유동 세포형을 사용하여 개발 중인 제브라피시에서 변경된 혈액 형성을 감지하고 양량화합니다.

이 프로토콜은 개발 물고기에서 유전자의 녹다운 과 발현을 허용하고 혈액 세포에 대한 다운스트림 효과의 양을 허용하기 때문에 중요합니다. 이 프로토콜은 적절한 계측에 액세스하여 빠르고, 쉽게 수행되고, 경제적이며, 자동화하기 쉽습니다. 이 절차를 보여주는 크리스틴 Rueb, 실험실에서 학부 연구원이 될 것입니다.

먼저 수정 후 5~200시간, 48시간 후 배아를 플라스틱 10센티미터 페트리 접시로 옮긴다. 배아가 아래쪽으로 가라 앉도록 접시를 기울이고 가능한 한 접시에서 E3 배지를 많이 제거합니다. 그런 다음 배아에 500 마이크로리터의 비료 프로테아를 추가합니다.

실온에서 5분 후, 모든 배아를 접시의 아래쪽 가장자리에 다시 팁을 넣고 접시의 측면을 부드럽게 탭하여 배아가 접시 바닥에 부드럽게 문질러 서 완전히 치밀하게 제거합니다. 스퀴즈 병을 사용하여 프로테아제고를 희석시키고 배아가 정착할 수 있도록 E3 배지의 약 20밀리리터를 첨가합니다. 그런 다음 배지를 데수화하고 프로테아제의 모든 흔적을 제거하는 것으로 입증된 것처럼 신선한 배지로 배아를 세 번 더 헹취시한다.

배아를 해리를 위해 준비하려면 P1000 파이펫을 사용하여 5-10개의 배아를 1개, 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 이송하고, 전달된 E3 배지를 흡인한다. 그런 다음 E3 배지에 10 밀리리터DTT를 배아 제브라피시에 넣고, 실온에서 30분 동안 마이크로센트심분리기 튜브를 수평 위치에 배치하여 점액 코팅을 제거한다. 배아 해리의 경우, DTT 처리된 배아를 세척당 칼슘과 마그네슘으로 보충한 DPBS 1밀리리터로 3회 세척하십시오.

칼슘과 마그네슘으로 보충된 500마이크로리터와 밀리리터당 5밀리리터의 5마이크로리터를 첨가하기 전에 해리 프로테아제. 그런 다음 60 분 동안 분당 185 회전에서 수평 궤도 셰이커에 섭씨 37도에서 샘플을 배양합니다. 주기적으로 배아를 확인하십시오, 그래서 당신은 그(것)들을 소화하지 않습니다.

일부 고체 조직을 가진 완전히 균일한 견본이 존재하는 경우에, 견본이 완전히 해리될 때까지 P1000 파이펫으로 배아를 삼각합니다. 유동 세포측정을 위해 해리된 제브라피시 배아 세포를 준비하려면 전체 셀 샘플을 5밀리리터 폴리스티렌 라운드 하단 튜브의 상단 저장소에 35 마이크로미터 셀 스트레이너 캡을 장착하여 전달합니다. 칼슘이나 마그네슘없이 PBS의 4 밀리리터로 캡을 헹구고, 원심분리에 의해 세포를 펠릿.

그런 다음 튜브 당 칼슘과 마그네슘없이 PBS의 500 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단합니다. 제브라피시 배아 세포의 유동 세포 측정 분석을 위해 각 튜브에 적죽은 세포 얼룩의 1-1,000 희석을 추가하기 전에 세포 현탁액을 부드럽게 소용돌이칩니다. 죽은 세포 얼룩을 적용 한 후 30 분 이내에, 폐기물 탱크를 비우고, 칼집 탱크를 적절한 용액으로 채우고, 유동 세포계의 유체 시스템을 시작합니다.

분석 소프트웨어에서 5개의 플롯을 그리고 첫 번째 플롯을 설정하여 측면 분산과 반대로 측정합니다. 전방 분산을 선형으로 설정하고 측면은 로그와트믹으로 산란합니다. 두 번째 플롯을 설정하여 앞으로 산란 높이와 전방 분산 폭을 측정하고 세 번째 플롯은 분산 높이대 측면 분산 폭을 측정합니다.

네 번째 플롯을 설정하여 x 축의 적색 죽은 세포 얼룩을 측정하고 y축에 측면 분산하여 죽은 세포에서 살아있는 사람의 차별을 허용합니다. 다섯 번째 플롯은 선택의 불소를 측정하도록 설정해야합니다. 모든 플롯이 설정된 경우 샘플을 사이토미터에 로드하고 유량을 줄여 세포가 빠르게 실행되지 않도록 합니다.

세포 집단의 대부분을 명확하게 관찰할 수 있도록 전방 및 측면 분산 설정을 조정하고 세포 집단 주위의 게이트를 그립니다. 이 게이트 셀에 레이블을 지정합니다. 두 번째 점 플롯이 셀에 게이트되어 있고, 게이트는 앞으로 흩어지고 측면은 이중을 제외하기 위해 싱글을 흩어 놓습니다.

네 번째 플롯에서 빨간색 죽은 셀 얼룩 설정을 조정하여 명확하게 부정적인 집단이 되도록 합니다. 이 세포 주위에 게이트를 그리고 이 게이트 라이브 셀에 레이블을 지정합니다. 다섯 번째 플롯에서, 살아있는 세포에 게이트와 양성 세포 주위에 게이트를 그립니다, 다음 적어도 수집 각 샘플을 실행 25, 000 라이브 셀 이벤트.

모든 샘플을 분석한 후 종료 절차를 따라 유체를 끄고 칼집 탱크를 다시 채우고 폐기물 탱크를 비웁니다. 각 배아 제브라피쉬 샘플에서 GFP 양성 적혈구의 백분율을 분석한 후, 모든 대조군의 평균을 계산할 수 있다. 일반적으로 평균값은 하나로 설정되고 모든 백분율은 이 기준점에서 계산됩니다.

본 대표적인 분석에서, 특정 모르폴리노를 가진 ISM1 성적체를 감소시키고, 수정 후 48시간 이내에 존재하는 GFP 양성 적혈구의 수를 감소시키는 것으로 판단되었다. 외인성 mRNA를 가진 ISM1 모르몰리노 수준에 있는 이 감소를 구출하고, 정상으로 적혈구의 수를 반환합니다. 시료에 적절한 소화가 중요합니다.

과도하게 소화하거나 소화가 부족한 경우 올바른 결과를 얻지 못할 것입니다. 팩스 기계를 사용할 수 있는 경우, 연구원은 체 외 배양, RNA 시퀀싱 및 정량적인 RT-PCR에 대 한 정렬 하 여 혈액 세포를 수집할 수 있습니다.