Name: 오르가노티픽 종양 조직 슬라이스에서 실시간 약물 반응 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 학습하세요 오르가노티픽 종양 조직 슬라이스에서 실시간 약물 반응 측정 방법을 통해 임상 종양 샘플의 약물 효과를 평가하고 중간 처리량 스크리닝을 수행하는 기술을. 이 프로토콜은 전임상 약물 개발을 가속화합니다.

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이 작품은 NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704], 시드니 킴멜 재단 [킴멜 학자 상], 폐암 발견 상 (LCD-505536)에 의해 지원되었다. 우리는 유방암 PDX 종양을 제공해 준 Alana Welm 박사(유타 대학교)에게 감사드립니다. 우리는 또한 PDX 모형의 정비를 위한 비교 의학, 프레드 허친슨 암 연구 센터 (FHCRC)에 있는 직원 및 유용한 토론을 위한 Gujral 실험실의 일원에게 감사하고 싶습니다. N.N.A는 FHCRC의 JSPS 해외 연구 펠로우십 및 학제 간 교육 교부금의 지원을 받고 있습니다. A.J.B.는 FHCRC의 염색체 대사 및 암 훈련 교부금에 의해 지원됩니다.

모든 마우스 실험은 동물 복지법의 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 가이드의 권고사항과 생물 의학 연구에서 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 지침서에 따라 수행되었습니다.
1. 종양 조직 조각의 준비
<ol><li>표 1의레시피에 따라 티슈 슬라이스 배양(TSC) 배지를 준비한다. 0.45 μm 진공 필터 유닛으로 매 질을 걸어 살균합니다.</li>
	<li>24 웰 플레이트에 대한 웰 당 TSC 배지의 Aliquot 250 μL, 또는 6 웰 플레이트에 대한 웰 당 매체의 1 mL. 플레이트를 37°C, 5%CO2 가습 인큐베이터에 보관하여 사용한다. 참고: 배지 및 보충제는 조직 유형 및 실험 목표에 따라 최적화될 수 있습니다. 배지의 양은 배양 삽입의 다공성 멤브레인을 흡수하기에 충분해야합니다. 멤브레인의 수준을 초과하지 마십시오. 중간 수준이 너무 낮거나 너무 높으면 중간 볼륨을 조정합니다. 연구원이 면역 조절제를 시험하는 경우에, 우리는 IL-210를가진 매체의 보충을 추천합니다.</li>
	<li>마우스에서 유래한 종양 조직을 사용하는 경우, 권장 절차로 마우스를 안락사시키고, 70% 에탄올을 분무하여 마우스의 노출된 피부를 살균하고, 무균 기술로 종양을 해부한다. 얼음 차가운 행크의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)을 포함하는 관에 종양 조직을 저장합니다.</li>
	<li>신선한 환자 종양 조직을 사용하는 경우, 단기적으로 얼음 차가운 HBSS에 보관하거나, 조직 생존력을 보존하기 위해 장기간 보관용(최대 24시간)을 위해 위스콘신 대학교(UW) 용액을 보관하십시오. 참고: 얼음으로 차가운 UW 용액으로 하룻밤 동안 출하된 PDX 티슈의 슬라이스가 성공적으로 준비되었습니다.</li>
	<li>종양 조직을 얼음 차가운 HBSS를 포함하는 10cm 배양 판으로 옮김을 옮김. 얼음 차가운 HBSS에 잠긴 동안 메스로 반으로 종양을 잘라. 6mm 직경의 생검 펀치를 사용하여 종양 조직을 실린더로 모양을 만들고 한쪽을 다듬어 평평한 표면을 만듭니다. 사용 될 때까지 얼음 차가운 HBSS에 조직을 저장합니다. 참고: 조직의 괴사 부위를 포함하지 마십시오, 이는 일반적으로 중앙에 불투명하고 깨지기 쉬운 외관을 갖는다.</li>
	<li>진동을 설정합니다. 70% 에탄올을 사용하여 모든 장비를 소독하십시오. 비브라토메 얼음 욕조 중앙에 아크릴 유리 뚜껑으로 덮인 비브라토메 완충트레이를 놓습니다. 얼음 욕조에 얼음을 넣고 완충트레이를 냉각된 HBSS로 채우고 자르는 동안 티슈를 시원하게 유지합니다. 면도날을 블레이드 홀더에 부착합니다. 참고: 비장제거 환경에서 진동을 유지하는 것은 이전 실험에 영향을 미치지 않았지만, 사용 가능한 경우 생체 안전 캐비닛 아래에 진동을 보관하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>조심스럽게 톱니 집게를 사용하여 HBSS에서 생검 펀치 종양 조직을 들어 올리고 보풀이없는 종이 타월로 조직을 두드려 과도한 완충액을 제거하십시오.</li>
	<li>의료 등급 시아노 아크릴레이트 접착제 한 방울을 표본 판에 놓고이 방울에 조직을 놓습니다. 접착제를 2-3분 동안 공기 건조시키고 플레이트를 완충트레이에 넣습니다. 조직이 완충제에 완전히 침지 될 때까지 일부 HBSS로 보충하십시오. 참고: 조직을 똑바로 세워 서 안정된 위치에 장착하는 것은 균일하게 절단된 슬라이스를 생성하는 데 매우 중요합니다. 장착 된 조직이 불안정한 경우 주변 조직에 더 많은 접착제를 추가하여 직립 위치를 유지하거나 조직을 언로드하고 바닥을 평평하게하고 다시 붙입니다. 탄성 조직은 슬라이스 중에 더 쉽게 밀고 구부러지는 경향이 있으며, 이 경우 길이가 짧고 (&amp;5 mm) 및 여러 번의 실행이 적절할 수 있습니다. 매우 깨지기 쉬운 조직의 경우 종이 타월은 조직을 파괴 할 수 있습니다. 이 경우, 조직은 일부 과잉 HBSS를 심지 플라스틱 표면에 배치 할 수 있습니다.</li>
	<li>진동 설정을 조정합니다. 절단 두께 = 250 μm, 진폭 = 3.00 mm, 슬라이스 속도 = 0.01-0.25 mm/s 및 블레이드 각도 = 15°-21°의 설정이 사용됩니다. 참고: 조직의 강성에 따라 슬라이싱 설정을 최적화합니다. 더 부드러운 조직은 더 낮은 속도로 더 깊은 블레이드 각도로 더 쉽게 절단됩니다. 18°의 블레이드 각도, 0.10-0.18 mm/s 사이의 절삭 속도 및 3.00 mm의 진폭은 마우스 4T1 및 PDX HCI010 종양에 적합합니다. 더 단단한 조직은 더 빠른 블레이드 속도로 절단 할 수 있습니다.</li>
	<li>블레이드의 시작 및 끝 위치를 설정하고 스테이지의 높이를 조정합니다. 연속 모드로 기기를 실행하여 조직이 균일하게 절단될 때까지 여러 사이클 동안 슬라이스를 잘라냅니다.</li>
	<li>조직을 계속 자르기. 소량의 HBSS 버퍼와 함께 슬라이스를 와이드 팁 이송 파이펫으로 배지로 세포 배양 인서트에 옮기고 흡입을 사용하여 전체 슬라이스를 들어 올립니다. 24개의 웰 플레이트에 인서트를 한 조각씩 놓습니다. 6개의 웰 플레이트용 인서트가 복제 분석에 대해 최대 4개의 슬라이스를 수용할 수 있습니다. 참고 : 티슈 슬라이스의 마지막 가장자리가 절단되지 않은 조직에 여전히 부착된 경우, 진동을 중지하고 조직 조각을 만지거나 찌르지 않고 두 쌍의 미세 팁 집게로 조직 조각을 분리하십시오. 별도의 면도날은 매달려 있는 조직을 제거하는 데 유용할 수 있습니다.</li>
	<li>미세 팁 이송 파이펫으로 여분의 버퍼를 제거합니다.</li>
	<li>블레이드가 접착 된 조직에 가까워지면 기구를 멈추고 무대를 낮추고 별도의 블레이드로 뻣뻣한 조직을 제거하고 새 조직을 장착하십시오. 충분한 조각이 수집될 때까지 슬라이스를 계속합니다.</li>
	<li>37°C, 5%CO2로설정된 가습 인큐베이터에서 플레이트를 배양한다. 조직 슬라이스는 세포 배양 삽입상에서 공기-액체 상호상에서 배양된다. 조직 슬라이스는 초기 슬라이스 제조 후 24-48 시간 동안 실험할 준비가 되어 있다. 장기 재배를 위해 2-3 일마다 중간을 교환하십시오.</li>
</ol>2. 생존력 측정
<ol><li>조직 슬라이스의 생존율 측정을 위해 제조업체의 지시에 따라 TSC 배지에서 1:1,000 희석에서 루시퍼라제및 판기판을 모두 포함하는 발광 기반 생존율 측정 시약으로 배지를 교환하십시오. 시약은루시퍼린(11)에대사된 프로레이트의 살아있는 세포의 감소 활성을 측정한다. 각 조직 슬라이스 위에 효소 기질 혼합물 50 μL을 전달합니다.</li>
	<li>가습 된 인큐베이터 내부에위치한 궤도 셰이커에 부드러운 교반과 함께 배양 37 ° C와 5 %CO2 하룻밤.</li>
	<li>발광 신호는 24 웰 플레이트에서 배양된 조직을 위한 마이크로플레이트 리더 또는 생체 내 이미징 기기를 사용하여 측정할 수 있다. 6 웰 플레이트에 여러 조직의 개별 생존력을 측정하기 위해 생체 내 이미징 시스템을 사용해야합니다.<ol>
<li>마이크로 플레이트 리더를 사용하는 경우 뚜껑없이 마이크로 플레이트를 설정합니다. 발광 강도를 측정할 수 있는 모든 유형의 마이크로플레이트 리더는 실험에 적합해야 합니다. 우리는 다음 설정을 사용 : 읽기 시간 = 1 초, 상단에서 측정, 게인 = 200. 참고: 정확도를 높이려면 흰색 벽 마이크로플레이트를 사용하여 실험을 설정합니다. 흰색 벽, 명확한 바닥 24 웰 플레이트는 테스트되었으며, 대부분의 경우, 명확한 웰 플레이트는 결과를 손상시키지 않습니다.</li>
		<li>생체 내 이미징 시스템을 사용하여 생존 가능성을 측정할 때 플레이트를 스테이지 중앙에 놓고 뚜껑을 제거합니다. C, 자동 노출 시간, f-stop = 1, 피사체 높이 = 0.0 cm의 마이크로 플레이트로 객관적인 설정에서 스테이지 설정 필드가 있는 발광 이미지 다음에 일반 사진 이미지를 수집합니다.</li>
		<li>생체 내 이미징 시스템과 함께 이미징 소프트웨어를 사용하여 발광 강도를 정량화합니다. 각 조직 슬라이스 주위에 일관된 관심 영역(ROI)을 그립니다. 이 프로토콜은 1cm 직경원을 ROI로 사용합니다(그림 1참조). 영역의 총 플럭스(p/s)를 측정합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 조직 슬라이스에 대한 약물 효과 평가
<ol><li>섹션 2에 설명된 바와 같이 발광 기반 생존성 측정 시약을 사용하여 치료 전에 기준선 생존 가능성을 측정합니다. 참고 : 여러 조직이 다른 조직에 비해 생존 가능성이 현저히 낮은 경우 분석에서 조직을 생략하십시오.</li>
	<li>디메틸 설폭사이드(DMSO)에 약물을 용해하여 재고 용액을 만듭니다. 원하는 농도에서 TSC 또는 다른 배양 배지(25 μL/well 의 250 μL를 함유하는 24개의 웰 플레이트에 대해 잘) 10x 약물 용액을 준비합니다. 차량 제어를 위해 동등한 DMSO 부피가 포함된 매체를 준비합니다.</li>
	<li>웰 의 바닥에 배양 배지에 10x 약물 용액을 보충. 파이펫팅하여 혼합하고 조직 위에 배지의 50 μL을 전달합니다. 참고: 여러 조직 조각을 사용할 수 있는 경우, 테스트 중복 또는 각 조건에 대 한 삼분량.</li>
	<li>37°C, 5%CO2,가습 인큐베이터에서 궤도 셰이커에 부드럽게 흔들어 밤새 배양한다.</li>
	<li>셰이커에서 플레이트를 제거하고 37°C, 5%CO2,가습 인큐베이터에서 정적으로 배양한다.</li>
	<li>원하는 시점에서 마이크로 플레이트 리더 또는 생체 내 이미징 시스템을 사용하여 조직에서 발광 강도를 측정합니다. 보통, 약물 효과 치료 후 감지 될 1-6 일. 참고: 발광 계 생존 시약은 배양 조건 하에서 적어도 3일 동안 안정적입니다. 그러나, 기질은 조직의 대사 활성에 따라 분석 기간 동안 고갈될 수 있다. 이전에 높은 신호가있는 조직에서 상당한 신호 강하가 관찰되면 모든 우물에서 기판을 보충하십시오.</li>
	<li>다음 방정식을 사용하여 치료된 종양 조직의 남은 생존 가능성을 계산합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61036/61036eq1v2.jpg"> 치료 된 조직의 생존력은 제어 종양 조직의 기준선 생존 및 생존 가능성에 의해 정상화됩니다.</li>
</ol>

<ol><li>Klemm, F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+therapeutic+response+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer.</a> Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).</li>
<li>Horvath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+out+irrelevant+cell-based+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Screening out irrelevant cell-based models of disease.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).</li>
<li>Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failures+in+Phase+III%3A+Causes+and+Consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Failures in Phase III: Causes and Consequences.</a> Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
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<li>Duellman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Cell+Viability+Assay+and+Use+in+Inhibitor+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).</li>
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<li>Chadwick, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brain+Tumor%2FOrganotypic+Slice+Co-culture+System+for+Studying+Tumor+Microenvironment+and+Targeted+Drug+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53304(2015).</li>
<li>Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Glioblastoma+Organotypic+Slice+Culture+Model+for+Study+of+Tumor+Cell+Migration+and+Patient-specific+Effects+of+Anti-Invasive+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53304(2017).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 프로토콜에서, 우리는 organotypic 종양 조직 조각에 정량적, 실시간 약물 효능 연구를위한 플랫폼을 보여줍니다. 조직 슬라이스 배양 시스템은 네이티브 종양 미세 환경의 세포 이질성 및 생리학적 특성을 포착함으로써 기존의 세포 기반 체외 방식에 비해 뚜렷한 이점을 제공한다. 이 플랫폼은 또한 약물 효능 테스트를 위한 더 높은 처리량을 가능하게 하여 세포 배양 연구와 생체 내 실험 사이의 격차를 해소하는 데 도움을 줍니다.
정확 하 고 일관 된 결과 얻으려면, 준비 하는 동안 조직 손상을 최소화 하는 것이 필수적이다. 조직 조각은 물리적 접촉으로 인한 손상을 방지하기 위해 넓은 팁 플라스틱 파이펫으로 처리해야합니다. 배양 배지 부피는 조직 슬라이스가 실험 기간 동안 공기 및 배지 둘 다에 접촉할 수 있도록 유지되어야 한다.
배양 배지는 조직 유형 및 실험 목적에 따라 최적화되어야 한다. 이 프로토콜에 사용되는 TSC 배지는...

암 세포와 주변 기질 조직의 물리적 및 생화학적 특성과의 상호 작용은 TME를 형성한다. TME는 종양 성장을 자극할 수 있고, 전이, 및 치료에 종양 반응을 조절할 수있습니다 1. 종래의 전임상 약물 개발에서, 약물 후보는 전형적으로 배양된 암 세포주를 사용하여 먼저 스크리밍되며, TME2가비판적으로 결여된 분석 플랫폼이다. 이러한 세포 기반 사전 스크리닝 단계에서생리학적 TME의 부족은 종양을 지탱하는 동물 모델에서 효과적인 제제의 발견을 제한할 수 있으며, 개발3의후기 임상 단계에서 많은 유망한 종양학 약물의 높은 감소율에 기여할 수 있다.
종양 약물 반응을 조절하는 TME의 중요성에도 불구하고, 실험적 제약은 약물 발견 및 개발의 초기 단계에서 보다 생리적으로 관련된 시스템의 적용을 제한합니다. 동물 모형 또는 참을성 있는 종양 견본에서 종양에 치료에이전트의 수백을 가리기 위하여 비실용적입니다. 실제로, 외과 표본은 다양한 유전적 배경을 가진 부족한 자원이며 동물 모델에서 수천 개의 후보 분자를 선별하는 것은 실험적 규모, 비용 및 동물 복지로 인해 실현 가능하지 않습니다.
종양 조직 슬라이스 배양은, 정밀하게 절단된, 얇은 종양 절편이 생체내에서 배양되는 경우, 약물 스크리닝 어세이에서 생리적 TME의 한계를 해결할 수 있다. 역사적으로, 신경 과학의 분야는 개척하고 뇌 조직에 대한 슬라이스 문화의 광범위한 최적화를 했다4. 최근, 많은 연구는 세포주 유래 종양, 자발적 종양 모델, 환자 유래 이종이식 (PDX) 및 1 차적인 참을성 있는 종양을 포함하여 종양 조직의 각종 모형에서 조각의 준비를 설명했습니다. Ex vivo 조직 슬라이스 배양은 생체 내 및 체외 배양 모두에서 혜택을통합5. 종양 조직 조각은 손상되지 않은 조직 구조 및 변종 된 세포 조성을 유지하여 TME 컨텍스트 내에서 암세포의 연구를 가능하게합니다.
이 프로토콜은 약물 반응을 평가하기 위해 실시간, 매우 민감한 생존 가능성 분석과 결합된 orgnotnotypic 종양 조직 슬라이스 배양 시스템을 소개합니다. 이전에 도입된 프로토콜에서 orgnotnotypic 종양 조직 조각에 대한 약물 효능 시험은 형광 염료 혼입, 면역 조직 화학 (IHC) 또는 MTT ((3- [4, 5-디메틸티아졸-2-yl]-2, 5 디페닐 테트라졸륨,브로마이드) 분석6,,7,8, 8에의한 세포 생존력의 변화를 측정하는 데 의존합니다.89 그러나 이러한 모든 방법은 종점 분석이며 낮은 감도, 긴 처리 시간, 복잡한 데이터 분석, 좁은 신호 범위 및 높은 실험 오차로 고통받고 있습니다. 당사의 발광 기반 라이브 셀 호환 시약은 사전 처리 및 최소한의 사후 처리 없이 광범위한 신호 범위와 순간(~5분) 측정을 제공하여 이러한 공술을 개선합니다. 이 시약은 매우 민감하고 세포 배양 배지에 공존할 수 있어 세포 생존가능성을 지속적으로 그리고 시간 과정으로 측정할 수 있습니다. 이 분석 시스템은 전임상 약물 개발에서 조직 슬라이스에 대한 약물 후보의 높은 처리량 스크리닝에 적용가능하다.

<table><tbody><tr><td>10cm 접시</td><td>Corning</td><td>430293</td><td></td></tr><tr><td>24웰 접시</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7524</td><td></td></tr><tr><td>4T1</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>6mm 직경 생검 펀치</td><td>Integra Miltex</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td>시그마-알드리치</td><td>A8960-5g</td><td>TSC용 medium</td></tr><tr><td>Belzer UW cold storage solcution (UW solution)</td><td>Bridge to Life</td><td>500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Membrane Mix</td><td>Fisher scientific</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Corning</td><td>MT-25950CQC</td><td></td></tr><tr><td>Double Edge Stainless Steel Cutting Blade</td><td>TED PELLA</td><td>121-6</td> 독소루비신(염산염) <td>슬라이싱용</td></tr><tr><td>Cayman Chemical</td><td></td><td>15007</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>파인 팁 집게</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4974</td><td></td></tr><tr><td>파인 팁 집게</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4976</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>시그마-알드리치</td><td>G5767-500g</td><td></td></tr><tr><td>칼슘, 마그네슘 또는 페놀 없는 TSC 매체 HBSS용 Red</td><td>Gibco</td><td>14-175-103</td><td></td></tr><tr><td>HCI010</td><td>Dr. Alana Welm, 유타 대학교</td><td>유방암 PDX</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 완충 용액</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>TSC 매체</td></tr><tr><td>용 ITS + Premix</td><td>Fisher Scientific</td><td>354352</td><td>TSC 매체</td></tr><tr><td>용 IVIS 스펙트럼</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Leica VT1200S Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030164</td><td>TSC 배지</td></tr><tr><td>밀리셀 세포 배양 인서트, 12mm, 친수성 PTFE, 0.4 &마이크로; m</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>밀리셀 세포 배양 인서트, 30mm, 친수성 PTFE, 0.4 &마이크로; m</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>시그마-알드리치</td><td>N0636-500g</td><td>TSC 매체</td></tr><tr><td>PELCO Pro CA44 조직 접착제</td><td>TED PELLA</td><td>10033</td><td>접착제</td></tr><tr><td>펜 연쇄상 구균</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>피셔 피셔 사이언티픽</td><td>15140163</td><td>TSC 매체</td></tr><tr><td>RealTime-Glo MT 세포 생존력 분석</td><td>Promega</td><td>G9711</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 EGF</td><td>BioLegend</td><td>585608</td><td>TSC 매체</td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>11875135</td><td></td></tr><tr><td>단일 에지 산업용 면도날</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>접착 조직 제거용</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Corning</td><td>25-035-CI</td><td>TSC 매체 피</td></tr><tr><td>루브산</td><td>나트륨 피셔용 과학</td><td>BW13115E</td><td>TSC 매체</td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3510A</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tooothed typs</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5155</td><td></td></tr><tr><td>이송 피펫</td><td>Fisher scientific</td><td>13-711-7M</td><td>와이드 팁</td></tr><tr><td>이송 피펫</td><td>Samco Scientific</td><td>235</td><td>Fine tip</td></tr><tr><td>윌리엄의 매체 E, 글루타민 없음</td><td>TSC 배지용</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>12551032</td></tr></tbody></table>

오르가노티픽 종양 조직 슬라이스에서 실시간 약물 반응 측정

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

종양 조직은 암 세포, 침투 된 면역 세포, 내피 세포, 섬유 아세포 및 세포 외 매트릭스로 구성됩니다. 이러한 복잡한 밀리외는 종양 미세환경(TME)을 구성하고 생체내 또는 약물 반응 ex vivo에서 치료에 대한 반응을 조절할 수 있다. 종래의 암 약물 발견 스크린은 단층에서 배양된 세포에서 수행되며, TME의 영향이 비판적으로 결여된 시스템이다. 따라서 민감하고 처리량이 높은 실험을 생리적 TME와 통합하는 실험 시스템은 전임상 약물 발견 과정을 강화할 것이다. 여기서, 우리는 중간 높은 처리량 약물 스크리닝을 위한 플랫폼으로서 생체내 종양 조직 슬라이스 배양을 소개한다. Organotypic 조직 슬라이스 배양은 액체 공기 계면에서 다공성 멤브레인의 지지로 유지되는 정밀하게 절단된 얇은 종양 섹션을 구성합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 환자 유래 이종이식(PDX) 모델로부터 마우스 종양 및 종양으로부터 제조된 조직 조각의 제조 및 유지를 설명한다. 약물 치료에 반응하여 조직 생존 력의 변화를 평가하기 위해, 우리는 조직에서 생존 가능한 세포의 실시간, 신속하고 민감한 측정을 가능하게 하는 생체 적합성 발광 기반 생존 성 분석기를 활용했습니다. 이 플랫폼을 사용하여, 우리는 다중 키나아제 억제제, staurosporine 및 세포 독성 에이전트, 독소 루비신에 조직 조각의 복용량 의존적 반응을 평가했습니다. 또한, 단일 PDX 종양으로부터 제조된 조직 슬라이스상에서 17개의 임상 및 전임상 약물을 스크리닝하여 생체내 약리학에 대한 조직 슬라이스의 적용을 입증한다. 우리의 생리학적 관련성, 매우 민감하고 강력한 생체 내 스크리닝 플랫폼은 전임상 종양학 약물 발견 및 치료 의사 결정을 크게 강화할 것입니다.

여기서, 마우스 4T1 유방종양 조직 및 유방암 PDX 모델, HCI01012로부터제조된 종양 조직 슬라이스에 대한 시간 과정, 다중 약물 효능 평가 프로토콜을 입증한다. 우리는 성공적으로 여러 마우스 유래 종양, PDX 및 신선한 환자 종양에서 조직 조각을 제조10. 종양 조직 제제 및 약물 효능 시험의 전반적인 워크플로우는 도 1에기재되어 있다. 일반적으로, 우리는 부피1,000-1,500 mm3의 단 하나 대량 종양에서 20-40 조직 조각을 준비할 수 있었습니다.
생존 력 측정을 위해 당사는 발광 기반의 라이브 셀 호환 생존 시약을 활용했습니다. 다중 키나아제 억제제, 스타우로스포린을 4일 동안 1 μM 농도에서 처리한 결과, DMSO 대조군으로 처리된 종양 조직과 비교하여 신호 강도를 100배 감소시켰습니다(도<s...

우리는 organotypic 종양 조직 조각에 있는 실시간 약 반응을 측정하기 위한 프로토콜을 소개합니다. 여기에 설명된 실험 전략은 생체 내 조건에서 임상 또는 마우스 종양에서 유래한 조직 조각에 중고 처리량 약물 스크린을 수행하는 플랫폼을 제공한다.

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

우리의 프로토콜은 다른 분자 분석 방법과 호환되며 약물이 조직 조각의 생존 가능성과 중간 처리량 스크리닝의 성능에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 우리가 아주 작은 사전 또는 사후 처리와 실시간으로 전체 조직 조각의 생존가능성을 측정할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 환자 종양 조직 샘플에서 직접 획득한 약물 후보 또는 조직 조각을 테스트하여 전임상 약물 개발 및 종양학을 가속화합니다.우리의 실시간 조직 생존 능력 평가 방법은 매우 다양하며 암 생물학, 신경 과학 및 발달 생물학 연구에 적용 될 수 있습니다. 실행 가능한 조직 조각을 준비하는 것은 절차의 성공의 열쇠입니다. 중간 조성물의 진동 설정은 조직 유형 및 탄력에 따라 조정되어야 합니다.종양 조직 슬라이스 수집 당일, 24웰 플레이트에서 잘 당 조직 슬라이스 배양 배지의 250 마이크로리터를 각 우물에 삽입한다. 그런 다음 플레이트를 사용 전까지 5%의 이산화탄소로 가습된 인큐베이터37도에 놓습니다. 종양 조직 단편을 획득하기 위해, 10센티미터 배양판에 얼음 감기 HBSS에 종양 조직을 침수하고 메스를 사용하여 조직을 반으로 자른다.6mm 생검 펀치를 사용하여 종양 조직의 실린더를 획득하고 각 실린더의 한쪽 끝을 다듬어 평평한 표면을 만듭니다. 티슈 조각을 신선하고 차가운 HBSS에 놓고 진동을 켭니다. 70%의 에탄올로 모든 장비를 소독하고 진동 유리 뚜껑으로 덮인 진동완유리 트레이를 진동얼음 욕조 중앙에 놓습니다.목욕에 얼음을 추가하고, 차가운 HBSS로 버퍼 트레이를 채웁니다. 면도날을 블레이드 홀더에 적재하고 이빨이 있는 집게를 사용하여 생검 펀치 종양 샘플을 신중하게 선택합니다. 시편 접시에 의료등급 시아노아크라일레트 접착제 한 방울을 넣습니다.여분의 버퍼를 제거하고 수직 안정 위치에 드롭에 조직의 실린더를 장착보풀이없는 종이 타월의 조각에 조직을 두드려. 2~3분간 의 공기 건조 후, 접시를 완충트레이에 넣고 조직이 완충제에 완전히 침지될 때까지 트레이에 HBSS를 추가합니다. 그런 다음 아이스 트레이와 버퍼 트레이 어셈블리를 진동에 넣고 팔을 잠그면 진동을 조립합니다.진동 절단 두께를 250 마이크로미터로 설정하고 진폭은 3mm로, 슬라이스 속도는 초당 0.01 내지 0.25 밀리미터, 블레이드 각도를 15~21도로 설정합니다. 블레이드의 시작 및 끝 위치를 설정하고 스테이지의 높이를 조정합니다. 연속 모드에서

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

출처: Ciraku, L., et. al입니다. 유방암 뇌 전이성 종양 성장을 연구하고 표적으로 삼기 위한 생체 외 뇌 절편 모델. J. Vis. 특급. (2021). 이 비디오는 유기형 마우스 뇌 절편에서 루시페라아제 발현 종양 세포의 이미징을 보여줍니다. Luciferin을 배지에 첨가하고 플레이트를 in vivo 이미징 시스템의 챔버 내부에 배치합니다. 이미지 캡처를 위한 매개변수가 조정되고 종양의 모양과 크기가 정의됩니다. 그런 다음 종양 세포에서 방출되는 생물 발광 신호가 기록됩니다.

유기형 마우스 뇌 절편에서 종양 성장을 평가하기 위한 생물 발광 이미징

암 세포와 뇌의 Organotypic 슬라이스 공 배양은 뇌 조직의 암 세포 침략의 과정에서 형광뿐만 아니라 시야 (비디오) 현미경으로 형태 학적 변화를 시각화 할 수 있습니다. 이 모델 시스템은 전지 교환 및 보충 접근이 가능하며 조작 및 분석의 다양한 제공합니다.

뇌의 Organotypic 슬라이스와 암 세포의 3 차원 회전 타원체와 공 배양 시스템

많은 유형의 인간 뇌종양은 뇌 내의 특정 영역에 국한되어 있으며 배양에서 성장하기 어렵습니다. 이 프로토콜은 종양 미세환경의 역할을 다루고 유기형 마우스 뇌 절편에서 자라는 형광 원발성 뇌종양 세포를 분석하여 신약 치료를 조사합니다.

약물 치료를 종양 미세 환경을 공부하고 대상에 대한 뇌종양 / Organotypic 슬라이스 공동 문화 시스템

glioblastoma (GBM)의 현재 ex vivo 모델은 생리 학적으로 인간 종양 침습 연구에 최적화되어 있지 않습니다. 여기, 우리는 신선한 인간 GBM 조직에서 organotypic 슬라이스 문화의 생성 및 유지를위한 프로토콜을 제시한다. 시간 경과 현미경 및 정량 세포 이동 분석 기술에 대한 설명이 제공됩니다.

종양 세포 이동 연구를위한 인간 Glioblastoma Organotypic Slice 문화 모델 및 항 침윤성 약물의 환자 특이 적 효과

우리는 생성, 재배 및 organotypic 조각 murine 폐 종양에서 파생 된의 체계적인 분석에 대 한 메서드를 제공 합니다. 우리는 또한 슬라이스 두께 대 한 최적화 하는 방법과 종양 조각 치료 약물 농도 선택 하는 방법을 설명 합니다.

설립 및 종양 조각의 분석 Explants 진단 테스트에 대 한 전제 조건으로

이 프로토콜은 유기형 절편 배양(OTSC)의 준비에 대해 설명합니다. 이 기술은 온전한 다세포 조직의 체외 배양을 용이하게 합니다. OTSC는 다세포 환경에서 약물에 대한 각각의 반응을 테스트하는 데 즉시 사용할 수 있습니다.

원발성 췌장암 및 전이에서 종양 미세환경의 전임상 모델로서의 유기형 절편 배양

이 프로토콜은 종양 내 이질성을 포착하기 위해 다중 매개변수, 단일 오가노이드 약물 반응을 정량화하고 시각화하기 위한 중간 및 고처리량 오가노이드 약물 스크리닝 및 현미경에 구애받지 않는 자동 이미지 분석 소프트웨어를 위한 반자동 방법을 설명합니다.

벌크 및 단일 오가노이드 분석을 위한 광시야 라이브 셀 이미징을 사용한 다중 파라미터 종양 오가노이드 약물 스크리닝

우리는 복막 표면으로 전이된 인간 암의 생산, 배양 및 시각화를 위한 프로토콜을 설명합니다. 절제된 종양 표본은 비브라톰을 사용하여 절단하고 투과성 삽입물에서 배양하여 산소 공급 및 생존력을 높인 다음 컨포칼 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 이미징 및 다운스트림 분석을 수행합니다.

절제된 인간 종양 표본에서 생체 외 유기형 가성 점액종 복막 종양 절편의 배양 및 이미징

환자 유래 종양 오가노이드는 기초 및 중개 연구를 위한 정교한 모델 시스템입니다. 이 방법 기사에서는 다양한 오가노이드 표현형의 동시 역학 평가를 위한 다중 형광 라이브 셀 이미징의 사용에 대해 자세히 설명합니다.

암의 환자 유래 오가노이드 모델에서 약물 반응을 위한 다중 라이브 셀 이미징

우리는 저간섭 홀로단층촬영을 사용하여 오가노이드의 고해상도, 무표지 및 3차원 이미징을 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 오가노이드 배양 준비, 이미징 획득 및 전산 이미지 분석을 자세히 설명하여 살아있는 오가노이드의 구조 역학 및 약물 반응을 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

저간섭성 홀로토마그래피를 통한 장내 오가노이드의 무표지, 고해상도 3D 이미징 및 머신러닝 분석

학습하세요 오르가노티픽 종양 조직 슬라이스에서 실시간 약물 반응 측정 방법을 통해 임상 종양 샘플의 약물 효과를 평가하고 중간 처리량 스크리닝을 수행하는 기술을. 이 프로토콜은 전임상 약물 개발을 가속화합니다.

오르가노티픽 종양 조직 슬라이스에서 실시간 약물 반응 측정

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