Name: 유세포측정을 사용하여 공생 균에 결합하는 인간 노로바이러스 바이러스와 같은 입자 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 학습하세요 유세포측정법을 사용하여 인간 노로바이러스 바이러스와 같은 입자가 공생 균에 결합하는 정량화 방법을. 이 기술은 바이러스-세균 상호작용을 안전하게 연구할 수 있게 합니다.

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수토누카 바르와 샤넬 모스비-하운드루프가 작성된 원고에 대한 비판적 검토와 세균 표준 곡선 생성에 도움을 준 알폰소 카릴로에게 감사드립니다. 이 작품은 건강의 국립 연구소에서 보조금에 의해 부분적으로 자금 (R21AI140012) 플로리다 대학에서 종자 보조금에 의해, 식품 및 농업 과학 연구소.

참고: 프로토콜에 설명 된 세균 성장 조건은 Enterobacter cloacae 및 유산 균 gasseri에대 한 표준 배양 조건. 바이러스를 수행하기 위하여:박테리아 부착 분석은 그밖 세균종으로, 선택된 박테리아는 박테리아를 위해 적당한 표준 조건 하에서 배양되어야 합니다.
1. 세균 성장 배지 준비
<ol><li>
엔테로박터 클로아카성장매체<ol>
<li>디이온화(DI) 물 1L에 트립톤 10g, 효모 추출물 5g, 염화나트륨 10g(NaCl)을 용해시켜 액체 배지를 준비합니다(재료 표참조). 모든 매체를 완전히 혼합하고 30 분 동안 오토 클레이브하여 살균하십시오.</li>
		<li>트립톤 10g, 효모 추출물 5 g, NaCl 10 g, 한천 15g을 DI 물 1L에 녹여 단단한 배지를 준비합니다. 모든 매체를 완전히 혼합하고 30 분 동안 오토 클레이브하여 살균하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
유산 균 가스 세리 성장 매체<ol>
<li>디맨, 로고사, 샤프(MRS; 재료표참조) 분말 55 g을 DI 물 1L에 녹여 액체 배지를 준비합니다. 준비 후 1개월 이내에 중간 크기로 사용하십시오. 살균하려면 끓일 때까지 15 분 동안 가열한 다음 15 분 동안 오토 클레이브를 하십시오.</li>
		<li>MRS 파우더 55 g과 한천 15g을 DI 물 1L에 녹여 단단한 배지를 준비합니다. 살균하려면 끓일 때까지 15 분 동안 가열한 다음 15 분 동안 오토 클레이브를 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 광학 밀도(OD) 및 박테리아 농도와 상관관계가 있는 표준 곡선 설정
<ol><li>한천판(E. cloacae)으로부터단일, 단리콜로카로 또는 냉동 글리세롤스톡(L. gasseri)으로부터직접 5 mL의 적절한 액체 배지를 접종하였다.</li>
	<li>박테리아를 하룻밤 동안 성장, 적절한 대기 조건 하에서(Enterobacter cloacae: 37 °C 에서 에어로빅 흔들림 200 rpm; L. gasseri: 밀폐 용기에 흔들림없이 37 ° C 수조).</li>
	<li>10,000 x g에서 10,000 x g에서 2 개의 분리 된 1.5 mL 원심 분리 튜브 및 원심 분리 박테리아를 5 분 동안 두 개의 분리 된 1.5 ml 배양으로 하룻밤 배양2 x 1.3 mL aliquots를 옮긴다.</li>
	<li>상급체를 제거하고 멸균 1x 인산염 완충 식염수 (PBS)의 1 mL로 샘플을 씻어. 이 세척 단계를 반복하여 총 2번 세척합니다.</li>
	<li>샘플을 10,000 x g에서 5 분 동안 다시 원심 분리하고 상류를 제거하고 멸균 1x PBS 의 1.3 mL에서 다시 일시 중단하십시오.</li>
	<li>세척 배양의 0.5 mL로 시작하여10-1에서 10-4까지1x PBS에서 박테리아를 연속적으로 희석시다.</li>
	<li>분광광도계를 사용하여 세척되고 희석되지 않은 배양물의 광학 밀도를 측정하고 각각 600 nm(OD600)에서4개의 희석을 측정하였다.</li>
	<li>2.6단계에서 각 희석에 대해 1x PBS로 10배 직렬 희석을 수행합니다. 각 계열에 대한 마지막 3개의 희석물의 플레이트 100 μL을 적절한 고체 배지상에 확산하여 각 샘플의 밀리리터(CFU/mL)당 콜로니 형성 단위의 수를 결정하였다. 각 희석을 삼중으로 플레이트합니다.</li>
	<li>플레이트가 실온에서 5 분 동안 건조되도록 하십시오. 플레이트를 반전시키고 적절한 대기 조건하에서 배양하십시오(E. cloacae: 37 °C에서 호기성, 밤새 배양 플레이트; L. gasseri: 37 °C에서 혐기성, 혐기성 공기 봉지와 밀폐 용기에 48 시간 동안 배양 플레이트 (재료 표참조). 참고: 2.5L 병당 혐기성 공기 봉지 1개 또는 7.0L 병당 3봉지를 사용하십시오(재료 표참조).</li>
	<li>플레이트 카운트를 사용하여 5개의 샘플 각각에 대해 CFU/mL을 결정합니다(즉, 원액,10-1, 10-2,-210-3,10-4). OD600 과 CFU/mL을 비교하는 표준 곡선을 생성합니다. 이 라인에 대한 방정식은 Od600에기초하여 CFU /mL을 결정하기 위해 VLP 박테리아 부착 분석은 사용됩니다.</li>
</ol>3. VLP 박테리아 부착 분석
주의: 인간 노로바이러스 VLP는 생물안전수준(BSL)-2의 위험요소이며, VLP와 관련된 모든 작업은 생물안전성 캐비닛에서 수행해야 합니다. 부착 분석 전에 세균 배양물의 준비는 유기체에 적합한 안전 조건을 사용하여 수행되어야한다.
<ol><li>시약 준비<ol>
<li>1x 인산염 완충 식염수 (PBS)<ol>
<li>DI 물 1L에 전체 패킷을 용해시켜 10x PBS 1L를 준비합니다.</li>
			<li>30 분 동안 오토 클레이브 솔루션.</li>
			<li>상기 용액을 DI 물에서 1:10희석하여 1x용액을 준비한다.</li>
			<li>0.22 μm 필터를 통과하여 용액을 살균하고 실온에서 보관합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>5% BSA<ol>
<li>5% (w/v) 용액을 생성하기 위해 PBS 100 mL에 소 혈청 알부민 (BSA) 분말 5 g을 추가합니다.</li>
			<li>덩어리가 용해 될 때까지 금속 교반 막대를 사용하여 소용돌이 또는 교반 판에 용액을 혼합합니다.</li>
			<li>0.22 μm 필터를 사용하여 필터 살균.</li>
			<li>용액을 4°C에 보관하십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>유세포분석염색 버퍼(FCSB)<ol>
<li>0.22 μm 필터를 통해 구입한 FCSB(재료 표참조)를 필터링합니다.</li>
			<li>남은 용액을 4°C에 보관하십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>5% 블로킹 버퍼 (BB) 참고: 매번 신선을 준비하세요.<ol>
<li>멸균 FCSB 10 mL에 BSA 0.5 g을 추가합니다.</li>
			<li>소용돌이는 샘플을 완전히 혼합하고 사용할 때까지 얼음에 둡니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>항체 컨쥬게이션<ol>
<li>인간 노로바이러스 GII 항체(재료 표참조)와 R-PHYcoerythrin(PE)을 제조자의 지시에 따라 R-PE 항체 라벨링 키트를 사용하여 컨쥬게이트(재료 표참조).</li>
		<li>VLP-박테리아 부착 분석 분석에서 향후 사용을 위해 4°C에서 공액 항체를 어둠 속에서 저장한다. 참고: 1차 항체는 유세포 분석 분석에 필요한 적절한 농도를 결정하기 위해 VLP-박테리아 부착 분석에서 사용하기 전에 적정되어야 한다. 항체 적정은 부착 분석에서 사용되는 각각의 박테리아에 대해 활용 반응이 수행될 때마다 수행되어야 한다.</li>
	</ol></li>
	<li>항체 적정<ol>
<li>공액된 인간 노로바이러스 GII 항체를 100배 희석시키고, 1:100의 시작 희석과 1:600의 결말 희석(총 6개의 희석)을 희석한다.</li>
		<li>다음 예외로 아래에 설명된 바와 같이 바이러스 부착 분석을 수행한다: 3.5.7 단계에서 5% BB의 350 μL에서 세균 펠릿을 재중단한다.</li>
		<li>샘플을 7개의 50 μL aliquots로 나눕니다.</li>
		<li>각 항체 희석의 50 μL을 하나의 튜브에 추가합니다.</li>
		<li>얼룩지지 않은 대조군으로 7번째 튜브에 5% BB의 50 μL을 추가합니다.</li>
		<li>아래에 설명된 대로 모든 샘플에서 유량 세포측정을 수행합니다.</li>
		<li>희석된 항체 샘플을 얼룩지지 않은 대조군과 서로 비교합니다. 양성 신호의 감소 또는 손실을 초래하지 않는 가장 낮은 항체 농도는 후속 측정에 사용하기 위해 선택되어야한다.</li>
	</ol></li>
	<li>박테리아의 준비<ol>
<li>박테리아가 고정 단계에 때까지 적절한 대기 조건하에서 적절한 액체 매체의 40 mL에서 박테리아를 성장.<ol>
<li>37°C에서 루리아 국물에서 밤새 에어로빅으로 E. cloacae 배양물을 성장시키고, 200 rpm에서 흔들어 고정된 단계에 도달합니다.</li>
			<li>37°C로 설정된 수조에서 흔들리지 않고 검은 스크류 캡 튜브로 MRS 국물에서 L. gasseri 배양을 성장시키고 18시간 동안 고정된 단계에 도달한다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>고정상 배양액을 50 mL 원점 튜브 및 원심분리기 샘플을 2,288 x g에서 10분 동안 세척하여 박테리아를 펠렛합니다.</li>
		<li>상급체를 제거하고 멸균 1x PBS 13 mL로 다시 일시 중단하십시오. 이 세척 단계를 반복하여 총 2번의 세척을 반복합니다.</li>
		<li>샘플을 다시 원심분리하고 상급체를 제거하고 1x PBS의 20 mL에서 샘플을 다시 일시 중단합니다. 참고: 셀 펠릿이 작으면 재서스펜션 부피를 감소시킬 수 있습니다.</li>
		<li>배양의 OD600을 측정합니다.</li>
		<li>이전에 준비된 표준 곡선을 사용하여 세척된 배양물의 mL당 CFU를 결정합니다.</li>
		<li>1x PBS로 필요에 따라 박테리아를 희석하여 배양 농도를 1 x 108 CFU/mL로 조정합니다.</li>
		<li>1 x 108 CFU/mL 세균 배양물의 1 mL을 필요한 수의 1.5 mL 원심분리기 튜브로 옮김을 전달합니다.</li>
		<li>튜브를 10,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다.</li>
		<li>멸균 5% BSA의 1 mL에서 세균 펠릿을 다시 중단하십시오.</li>
		<li>일정한 회전으로 37 °C에서 1 시간 동안 튜브를 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>바이러스 첨부 파일<ol>
<li>BSL-2 생체 안전 성 캐비닛 내부에서 작업, HuNoV VLP의 10 μg를 추가 (재료의 표참조) PBS에 다시 일시 중단 박테리아를 포함 하는 각 튜브에 하 고 파이펫팅에 의해 철저 하 게 혼합. 참고: VLP 농도는 각 VLP 준비마다 다릅니다. 따라서 박테리아에 첨가된 부피는 제제 배치마다 다양하며 실험에서 각 튜브에 10 μg가 첨가되도록 그에 따라 조정되어야 한다. 박테리아 만 대조군 (예를 들어, VLP가없는 샘플)의 경우 실험 샘플에 추가 된 VLP의 부피와 동일한 PBS 볼륨을 추가하십시오.</li>
		<li>일정한 회전으로 37 °C에서 1 시간 동안 튜브를 배양하십시오. 참고: 튜브 리볼버(재료 표참조)는 인큐베이션 중에 40rpm으로 설정됩니다.</li>
		<li>배양 후, 샘플을 10,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다.</li>
		<li>상급을 버리고 PBS 의 1 mL에 세균 성 펠릿을 다시 중단하십시오.</li>
		<li>세척 단계 3.5.3 및 3.5.4를 반복합니다.</li>
		<li>샘플을 10,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다.</li>
		<li>상급을 버리고 5 % BB의 150 μL에서 세균 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>항체 염색<ol>
<li>신선한 5% BB를 준비합니다. 참고 : 형광 태그 항체를 사용하는 모든 작업은 어둠 속에서 수행되어야하며 항체, BB 및 FCSB는 얼음위에 보관해야합니다.</li>
		<li>인간 노로바이러스 GII 항체를 E. cloacae 시료의 경우 1:125, L. gasseri 시료의 경우 5% BB에 1:150을 희석하여 시료당 50 μL의 희석된 항체를 준비합니다.</li>
		<li>인간 노로바이러스 GII 항체를 5% BB에서 각 박테리아에 대해 희석한 것과 같은 방식으로 이소형 항체를 희석하고, 샘플당 50 μL의 희석된 이소타입 대조군을 준비하였다.</li>
		<li>각 부착 분석 샘플을 3.3.7 단계에서 3개의 50 μL aliquots로 나누어 깨끗한 1.5 mL 원심분리기 튜브로 옮김을 전달합니다.</li>
		<li>샘플의 첫 번째 세트에 BB 50 μL을 추가합니다. 이 집합은 스테인드되지 않은(Uns) 컨트롤입니다.</li>
		<li>제2 세트에, GII 항체 희석의 50 μL을 첨가한다. 이로 인해 최종 항체 농도는 E. cloacae의 경우 1:250, L. gasseri의경우 1:300입니다. 이 샘플 세트는 스테인드(AB) 샘플이 될 것이다.</li>
		<li>세 번째 세트에 희석된 이소타입 항체의 50 μL을 첨가한다. 이 집합은 아이소타입 컨트롤(IC)이 됩니다. 파이펫팅으로 잘 섞으세요. 샘플을 얼음과 어둠 속에서 30 분 동안 배양합니다.</li>
		<li>원심분리기 는 5 분 동안 10,000 x g의 모든 샘플을 채우지 않습니다.</li>
		<li>상급체를 버리고 FCSB의 100 μL에서 샘플을 다시 중단합니다.</li>
		<li>모든 샘플을 10,000 x g에서 5분 동안 원심분리기. 상급체를 버리고 FCSB의 100 μL에서 샘플을 다시 중단합니다.</li>
		<li>원심분리기 는 5 분 동안 10,000 x g의 모든 샘플을 채우지 않습니다.</li>
		<li>상급체를 버리고 FCSB의 150 μL에서 샘플을 다시 중단합니다.</li>
		<li>각 샘플을 총 부피 550 μL에 대해 400 μL의 FCSB 버퍼를 함유하는 FCSB 튜브로 옮김.</li>
		<li>시료가 유세포분석으로 분석될 때까지 샘플을 4°C로 유지합니다. 참고 : 유세포 측정은 항체 염색 의 4 시간 이내에 수행됩니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 유세포분석
참고: 아래에 설명된 전압 설정은 재료 표에 나열된 유량 세포계 및 소프트웨어를 기반으로 하며 유동 세포계에 따라 다를 수 있습니다. 설정은 각 박테리아에 대해 최적화되어야 합니다. 모든 그래프의 축이 비xponential 단계에 있는지 확인합니다.
<ol><li>작업 영역 설정 참고: 작업 공간을 설정하는 데 사용되는 플롯의 설정은 게이팅 및 데이터 분석에 사용되는 설정과 다릅니다. 작업 공간을 설정하는 목적은 세포 집단을 시각화하고, 다운스트림 분석에 영향을 줄 수 있는 세균 세포의 과도한 응집이 없는지 확인하고, 데이터가 수집되는 동안 염색된 세포와 얼룩지지 않은 세포를 구별하는 것입니다.<ol>
<li>박테리아가 함께 뭉치지 않도록 하기 위해 일련의 밀도 플롯을 설정합니다.<ol>
<li>전체 모집단을 시각화하기 위해 전방 분산 영역(FSC-A) 대 측면 분산 영역(SSC-A)을 생성합니다.</li>
			<li>순방향(FSC-W) 및 측면 산란 폭(SSC-W)과 순방향(FSC-H) 및 측면 산란 높이(SSC-H)를 각각 비교하는 두 개의 그래프를 만들어 단일 셀과 셀 덩어리를 평가하기 위해 플롯을 설정합니다.</li>
			<li>PE 양수 모집단만 표시하는 플롯을 만듭니다(PE-A 대 SSC-A).</li>
		</ol>
</li>
		<li>기준 전압을 E. cloacae의 경우 500, L. gasseri의경우 340으로 설정합니다. 이 것들은 나중에 추가로 조정될 것입니다.</li>
		<li>집계된 총 이벤트를 10,000개의 이벤트로 설정합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플 실행<ol>
<li>SSC-A, FSC-A 또는 PE-A에 대해 플롯된 수를 표시하는 세 개의 별도의 히스토그램 플롯을 만듭니다.</li>
		<li>유량 세포계에 얼룩이 없는 샘플을 놓고 샘플 이벤트를 획득하여 SSC-A의 히스토그램의 최대 피크가 102 ~ 103 이내이고 FSC-A의 히스토그램의 최대 피크가 x축에서 104 ~ 105 사이임을 확인합니다. 그렇지 않은 경우 피크가 지정된 범위 내에 있지 않으면 FSC 및 SSC 전압을 적절하게 조정합니다.</li>
		<li>유량 세포계에 스테인드 샘플(AB)을 놓고 전압 PE를 조정하여 x축에서 최대 피크가 103을 넘도록 합니다.</li>
		<li>이러한 측정을 기반으로 양수 PE 게이트를 설정하고 PE-A 대 SSC-A 밀도 그래프에서 게이트를 설정합니다.</li>
		<li>모든 샘플을 낮은 또는 중간 속도로 결정된 설정에서 실행합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 관계의 충돌이 없습니다.

박테리아에 장바이러스의 결합을 정량화하는 기능은 이 박테리아가 바이러스성 감염을 바꾸는 기계장치를 해명하기 위한 중요한 첫번째 단계입니다. 본 명세서에 기재된 방법은 인간 노로바이러스 VLP 상호작용을 E. 클로아카(gram-negative 박테리아) 및 L. gasseri(그람 양성 박테리아)와 측정하도록 최적화되었지만, 임의의 포유류 바이러스 및 관심 있는 박테리아와 함께 사용하도록 적응될 수 있다. VLPs는 부착 분석에서 사용하기 위한 살아있는 바이러스에 대한 이상적인 대안이며 이들 입자는 유세포 분석기를 사용하여 쉽게 정량화될 수 있지만, P 입자는 또한 인간 노로바이러스와박테리아(24)사이의 상호작용을 조사하기 위해 사용되어 왔다. 이 연구에서는, 박테리아에 결합된 바이러스의 양은 세균 집단과 반대로 정량화되었다, 여기에서 보고되는 바와 같이. P 입자는 VLP 및 야생형<sup cla...

인간 노로바이러스(HuNoVs)는 전 세계적으로 위장병의 주요 원인으로,매년6억 8,500만 건의 감염과 200,000명 이상의 사망을 초래합니다. 다른 장내 바이러스와 마찬가지로, 동보 박테리아의 존재는 이 병원체뿐만 아니라 대리 바이러스, 뮤린 노로바이러스2,,3의감염을 향상시키는 것으로 나타났다. 박테리아가 인간 노로 바이러스4,,5,,6에의한 감염을 억제 할 수 있다는 충돌보고서가 있습니다. 여러 바이러스의 경우, 바이러스와 박테리아 간의 직접적인 상호작용은 바이러스감염에영향을 미치는 메커니즘의 근간을 이룬 것으로 나타나며2,7,,8,,9,,10,전자 현미경을 통해 인간 노로바이러스가 박테리아11,,12의표면에 직접 결합하는 것으로 나타났다. 그러므로, 이 상호 작용을 특성화하는 것은 박테리아가 바이러스성 감염에 영향을 미치는 기계장치를 결정하는 것이 중요하게 되었습니다. 이러한 특성화는 숙주 미생물군유전체7,,12,,13의성분인 세균종의 배열에 대한 바이러스 결합을 정량화하는 것으로 고전적으로 시작되었다. 이 첨부 성 분석은 박테리아에 묶인 바이러스의 양을 밝힐 뿐만 아니라 바이러스 적합성 및 생존에 이 상호 작용의 충격을 결정하는 것을 돕습니다.
바이러스 부착을 정량화하기 위해, 전통적으로 채택된 방법은 바이러스 게놈12 또는 방사성 표지된 바이러스의 생성을 정량화하는 PCR 기반 측정법을 포함하고 있으며, 바이러스입자를정량화하기 위해 분신계계의 사용7,8,,9,,13. 이러한 방법의 사용은 일반적으로 높은 티터 바이러스 주식과 그들을 생성하는 시험관 내 재배 기술에 대한 액세스를 필요로한다. 인간 노로 바이러스에 대한 여러 배양 시스템은 지금 존재하지만2,,14,15,아무도 제한하거나 인간의 노로 바이러스 / 세균 상호 작용을 정량화하기 위해 PCR 및 종축 계수의 사용을 제거 이러한 고농축 주식을 생성하는 데 필요한 강력한 복제를 지원하지 않습니다.14
이 문제를 우회하기 위해, 바이러스 유사 입자(VLPs)는 인간 노로바이러스와박테리아(16,,17)사이의 상호작용을 조사하기 위해 바이러스를 살리기 위해 대리로 사용될 수 있다. VLPs는 밀접하게 그(것)들이 파생되는 바이러스를 닮은 비 감염성 입자입니다. 인간 노로바이러스의 경우, 이들 입자는 유전물질이 결여된 손상되지 않은 바이러스 성 캡시드(즉, 노로바이러스를 위한 RNA)를 만들기 위해 자가 조립하는 VP1(및 언젠가 VP2) 단백질의 발현으로부터 생성된다. 이들 VLP는 잘 특징지어지고 있으며, 구조적으로 그리고 항원적으로 유사하며, 이들은,18,19,,20,,21,,22,,23에서유래되는 야생형 바이러스와 유사하다. 따라서, VLP는 인간 노로바이러스와 공생 박테리아 사이의 표면 상호 작용을 조사하기위한 이상적인 대리역할을합니다. VLPs는 유전 물질이 부족하다는 것을 감안할 때, PCR 기지를 둔 세포는 바이러스성 결합을 정량화하기 위하여 이용될 수 없습니다. 항체 기반 유동 세포분석 방법은 이전에 설명되었고 반정량적인 방식으로 박테리아에 결합하는 낮은 수준의 VLP를 검출할 수있었다 16. 이 방법은 그람 음성 및 그람 양성 공생박테리아(16)에결합하는 인간 노로바이러스 VLP의 정확한 정량화를 허용하도록 최적화되었다.

<table><tbody><tr><td>5ml 폴리스렌 라운드 바텀 튜브(셀 스트레이너 캡 포함</td>) <td>Corning</td><td>352235</td><td>항체 염색 후 샘플은 유세포 분석을 위해 튜브로 옮겨집니다.</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A7002</td><td>배지 준비에 사용</td></tr><tr><td>AnaeroPack</td><td>Thermo Scientific</td><td>R681001</td><td>Lactobacillus gasseri</td></tr><tr><td>BD FacsDiva 소프트웨어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSR Fortessa 유세포 분석기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1605</td><td>유세포 분석에 사용</td></tr><tr><td>유세포 분석 염색 완충액(FCSB)</td><td>BD Biosciences</td><td>554657</td><td>유세포 분석</td></tr><tr><td>마우스 IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12473281</td><td>Isotype control에 사용됩니다. 이 항체는 제조업체에서 접합 형태로 구입합니다.</td></tr><tr><td>MRS Powder</td><td>BD Biosciences</td><td>288130</td><td>배지 준비 및 락토바실러스 가세리 배양에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA5-18241</td><td>Norovirus GII 항체. 이 항체는 unconjugated 형태로만 사용할 수 있으므로 설명된 유세포 분석 분석에서 사용하기 전에 형광 접합해야 합니다. 이 프로토콜에서 PE는 선택된 형광이었지만 연구원이 사용하는 유세포 분석기에 가장 적합한 다른 형광 분자를 선택할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>노로바이러스 GII.4 VLP</td><td>Creative Biostructure</td><td>CBS-V700</td><td>인간 노로바이러스 유사 입자, VLP는 바큘로바이러스 시스템을 사용하여 생성되었으며 10% 글리세롤이 함유된 인산염 완충 식염수에 재현탁되었습니다. 저자는 VLP의 입자 농도를 결정하기 위해 독립적인 나노사이트 추적 분석을 수행했습니다. 농도는 밀리리터당 약 1011 VLP입니다. VLP의 단백질 농도에 따라 VLP 부착 분석에서 박테리아당 약 200개의 입자가 추가됩니다.</td></tr><tr><td>PBS 10X</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP665</td>는 <td>사용하기 전에 1X로 희석하십시오.</td></tr><tr><td>SiteClick R-PE 항체 라벨링 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S10467</td><td>접합 키트는 비접합 항체를 라벨링하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271</td><td>배지 준비에 사용</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Oxoid</td><td>LP0042</td><td>미디어 준비에 사용</td></tr><tr><td>튜브 리볼버</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88881001</td><td>바이러스에 사용: 박테리아 부착 분석. 최대 속도(40rpm)로 설정합니다.</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td>배지 준비에 사용</td></tr></tbody></table>

유세포측정을 사용하여 공생 균에 결합하는 인간 노로바이러스 바이러스와 같은 입자 정량화

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

생균은 진핵 바이러스의 감염에 영향을 미치기 위하여 잘 설치됩니다. 병원체와 숙주 미생물군유전체 사이의 직접 결합은 이러한 바이러스의 많은 감염을 변경하는 책임이 있다. 따라서, 바이러스-박테리아 결합의 특성화는 박테리아가 바이러스 감염을 변화시키는 메커니즘(들)을 해명하는 데 필요한 기초 단계이다. 인간 노로 바이러스에 대 한, 연구용 박테리아 B 세포 감염을 향상. 바이러스는 직접 이러한 박테리아에 바인딩, 이 직접 적인 상호 작용 감염 향상의 메커니즘에 관여 하는 것을 나타내는. 방사성 표지된 바이러스 및 중합효소 연쇄 반응(PCR)의 주식 계수를 포함하여 박테리아와 바이러스 간의 상호 작용을 정량화하는 데 다양한 기술을 사용할 수 있습니다. 두 방법 모두 실험실에서 생성해야 할 수도 있는 살아있는 바이러스의 사용을 필요로 합니다. 현재, 인간 노로바이러스에 사용할 수 있는 체외 배양 시스템 중 어느 것도 고농축 바이러스 성 주식의 생성을 허용할 만큼 충분히 견고하지 않다. 살아있는 바이러스 대신에, 바이러스 같이 입자 (VLPs)는 노로바이러스와 박테리아 사이 상호 작용을 특성화하기 위하여 이용되었습니다. 본 명세서에서 유동 세포분석 방법은 그람 음성 및 그람 양성 박테리아에 VLP 결합을 정량화하기 위해 바이러스 특이적 항체를 사용하여 기술된다. 박테리아 만 및 이소형 대조군 모두의 포함은 시험된 박테리아에 대한 VLP 부착의 배경 항체 결합 및 정확한 정량화를 감소시키기 위해 분석법의 최적화를 허용하였다. 높은 VLP: 박테리아 비율은 세균 인구의 큰 비율에 결합하는 VLPs 귀착됩니다. 그러나, VLP 수량 감소 하는 경우, 결합 하는 박테리아의 백분율 또한 감소. 궁극적으로, 이 방법은 노로바이러스:세균 상호 작용을 조절하는 특정 조건 및 구조적 구성 요소를 해명하는 향후 실험에 사용될 수 있다.

공생 박테리아에 결합하는 인간 노로바이러스 VLP를 정량화하는 데 사용되는 게이팅 전략은 도 1에나타내었다. 대표적인 밀도 도트는 VLP 부착이 단일 집단에서 결정되도록 세포 파편 및 세포 덩어리를 제거하기 위해 시료를 문게 한 방법에 대한 개요를제공합니다(그림 1A). 대표적인 히스토그램은 이소형 조절 항체로 염색된 VLP-박테리아 시료의 노로바이러스 VLP 및 낮은 배경 신호가 결여된 시료에서만 항노로바이러스 항체 신호의 낮은 수준을 입증한다(도1B). 이소타입 제어 피크는 또한 얼룩이 없는 샘플과 겹치면서 동일한 시료를 반인간 노로바이러스 GII 항체로 염색하면 피크에서 상당한 변화가 발생합니다.
<p class="jove_content" ...

이 프로토콜의 목적은 진핵 병원체 인간 노로바이러스의 결합을 박테리아에 정량화하는 것이다. 초기 바이러스-박테리아 부착 분석을 수행한 후, 유동 세포측정은 집단 내에서 바이러스 결합 박테리아를 검출하는 데 사용된다.

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

바이러스 세균성 상호 작용은 호스트 면역 반응의 성공적인 바이러스 감염 및 자극을 위해 중요할 수 있습니다. 그러나 현재, 인간 노로 바이러스의 고농축 및 정제 된 재고는 실험실에서 생성 될 수 없습니다. 이 기술은 바이러스와 같은 입자 또는 살아있는 바이러스를 사용할 수있는 박테리아에 결합하는 모든 바이러스와 함께 사용할 수 있습니다.그것은 우리가 이 바이러스와 박테리아 사이 상호 작용을 정량화하는 것을 가능하게 합니다. 냉동 글리세롤 육수에서 직접 한 천 판에서 Enterobacter 클로카의 단일 절연 식민지와 액체 매체의 5 밀리리터를 접종. 하룻밤 박테리아를 성장.다음 날, 문화의 1.3 밀리리터 알리쿼트를 별도의 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기다. 튜브를 10, 000 x g에서 5분간 원심분리합니다. 수퍼나티를 제거한 다음, 세척할 때마다 멸균 1X PBS 1밀리리터를 사용하여 샘플을 두 번 세척합니다.샘플을 10, 000 x g에서 5분 동안 다시 원심분리합니다. 상체를 제거하고 멸균 1X PBS의 1.3 밀리리터에서 펠릿을 다시 분리하십시오. 세척 된 배양의 0.5 밀리리터로 시작하여 10에서 마이너스 10에서 마이너스 4까지 1X PBS에서 박테리아를 연속적으로 희석시하십시오.분광계를 사용하여, 세척되지 않은 희석 배양의 광학 밀도와 600 나노미터에서 4개의 희석제 각각을 측정합니다. 이전 희석제 각각에 대해 1X PBS에서 10배 의 직렬 희석을 수행합니다. 각 계열에 대한 마지막 3개의 희석제 100마이크로리터를 각 시료에 대해 밀리리터당 콜로니 성형 유닛수를 결정합니다.접시가 실온에서 5분간 건조되도록 합니다. 접시를 반전시키고 인큐베이터에서 배양합니다. 원고에 설명된 바와 같이 시약, 항체 및 박테리아를 준비한 후, BSL-2 생물안전 캐비닛에 모든 물질을 조립한다.인간 노로바이러스를 위한 바이러스 와 같은 입자는 BSL-2 병원체로 나열되고 VLP를 사용하여 수행하는 모든 작업은 인증된 생물안전 캐비닛에서 수행되어야 합니다. 박테리아의 각 튜브에 인간 노로 바이러스 VLP의 10 마이크로 그램을 추가하고 파이펫팅에 의해 철저하게 혼합. 일정한 회전과 섭씨 37도에서 1 시간 동안 튜브를 배양.인큐베이션 후, 5 분 동안 10, 000 x g에서 튜브를 원심 분리합니다. 흡인 및 슈퍼 나탄을 폐기하고 PBS의 1 밀리리터에서 세균 펠릿을 다시 중단. 세척 단계를 한 번 반복한 후, 5 분 동안 10, 000 X g에서 튜브를 원심 분리합니다.상체를 버리고 5 % 차단 버퍼의 150 마이크로 리터에서 VLP 박테리아 펠릿을 다시 중단하십시오. 발생하는 일반적인 오류는 튜브를 교환하고 잘못된 치료가 추가된다는 것입니다. 이를 방지하기 위해 올바른 치료에 해당하는 모든 튜브를 한 번에 튜브에 추가합니다.각 세균성 시료에 대해, 희석된 인간 노로바이러스 GII 항체의 50마이크로리터를 준비한다. 5% 블로킹 버퍼를 사용하여, E.cloacae 샘플에 대해 항체를 1대 125로 희석한다. 동일한 희석 비를 사용하여 각 세균 성 시료에 대해 희석 된 동형 항체 50 마이크로 리터를 준비하십시오.각 부착 분석 분석 샘플을 깨끗한 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 이송하여 350 마이크로리터 알리쿼트로 나눕니다. 스테인드 컨트롤을 만들려면 각 세균 샘플의 첫 번째 알리쿼트에 블로킹 버퍼 50 마이크로리터를 추가합니다. 스테인드 샘플의 경우, 2차 알리쿼트 세트에 GII 항체 희석의 50마이크로리터를 추가합니다.희석된 이소형 항체의 50마이크로리터를 알리쿼트의 세 번째 세트에 추가하여 등형 대조군을 생성한다. 얼음과 어둠 속에서 30분 동안 모든 샘플을 배양합니다. 그런 다음 모든 샘플을 10, 000 X g에서 5분 동안 원심분리합니다.슈퍼네티츠를 폐기하고 각 샘플을 FCSB의 150 마이크로리터로 재보힙합니다. 다시 말하지만, 원심 분리기는 5 분 동안 10, 000 X g의 모든 샘플을 원심 분리합니다. 다시 말하지만, 슈퍼네이터를 버리고 FCSB의 100 마이크로리터에서 샘플을 다시 중단하십시오.시료를 원심분리한 후 최종 한 번 은은하고 슈퍼네티츠를 폐기한 후 FCSB의 150마이크로리터에서 샘플을 다시 중단합니다. 각 샘플을 FCSB 의 400 마이크로리터를 포함하는 튜브로 전달하여 총 550 마이크로리터를 사용할 수 있습니다. 시료를 섭씨 4도에 저장하여 혈류 세포측정에 의해 분석될 때까지 보관합니다.VLP 부착은 유동 세포측정을 사용하여 측정되었다. 첫째, 밀도 플롯은 세포 파편을 게이트하는 데 사용되었고, 그 다음에는 세균이중과 세포 덩어리를 제거하기 위해 후속 점도 플롯 게이팅이 뒤따랐습니다. 대표적인 히스토그램은 세균성 만 샘플에서 PE 신호의 부족과 VLP:박테리아 샘플의 PE 신호 강도의 변화를 입증하여 얼룩이 없는 및 동종 형 대조군과 비교됩니다.10 마이크로그램의 VLP를 가진 잠복한 후, 유동 세포측정은 E.colacae와 L.gasseri 모두에 결합하는 입자 결합을 검출했습니다. 이 분석체에 대한 결합 정량화의 한계를 결정하기 위해, VLP의 희석 시리즈는 박테리아에 첨가하기 전에 생성되었다. VLP의 양감소는 VLP에 의해 결합된 백분율 박테리아에 대응하는 감소 귀착되었습니다.바이러스를 알고: 박테리아 비율을 알고 실험 사이 일관된 비율을 유지하는 것은 결과를 해석에 중요합니다. 세균및 바이러스 돌연변이체는 이러한 상호 작용을 중화시키는 미생물 표면 구조를 구체적으로 결정하기 위해 생성될 수 있다. 이 기술은 연구원이 바이러스 유전자형에 있는 변경, 세균성 성장 조건 및 세균성 표면 구조물에 있는 변경이 바이러스성 결합을 바꾸는 방법을 포함하여 노로바이러스 세균성 상호 작용에 영향을 미치는 상황 및 조건에 관하여 질문에 대답하는 것을 허용합니다.

quantifying-human-norovirus-virus-like-particles-binding-to-commensal

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기 효율적으로 세포 배양에 복제 유일한 노로 바이러스입니다 손쥐 노로 바이러스 (MNV)의 전염성 입자를 정량화하는 방법을 설명합니다. 플라크 분석은 손쥐 대 식세포에 대한 MNV의 tropism을 활용하고 MNV를 포함하는 생물이나 환경 샘플에서 사용하기 위해 적용 할 수 있습니다.

손쥐 노로 바이러스에 대한 상패 분석

Source: Moore, M. D., et al. Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity. J. Vis. Exp. (2017)The video demonstrates a protocol for monitoring the heat-induced aggregation of virus-like particles using dynamic light scattering (DLS). It begins with preparing a monodisperse suspension of purified particles. The sample is then loaded into a preheated DLS instrument. As the capsid proteins denature with heat, exposed hydrophobic regions cause particle...

Tracking Aggregation of Virus-Like Particles Using Dynamic Light Scattering

이 비디오는 비트로넥틴과 박테리아 표면 단백질의 상호 작용을 감지하는 방법을 보여줍니다. 유세포 분석 분석은 비트로넥틴에 결합된 형광 표지 항체의 형광 신호를 측정하여 박테리아 표면에서 그 존재를 확인합니다. 이 기술은 숙주-병원체 상호 작용 및 잠재적인 박테리아 감염 요법에 대한 통찰력을 제공합니다.

유세포 분석을 사용한 박테리아 표면에 대한 Vitronectin 결합 검출

이 동영상은 인간 장내 세균에 결합하는 인간 노로바이러스 유사 입자(VLP)를 정량화하기 위한 분석을 보여줍니다. 박테리아 현탁액은 VLP와 혼합되고 배양되어 VLP-박테리아 복합체가 형성될 수 있도록 합니다. 그런 다음 복합체를 형광단 태그가 지정된 VLP 특이적 항체로 라벨링한 다음 유세포 분석 기반 시각화 및 정량화를 통해 VLP 결합 박테리아의 비율을 식별합니다.

인간 노로바이러스 VLP와 장내 세균의 결합을 정량화하기 위한 분석

여기에서는 Buffalo Green Monkey 신장 세포주를 사용하여 총 배양 가능한 바이러스를 측정하는 절차를 제시합니다. 이 절차는 환경 및 음용수에서 감염성 바이러스의 발생을 측정하기 위한 표준화된 도구를 제공합니다.

엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. II. 총 배양 가능한 바이러스 분석

여기에서는 역전사-정량적 PCR을 사용하여 환경 및 음용수에서 엔테로바이러스와 노로바이러스를 정량화하는 절차를 제시합니다. EPA Method 1615의 표준화된 절차를 통해 지하수에서 바이러스가 회수되는 평균 비율은 소아마비 바이러스의 경우 20%, 쥐 노로바이러스의 경우 30%였다.

엔테로 바이러스 및 문화와 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 파트 III. RT-qPCR에 의한 바이러스 검출

우리는 인플루엔자 A 바이러스가 A549 세포에 부착하는 것과 유세포 분석을 통해 바이러스 입자가 표적 세포로 내재화되는 것을 모두 측정하기 위한 반정량적 방법을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

유동 세포 계측법에 의해 A549 세포의 부착 및 국제화 인플루엔자의 바이러스를 측정

여기서는 표현 E.의 (P) 영역을 돌출 고품질 노로 바이러스를 정제하는 방법을 설명 대장균 X 선 결정학 연구에 사용. 이 방법은 다른 calicivirus의 P 영역뿐만 아니라, 비 구조 단백질에 적용 할 수있는 예. 바이러스 게놈의 단백질 - 결합 (VPG), 프로테아제 및 RNA 의존적 RNA 폴리머 라제 (RDRP).

인간의 노로 바이러스 돌출 도메인의 생산에<em&gt; E. 대장균</em&gt; X 선 결정학에 대한

바이러스 또는 세포외 소포체는 표면 항원을 인식하는 항체에 결합된 15nm 자성 나노입자로 면역포획되었습니다. 포획된 비리온 또는 소포는 다른 표면 항원에 대한 형광 항체로 표지되었습니다. 그 결과로 생성된 복합체는 높은 자기장에서 분리되고 형광에 트리거된 기존 유세포 분석기로 분석되었습니다.

비리의 항원 스펙트럼과 세포 외 소포를 분석하는 Virometry 흐름

환경적으로 단단한 표면에서 노로바이러스를 검출하고 정량화하기 위해 매크로폼 기반 샘플링 방법론이 개발되고 평가되었습니다.

표면에 인간의 노로 바이러스의 검출을위한 면봉 표본 추출 방법

일상적인 탐지 방법 바이러스 성 게놈 증폭을 이용 하는 비 전염 성 입자에서 전염 성 차별을 그들의 무 능력에 의해 제한 됩니다. 이 문서의 목적은 aptamer 바인딩, 동적 산란, 및 전송 전자 현미경 검사 법을 사용 하 여 감염 노로바이러스 입자의 차별에 도움이 다른 방법에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하는 것입니다.

대체 체 외에 바이러스 성 Capsid 구조적 무결성의 결정에 대 한 방법

학습하세요 유세포측정법을 사용하여 인간 노로바이러스 바이러스와 같은 입자가 공생 균에 결합하는 정량화 방법을. 이 기술은 바이러스-세균 상호작용을 안전하게 연구할 수 있게 합니다.

유세포측정을 사용하여 공생 균에 결합하는 인간 노로바이러스 바이러스와 같은 입자 정량화

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