Name: 리포터 단백질을 발현하는 재조합 로타바이러스를 회수하는 역유전학 방법 간소화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: 배우세요 역유전학 방법으로 형광 리포터 단백질을 발현하는 재조합 로타바이러스를 생성하는 기술입니다. BHKT7 세포와 최소 플라스미드 시스템을 활용하여 바이러스학 및 백신 개발 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 NIH 보조금 R03 AI131072 및 R21 AI144881, 인디애나 대학 창업 자금, 로렌스 M. 블랫 인다우먼트에 의해 지원되었다. 우리는 IU 로타후시에 실험실의 구성원, 울리히 Desselberger, 및 귀도 파파 역 유전학 프로토콜을 개발에 그들의 많은 기여와 제안에 감사드립니다.

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<li>Kawagishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+genetics+system+for+a+human+group+A+rotavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Reverse genetics system for a human group A rotavirus.</a> Journal of Virology. , (2019).</li>
<li>Komoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+infectious+recombinant+human+rotaviruses+from+just+11+cloned+cDNAs+encoding+the+rotavirus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of infectious recombinant human rotaviruses from just 11 cloned cDNAs encoding the rotavirus genome.</a> Journal of Virology. 93 (8), 02207-02218 (2019).</li>
<li>Mohanty, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+point+mutation+in+the+rhesus+rotavirus+VP4+protein+generated+through+a+rotavirus+reverse+genetics+system+attenuates+biliary+atresia+in+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A point mutation in the rhesus rotavirus VP4 protein generated through a rotavirus reverse genetics system attenuates biliary atresia in the murine model.</a> Journal of Virology. 91 (15), 00510-00517 (2017).</li>
<li>Navarro, A., Trask, S. D., Patton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genetically+stable+recombinant+rotaviruses+containing+novel+genome+rearrangements+and+heterologous+sequences+by+reverse+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of genetically stable recombinant rotaviruses containing novel genome rearrangements and heterologous sequences by reverse genetics.</a> Journal of Virology. 87, 6211-6220 (2013).</li>
<li>Duarte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+infection+alters+splicing+of+the+stress-related+transcription+factor+XBP1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Rotavirus infection alters splicing of the stress-related transcription factor XBP1.</a> Journal of Virology. 93 (5), 01739-01818 (2019).</li>
<li>Philip, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+recombinant+rotavirus+expressing+NSP3-UnaG+fusion+protein+by+a+simplified+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of recombinant rotavirus expressing NSP3-UnaG fusion protein by a simplified reverse genetics system.</a> Journal of Virology. , 1616-1619 (2019).</li>
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<li>Komoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+genetics+system+demonstrates+that+rotavirus+nonstructural+protein+NSP6+is+not+essential+for+viral+replication+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Reverse genetics system demonstrates that rotavirus nonstructural protein NSP6 is not essential for viral replication in cell culture.</a> Journal of Virology. 91 (21), 00695-00717 (2017).</li>
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<li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+stable+rotavirus+reporter+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Development of stable rotavirus reporter expression systems.</a> Journal of Virology. , 01774-01818 (2019).</li>
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<li>Kumagai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bilirubin-inducible+fluorescent+protein+from+eel+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle.</a> Cell. 153, 1602-1611 (2013).</li>
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<li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+%28BRSV%29+from+cDNA%3A+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture%2C+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> Journal of Virology. 73, 251-259 (1999).</li>
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<li>Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing%2C+storage%2C+and+quantification+of+rotaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Culturing, storage, and quantification of rotaviruses.</a> Current Protocols in Microbiology. 15 (1), (2009).</li>
<li>Benureau, Y., Huet, J. C., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+is+associated+with+the+rotavirus+capsid+and+is+activated+by+solubilization+of+outer+capsid+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Trypsin is associated with the rotavirus capsid and is activated by solubilization of outer capsid proteins.</a> Journal of General Virology. 86 (11), 3143-3151 (2005).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

우리의 실험실에서, 우리는 재조합 SA11 로타바이러스를 생성하기 위하여 본원에 기술된 역유전학 프로토콜에 일상적으로 의존한다. 이 접근으로, 분자 생물학 기술에 있는 작은 경험이 있는 개별 또는 rotaviruses로 일하는 것은 그들의 첫번째 시도조차 재조합 바이러스를 복구합니다. 우리는 이 프로토콜에 따라 거의 100개의 재조합 바이러스를 생성했는데, 여기에는 외래 단백질(예를 들어, FPs)을 발현하기 위해 재설계되고 서열 추가, 삭제 및 점 돌연변이를 포함하는 게놈이 있는 바이러스가 있습니다.
이 프로토콜에 주어진 조건 및 배양 시간은 재조합 바이러스의 잘 성장하는 균주의 회복에 적용된다. 유전자 변형으로 인해 제대로 성장할 것으로 예상될 수 있는 SA11 바이러스를 복구하려고 시도하는 경우 조정을 고려해야 합니다. 특히, 형질감염된 BHK-T7/MA014 세포에서 이러한 바이러스의 역가가 낮을 수 있기 때문에, 우리는 전형적으로 후속 증폭 단계에서 접종으로 사용되는 용...

로타 바이러스는 유아와 어린 아이들에 있는 가혹한 위장염의 중요한 원인, 뿐만 아니라 많은 그밖 포유류 및 조류 종의 젊은1. Reoviridae 가족의 일원으로서, 로타바이러스는 분할된 이중 가닥 RNA (dsRNA) 게놈이 있습니다. 게놈 세그먼트는 단백질2의3개의 동심 층에서 형성된 비 봉투에 싸인 icosahedral virion 안에 포함됩니다. 게놈 세그먼트의 시퀀싱 및 계통유전학 적 분석에 기초하여, 9종의 로타바이러스(A−D, F−J)가3가지로정의되었다. 로타바이러스 종 A를 포함하는 이들 균주는 대부분의 인간 질환에 대한 책임이 있다4. 지난 10 년 에서 시작 된 어린 시절 예방 접종 프로그램에 로타 바이러스 백신의 도입은 로타 바이러스 사망률과 이환율의 상당한 감소와 상관 관계가 있습니다. 가장 주목할 만한, 로타 바이러스 관련 어린 시절 죽음의 수는 2000년에 대략 528,000에서 2016년에 128,500에4,,5로감소했습니다. 로타바이러스 백신은 생후 6개월까지 어린이에게 2~3회 투여되는 살아있는 감쇠 균주에서 제조됩니다. 인간 과 다른 포유류 종에서 순환하는 유전적으로 다양한 로타 바이러스 균주의 많은 수, 돌연변이 발생 및 재분류를 통해 빠르게 진화하는 능력과 결합, 어린이를 감염로 타 바이러스의 유형에 항원 변화를 초래할 수있다6,,7,,8. 이러한 변화는 기존 백신의 효능을 약화시킬 수 있으며, 대체 또는 수정이 필요합니다.
11개의 로타바이러스 게놈 세그먼트 중 어느 한 쪽의 조작을 가능하게 하는 완전 플라스미드 기반 역유전학 시스템의 개발은 최근에9개달성되었다. 이러한 시스템의 가용성으로, 그것은 로타 바이러스 복제 및 병인의 분자 세부 사항을 해명 할 수있게되었다, 안티 로타 바이러스 화합물에 대한 개선 된 높은 처리량 스크리닝 방법을 개발하고, 로타 바이러스 백신의 새로운 잠재적으로 더 효과적인 클래스를 만들 수 있게되었다. 로타바이러스 복제 동안, 바이러스 성 (+)RNAs는 바이러스 성 단백질의 합성을 안내 할뿐만 아니라 자손 dsRNA 게놈 세그먼트10,,11의합성을위한 템플릿역할을합니다. 현재까지 기술된 모든 로타바이러스 역유전학 시스템은 재조합 바이러스9,,12,,13을회수하는데 사용되는 cDNA 유래(+)RNA의 공급원으로서 포유류 세포주내로 T7 전사 벡터의 형질감염에 의존한다. 전사 벡터 내에서, 전신 바이러스 성 cDNA는 상류 T7 프로모터와 다운스트림 간염 델타 바이러스 (HDV) ribozyme 사이에 위치되어 바이러스 (+)RNA가 본격적인 5'및 3'termini를 포함하는 T7 RNA 폴리머라제에 의해 합성됩니다(그림 1A). 1세대 역유전학 시스템에서, 재조합 바이러스는 11T7(pT7) 전사 벡터로 T7 RNA 폴리머라제(BHK-T7)를 발현하는 아기 햄스터 신장 세포를 트랜스펙팅함으로써 만들어졌으며, 시미안 SA11 바이러스 균주의 독특한(+)RNA및 3개의 CMV 프로모터-구동 발현 플라스미드의 각각의 지시 합성, 조류 류바이러스 p10FAST 융합 단백질을 인코딩한 1개 및 백시니아 바이러스 D1R-D12L 캡핑 효소 복합체의 2개의 인코딩서브유닛. 형질감염된 BHK-T7 세포에서 생성된 재조합 SA11 바이러스는 로타바이러스 성장을 허용하는 세포주인 MA104 세포를 감독함으로써 증폭되었다. 1세대 역유전학 시스템의 변형된 버전은 더 이상 지지플라스미드(12)를사용하지 않는다고 기술되었다. 대신, 수정된 시스템은 단순히 BHK-T7 세포를 11개의 SA11 T7 전사 벡터로 트랜스펙팅함으로써 재조합 로타바이러스를 성공적으로 생성하며, 바이러스 성 공장(viroplasm) 빌딩 블록(비구조적 단백질 NSP2 및 NSP5)에 대한 벡터가 다른 벡터14, 15보다,153배 높은 수준으로 추가된다는 경고와 함께. 역유전학 시스템의 변형된 버전은 또한 로타바이러스16,,17의인간 KU 및 Odelia 균주의 회복을 지원하는 개발되었다. 로타바이러스 게놈은 VP418,NSP19,NSP219,NSP320,,21,NSP522,,23에도입된 돌연변이와 함께 현재까지 생성된 재조합 바이러스와 함께 역유전학에 의한 조작이 현저하게 가능하다. 지금까지 생성된 가장 유용한 바이러스 중에는 형광 리포터 단백질(FPs)9,,12,,21,,24,,25를발현하도록 설계된 바이러스가 있다.
이 간행물에서는, 우리는 우리가 SA11 로타바이러스의 재조합 긴장을 생성하기 위하여 우리의 실험실에서 사용하는 역유전학 시스템을 위한 프로토콜을 제공합니다. 당사의 프로토콜의 주요 특징은 11개의 pT7 전사 벡터(pT7/NSP2SA11 및 pT7/NSP5SA1 벡터의 3배 수준을 포함하도록 변형된 변형)와 아프리카 돼지 열바이러스(ASFV) NP868R 캡핑 효소를 코딩하는 CMV 발현 벡터를 가진 BHK-T7 세포의 병용화이다.21 Figure 2 우리의 손에, NP868R 플라스미드의 존재는 형질감염된 BHK-T7 세포에 의한 재조합 바이러스의 더 높은 역가의 생산으로 이어집니다. 본 공보에서는, 우리는 또한 세그먼트 7 단백질 생성물 NSP3뿐만 아니라 별도의 FP를 발현하는 재조합 바이러스가 생성될 수 있도록 pT7/NSP3SA11 플라스미드를 수정하기 위한 프로토콜을 제공한다. 이는 fp ORF(도1B)24,,26에이어 다운스트림 2A 번역 정지-재시작 엘리먼트를 포함하는 pT7/NSP3SA11 플라스미드에서 NSP3 오픈 판독 프레임(ORF)을 재엔지니어링함으로써 달성된다. 이러한 접근법을 통해, 우리는 다양한 FPs를 발현하는 재조합 로타바이러스를 생성하였다: UnaG (녹색), mKate (원빨색), mRuby (빨강), TagBFP (청색), CFP (시안), 및 YFP (노란색)24,,27,,28. 이러한 FP 발현 로타바이러스는 NSP3 ORF를 삭제하지 않고 만들어지므로 기능하는 바이러스 단백질의 완전한 보완을 인코딩할 것으로 예상되는 바이러스를 산출합니다.

<table><tbody><tr><td>아기 햄스터 신장 - T7 RdRP (BHK-T7) 세포</td><td></td><td></td><td>접촉: ubuchholz@niaid.nih.gov</td></tr><tr><td>Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>45608105</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer AutoT4 viable cell counter</td><td>Nexcelom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP Gel Imaging System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>MP</td><td>194002</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate</td><td>Bio-Rad</td><td>170-5060</td><td></td></tr><tr><td>유능한 대장균 DH5alpha 박테리아</td><td>Lucigen</td><td>60602-2</td><td></td></tr><tr><td>Complete Protease 억제제</td><td>Pierce</td><td>A32965</td><td></td></tr><tr><td>일회용 전사 피펫, 초미세 확장 팁</td><td>MTC Bio</td><td>P4113-11</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>독수리의 최소 필수 매체, 2x (2xEMEM)</td><td>Quality Biological</td><td>115-073-101</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 절대 (200 proof)</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드 용액 (10 mg/ml)</td><td>Invitrogen</td><td>15585-011</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS), 열 비활성화</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>Flag M2 항체, 마우스 단클론</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit</td><td>Sigma</td><td>NA0200-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin (G-418)</td><td>Invitrogen</td><td>10131-027</td><td></td></tr><tr><td>Gibco FluroBrite DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>A1896701</td><td>낮은 배경 포함 DMEM 형광</td></tr><tr><td>Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM)</td><td>Gibco</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated</td><td>Cell-Signaling Technology</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum</td><td>Patton lab</td><td>lot 55068</td><td></td></tr><tr><td>Guinea Pig Anti-VP6 Antierum</td><td>Patton lab</td><td>lot 53963</td><td></td></tr><tr><td>말 항기니피그 IgG, 양고추냉이 과산화효소(HRP) 공액</td><td>KPL</td><td>5220-0366</td><td></td></tr><tr><td>말 항-마우스 IgG, 양고추냉이 에록시다제(HRP) 접합</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR 검출 키트</td><td>JH Science</td><td>25235</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 알코올</td><td>Macron</td><td>3032-02</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 용액( 100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Luria Agar 분말 (Miller's LB Agar)</td><td>RPI 연구 제품</td><td>L24020-2000.0</td><td></td></tr><tr><td>매체 199 (M199) 배양 매체</td><td>Hyclone</td><td>Sh30253.01</td><td></td></tr><tr><td>최소 필수 매체 -Eagle Joklik's Forumation (SMEM)</td><td>Lonza</td><td>04-719Q</td><td></td></tr><tr><td>원숭이 신장 (MA104) 세포</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-2378.1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One 분광 광도계</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>중성 적색 용액(0.33%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N2889-100ml</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산 용액(100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-gel</td><td>Invitrogen</td><td>XP00102BOX</td><td></td></tr><tr><td>Free Nuclease-Free 분자 생물학 등급 물</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin 젤 및 PCR 클린업 키트</td><td>Takara</td><td>740609.25</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 환원 혈청 매체</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>펠렛 유봉 (RNase-free, 일회용)</td><td>Fisher</td><td>12-141-368</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액, (100x penn-strep)</td><td>코닝</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS), 10x</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>돼지 트립신, IX-S</td><td>유형, 시그마-알드리치</td><td>T0303</td><td></td></tr>, <tr><td>PureYield 플라스미드 Miniprep 시스템</td>, <td>Promega</td><td>A1223</td><td></td></tr>, <tr><td>Qiagen 플라스미드 맥시 키트</td>, <td>Qiagen</td><td>12162</td><td></td></tr>, <tr><td>Qiagen 플라스미드 미디 키트</td>, <td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr>, <tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>SA11 pT7 전사 벡터</td><td>Addgene</td><td>89162-89172</td><td></td></tr><tr><td>SA11 pT7 / NSP3 전사 벡터 형광 단백질</td><td></td><td></td><td>발현 연락처 : jtpatton@iu.edu</td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50000</td><td>젤 전기 영동</td></tr><tr><td>SeaPlaque agarose</td><td>Lonza</td><td>50100</td><td>플라크 분석 용</td></tr><tr><td>Superscript III 원스텝 RT-PCR 키트</td><td>Invitrogen</td><td>12574-035</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot 터보 니트로셀룰로오스 전송 키트</td><td>Bio-Rad</td><td>170-4270</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Llot 터보 전송 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TransIT-LTI 트랜스펙션 시약</td><td>Mirus</td><td>MIR2306</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine-SDS 겔 러닝 버퍼(10x)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0772</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Trizol RNA 추출 시약</td><td>Ambion</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Corning</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>트립신(0.05%)-EDTA(0.1%) 세포 해리 용액</td><td>품질 생물학</td><td>118-087-721</td><td></td></tr><tr><td>트립토스 인산염 육수</td><td>Gibco</td><td>18050-039</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>VWR</td><td>0777-1L</td><td></td></tr><tr><td>Vertrel VF 솔벤트</td><td>Zoro</td><td>G0707178</td><td></td></tr><tr><td>Zoe 형광 라이브 셀 이미저</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

리포터 단백질을 발현하는 재조합 로타바이러스를 회수하는 역유전학 방법 간소화

Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins

Rotaviruses는 인간을 포함하여 많은 포유류 및 조류 호스트 종의 젊은에 있는 가혹한 위장염을 일으키는 원인이 되는 분할된 이중 좌초된 RNA 바이러스의 크고 진화하는 인구입니다. 로타바이러스 역유전학 시스템의 최근 출현으로, 로타바이러스 생물학을 탐구하고, 기존 로타바이러스 백신을 수정 및 최적화하고, 로타바이러스 다표적 백신 벡터를 개발하기 위해 지시된 돌연변이 발생을 사용할 수 있게 되었다. 이 보고서에서는 재조합 로타바이러스의 효율적이고 신뢰할 수 있는 복구를 허용하는 단순화된 역유전학 시스템을 설명합니다. 이 시스템은 전신 로타바이러스(+)RNAs를 발현하는 T7 전사 벡터의 공동 형질감염과 BHK 세포에 RNA 캡핑 효소를 코딩하는 CMV 벡터를 구성하여 T7 RNA 폴리머라제(BHK-T7)를 생성한다. 재조합 로타바이러스는 바이러스 성장을 위해 매우 허용되는 원숭이 신장 세포주인 MA104 세포로 형질감염된 BHK-T7 세포를 감독함으로써 증폭된다. 본 보고서에서, 우리는 또한 게놈 세그먼트 7(NSP3)으로 2A 번역 정지 재시작 원소의 도입을 통해 별도의 형광 리포터 단백질을 발현하는 재조합 로타바이러스를 생성하기 위한 접근법을 설명한다. 이 접근법은 바이러스 성 개방 판독 프레임 중 어느 것을 삭제하거나 수정하는 것을 방지하여 형광 단백질을 발현하면서 완전한 기능의 바이러스 성 단백질을 유지하는 재조합 로타바이러스의 생산을 허용합니다.

이 문서에서 기술된 역유전학 프로토콜은 여러 가지 뚜렷한 단계를 통해 진행됩니다: (1) 로타바이러스 pT7 전사 벡터와 pCMV/NP868R 발현 플라스미드를 가진 BHK-T7 세포의 공동 형질전환, (2) MA104 세포를 이용한 형질감염된 BHK-T7 세포의 감독, (3) MA104 세포를 사용하여 BHK-T7/MA104 세포에 존재하는 재조합 바이러스의 증폭, (4) MA104 세포를 이용한 재조합 바이러스의 플라크분리(그림 2). 우리의 손에, 프로토콜은 효율적입니다, BHK-T7 / MA104 세포에서 재조합 야생형 SA11 바이러스 (rSA11 / wt)의 타이터를 산출 ~ 104 PFU / mL의 및 증폭 MA104 세포 용해 &gt;1 x 107 PFU / mL. FPs를 발현하는 변형된 pT7/NSP3SA11 플라스미드를 사용하여 역유전학에 의해 생성된 SA11 재조합 바이러스(예를 들어, rSA11/NSP3-2A-3x...

플라스미드 DNA로부터의 재조합 로타바이러스 생성은 로타바이러스 복제 및 병인, 및 로타바이러스 발현 벡터 및 백신의 개발을 위한 필수적인 도구를 제공한다. 본 명세서에서, 우리는 형광 리포터 단백질을 발현하는 균주를 포함하는 재조합 로타바이러스를 생성하기 위한 단순화된 역유전학 접근법을 설명한다.

Rotaviruses are a large and evolving population of segmented double-stranded RNA viruses that cause severe gastroenteritis in the young of many mammalian ...

이 프로토콜은 재조합 로타바이러스를 만들기위한 신뢰할 수있는 효율적인 역 유전학 시스템을 설명합니다. 또한 형광 마커 단백질을 표현하는 재조합 로타바이러스를 만드는 방법에 대해서도 설명합니다. 이 방법은 플라스미드의 최소한의 수를 요구하는 간단하고 별도의 불소 단백질뿐만 아니라 바이러스 성 단백질을 표현하는 재조합 로타바이러스를 생성 할 수 있습니다.먼저 BHKT7 세포를 12웰 플레이트에 시드합니다. PBS를 가진 세포의 갓 컨할 수 있는 단층을 헹구는 다. 그런 다음 트립신-EDTA 용액으로 단층층을 방해하고 GMEM 완성 배지의 5밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다.트라이판 블루와 자동 셀 카운터를 사용하여 실행 가능한 BHKT7 세포의 농도를 결정합니다. 그런 다음 12웰 세포 배양 판의 각 웰에 GMEM의 1 밀리리터에서 다섯 번째 세포에 두 번 10을 종자. 하룻밤 사이에 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.다음 날, 원고 의 지시에 따라 트랜스포밍을 위해 플라스미드 혼합물을 준비한다. 그런 다음 미리 따뜻워진 감혈제 110마이크로리터를 각 플라스미드 혼합물에 넣고 부드럽게 파이펫을 위아래로 섞어 넣습니다. 혼합물에 32 마이크로리터의 트랜스페션 시약을 추가합니다.소용돌이 다음 간단한 원심 분리를 하고 실온에서 20분 동안 배양하십시오. 한편, GMEM 불완전 배지의 2밀리리터로 BHKT7 세포를 헹구는다. 각 웰에 SMEM 불완전 한 매체의 밀리 리터 1 밀리리터를 추가하고 인큐베이터에 접시를 반환합니다.20 분 인큐베이션 후, 200 마이크로 리터 파이펫을 사용하여 각 우물에 드롭하여 경피 혼합물을 추가합니다. 부드럽게 접시를 흔들어 인큐베이터로 돌아갑니다. 2 일 후 형질 전환, PBS와 MA104 세포의 갓 confluent 단층 헹구기.트립신-EDTA 용액으로 단층층을 방해하고 DMEM 의 5밀리리터 의 5밀리리터에서 세포를 다시 일시 중단합니다. 세포를 계산하고 DMEM 불완전 배지의 밀리리터 당 다섯 번째 세포에 8배 10으로 농도를 조절한다. MA104 세포의 0.25 밀리리터를 트랜스감염된 BHKT7 세포로 우물에 떨어뜨립니다.각 웰에 밀리리터 트립신 스톡 솔루션당 1밀리그램에 0.8 마이크로리터를 추가하여 트립신 농도를 밀리리터당 0.5 마이크로그램으로 조정합니다. 남은 MA104 세포를 DMEM에서 밀리리터당 5번째 세포에 1.5배 10배 의 농도로 희석하고 6웰 플레이트의 각 웰에 2밀리리터를 배치한다. 형질 전환 후 6 일, 전감염된 세포에서 재조합 바이러스를 복구.BHKT7 MA104 세포를 멸균 조건하에서 동결/해동3사이클로 조절하여 음의 섭씨 20도및 실온 사이에서 플레이트를 이동시합니다. 리스를 1.5 밀리리터 튜브로 옮기. 원심 분리는 500 배 g와 4섭씨에서 10 분 동안 튜브를 분리하여 세포 파편을 펠렛합니다.상체를 수집하고 섭씨 4도에 보관하십시오. 트립신을 100 마이크로리터의 정제 된 세포 용액에 밀리리터 당 10 마이크로 그램의 최종 농도에 추가하고 1 시간 동안 섭씨 37도에서 혼합물을 배양하십시오. 그런 다음 DMEM 불완전 한 매체에서 음수 7에 10에서 음수 10에 이르기까지 10 배 직렬 희석 계열을 준비합니다.MA104 단층층을 PBS 2밀리리터로 두 번 헹구고 DMEM 불완전 한 배지로 한 번 헹구는 다. 400 마이크로리터의 용해 희석제를 접시에 복제하여 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양하여 10~15분마다 흔들어 단층층 전체에 희석제를 재분배합니다. 1.5%의 녹아 냉각된 아가로즈와 예열된 2X EMEM의 동일한 볼륨을 결합하여 아가로즈 MEM 오버레이 솔루션을 준비합니다.이 용액을 수조에서 섭씨 42도에서 유지하고 세포에 배치하기 직전에 트립신 농도를 밀리리터당 0.5 마이크로그램으로 조정합니다. 6웰 플레이트에서 희석을 흡입합니다. 그런 다음 불완전한 배지의 두 밀리리터로 한 번 세포를 헹구는 다.아가로즈 MEM 오버레이 용액3밀리리터를 각 웰의 셀 모노레이어에 부드럽게 추가합니다. 실온에서 아가로즈가 굳어지게 하십시오. 그런 다음 플레이트를 인큐베이터에 반환합니다.3 일 후, 이전에 설명 한 바와 같이 아가로즈 MEM 오버레이 솔루션을 준비하고 사용하기 직전에 밀리리터 당 50 마이크로 그램의 최종 농도에 중립 적색을 추가합니다. 6웰 플레이트에 기존 아가로즈 위에 오버레이 용액 2밀리리터를 추가합니다. 아가로즈가 접시를 경화하고 인큐베이터로 돌려보내중립 빨간색으로 판을 빛으로부터 보호하도록 합니다.다음 6 시간 동안, 라이트 박스의 도움으로 로타 바이러스 플라크를 식별합니다. 일회용 이송 파이펫을 사용하여 명확하게 정의된 플라크를 선택하여 세포 층으로 완전히 확장되는 아가로즈 플러그를 복구합니다. DMEM 불완전 배지의 0.5 밀리리터를 포함하는 1.5 밀리리터 튜브에 플러그를 배출하고 30 초 동안 샘플을 소용돌이.MA104 단층 또는 AT25 플라스크에 대한 전파에 의해 배지로 용출된 플라크 격리 바이러스를 증폭시키고 DMEM 불완전 배지및 트립신의 밀리리터당 0.5 마이크로그램을 제공합니다. 1.5 밀리리터 마이크로센트심분리기 튜브에 600마이크로리터의 감미로운 감염된 세포 리스와 400마이크로리터의 구안디늄 티오티야네이트를 첨가한다. 30초 동안 소용돌이를 가하고 실온에서 5분간 배양합니다.그런 다음 클로로폼 200 마이크로리터를 추가합니다. 30초 동안 용액을 소용돌이시키고 3분간 배양합니다. 13, 000배, 섭씨 4도에서 5분간 미세원심분리를 한 후, 상부 수성 상면의 550마이크로리터를 신선한 튜브로 옮긴다.차가운 이소 프로필 알코올의 두 볼륨을 추가하고 튜브를 4 ~ 6 번 반전. 샘플을 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 원심 분리는 13, 000 배 g 및 섭씨 4도에서 10 분 동안 분리합니다.RNA 펠릿을 떠나는 상체를 버리십시오. RNA를 튜브에 75%에탄올 1밀리리터를 첨가하여 한 번 반전시키고 7, 500배, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리하여 RNA를 세척합니다. 에탄올을 조심스럽게 제거한 후 RNA가 5~10분 동안 건조되도록 하십시오.그런 다음 펠릿을 15마이크로리터의 뉴클레아제 프리 워터에 녹입니다. 용존 RNA 샘플의 10 마이크로 리터에 6X DNA 로딩 버퍼의 2 개의 마이크로 리터를 추가합니다. 프리 캐스트 10 % 폴리 아크라이알라미드 미니 젤에 로드합니다.일정한 16 밀리암페어 전류하에서 2시간 동안 트리스 글리신 실행 버퍼에서 전기전도에 의한 RNA를 해결한다. 젤 이 가동이 완료되면 밀리리터 에티듐 브로마이드 당 1마이크로그램을 함유한 물에 5~10분 동안 젤을 담그고 UV 트랜틸루미나이터로 로타바이러스 게놈 세그먼트를 감지합니다. 이 역유전학 프로토콜은 MA104 세포에 플라크 분석으로 쉽게 식별할 수 있는 재조합 SA11 바이러스를 생성하여 플라크 격리를 허용하는 데 사용되었습니다.플라크 정제 rSA11 야생형 및 SA11-UnaG 바이러스의 dsRNA 게놈은 페놀과 구아니디늄 티오시아네이트를 함유한 용액으로 추출되었으며, 10%의 폴리아크라이글라미드 젤에서 전기전도에 의해 해결되고 에티듐 브로마이드로 염색하여 검출하였다. 예상대로, rSA11-UnaG의 세그먼트 7 또는 NSP3 dsRNA는 2A-3xFLUnaG 서열의 존재로 인해 rSA11 야생 유형보다 훨씬 느리게 마이그레이션되었다. UnaG 형광 단백질의 발현을 확인하기 위해 MA104 세포는 야생 형 및 재조합 바이러스에 감염되어 살아있는 세포 이미저로 검사했습니다.분석 결과 rSA11-UnaG는 녹색 형광을 발생시켰으며 rSA11 야생 형에 감염된 세포에서 형광이 발견되지 않은 것으로 나타났습니다. 면역블롯 분석은 rSA11-NSP3-2A-xflUnaG의 2A 소자가 두 개의 분리된 단백질의 발현을 촉진했는지 여부를 조사하기 위해 수행되었다. 분석 결과 NSP3-2A 및 3xFL-UnaG는 실제로 기능성 2A 요소를 나타내는 별도의 단백질로 표현되었다는 것을 보여주었다.재조합 로타바이러스의 성공적인 회복을 위해, 과잉 시식을 위한 고품질, 잘 관리된 BHKT7 세포 및 MA104 세포는 고순수 플라스미드의 정확한 양을 사용하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 로타바이러스 NSP3 유전자를 수정하기 위하여 역 유전학 시스템을 사용하는 방법을 설명하더라도, 동일 접근은 SP1과 같은 그밖 유전자를 수정하기 위하여 이용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

리프트 밸리 열병 바이러스 MP - 12 백신 스트레인에 대한 역방향 유전 시스템은 증가 감쇄 및 immunogenicity로 추가 MP - 12 돌연변를 만들기위한 유용한 도구입니다. 우리는 NSS 돌연변이 변종을 생성하고 특성화 프로토콜을 설명합니다.

리프트 밸리 열병 바이러스 백신 안전 및 효능을 향상하기 위해 MP - 12 스트레인의 NSS 진을 조작하는 역방향 유전자를 사용하여

여기에는 오직 사용중인 다른 프로토콜에 비해 100 개 이상의 배 이상에 의한 재조합 파르 보 바이러스 생산의 효율성을 향상시켜 세포 감염에 기반 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 파르 보 바이러스의 부사장의 전송 단위 (광고-VP)를 포함하는 5-기반 도우미 소설 아데노 바이러스의 사용에 의존하고 있습니다.

아데노 바이러스 파생 시스템의 도움으로 효율적인 재조합 파르 보 바이러스 생산

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Plasmid-Mediated Generation of Recombinant Rotavirus in Cultured Cells

Source: Philip, A. A., et al., Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the isolation of rotavirus double-stranded RNA from clarified cell lysates. It further illustrates the separation and visualization of genome segments through polyacrylamide gel electrophoresis.

Isolation and Visualization of Rotavirus Genome via Gel Electrophoresis

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형광 태그 바시니아 바이러스 단백질의 효율적인 생성을위한 방법론

우리는 스펙트럼 구별 리포터 형광의 단계 - 특이 적 발현을 통해 바이러스 감염 및 유전자 발현의 실시간 측정을 가능하게하는 형광 리포터 백시 니아 바이러스의 사용을 설명한다. 우리 세부 정확하게 바이러스 복제가 저분자 저해에 응답하여 영향되는 단계를 식별하기위한 플레이트 기반 방법.

유전자 발현의 모든 단계에서 바이러스 성 기능을 정량화 우두 바이러스 기자

백시 니아 바이러스 (VV)가 널리 생물 의학 연구 및 인간 건강의 개선에 이용되고있다. 이 문서에서는 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 VV 게놈을 편집 할 수있는 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다.

간단하고 효율적인 접근 방법은 돌연변이 백시 니아 바이러스 벡터를 구축하기

우리를 생성 하는 방법을 설명 하 고 RSVs에 대 한 호흡 syncytial 바이러스 (RSVs)와 최적화 된 패 분석 결과 수정 유전자 증폭. 우리는 두 재조합 바이러스는 각각 RSV 복제의 정량화를 허용 하 고 라이브 RSV 포함 몸과 포함 시체 관련 된과 립 역동성의 분석을 생성 하 여이 프로토콜을 설명 합니다.

생성, 증폭 및 재조합 호흡 Syncytial 바이러스의 적정

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리포터 발현 재조합 SARS-CoV-2를 이용한 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서의 바이러스 감염의 라이브 이미징 및 정량화

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