유세포측정을 사용하여 공생 균에 결합하는 인간 노로바이러스 바이러스와 같은 입자 정량화

이 프로토콜의 목적은 진핵 병원체 인간 노로바이러스의 결합을 박테리아에 정량화하는 것이다. 초기 바이러스-박테리아 부착 분석을 수행한 후, 유동 세포측정은 집단 내에서 바이러스 결합 박테리아를 검출하는 데 사용된다.

바이러스 세균성 상호 작용은 호스트 면역 반응의 성공적인 바이러스 감염 및 자극을 위해 중요할 수 있습니다. 그러나 현재, 인간 노로 바이러스의 고농축 및 정제 된 재고는 실험실에서 생성 될 수 없습니다. 이 기술은 바이러스와 같은 입자 또는 살아있는 바이러스를 사용할 수있는 박테리아에 결합하는 모든 바이러스와 함께 사용할 수 있습니다.

그것은 우리가 이 바이러스와 박테리아 사이 상호 작용을 정량화하는 것을 가능하게 합니다. 냉동 글리세롤 육수에서 직접 한 천 판에서 Enterobacter 클로카의 단일 절연 식민지와 액체 매체의 5 밀리리터를 접종. 하룻밤 박테리아를 성장.

다음 날, 문화의 1.3 밀리리터 알리쿼트를 별도의 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기다. 튜브를 10, 000 x g에서 5분간 원심분리합니다. 수퍼나티를 제거한 다음, 세척할 때마다 멸균 1X PBS 1밀리리터를 사용하여 샘플을 두 번 세척합니다.

샘플을 10, 000 x g에서 5분 동안 다시 원심분리합니다. 상체를 제거하고 멸균 1X PBS의 1.3 밀리리터에서 펠릿을 다시 분리하십시오. 세척 된 배양의 0.5 밀리리터로 시작하여 10에서 마이너스 10에서 마이너스 4까지 1X PBS에서 박테리아를 연속적으로 희석시하십시오.

분광계를 사용하여, 세척되지 않은 희석 배양의 광학 밀도와 600 나노미터에서 4개의 희석제 각각을 측정합니다. 이전 희석제 각각에 대해 1X PBS에서 10배 의 직렬 희석을 수행합니다. 각 계열에 대한 마지막 3개의 희석제 100마이크로리터를 각 시료에 대해 밀리리터당 콜로니 성형 유닛수를 결정합니다.

접시가 실온에서 5분간 건조되도록 합니다. 접시를 반전시키고 인큐베이터에서 배양합니다. 원고에 설명된 바와 같이 시약, 항체 및 박테리아를 준비한 후, BSL-2 생물안전 캐비닛에 모든 물질을 조립한다.

인간 노로바이러스를 위한 바이러스 와 같은 입자는 BSL-2 병원체로 나열되고 VLP를 사용하여 수행하는 모든 작업은 인증된 생물안전 캐비닛에서 수행되어야 합니다. 박테리아의 각 튜브에 인간 노로 바이러스 VLP의 10 마이크로 그램을 추가하고 파이펫팅에 의해 철저하게 혼합. 일정한 회전과 섭씨 37도에서 1 시간 동안 튜브를 배양.

인큐베이션 후, 5 분 동안 10, 000 x g에서 튜브를 원심 분리합니다. 흡인 및 슈퍼 나탄을 폐기하고 PBS의 1 밀리리터에서 세균 펠릿을 다시 중단. 세척 단계를 한 번 반복한 후, 5 분 동안 10, 000 X g에서 튜브를 원심 분리합니다.

상체를 버리고 5 % 차단 버퍼의 150 마이크로 리터에서 VLP 박테리아 펠릿을 다시 중단하십시오. 발생하는 일반적인 오류는 튜브를 교환하고 잘못된 치료가 추가된다는 것입니다. 이를 방지하기 위해 올바른 치료에 해당하는 모든 튜브를 한 번에 튜브에 추가합니다.

각 세균성 시료에 대해, 희석된 인간 노로바이러스 GII 항체의 50마이크로리터를 준비한다. 5% 블로킹 버퍼를 사용하여, E.cloacae 샘플에 대해 항체를 1대 125로 희석한다. 동일한 희석 비를 사용하여 각 세균 성 시료에 대해 희석 된 동형 항체 50 마이크로 리터를 준비하십시오.

각 부착 분석 분석 샘플을 깨끗한 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 이송하여 350 마이크로리터 알리쿼트로 나눕니다. 스테인드 컨트롤을 만들려면 각 세균 샘플의 첫 번째 알리쿼트에 블로킹 버퍼 50 마이크로리터를 추가합니다. 스테인드 샘플의 경우, 2차 알리쿼트 세트에 GII 항체 희석의 50마이크로리터를 추가합니다.

희석된 이소형 항체의 50마이크로리터를 알리쿼트의 세 번째 세트에 추가하여 등형 대조군을 생성한다. 얼음과 어둠 속에서 30분 동안 모든 샘플을 배양합니다. 그런 다음 모든 샘플을 10, 000 X g에서 5분 동안 원심분리합니다.

슈퍼네티츠를 폐기하고 각 샘플을 FCSB의 150 마이크로리터로 재보힙합니다. 다시 말하지만, 원심 분리기는 5 분 동안 10, 000 X g의 모든 샘플을 원심 분리합니다. 다시 말하지만, 슈퍼네이터를 버리고 FCSB의 100 마이크로리터에서 샘플을 다시 중단하십시오.

시료를 원심분리한 후 최종 한 번 은은하고 슈퍼네티츠를 폐기한 후 FCSB의 150마이크로리터에서 샘플을 다시 중단합니다. 각 샘플을 FCSB 의 400 마이크로리터를 포함하는 튜브로 전달하여 총 550 마이크로리터를 사용할 수 있습니다. 시료를 섭씨 4도에 저장하여 혈류 세포측정에 의해 분석될 때까지 보관합니다.

VLP 부착은 유동 세포측정을 사용하여 측정되었다. 첫째, 밀도 플롯은 세포 파편을 게이트하는 데 사용되었고, 그 다음에는 세균이중과 세포 덩어리를 제거하기 위해 후속 점도 플롯 게이팅이 뒤따랐습니다. 대표적인 히스토그램은 세균성 만 샘플에서 PE 신호의 부족과 VLP:박테리아 샘플의 PE 신호 강도의 변화를 입증하여 얼룩이 없는 및 동종 형 대조군과 비교됩니다.

10 마이크로그램의 VLP를 가진 잠복한 후, 유동 세포측정은 E.colacae와 L.gasseri 모두에 결합하는 입자 결합을 검출했습니다. 이 분석체에 대한 결합 정량화의 한계를 결정하기 위해, VLP의 희석 시리즈는 박테리아에 첨가하기 전에 생성되었다. VLP의 양감소는 VLP에 의해 결합된 백분율 박테리아에 대응하는 감소 귀착되었습니다.

바이러스를 알고: 박테리아 비율을 알고 실험 사이 일관된 비율을 유지하는 것은 결과를 해석에 중요합니다. 세균및 바이러스 돌연변이체는 이러한 상호 작용을 중화시키는 미생물 표면 구조를 구체적으로 결정하기 위해 생성될 수 있다. 이 기술은 연구원이 바이러스 유전자형에 있는 변경, 세균성 성장 조건 및 세균성 표면 구조물에 있는 변경이 바이러스성 결합을 바꾸는 방법을 포함하여 노로바이러스 세균성 상호 작용에 영향을 미치는 상황 및 조건에 관하여 질문에 대답하는 것을 허용합니다.