다. 죽은 세포 차별 염료에 올바른 검출 필터를 사용해야 합니다.</li>
			<li>다섯 번째 플롯은 선택의 불소를 측정합니다. 이를 형광소(도1)의히스토그램으로 시각화하거나 점도플롯(보충도 2)을사용한다. 참고: 동일한 동물에서 둘 이상의 플루오로포어를 검사할 때 점 플롯을 사용하여 두 매개 변수를 동시에 보는 것이 좋습니다. 형광이 서로 스펙트럼 중복될 가능성이 있는경우(보조도 2),점도 도표도 추천합니다. 영역(A) 설정을 사용하여 모든 매개 변수에 대해 사이토미터의 레이저 펄스에 의해 생성된 곡선 아래 영역을 계산합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>샘플을 로드하고 샘플이 빠르게 실행되지 않도록 유량을 줄입니다. 세포 집단의 대부분을 명확하게 볼 수 있도록 FSC 및 SSC 설정을 조정합니다(그림1A).</li>
		<li>세포 인구 주위에 게이트를 그리고 그것을 세포를 레이블. 두 번째 점 플롯이 셀에 게이트되어 있는지 확인하고, FSC에서 첫 번째 게이팅을 한 다음 SSC 싱글t에서 더블을 제외합니다.</li>
		<li>네 번째 플롯에서 빨간색 죽은 세포 얼룩 설정을 조정하여 분명히 부정적인 집단이 있습니다. 이 세포 주위에 게이트를 그리고 그(것)들을 살아있는 세포에 레이블을 지정합니다. 다섯 번째 플롯에서, 살아있는 세포에 게이트와 형광소 음성 및 양성 세포를 검사. 양수 세포 주위에 게이트를 그립니다. 참고: 이 계층적 게이팅 전략은 세포 게이트에 있는 살아있는 세포 게이트에 있는 단 하나 형광구+ 세포를 검사합니다. 게이트를 올바르게 설정하십시오. 이러한 게이트는 실험에 따라 사용자 지정할 수 있습니다.</li>
		<li>각 샘플을 실행하여 적어도 25,000개의 라이브 셀 이벤트를 수집합니다.</li>
		<li>종료 절차를 따라 유체를 끕니다. 칼집 탱크를 리필하고 폐기물 탱크를 비웁니다. 참고: 단백질 발현이 낮거나 세포 집단이 드물때 형광+ 세포를 시각화하는 것은 종종 어렵습니다. 파라미터가 제대로 설정되도록 하기 위해, 플루오로포레- 형제 배아는 제대로 게이트를 그리고 레이저 전압을 조정하기 위하여 함께 준비되어야 합니다(보충 도 2). 대상 세포 집단이 드문 경우 25,000개 이상의 이벤트를 수집합니다. 5-10 소화 된 동물, 하나는 이벤트의 수백만을 수집 할 수 있어야합니다. 불소공포증+ 세포의 총 수는 또한 이 데이터로 얻을 수 있다. 단순히 혈류계와 샘플에서 세포의 총 수를 계산하고 물고기 당 형광요법+ 세포의 절대 수를 얻기 위해 형광 + 세포의 비율을 곱합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li>
<li>Weinstein, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+mutations+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic mutations in the zebrafish.</a> Development. , 303-309 (1996).</li>
<li>Ransom, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+zebrafish+mutants+with+defects+in+embryonic+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis.</a> Development. 123, 311-319 (1996).</li>
<li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+insertional+mutagenesis+screen+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.</a> Genes & Development. 13, 2713-2724 (1999).</li>
<li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383, 829-832 (1996).</li>
<li>Yeh, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+chemical+modifiers+of+oncogene-regulated+hematopoietic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation.</a> Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).</li>
<li>Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+genetic+screen+in+zebrafish+for+pathways+interacting+with+cdx4+in+primitive+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis.</a> Zebrafish. 7, 61-68 (2010).</li>
<li>Ridges, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+screen+identifies+novel+compound+with+selective+toxicity+against+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia.</a> Blood. 119, 5621-5631 (2012).</li>
<li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447, 1007-1011 (2007).</li>
<li>Astuti, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Functional+Bioluminescent+Zebrafish+Screen+for+Enhancing+Hematopoietic+Cell+Homing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing.</a> Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).</li>
<li>Stachura, D. L., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+dissection+of+zebrafish+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis.</a> Methods in Cell Biology. 133, 11-53 (2016).</li>
<li>Berrun, A. C., Stachura, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+In+Vitro+Assay+to+Quantitate+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+%28HSPCs%29+in+Developing+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56836(2017).</li>
<li>Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. III <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22Essential+Zebrafish+Methods%3A+Cell+and+Developmental+Biology%22">Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology</a>. , Academic Press. Cambridge, MA. (2009).</li>
<li>Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDrummond%2C+IA+%22The+Zebrafish%3A+Cellular+and+Developmental+Biology%2C+Part+A%22">The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A</a>. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. I. 100, Elsevier. Boston, MA. 233-260 (2010).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).</li>
<li>Ganis, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+globin+switching+occurs+in+two+developmental+stages+and+is+controlled+by+the+LCR%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR.</a> Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).</li>
<li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li>
<li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106, 3803-3810 (2005).</li>
<li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, e1-e11 (2013).</li>
<li>Ding, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+High-Throughput+Flow+Cytometry+in+Early+Drug+Discovery%3A+An+AstraZeneca+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective.</a> SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).</li>
<li>Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+flow+cytometry+for+drug+discovery%3A+principles%2C+applications%2C+and+case+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies.</a> Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).</li>
<li>Joslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fully+Automated+High-Throughput+Flow+Cytometry+Screening+System+Enabling+Phenotypic+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery.</a> SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).</li>
</ol>

D.L.S.는 과학 컨설턴트이며 핀리스 푸드, Inc.와 Xytogen 생명 공학, Inc.K.F.R.로부터 보상을 받았습니다.

Zebrafish는 원시적이고 확실한 척추동물 조혈을 연구하기위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 지난 수십 년 동안 여러 분석이 개발되고 정제되어 제브라피쉬가 약물 검사, 유전 돌연변이 생성 및 테스트, 전체적으로 조혈에 필수적인 분자 경로를 분석할 수 있도록 하는 빠르고 경제적인 모델이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 빠른 데이터 수집, 성인 동물보다 적은 물리적 공간의 사용, 대규모 화학 스크린에 대한 적은 약물의 사용을 허용하는 배아 얼룩말 피시를 사용합니다. 또한 mRNA의 과발현, CRISPR 돌연변이체 생성 및 MO 유도 된 성적 증명서 감소 후 의 양을 허용하여 초기 배아 발달 중에 발생하는 특정 유전 경로를 변경합니다. 중요한 것은, 그것은 현장 혼성화 또는 조직학적 염색 기술에서 할 어려운 혈액 세포의 민감하고 강력한 양을 허용합니다.
이 분석은 유연하며 많은 연구 질문에 대답하도록 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜의 1개의 수정은 동물의 발달 단계가 다른 혈액 세포...

혈액 생산 (혈종)은 초기 배아에서 처음 시작되는 필수적인 발달 과정입니다. 이 과정은 원시적 적혈구와 대식세포를 중구로부터 직접 생성하여 시작하여 나중에 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 생산으로 전환합니다. 다능성 인 이 줄기 세포는 유기체에서 성숙한 혈액 세포의 모든 종류를 생성합니다. 자체 갱신이 가능한 이 시스템은 이러한 HSPC를 통해 지속적으로 보충됩니다. 이 과정은 개발 초기에 시작되는 동안, 혈액 조혈은 동물의 생명을 위해 계속, 신체의 먼 사이트에 산소를 수송 하는 기능을 제공, 부상 후 출혈을 중지, 감염에서 시체를 보호. 이 복잡한 시스템의 발달은 발달 도중 시간적으로 그리고 공간적으로 통제되고 혈액 세포 생산에 있는 어떤 동요든지 유기체를 위한 치명적일 수 있습니다, 빈혈, 혈소판감소증, 백혈병 및 백혈병의 결과로.
조혈 연구에 사용되는 인기있는 동물 모델은 인간과 비교할 때 혈액 발달이 유사하기 때문에 제브라피시(Danio rerio)입니다. 사실, 조혈 중에 사용된 많은 유전자와 분자 통로는 척추 동물 진화 전반에 걸쳐 보존되어 제브라피시를 연구하여 인간 유전자에 대해 배울 수 있게 합니다. 중요한 것은, 제브라피시 배아는 바디 외부에서 발전하고 7 일 안에 가장 성숙한 혈액 세포 모형을 생성했습니다, 짧은 시간에 조혈 계통의 직접적인 가시화를 허용하. Zebrafish는 또한 매우 fecund, 이는 연구원이 재현 가능한 데이터를 생성하는 데 중요한 짧은 시간 프레임에서 샘플의 더 많은 수를 관찰 할 수 있습니다. 제브라피쉬의 짧은 생성 시간 및 외부 발달은 돌연변이 발생 연구1,2,3,4,5 및 약물 스크리닝6,7,8,9,10동안 보다 쉽게 조작 및 관찰을 제공한다. 이것은 인간 혈액 무질서를 위한 유망한 치료 화합물의 패널이 신속하고 능명하게 시험될 수 있게 합니다.
중요한 것은, 제브라피쉬는 또한 유전적으로 순종하며, 게놈은 순서와 부가된다. 이 기관성은 모르폴리노와 같은 역유전학 기술을 허용합니다-(MO-) 중재된 녹다운 및 CRISPR 매개 유전 절제술이 수행될 수 있습니다. Zebrafish는 또한 앞으로 유전 스크린을 수행하는 모델로 자신의 유틸리티를 입증했다; 척추 동물 혈액 형성에 관련 된 많은 필수 유전자와 경로이러한 방식으로 발견 되었습니다. 혈액 세포를 관찰하는 수많은 방법은 또한 제브라피시에서 개발되었습니다. 전통적인 조직학적 염색 기술이 존재하지만 혈액 특이적 성적증명서에 대한 시투 혼성화에서도 수행할 수 있습니다. 중요한 것은, 수많은 형질전환선도 존재하여 형광 단백질이 계보 특이적 프로모터에 의해 발현되어 형광단백질(11)을가진 특정 혈액 세포의 라벨링을 허용한다. 이것은 연구원이 시간이 지남에 따라 살아있는 유기체에 있는 혈액 세포 창세기, 확장 및 규정의 상시 관측을 능력을 발휘할 수 있습니다.
전반적으로, 조혈 시스템의 보존, 형질 대사의 존재와 쉬운 개발, 쉬운 시각화, 짧은 세대 시간은 제브라피쉬가 패혈증의 경제적이고 빠르며 적응 가능한 모델로 만들었습니다. Zebrafish 연구원을 위해 사용할 수 있는 기술의 도구 상자를 개선하기 위해, 우리는 태아에 있는 혈액 세포의 수를 강력하게 양을 하기 위하여 이 분석법을 개발했습니다. 이 방법은 형질전환 동물을 소화하고 형광 혈액 세포를 위한 유동 세포측정을 능력을 발휘하는 관련시킵니다. 이러한 방식으로, 돌연변이 동물로부터의 혈액 세포, MO 및 CRISPR 수정의 효과 및 소분자의 효과는 빠르고 재현 가능한 방식으로 정량적으로 분석될 수 있다. 이러한 소는 시간이 지남에 따라 그들의 세대, 증식 및 유지 보수의 검사를 허용, 혈액 세포를 열거 하는 사용자 친화적 이고 경제적인 방법.

<table><tbody><tr><td>1.5ml MCF 튜브</td><td>FisherBrand</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>10mm 폴리스티렌 easygrip 페트리 접시</td><td>Corning Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>셀 스트레이너 캡이 있는 5ml 폴리스티렌 원형 바닥 튜브</td><td>Corning Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria Fusion 유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dithiolthreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>646563 DPBS(10x) with Ca2+ and Mg2+</td><td>Life Technologies</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>FBS 500 mL</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-108</td><td></td></tr><tr><td>HyClone PBS (1x)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>sh30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Librease</td><td>Roche Sigma-Aldrich</td><td>5401119001</td><td>dissociation protease</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche Sigma-Aldrich</td><td>11459643001</td><td>디코리온네이션 프로테아제</td></tr><tr><td>SYTOX 레드 데드 셀 염색</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>S34859</td><td></td></tr></tbody></table>

유동 세포형을 사용하여 개발 중인 제브라피시에서 변경된 혈액 형성을 감지하고 양량화합니다.

Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

척추 동물에서 성숙한 혈액을 포함하는 세포 혈통의 다양성은 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 분화에서 발생합니다. 이것은 유기체의 수명 내내 생기는 중요한 프로세스이고, 배아 발생 도중 관련시킨 분자 통로의 중단은 치명적인 장기 결과를 가질 수 있습니다. 여러 가지 이유로, 제브라피쉬(다리오레리오)는조혈을 연구하는 모델 유기체가 되었습니다. Zebrafish 배아는 외부적으로 발전하고, 7일 후에 풍부하게함 (dpf)까지 그들의 일생을 위해 지속될 결정적인 혈액 세포의 대부분의 특수형을 생성했습니다. 조혈 세포의 수를 평가하는 분석이 개발되었으며, 주로 특정 조직학적 얼룩, 시상 혼성화 기술 및 형광 단백질의 발현을 유도하는 혈액 세포 별 프로모터를 활용하는 형질 세포 특이적 프로모터를 활용하는 형질 동물의 현미경 검사를 활용하고 있다. 그러나, 대부분의 염색 된 애법과 현장에서 혼성화 기술은 정확하게 존재하는 혈액 세포의 수를 양량하지 않습니다; 셀 수의 큰 차이만 쉽게 시각화할 수 있습니다. 형질 또는 공초점 현미경 검사를 가진 개별을 분석하는 것은 수행될 수 있습니다, 그러나 이 분석의 양은 수동으로 계산하거나 고가의 화상 진찰 소프트웨어를 이용에 의존합니다, 둘 다 오류를 만들 수 있습니다. 혈액 세포 수를 평가하는 추가 방법의 개발은 경제적일 것이고, 더 빨리, 심지어 CRISPR 매개 유전자 수정의 효력, 모르폴리노 중재한 성적증명서 감소 및 대규모에 조혈증에 영향을 미치는 약 화합물의 효력을 신속하게 평가하기 위하여 자동화될 수 있었습니다. 혈액 세포를 양화하는 이 새로운 분석은 전체 제브라피시 배아를 해리하고 존재하는 형광표 혈액 세포의 양을 분석해서 수행됩니다. 이 분석서는 혈액 세포 생성, 확장 및 태아 발생 도중 규칙에 책임 있는 분자 통로의 elucidation를 허용해야 합니다, 이는 연구원이 혈액 질병 도중 변경된 새로운 요인을 추가로 발견할 수 있을 것입니다, 뿐만 아니라 척추 동물 조혈의 진화 도중 필수적인 통로.

배아 제브라피시에서 적혈구를 열거하기 위해 lcr:GFP16 배아는 PBS, 7.0 ng/nL ism1 MO, 또는 7.0 ng/nL ism1 MO를 가진 1세포 단계에서 7.0 ng ism1 mRNA12를주입하였다. 48 hpf에서 그들은 소화되었고 혈류 세포 측정 분석을 실시하였다. 각 샘플에서 GFP+ 적혈구의 백분율을 분석한 후(각 샘플은 5개의 무작위로 선택된 배아; 도 1A)모든 대조군의 평균이 계산되었다. 이 평균은 1로설정되었으며 모든 백분율은 해당 참조점에서 계산되었습니다. 이러한 데이터는 특정 MO를 사용하여 ism1 성적증명서를 감소시켜 48hpf 배아에 존재하는 GFP+</s...

이 분석법은 배아 제브라피시를 개발하는 데 혈토포이성 세포를 양수화하는 간단한 방법입니다. 해리된 제브라피시로부터의 혈액세포는 혈류 세포측정 분석을 받게 된다. 이것은 돌연변이 동물및 유전 수정 후에 혈액 결점의 검출을 허용합니다.

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...

이 프로토콜은 개발 물고기에서 유전자의 녹다운 과 발현을 허용하고 혈액 세포에 대한 다운스트림 효과의 양을 허용하기 때문에 중요합니다. 이 프로토콜은 적절한 계측에 액세스하여 빠르고, 쉽게 수행되고, 경제적이며, 자동화하기 쉽습니다. 이 절차를 보여주는 크리스틴 Rueb, 실험실에서 학부 연구원이 될 것입니다.먼저 수정 후 5~200시간, 48시간 후 배아를 플라스틱 10센티미터 페트리 접시로 옮긴다. 배아가 아래쪽으로 가라 앉도록 접시를 기울이고 가능한 한 접시에서 E3 배지를 많이 제거합니다. 그런 다음 배아에 500 마이크로리터의 비료 프로테아를 추가합니다.실온에서 5분 후, 모든 배아를 접시의 아래쪽 가장자리에 다시 팁을 넣고 접시의 측면을 부드럽게 탭하여 배아가 접시 바닥에 부드럽게 문질러 서 완전히 치밀하게 제거합니다. 스퀴즈 병을 사용하여 프로테아제고를 희석시키고 배아가 정착할 수 있도록 E3 배지의 약 20밀리리터를 첨가합니다. 그런 다음 배지를 데수화하고 프로테아제의 모든 흔적을 제거하는 것으로 입증된 것처럼 신선한 배지로 배아를 세 번 더 헹취시한다.배아를 해리를 위해 준비하려면 P1000 파이펫을 사용하여 5-10개의 배아를 1개, 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 이송하고, 전달된 E3 배지를 흡인한다. 그런 다음 E3 배지에 10 밀리리터DTT를 배아 제브라피시에 넣고, 실온에서 30분 동안 마이크로센트심분리기 튜브를 수평 위치에 배치하여 점액 코팅을 제거한다. 배아 해리의 경우, DTT 처리된 배아를 세척당 칼슘과 마그네슘으로 보충한 DPBS 1밀리리터로 3회 세척하십시오.칼슘과 마그네슘으로 보충된 500마이크로리터와 밀리리터당 5밀리리터의 5마이크로리터를 첨가하기 전에 해리 프로테아제. 그런 다음 60 분 동안 분당 185 회전에서 수평 궤도 셰이커에 섭씨 37도에서 샘플을 배양합니다. 주기적으로 배아를 확인하십시오, 그래서 당신은 그(것)들을 소화하지 않습니다.일부 고체 조직을 가진 완전히 균일한 견본이 존재하는 경우에, 견본이 완전히 해리될 때까지 P1000 파이펫으로 배아를 삼각합니다. 유동 세포측정을 위해 해리된 제브라피시 배아 세포를 준비하려면 전체 셀 샘플을 5밀리리터 폴리스티렌 라운드 하단 튜브의 상단 저장소에 35 마이크로미터 셀 스트레이너 캡을 장착하여 전달합니다. 칼슘이나 마그네슘없이 PBS의 4 밀리리터로 캡을 헹구고, 원심분리에 의해 세포를 펠릿.그런 다음 튜브 당 칼슘과 마그네슘없이 PBS의 500 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단합니다. 제브라피시 배아 세포의 유동 세포 측정 분석을 위해 각 튜브에 적죽은 세포 얼룩의 1-1,000 희석을 추가하기 전에 세포 현탁액을 부드럽게 소용돌이칩니다. 죽은 세포 얼룩을 적용 한 후 30 분 이내에, 폐기물 탱크를 비우고, 칼집 탱크를 적절한 용액으로 채우고, 유동 세포계의 유체 시스템을 시작합니다.분석 소프트웨어에서 5개의 플롯을 그리고 첫 번째 플롯을 설정하여 측면 분산과 반대로 측정합니다. 전방 분산을 선형으로 설정하고 측면은 로그와트믹으로 산란합니다. 두 번째 플롯을 설정하여 앞으로 산란 높이와 전방 분산 폭을 측정하고 세 번째 플롯은 분산 높이대 측면 분산 폭을 측정합니다.네 번째 플롯을 설정하여 x 축의 적색 죽은 세포 얼룩을 측정하고 y축에 측면 분산하여 죽은 세포에서 살아있는 사람의 차별을 허용합니다. 다섯 번째 플롯은 선택의 불소를 측정하도록 설정해야합니다. 모든 플롯이 설정된 경우 샘플을 사이토미터에 로드하고 유량을 줄여 세포가 빠르게 실행되지 않도록 합니다.세포 집단의 대부분을 명확하게 관찰할 수 있도록 전방 및 측면 분산 설정을 조정하고 세포 집단 주위의 게이트를 그립니다. 이 게이트 셀에 레이블을 지정합니다. 두 번째 점 플롯이 셀에 게이트되어 있고, 게이트는 앞으로 흩어지고 측면은 이중을 제외하기 위해 싱글을 흩어 놓습니다.네 번째 플롯에서 빨간색 죽은 셀 얼룩 설정을 조정하여 명확하게 부정적인 집단이 되도록 합니다. 이 세포 주위에 게이트를 그리고 이 게이트 라이브 셀에 레이블을 지정합니다. 다섯 번째 플롯에서, 살아있는 세포에 게이트와 양성 세포 주위에 게이트를 그립니다, 다음 적어도 수집 각 샘플을 실행 25, 000 라이브 셀 이벤트.모든 샘플을 분석한 후 종료 절차를 따라 유체를 끄고 칼집 탱크를 다시 채우고 폐기물 탱크를 비웁니다. 각 배아 제브라피쉬 샘플에서 GFP 양성 적혈구의 백분율을 분석한 후, 모든 대조군의 평균을 계산할 수 있다. 일반적으로 평균값은 하나로 설정되고 모든 백분율은 이 기준점에서 계산됩니다.본 대표적인 분석에서, 특정 모르폴리노를 가진 ISM1 성적체를 감소시키고, 수정 후 48시간 이내에 존재하는 GFP 양성 적혈구의 수를 감소시키는 것으로 판단되었다. 외인성 mRNA를 가진 ISM1 모르몰리노 수준에 있는 이 감소를 구출하고, 정상으로 적혈구의 수를 반환합니다. 시료에 적절한 소화가 중요합니다.과도하게 소화하거나 소화가 부족한 경우 올바른 결과를 얻지 못할 것입니다. 팩스 기계를 사용할 수 있는 경우, 연구원은 체 외 배양, RNA 시퀀싱 및 정량적인 RT-PCR에 대 한 정렬 하 여 혈액 세포를 수집할 수 있습니다.

using-flow-cytometry-to-detect-quantitate-altered-blood-formation

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

사파이어 femtosecond 레이저 발진기 : 메소드는 티에서 두 광자 흡수를 사용하는 형광 단백질 갇힌를 포함하는 단일 세포를 photoactivate에 설명되어 있습니다. 운명의지도 photoactivated 세포는 immunohistochemistry가 사용됩니다. 이 기술은 모든 세포 유형에 적용할 수 있습니다.

Zebrafish의 단세포 운명 매핑

zebrafish 배아 심장의 immunostaining를 수행하는 빠른 방법이 설명되어 있습니다. 전체 마운트 immunostaining 접근 방식에 비해,이 방법은 크게 크게 감소 처리 시간 이내에 심장에 세포 / subcellular 구조를 공개 고해상도 이미지를 얻는 수있는 항체의 침투를 증가시킵니다.

해부 Zebrafish 배아 심장의 Immunostaining

본 논문은 Zebrafish의 지느러미 대동맥에서 혈액을 수집하는 기술을 선물한다. 그것은 또한 콜레스테롤과 트리 글리세 라이드 수준을 결정하기위한 시험과 같은 생화 학적 분석에 사용을 위해 혈청을 얻기위한 지침을 제공합니다.

성인 Zebrafish의 생물 화학 분석을위한 혈액 수집

애벌레 제브라 피쉬의 뇌 발달의 영상이 설명되어 있습니다. 3D 영상을 촉진하고 화학적 처리를 사용하여 뇌 혈관 발달을 수정하는 기술도 제공됩니다.

이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 단일 세포를 분리하고, 관심 세포를 농축하고, 미세유체 기반 단세포 다중 시스템에서 제브라피시 세포를 포획하고, 단일 세포에서 유전자 발현을 평가하는 방법을 설명합니다.

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

여기, 우리는 조 혈 줄기와 조상 세포 (HSPCs) 배아 zebrafish quantitate 간단한 방법을 제시. 천연된 제 브라에서 HSPCs는 지원 요소, 성숙한 혈액으로 차별화와 스에 도금. 혈액의 검출 결함 및 심사 실시 쉽게 마약을 수 수 있습니다.

조 혈 줄기와 뿌리를 Quantitate를 생체 외에서 시험의 개발 세포 (HSPCs) Zebrafish 태아를 개발

생체 내 이미징은 신경계 발달의 근본적인 세포 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기에서 우리는 개발 제브라피시 신경계 내의 다중 색깔 Brainbow 표지세포의 다수를 구상하기 위하여 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 이용하기 위한 기술을 기술합니다.

무지개와 타임랩스 공초점 이미징을 사용하여 살아있는 제브라피시의 뇌 발달 시각화

우리는 간단하고 빠른 병기 결정 방법으로 최적화된 투명한 제브라피시 배아의 난황에 이종 이식을 위한 프로토콜을 설명합니다. 주입 후 분석에는 생존 및 유세포 분석을 통한 이종 이식 세포의 질병 부담 평가가 포함됩니다.

투명 제브라피시 배아에서 종양 이종 이식 분석을 위한 간단하고 빠르며 효과적인 방법

이 프로토콜은 제브라피쉬 배아의 심장 형태 및 기능을 평가하기 위한 저비용 광학 현미경 방법을 설명하여 고급 이미징 시스템 없이도 발달 심장 독성을 재현 가능하게 평가할 수 있습니다.

표준 현미경 및 비디오 분석을 사용한 제브라피쉬 배아의 기능적 심장 영상: 환경 및 생물 의학 연구에서의 응용

이 연구에서는 제브라피시 유충에 대해 EBD(Evans Blue Dye) 분석을 수행하는 간단한 방법을 설명합니다.  이 기술은 골격근 무결성의 특성화와 근이영양증의 제브라피시 모델을 묘사하기 위한 강력한 도구이며 새로운 치료법 개발을 위한 귀중한 방법입니다.

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

학습하세요 유동 세포형을 사용하여 Danio rerio 배아에서 혈액 세포를 정량화하고 유전자 변형에 따른 혈액 형성 결함을 감지하는 방법을. 이 프로토콜은 빠르고 경제적이며 자동화가 가능합니다.

유동 세포형을 사용하여 개발 중인 제브라피시에서 변경된 혈액 형성을 감지하고 양량화합니다.

더 많은 동영상 탐색