Name: MeCP2 단백질 변이체에 대한 전기 화학 발광 기반 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 학습하세요 MeCP2 단백질 정량을 위한 전기화학발광 면역분석법(ECLIA)을 사용하여 신경과학 연구에서 빠르고 민감한 단백질 측정을 수행하는 방법을. 이 기법은 웨스턴 블롯보다 우수한 재현성을 제공합니다.

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브리기테 스투름 박사님께 ECLIA 악기를 지원해 주신 것에 대해 매우 감사드립니다.

연구 목적을 위한 피부 생검 조달을 위한 승인은 웨스트미드에 있는 아동 병원의 인간 연구 윤리 위원회에서, 오스트레일리아에서 얻었습니다. 동물 실험에 대한 동의는 오스트리아 연방 과학 경제부에서 얻어졌으며, 이는 현지 동물 복지 규정에 따라 수행되었습니다(GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
참고: ECLIA 시스템의 원리는 그림 1에설명되어 있습니다.
1. 항체 선택
<ol><li>다양한 MeCP2 항체의 범위에 대한 신호 대 잡음 비를 평가하고 1차 마우스 모노클로날 MeCP2 항체(클론 Mec-168) 및 토끼 폴리클로날 MeCP2 검출 항체(맞춤형)의 조합 내에서 최고의 신호 강도 및 최고 특이성을 식별한다. 이차 항체의 경우, 시스템 특이적항체(물자 표)를사용하며, 이는 또한 실험적으로 검증되었다. 참고: 표 1은 MeCP2-ECLIA 개발 및 이들의 시험된 희석 범위 동안 검증된 모든 항체에 대한 개요를 제공합니다.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>함수</td>
			<td>이름</td>
			<td>복제</td>
			<td>희석</td>
		</tr>
<tr>
<td>기본</td>
			<td>마우스, 안티 MeCP2</td>
			<td>멕-168</td>
			<td>1:500−-1:10,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>기본</td>
			<td>마우스, 안티 MeCP2</td>
			<td>4B6</td>
			<td>1:250-1:4,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>기본</td>
			<td>마우스, 안티 MeCP2</td>
			<td>남성 8</td>
			<td>1:500-1:4,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>기본</td>
			<td>마우스, 안티 MeCP2</td>
			<td>1B11</td>
			<td>1:500-1:4,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>기본</td>
			<td>토끼, 안티 MeCP2</td>
			<td>D4F3</td>
			<td>1:500-1:4,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>보조</td>
			<td>토끼, 안티 MeCP2</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>1:2,000−1:20,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>보조</td>
			<td>토끼, 안티 MeCP2</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>1:2,000−1:20,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>검색</td>
			<td>SULFO-TAG 라벨 안티 토끼</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>1:500−-1:1,000</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 항체 및 사용된 작용 희석의 목록.
<ol start="2"><li>대안적으로, 기존의 ELISA와 잘 작동하는 각 쌍의 MeCP2 항체를 사용한다.</li>
</ol>2. TAT-MeCP2 융합 단백질로 HDF 치료
참고: TAT-MeCP2는 대장균에서 재조합하여 발현하고, 앞서 설명한바와 같이 표준 크로마토그래피 기술을 사용하여 정제하고 -80°C에서 저장하였다.
<ol><li>플레이트 1 x 106 인간 진피 섬유아세포(HDF) 세포를 100 mm 접시에 5%CO2로 37°C에서 밤새 성장시키고 약 90% 동률에 도달할 때까지 세포를 성장시다.</li>
	<li>TAT-MeCP2 융합 단백질 1병을 꺼내십시오. 얼음을 녹이고 부드럽게 섞어주세요.</li>
	<li>TAT-MeCP2를 HDF 배양 배지의 50 mL에서 500 nM의 최종 농도로 희석한다.</li>
	<li>100 mm 접시에서 매체를 제거하고 최대 24 시간까지 다양한 잠복기 동안 37 °C에서 500 nM TAT-MeCP2로 세포를 배양합니다.</li>
	<li>셀에서 TAT-MeCP2 용액을 제거합니다. 미리 데운 덜베코의 인산완식염수(DPBS)로 세포를 2x 세척합니다.</li>
	<li>37 °C10에서5 분 동안 0.05 % 트립신 -EDTA 용액의 2 mL로 세포를 치료하십시오.</li>
	<li>6 mL의 HDF 배양 배지를 추가하여 트립신을 비활성화하고 15 mL 튜브에서 세포를 수집합니다.</li>
	<li>실온에서 5 분 동안 500 x g에서 원심 분리에 의해 세포를 펠렛.</li>
	<li>상한제를 제거하고 얼음으로 차가운 DPBS로 세포를 2x 씻어 내다. 펠릿을 얼음위에 보관하고 시료 준비를 진행합니다.</li>
</ol>3. 견본 준비
<ol><li>HDF 리세이츠<ol>
<li>스즈키 외11에따르면 세포질 및 핵 세포 전구내의 세포분열에 대한 REAP 방법을 사용하여 MeCP2의 가장 높은 단백질 수준을 결정한다. 분획을 실험당 6개 이하로 제한합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마우스 뇌가 리세이트<ol>
<li>각 저혈압 매리시스 시약 및 추출 완충제의 100 mL을 준비합니다.<ol>
<li>저혈압 용염 시약의 경우, 잘 혼합 10 mM HEPES, 1.5 mM 염화 마그네슘 과 10 mM 염화 칼륨.</li>
			<li>추출 버퍼의 경우, 잘 혼합 20 mM HEPES, 1.5 mM 염화 마그네슘, 0.42 M 염화 나트륨, 0.2 mM EDTA, 그리고 25% (v/v) 글리세롤.</li>
			<li>두 버퍼의 pH를 7.9로 조정합니다.</li>
			<li>1 mM 디티오트레이톨(DTT) 및 프로테아제 억제제 칵테일 1m를 두 버퍼에 신선하게 첨가합니다. 사용하기 전에 얼음을 식히세요.</li>
		</ol>
</li>
		<li>일시 중단 100 총 마우스 뇌의 mg (변형: C57BL/6J, 야생형 남성과 여성 및 B6.129P2 (C)-Mecp2tm1.1Bird/J,hemizygous 남성 및 이종 시균의 1 mL에 4−8 주 령.</li>
		<li>미리 냉각 된 Dounce 모든 유리 조직 균질화로 뇌를 균질화15 스트로크의 균질화 A (느슨한, 큰 클리어런스) 및 B (좁은 정리를 위해) 각각.</li>
		<li>균질화된 세포를 4°C에서 20분 동안 10,000 x g에서 깨끗한 튜브 및 원심분리기로 옮긴다. 상급제를 폐기하십시오 (또는 추가 사용을 위해 세포 플라즈마 분획으로 보관하십시오).</li>
		<li>시작 재료 100 mg당 추출 버퍼의 140 μL에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 튜브를 예식된 열블록에 놓고 4°C에서 30분간 부드럽게 섞습니다.</li>
		<li>4 °C에서 10 분 동안 16,000 g에서 튜브를 원심 분리합니다. 상층부(즉, 핵 분획)를 새로운 사전 냉각 튜브로 옮기고 사용 될 때까지 -80 °C에서 보관하십시오. 참고: 마우스 뇌및 HDF에서 유래한 리세이트의 단백질 농도는 BCA 단백질 분석에 의해 평가될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. MeCP2-ECLIA 프로토콜
<ol><li>세척 용액, 차단 완충제 및 분석 희석제 용액의 준비 (1 일째)<ol>
<li>500 μL의 Tween 20 ~1 L의 PBS를 추가하여 PBS 용액에 0.05 % 트웬 20을 준비하고 격렬하게 혼합하고 "세척 용액"으로 라벨을 붙입니다. 참고: 갓 준비한 세척 버퍼만 사용해야 합니다.</li>
		<li>인산완식염수(PBS)에서 3% 블로커A(재료표)의차단 용액을 준비한다. 부드럽게 저어서 섞고, 걸소 살균하고 최대 2주 동안 사용할 때까지 냉장고에 보관하세요.</li>
		<li>PBS 의 10 mL에 차단 용액 5 mL을 추가하여 분석 희석제 용액 (PBS에서 1 % 차단기 A)을 준비하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>높은 바인드 플레이트 코팅<ol>
<li>96 웰 멀티 어레이 단일 스팟 높은 바인드 플레이트를 꺼낸다. 참고: 높은 바인드 플레이트는 결합 능력이 크기 때문에 소수성 표면이 있는 표준 플레이트보다 동적 범위가 더 큽습니다.</li>
		<li>단일클론 마우스 항-MeCP2 항체를 얼음 상에 해동하고 항체의 0.67 μL을 PBS의 4 mL(PBS에서 1:6,000 항체 희석)으로 혼합한다. 항체 용액을 잘 혼합하고 튜브를 "코팅 용액"으로 라벨링합니다.</li>
		<li>다중 채널 피펫터를 사용하여 각 웰의 하단 모서리에 25 μL의 코팅 용액을 조심스럽게 분배하는 단계; 이를 용액 코팅 방법이라고 합니다. 양쪽의 96웰 플레이트를 부드럽게 눌러 코팅 용액이 각 우물의 바닥을 덮도록 합니다.</li>
		<li>접착제 호일로 플레이트를 밀봉하고 밤새 4 °C (12−16 h)에서 냉장고에 접시를 인큐베이션.</li>
	</ol>
</li>
	<li>블로킹 (2일차)<ol>
<li>냉장고에서 접시를 꺼내 호일을 제거합니다.</li>
		<li>폐기 바구니에 던져 항체 코팅 용액을 제거하고 우물에서 모든 코팅 용액을 제거하기 위해 종이 타월에 접시를 누릅니다.</li>
		<li>웰당 차단 용액 125 μL을 추가합니다. 플레이트를 다시 밀봉하고 궤도 마이크로 플레이트 셰이커에 놓습니다.</li>
		<li>800 rpm에서 일정한 흔들림으로 실온에서 90 분 동안 접시를 배양하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>표준 및 시료 준비<ol>
<li>인큐베이션 시간 동안 MeCP2 및/또는 TAT-MeCP2 단백질 표준 및 다양한 샘플을 준비합니다. 참고: 표준 희석에 사용되는 용해 버퍼는 분석된 샘플에 사용되는 것과 동일해야 합니다.</li>
		<li>MePC2 및/또는 TAT-MeCP2 단백질 스톡 솔루션(250 μg/mL)의 유리병을 꺼내면 마우스 뇌가 용해되고 HDF가 -80°C에서 용해됩니다. 얼음에 그들을 해동.</li>
		<li>표 2에따라 표준 스톡 솔루션(MeCP2 및/또는 TAT-MeCP2)을 깨끗한 튜브에 희석합니다.</li>
		<li>다음과 같이 용해 완충액으로 샘플을 희석: 용해 완충액의 25 μL당 마우스 뇌 용해액의 1-20 μg, 용해 완충액의 25 μL 당 HDF 용해의 0.25-1 μg. 각 시료의 충분한 부피를 준비하여 삼중으로 분석을 수행합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>표준</td>
			<td>농도</td>
			<td>희석</td>
		</tr>
<tr>
<td>표준 1</td>
			<td>1,800 ng/mL</td>
			<td>1.08 μL 표준 재고 솔루션 + 148.92 μL 용해 버퍼</td>
		</tr>
<tr>
<td>표준 2</td>
			<td>600 ng/mL</td>
			<td>50 μL 표준 1 + 100 μL Lysis 버퍼</td>
		</tr>
<tr>
<td>표준 3</td>
			<td>200 ng/mL</td>
			<td>50 μL 표준 2 + 100 μL Lysis 버퍼</td>
		</tr>
<tr>
<td>표준 4</td>
			<td>66.67 ng/mL</td>
			<td>50 μL 표준 3 + 100 μL Lysis 버퍼</td>
		</tr>
<tr>
<td>표준 5</td>
			<td>22.22 ng/mL</td>
			<td>50 μL 표준 4 + 100 μL Lysis 버퍼</td>
		</tr>
<tr>
<td>표준 6</td>
			<td>7.41 ng/mL</td>
			<td>50 μL 표준 5 + 100 μL Lysis 버퍼</td>
		</tr>
<tr>
<td>표준 7</td>
			<td>2.47 ng/mL</td>
			<td>50 μL 표준 6 + 100 μL Lysis 버퍼</td>
		</tr>
<tr>
<td>표준 8</td>
			<td>0.82 ng/mL</td>
			<td>50 μL 표준 7 + 100 μL Lysis 버퍼</td>
		</tr>
<tr>
<td>표준 9</td>
			<td>0.27 ng/mL</td>
			<td>50 μL 표준 8 + 100 μL Lysis 버퍼</td>
		</tr>
<tr>
<td>표준 10</td>
			<td>0 ng/mL</td>
			<td>150 μL Lysis 버퍼</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 0에서 1,800 ng/mL까지의 표준 시리즈.
<ol start="5"><li>샘플 및 표준 솔루션 추가<ol>
<li>폐바구니에 던져 서 차단 용액을 제거하고 우물에서 모든 차단 솔루션을 제거하기 위해 종이 타월에 접시를 누릅니다.</li>
		<li>세척 용액을 추가하고 즉시 제거하여 150 μL의 세척 용액으로 플레이트를 3x 씻어 내보소.</li>
		<li>단일 채널 파이펫을 사용하여 웰의 하단 모서리에 25 ul의 표준 및 샘플을 추가합니다.</li>
		<li>접시를 밀봉하고 800 rpm에서 일정한 흔들림으로 실온에서 4 시간 동안 플레이트를 배양하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>표지되지 않은 검출 항체<ol>
<li>얼음에 폴리 클론 토끼 항 MeCP2 항체를 해동. 분석 희석액으로 항체 1:6,000을 희석한다.</li>
		<li>표준과 샘플을 쓰레기 바구니에 던져 서 제거하고 종이 타월에 접시를 누릅니다.</li>
		<li>세척 용액을 추가하고 즉시 제거하여 150 μL의 세척 용액으로 플레이트를 3x 씻어 내보소.</li>
		<li>다중 채널 파이펫터를 사용하여 각 우물에 25 μL의 라벨이 없는 검출 항체를 추가합니다. 접시를 밀봉하고 실온에서 800 rpm에서 일정한 흔들림으로 1 시간 동안 배양하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>특정 공액 항체<ol>
<li>냉장고에서 특정 이차 항체(재료 표)를꺼내 얼음에 놓습니다. 항체를 희석시키는 분석액으로 1:666.67을 희석시키고 부드럽게 섞는다.</li>
		<li>라벨이 부착되지 않은 이차 항체를 폐기 바구니에 넣고 종이 타월로 접시를 탭합니다.</li>
		<li>세척 용액을 추가하고 즉시 제거하여 150 μL의 세척 용액으로 플레이트를 3x 씻어 내보소.</li>
		<li>다중 채널 파이펫터를 사용하여 각각의 웰에 25 μL의 특정 공액 항체(재료 표)를추가합니다. 접시를 밀봉하고 실온에서 800 rpm에서 일정한 흔들림으로 1 시간 동안 배양하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>접시 읽기<ol>
<li>자유 공액항체(재료 표)를폐기 바구니에 넣고 종이 타월로 접시를 탭합니다.</li>
		<li>세척 용액 150 μL로 플레이트를 3x 씻으소서.</li>
		<li>트리프로필라민을 함유하는 계면활성제와 함께 1x Tris 계금 판독버퍼(표)의150 μL을 플레이트에 광 발생을 위한 공동 반응제로 첨가한다. 역피케팅 기술을 사용하여 기포를 피하십시오.</li>
		<li>플레이트를 마이크로 플레이트 검출플랫폼(재료 표)에놓고 즉시 측정을 시작합니다. 96웰 플레이트 수집을 위한 설정을 사용합니다.</li>
		<li>전기 화학 발광 검출 시스템(재료표)에내장 된 CCD 카메라에 의해 전기 화학 발광 신호를 캡처하고 상대 광 단위 (RLU)에 해당하고 빛의 강도에 정비례하는 신호 수를 기록합니다. 참고: 전기화학적 자극시, 탄소 전극에 결합된 루테늄 라벨은 620 nm에서 발광광을 방출한다. 계측기 와드소프트웨어(재료 표)로데이터를 분석합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

내인성 MeCP2, 재조합 MeCP2 및 TAT-MeCP2 수준을 측정하기 위해 96 웰 플레이트 ECLIA가 개발되었습니다. MeCP2 단백질 기능의 손실은 RTT 증후군6으로이어지며, 치료는 현재 증상 관리 및 물리 치료로 제한됩니다. 1개의 유망한 처리 도로는 MeCP2 수준이 그들의 필요로 한 농도까지 적정될 수 있는 소위 단백질 대체 요법입니다12,,13,,14,,15. 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 TAT 융합,단백질의 잠재력은 지난 2년간12,,13,14,,<sup ...

전기 화학 발광 면역 분석 (ECLIA)는 전기 화학적으로 자극 될 때 발광을 방출하도록 설계된 라벨을 활용하는 프로세스를 기반으로합니다. 그것은 임상 진단 1뿐만 아니라 기초 산업 및 학술 연구, 식품 산업에서 생물학적 분석물의 정량적 검출을 위한 광범위하게 적용 가능한기술이다. 일반적으로 탄소 잉크 전극이 있는 일회용 96웰 플레이트가 사용됩니다. 이들 전극은 면역분석에 대한 고체상 담체로서 작용한다. 이차 항체는 전기 발광 라벨에 공액되고 전기가 시스템에 가해지면 화학 라벨의 발광이 트리거됩니다. 초저잡음 전하 결합 장치(CCD)는 포획 항체에 결합된 항원과 정비례하는 광 강도를 기록하여 샘플2의표적 화된 공액을 정량화합니다. 효소 연계 면역흡착 분석(ELISA)에 비해 ECLIA는 더 높은 감도 및 재현성을 제공하며 더 나은 자동화 및 일관성3을제공함에 있어 유리한 것으로 간주됩니다.
여기서 우리는 새로 개발된 ECLIA 시스템을 사용하여 인간 및 뮤린 기원의 샘플에서 메틸-CpG 결합 단백질 2(MeCP2) 수준뿐만 아니라 재조합 단백질의 상이한 변이체를 분석하였다. MecP2는 메틸화된 DNA 서열과 상호 작용하는 것으로 알려진 X-연결된 핵산 결합 단백질입니다. 이 단백질은 유전자발현4,,5의조절에 연루되어 있다. 이 단백질을 부호 매코딩하는 유전자에 있는 기능 상실 돌연변이는 Rett 증후군 (RTT),6가혹한 신경 발달 무질서6를 일으키는 원인이 되는 주요 범인입니다. 또 다른 MeCP2 관련 장애, MECP2 중복 증후군, 또한 RTT의 그들과 겹칠 수 있는 신경 증상으로 이어질7. 특히, 여성은 주로 RTT에 의해 영향을받는 반면 남성은 주로 MECP2 중복 증후군6,,7에의해 고통받고 있습니다.
이러한 장애는 중추 신경계 (CNS)에서 각각 부족하거나 과잉 MeCP2 수준과 관련이 있습니다. 따라서, CNS에서 MeCP2 수준을 증가 포함 하는 RTT에 대 한 치료 옵션 MeCP2의 초과와 관련 된 해로운 효과 방지 해야 할 것 이다7. 이 사실로 인해 ECLIA 시스템에서 제공하는 MeCP2 단백질 수준의 매우 민감하고 정확한 정량화는 RTT의 발전과 MECP2 중복 증후군 연구에 매우 중요합니다. 인간 세포주 및 마우스 조직 샘플로부터 내인성 및 외인성 MeCP2 수준의 정밀한 측정은 인간 MeCP2 이소폼 B(또한 이소폼 e1라고도 함)로 구성된 재조합 단백질뿐만 아니라, 혈액-뇌장벽을,교차시킬 가능성이 있는 최소한의 N-말단 HIV-TAT 트랜스듀션 도메인(TAT-MeCP2)이 이 작업에서제시된다.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td>Hypotonic lysis 시약, 추출 버퍼</td></tr><tr><td>Bio-Rad 단백질 분석 염료 시약 농축액</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td><td>500-0006</td><td>샘플 전처리</td></tr><tr><td>검출 AB SULFO-TAG 표지 안티 토끼</td><td>메조 스케일 진단</td><td>R32AB-1</td><td>항체</td></tr><tr><td>디스커버리 워크벤치 4.0</td><td>메조 스케일 디스커버리</td><td></td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>DMEM (1X)</td><td>gibco by Life Technologies</td><td>41966-029</td><td>샘플 전처리</td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (sterile)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>시료 전처리, 세척 용액, 코팅 용액</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>추출 완충액</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td>시료 전처리</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td>추출 버퍼</td></tr><tr><td>금 판독 버퍼 T (1x) with surfactant</td><td>Meso Scale 진단</td>: <td>R92TG</td>, <td>MeCP2, ECLIA 프로토콜</td></tr>, <tr><td>HEPES,</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td>, <td>Hypotonic lysis 시약, 추출 버퍼</td></tr><tr><td>, KIMBLE, Dounce, 조직 분쇄기 세트</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>D8938</td>, <td>시료 전처리</td></tr><tr><td>실험실, 셰이커, 흔들림 동작(저속)</td><td>GFL</td>, <td>3014</td>, <td>MeCP2, ECLIA 프로토콜</td></tr><tr><td>, 염화마그네슘, 육수화물(MgCl*6H20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td></tr><tr><td>MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)</td><td>Abnova Corporation</td><td>H00004204-P01</td><td>세포 처리</td></tr><tr><td>Microseal B seal</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td><td></td><td>플레이트 밀봉</td></tr><tr><td>용 MSB1001, 마우스에서 생산, 클론 Mec-168, 정제 된 면역 글로불린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6818-100UL에서 생산; RRID:AB_262075</td><td>항체, 코팅 용액</td></tr><tr><td>MSD 차단제 A</td><td>메조 스케일 진단</td><td>R93BA-4</td><td>차단제</td></tr><tr><td>MSD SECTOR 이미저 2400</td><td>메조 스케일 진단</td><td>I30AA-0</td><td>MeCP2 ECLIA 프로토콜</td></tr><tr><td>다중 어레이 96웰 플레이트</td><td>메조 스케일 진단</td><td>L15XB-3/L11BX-3</td><td>MeCP2 ECLIA 프로토콜</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>gibco by Life Technologies</td><td>15140122</td><td>토끼</td></tr><tr><td>Eurogentec S.A.</td><td>에서 생산되는 시료 전처리 Polyclonal Anti-MeCP2</td><td>맞춤형 항체</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨 (KCl)</td><td>Merck KGaA</td><td>1049361000</td><td>Hypotonic lysis 시약</td></tr><tr><td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB1404063; RRID:AB_10737296</td><td>항체</td></tr><tr><td>1차 AB 마우스, anti-MeCP2 (4B6)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WH0004204M1; RRID:AB_1842411</td><td>항체</td></tr><tr><td>기본 AB 마우스, anti-MeCP2 (Mec-168)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6818; RRID:AB_262075</td><td>항체</td></tr><tr><td>기본 AB 마우스, anti-MeCP2 (Men-8)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7443; RRID:AB_477235</td><td>항체</td></tr><tr><td>일차 AB 토끼, 항-MeCP2 (D4F3)</td><td>세포 신호 기술</td><td>3456S; RRID:AB_2143849</td><td>항체</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8340</td><td>Hypotonic lysis 시약, 추출 버퍼</td></tr><tr><td>2차 AB, 토끼, anti-MeCP2</td><td>Eurogentec S.A.</td><td>맞춤형</td><td>항체</td></tr><tr><td>2차 AB, 토끼, anti-MeCP2</td><td>Merck</td><td>07-013</td><td>항체</td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>추출 버퍼</td></tr><tr><td>SULFO-TAG 라벨링된 안티 토끼 항체(염소)</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>W0015528S</td><td>항체</td></tr><tr><td>TAT-MeCP2 융합 단백질</td><td>사내 생산</td><td></td><td>세포 치료</td></tr><tr>Life Technologies <td>25200-056</td><td>세포 처리</td>트윈 20 Sigma-Aldrich P9416 세척 용액의 <td>Trypsin EDTA 0.25%(1X)</td><td>gibco</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mecp2 단백질 변이체에 대한 전기 화학 발광 기반 분석

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

ECLIA는 96 웰 포맷으로 내인성 및 재조합 단백질 양을 정량화할 수 있는 다목적 방법입니다. ECLIA 효율성을 입증하기 위해, 이 분석은 마우스 뇌 조직에서 MeCP2의 본질적인 수준을 분석하고 인간 진피 섬유아세포에서 TAT-MeCP2의 섭취를 분석하는 데 사용되었다. MeCP2-ECLIA는 낮은 분석 및 분석 간 오류로 매우 정확하고 재현 가능한 측정을 생성합니다. 요약하자면, 우리는 고처리량 스크린에서 이용될 수 있는 MeCP2 단백질 변이체의 평가를 위한 정량적인 방법을 개발했습니다.

ECLIA 시스템의 원리는 그림 1에설명되어 있습니다. 두 개의 MeCP2 변형에 대한 표준 곡선은 그림 2에나와 있습니다. 광범위한 농도(1-1,800 ng/mL)에서 정확한 정량화가 가능했습니다. 도 3에서마우스 뇌 및 HDF에서 유래된 메CP2 수준의 포액을 분석했습니다. 이형에서의 뇌 핵 용해물에서의 MeCP2 발현, 야생형 및 녹아웃 마우스는 도 3A에서비교하였고, 도 3B에서 MeCP2 단백질은 ECLIA를 사용하여 MECP2 결핍 인간 섬유아세포(c.806delG)에서 검출되었다. MECP2 결핍 세포주(c.806delG)에 의한 TAT-MeCP2의 섭취도 시간이 지남에 따라 조사되었다(그림4). 마...

전기 화학 발광 면역 분석 (ECLIA)은 내인성 및 외인성 적용 MeCP2 단백질 변이체의 정량적 검출을위한 새로운 접근법으로, 광범위한 작업 범위에 걸쳐 낮은 인트라 및 분석 오류로 높은 정량적, 정확하고 재현 가능한 측정을 생성합니다. 여기서, MeCP2-ECLIA에 대한 프로토콜을 96웰 형식으로 설명한다.

MeCP2 단백질 변이체에 대한 전기 화학 발광 기반 분석

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

ECLIA는 MeCP2의 세포 수준을 정량화하는 간단하면서도 효율적인 방법입니다. ECLIA는 서양 블롯 및 ELISA와 같은 다른 정량화 방법에 비해 빠르고 민감하며 취급하기가 쉽습니다. PBS에서 0.5%Tween 20인 세탁 용액을 준비하려면 500 마이크로리터의 Tween 20을 PBS 1리터에 넣고 적극적으로 혼합합니다.3%블로커 A와 PBS의 블로킹 용액을 준비하고 부드럽게 저어줍니다. 여과로 차단 용액을 살균합니다. 분석 희석 솔루션, 1%Blocker A 및 PBS를 준비하려면 PBS 의 10 밀리리터에 블로킹 솔루션 5밀리리터를 추가합니다.다음으로 얼음에 단클론 마우스 항 MeCP2 항체를 해동. 항체의 0.67 마이크로리터를 PBS의 4밀리리터와 혼합한 다음 용액을 소용돌이시다. 96웰 높이의 바인드 플레이트를 코팅하려면 멀티채널 파이퍼를 사용하여 코팅 용액 25마이크로리터를 각 웰의 하단 모서리에 조심스럽게 분배합니다.코팅 용액이 각 우물의 바닥을 덮는지 확인하기 위해 각 면에 96 웰 플레이트를 부드럽게 두드려. 접착제 호일로 접시를 밀봉하고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 냉장고에서 96웰 플레이트를 회수하고 호일을 제거합니다.이를 폐기물 용기로 밀어 서 우물내의 항체 코팅 용액을 제거합니다. 그런 다음 종이 타월에 접시를 탭하여 남은 해결책을 제거합니다. 다음으로 각 웰에 125마이크로리터의 블로킹 솔루션을 추가합니다.그런 다음 접착제 호일로 접시를 다시 밀봉합니다. 800 RPM에 설정된 궤도 마이크로 플레이트 셰이커에 플레이트를 놓고 실온에서 90분 동안 배양합니다. MeCP2 또는 Tat-MeCP2 단백질 스톡 솔루션, 마우스 뇌 용액 및 HDF 용액의 얼음 1부 바이알을 얼음 위에 해동합니다.원고의 표 2에 설명된 대로 깨끗한 튜브에 단백질 스톡 용액을 희석시. 다음으로 lysate 샘플을 희석시. 마우스 뇌 용해물의 경우, 용해 버퍼의 25 마이크로 리터 당 1 ~ 20 마이크로 그램을 사용합니다.HDF 용액의 경우 25마이크로리터당 0.25마이크로그램에 1마이크로그램을 추가합니다. 96웰 플레이트가 90분 동안 배양한 후, 이를 폐기물 용기로 밀어서 우물에서 차단 용액을 제거합니다. 그런 다음 종이 타월에 접시를 탭하여 남은 해결책을 제거합니다.그런 다음 세척 용액 150 마이크로리터로 플레이트를 세 번 씻고 즉시 제거하십시오. 96웰 플레이트의 우물에 표준 및 샘플 25 마이크로리터를 추가합니다. 접시를 밀봉하고 일정한 800 RPM 흔들림과 실온에서 또 다른 4 시간 동안 인큐베이션.표지가 없는 검출 항체, 폴리클론 토끼 항-MeCP2를 얼음 위에 해동하십시오. 분석 희석용액을 사용하여, 항체를 1 대 6, 000의 비율로 희석한다. 96웰 플레이트가 셰이커에 인큐베이팅이 완료되면 플레이트를 폐기물 용기에 밀어 서 표준 및 샘플을 제거합니다.그런 다음 종이 타월에 접시를 탭하여 남은 해결책을 제거합니다. 세척 용액을 추가하고 즉시 제거하여 150 마이크로 리터의 세척 용액으로 접시를 세 번 씻습니다. 다중 채널 파이퍼를 사용하여 라벨이 부착되지 않은 검출 항체 용액 25마이크로리터를 각 웰에 추가합니다.접시를 밀봉하고 800 RPM에서 일정한 흔들림과 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션. 냉장고에서 특정 이차 항체를 얻고 하나의 얼음을 놓습니다. 보조 바디를 분석 희석 용액으로 희석하고 부드럽게 섞습니다.96웰 플레이트에서 라벨이 없는 무료 검출 항체를 제거하려면 폐기물 용기에 넣은 다음 종이 타월에 접시를 누릅니다. 플레이트를 3배 나 세척한 후, 멀티채널 파이프터와 함께 각각 25마이크로리터의 이차 항체를 첨가한다. 접시를 밀봉하고 800 RPM에서 일정한 흔들림과 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션.폐기물 용기에 넣고 종이 타월에 접시를 두드리고 이전에 설명한 대로 플레이트를 세 번 세척하여 자유 이차 항체를 제거합니다. 플레이트의 각 웰에, 150 마이크로 리터의 150 계면 활성제로 골드 읽기 버퍼, 광 생성을위한 코어 액터로 트리 프로필라민을 포함. 기포를 생성하지 않으려면 역파이프팅 기술을 사용하십시오.전기 화학 발광 검출 시스템을 갖춘 마이크로 플레이트 플랫폼에 96웰 플레이트를 배치합니다. 내장된 CCD 카메라를 사용하여 즉시 데이터 캡처를 시작합니다. 상대광 단위에 대응하고 빛의 강도에 직접 비례하는 기록 신호 카운트.MeCP2 표준 곡선은 여러 측정에서 인간 MeCP2로부터 생성되었습니다. ECLIA는 밀리리터당 1나노그램에서 밀리리터당 1800나노그램의 범위에서 재조합 인간 MeCP2를 정확하게 정량화할 수 있습니다. ECLIA를 사용하여, MeCP2 단백질 수준은 이종화구와 여성 야생형 마우스와 1개의 MeCP2 녹아웃 마우스에서 두뇌 핵 용액에서 측정되었습니다.ECLIA는 건강한 대조군으로부터 세포 용액및 레트 증후군의 모델로 사용되는 c. 806delG 세포주로부터 수행되었다. ECLIA 또는 면역 형광에 의해 돌연변이 세포주에서 MeCP2 단백질이 검출되지 않았다.ECLIA는 또한 MeCP2 결핍 세포주 초과 근무에 의해 Tat-MeCP2의 uptake를 조사하는 데 사용되었다. ECLIA 인터 및 내 분석 정밀도는 3일 연속 으로 결정되었다. 미래의 단백질 대체 요법을 위해, MeCP2 전달은 ECLIA에 의하여 단백질 수준 평가에 따라 반복적으로 최적화될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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MeCP2 단백질 변이체에 대한 전기 화학 발광 기반 분석

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