Name: 저하된 FFPE-RNA 시료의 시퀀싱 및 분석을 위한 최적화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: 학습하세요 FFPE-RNA 시료의 시퀀싱 최적화 방법을 통해 저하된 RNA 품질을 개선하고 유전자 발현 데이터를 향상시키는 기술입니다. 이 프로토콜은 생물학 및 임상 샘플의 전사체 특성 분석에 필수적입니다.

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우리는 다니엘 캐릭 박사에게 감사드립니다 (암 통제 및 인구 과학의 부, 국립 암 연구소) 지속적인 도움, 특히이 연구를 시작하고, 샘플을 제공하고, 데이터 분석 중에 유용한 제안을 위해. 우리는 진심으로 샘플 준비 및 시퀀싱 동안 자신의 도움을 위해 암 연구를위한 프레드릭 국립 연구소의 CCR 시퀀싱 시설의 모든 구성원에게 감사드립니다, 샘플 QC에 도움을 특히 브렌다 호, 도서관 QC에 대한 옥사나 독일어, 시퀀서를 실행하기위한 타티아나 스미르노바. 우리는 또한 데이터 분석 및 RNA-seq 파이프라인 구현을 돕는 시퀀싱 시설 생물 정보학 그룹의 Tsai-wei Shen및 애슐리 월튼에게 감사드립니다. 또한 RNaseq 분석 파이프라인 및 모범 사례 개발에 대한 지원을 위해 CCBR 및 NCBR에 감사드립니다.

<ol><li>Carrick, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+Next+Generation+Sequencing+on+Older+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue.</a> PLoS One. 10 (7), 0127353(2015).</li>
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<li>Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Utilization+of+Formalin+Fixed-Paraffin-Embedded+Specimens+in+High+Throughput+Genomic+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Genomics%22%5BJournal%5D)">The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies.</a> International Journal of Genomics. 2017, 1926304(2017).</li>
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<li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22(2017).</li>
<li>Amini, P., Nassiri, S., Ettlin, J., Malbon, A., Markkanen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+RNA+sequencing+of+FFPE+subsections+reveals+highly+conserved+stromal+reprogramming+between+canine+and+human+mammary+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Next-generation RNA sequencing of FFPE subsections reveals highly conserved stromal reprogramming between canine and human mammary carcinoma.</a> Disease Models and Mechanisms. 12 (8), (2019).</li>
<li>Wimmer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA+quality%2C+microarray+data+reliability+and+pathway+analysis+in+fresh%2C+fresh+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA quality, microarray data reliability and pathway analysis in fresh, fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6351(2018).</li>
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<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nature Protocols. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Research. 37 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Evaluating RNA Quality from FFPE Samples. Illumina. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf">https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf</a> (2016).</li>
</ol>

이 작품은 국립 암 연구소에 의해 투자 되었다 (NCI), 건강의 국가 학회 (NIH). Leidos 생물 의학 연구, Inc.는 NIH에 의해 완전히 투자되는 암 연구를 위한 프레드릭 국립 연구소를 위한 운영 및 기술 지원 계약자입니다. 몇몇 저자 (YZ, MM, KT, YL, JS, BT)는 Leidos 생물 의학 연구, Inc.와 제휴하고 있습니다, 그러나 저자의 모든 저자는 저자의 급여 및 연구 자료를 포함하여 국립 암 학회에 의해 완전히 투자됩니다. Leidos Biomedical Research, Inc.는 저자(YZ, MM, KT, YL, JS, BT) 또는 연구 용 자료에 대한 급여를 제공하지 않았으며, 연구 설계, 데이터 수집, 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 어떠한 역할도 하지 않았습니다.

여기에 설명된 방법은 FFPE-RNA 샘플에서 양호한 서열 데이터를 얻는 데 필요한 주요 단계를 간략하게 설명합니다. 이 방법으로 고려해야 할 주요 사항은 다음과 같습니다: (1) 샘플 취급 및 동결 및 해동 주기를 최소화하여 추출 후 RNA가 가능한 한 잘 보존되도록 하십시오. 별도의 QC aliquots는 매우 유용합니다. (2) 지정된 샘플 세트에 가장 적합한 QC 메트릭을 사용합니다. RIN 값 및 DV200은 종종 열화된 샘플에 유용하지 않으며, DV100은 주어진 샘플 세트에서 품질을 평가하기 위한 선택의 메트릭일 수 있다. (3) 더 저하된 샘플의 경우 높은 샘플 입력을 사용하는 것이 가장 좋습니다. 입력량이 높을수록 최종 라이브러리의 다양성이 향상되고 중복이 낮아지므로 데이터 품질이 향상됩니다. FFPE-RNA 샘플의 모든 RNA가 효소 과정에 대한 높은 분해 및 내화성으로 인해 사용할 수 있는 것은 아니기 때문에 이러한 효과는 신선한 냉동 RNA에 비해 FFPE-RNA에서 ...

차세대 염기서열 분석 방식을 사용하여 다양한 유형의 샘플에서 풍부한 정보를 얻을 수 있었습니다. 그러나 오래되고 잘 보존되지 않은 샘플은 시퀀스 데이터를 생성하는 일반적으로 사용되는 방법에 대해 작동하지 않으며 종종 잘 설정된 프로토콜을 수정해야 합니다. FFPE 조직은 임상 시편1,2,3에,3널리 활용되어 온 이러한 샘플 유형을 나타낸다. FFPE 보존은 조직 형태를 유지하는 동안, FFPE 조직에 있는 핵산은 일반적으로 각종 무질서의 밑에 분자 기계장치에 관하여 중요한 통찰력으로 이끌어 낼 수 있는 게놈 정보를 검색하는 것을 어렵게 만드는 손상 및 분해의 넓은 범위를 전시합니다.
RNA 염기서열 분석에 의해 생성된 유전자 발현 데이터는 종종 질병 및 저항 메커니즘을 연구하는 데 중요한 역할을 하며 DNA 돌연변이 분석을 보완합니다. 그러나, RNA는 FFPE 조직에서 정확한 유전자 발현 데이터를 생성하는 것이 더 도전적이기 때문에 분해에 더 취약합니다. 더욱이, 시퀀싱의 광범위한 가용성 및 경제성이 비교적 최근이기 때문에, 오래된 표본은 종종 RNA 무결성을 보존하는 데 필요한 조건에서 저장되지 않았다. FFPE 견본을 위한 문제점의 몇몇은 파라핀에 포함하기 때문에 RNA의 분해, 시퀀싱에 요구되는 효소 프로세스에 단편화 또는 불응성으로 이끌어 내는 RNA의 화학적 수정, 및 폴리 A 꼬리의 손실을 포함합니다, 역전사제4를위한 프라이머로 올리고-dT의 적용성을 제한하는. 또 다른 과제는 조직에 있는 RNA와 같은 불안정한 분자의 추가 저하로 이끌어 낼 수 있는 최적이 아닌 조건의 FFPE 견본의 취급/저장입니다5. 이것은 RNA 염기서열 분석에 의한 유전자 발현 분석이 견본을 위해 예상되지 않았을 때 한 번에 집합되었을 수 있는 오래된 견본을 위해 특히 관련이 있습니다. 이러한 모든 경우 유용한 서열 데이터를 생성하는데 사용할 수 있는 추출된 RNA의 품질 및 양이 감소합니다. 성공 확률이 낮고, 시퀀싱 비용이 높기 때문에 많은 연구자들이 잠재적으로 유용한 FFPE 샘플에서 유전자 발현 데이터를 생성하고 분석하지 못하게 되었습니다. 최근 몇 년 동안 의 몇몇 연구 결과는 더 적은 및/또는 더 최근 견본을 위한 이기는 하지만 유전자 발현 분석2,,6,,7,,8,,9를위한 FFPE 조직의 유용성을 설명했습니다.
타당성 조사로서, 우리는 RNA 시퀀싱 및 유전자 발현 분석을 위한 감시, 역학 및 최종 결과(SEER) 암 레지스트리로부터 3개의 잔류 조직 저장소로부터 FFPE 종양 조직 표본으로부터 추출된 RNA를 사용하였다10. 임상 병리학 실험실에서 조달, 고급 난소 장액 선암에서 FFPE 조직은 RNA 추출 하기 전에 다양 한 조건 하에서 7-32 년에서 저장 되었다. 대부분의 경우에 이 블록은 미래에 어떤 민감한 유전 분석든지의 기대 없이 년 동안 다른 사이트에 저장되었기 때문에, 핵산을 보존하기 위하여 많은 주의를 취하지 않았습니다. 따라서, 대부분의 견본은 박테리아로 오염된 견본의 큰 비율로, 나쁜 질 RNA를 전시했습니다. 그럼에도 불구하고, 우리는 유전자 정량화를 수행하고, 유전자 커버리지의 균일성 및 연속성을 측정하고, 재현성을 측정하기 위해 생물학적 복제중 Pearson 상관 분석을 수행할 수 있었습니다. 주요 서명 유전자 패널의 세트에 기초하여, 우리는 암 게놈 아틀라스 (TCGA) 데이터와 우리의 연구 결과에 있는 견본을 비교하고 견본의 대략 60%가 비교한 유전자 발현 단면도11가있었다는 것을 확인했습니다. 다양한 QC 결과와 샘플 메타데이터 간의 상관관계를 바탕으로, 사용 가능한 시퀀스 데이터를 생성할 가능성이 높은 샘플을 식별하기 위한 예측 값이 좋은 주요 QC 메트릭을확인했습니다 11.
여기에서는 FFPE-RNA 품질 평가, 추출된 RNA 샘플에서 시작되는 시퀀싱 라이브러리 생성 및 시퀀싱 데이터의 생물 정보 분석에 사용되는 방법론을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent DNA 7500 Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1506</td><td></td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA FFPE Kit</td><td>Qiagen</td><td>80234</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 터치 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>1855195</td><td></td></tr><tr><td>Library Quantification kit v2-Illumina</td><td>KapaBiosystems</td><td>KK4824</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina</td><td>New England Biolabs</td><td>E7765S</td><td>https://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit</td></tr><tr><td>NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)</td><td>New England Biolabs</td><td>E6310L</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500 염기서열분석 시스템</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1001</td><td>NextSeq 500 시스템 가이드: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf</td></tr><tr><td>NextSeq PhiX Control Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3002</td><td></td></tr><tr><td>NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS)</td><td>Illumina</td><td></td><td></td>20024907</tr><tr><td>10X Genomics 자기 분리기</td><td>10X Genomics</td><td>120250</td><td></td></tr><tr><td>Rotator Multimixer</td><td>VWR</td><td>13916-822</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>염기서열분석 시약 키트</td><td>Illumina</td><td>20024907</td><td></td></tr><tr><td>플로우 셀 패키지</td><td>Illumina</td><td>20024907</td><td></td></tr><tr><td>버퍼 카트리지 및 시약 카트리지</td><td>Illumina</td><td>20024907</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨 용액 (0.2N)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>SX0607D-6</td><td></td></tr><tr><td>TRIS-HCL 버퍼 1.0M, pH 7.0</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-151-871</td><td></td></tr></tbody></table>

저하된 ffpe-rna 시료의 시퀀싱 및 분석을 위한 최적화

Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples

RNA 시퀀싱(RNA-seq)에 의한 유전자 발현 분석은 잠재적으로 저항 및/또는 감수성 메커니즘뿐만 아니라 다양한 질병의 기초에 대한 기계적 이해로 이어질 수 있는 임상 샘플에 대한 고유한 통찰력을 가능하게 합니다. 그러나, 임상 견본에 있는 조직 형태를 보존하기 위한 일반적인 방법을 나타내는 FFPE 조직은, 유전자 발현 프로파일링 분석을 위한 제일 근원이 아닙니다. 이러한 샘플에서 얻은 RNA는 종종 분해, 단편화 및 화학적으로 변형되어 최적이 아닌 시퀀싱 라이브러리로 이어집니다. 차례로, 이들은 유전자 발현 분석 및 돌연변이 발견을 위해 믿을 수 없을 지도 모르다 나쁜 질 순서 데이터를 생성합니다. FFPE 샘플을 최대한 활용하고 품질이 낮은 샘플에서 최상의 데이터를 얻으려면 실험 설계를 계획하고 시퀀싱 라이브러리를 준비하며 데이터 분석 중에 특정 예방 조치를 취하는 것이 중요합니다. 여기에는 정밀한 시료 품질 관리(QC)에 적합한 메트릭의 사용, 시퀀싱 라이브러리 생성 동안 다양한 단계에 가장 적합한 방법 식별, 신중한 라이브러리 QC 등이 포함됩니다. 또한 RNA-seq 데이터에서 아티팩트를 식별하고, 오염 및 낮은 품질 판독을 필터링하고, 유전자 커버리지의 균일성을 평가하고, 생물학적 복제물 중 유전자 발현 프로필의 재현성을 측정하기 위해서는 서열 데이터 분석을 위한 올바른 소프트웨어 도구 및 매개 변수를 적용하는 것이 중요합니다. 이러한 단계는 매우 이질적인 RNA 샘플의 프로파일링을 위한 높은 정확도와 재현성을 보장할 수 있습니다. 여기에서 우리는 FFPE RNA 조직에서 얻은 것과 같은 낮은 품질의 RNA로부터 얻은 유용한 데이터의 양을 증가시키는 데 도움이 될 수 있는 샘플 QC, 라이브러리 준비 및 QC, 시퀀싱 및 데이터 분석을 위한 다양한 단계를 설명합니다.

위에서 설명한 방법론은 7-32년 동안 다양한 조건하에서 저장된 67개의 FFPE 샘플에 적용하였다(중앙값 시료 저장 시간은 17.5년이었다). 여기에 제시된 데이터 집합 및 분석 결과는 Zhao 등11에이전에 기술되고 출판되었습니다. 앞에서 설명한 바와 같이 샘플 품질을 검사할 때(즉, 도 2의예시 트레이스), DV100은 고열RNA 샘플에 대한 더 작은 단편 크기의 비율을 정확하게 측정하는 것이 더 민감하기 때문에 DV200보다 더 유용한 것으로 나타났다.
주어진 샘플 세트에서, Illumina34에서권장하는 대로 샘플의 10% 미만(67개 중 7개)은 DV 200컷컷30%보다 높았습니다.200 샘플의 약 26%(67개 중 19개)는 DV100 &gt; 60%(...

이 방법은 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) RNA 샘플로부터 얻을 수 있는 서열 데이터의 질 및 양을 개선하는 단계를 설명한다. 우리는 FFPE-RNA 샘플의 품질을 보다 정확하게 평가하고, 시퀀싱 라이브러리를 준비하고, FFPE-RNA 샘플의 데이터를 분석하는 방법론을 설명합니다.

저하된 FFPE-RNA 시료의 시퀀싱 및 분석을 위한 최적화

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding ...

우리의 프로토콜은 FFPE 유래 RNA 샘플, 특히 최적이 아닌 품질 샘플에서 생성된 유전자 발현 데이터의 품질과 양을 개선하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 FFPE 조직 샘플 내의 RNA 품질을 평가하고 다운스트림 처리를 최적화하여 샘플 시퀀싱 데이터의 양과 품질을 향상시킬 수 있습니다. 이 방법은 생물학적 및 임상 샘플에서 성적증명서의 포괄적인 특성화를 허용하고 개발 및 질병에서 게놈의 기능적 요소에 대한 통찰력을 제공할 수 있다.샘플 QC, 라이브러리 준비 및 데이터 분석을 위한 방법의 FFPE-RNA 분해 및 선택은 모두 매우 까다로울 수 있다. 올바른 방법과 적절한 컨트롤을 선택할 때 세심한 주의를 기울여야 합니다. 시각적 데모를 사용하면 시청자가 계획, 평가 및 시퀀싱 프로세스, 특히 제대로 보존되지 않은 FFPE 샘플에 필요한 작은 미묘한 수정 및 예방 조치를 관찰할 수 있습니다.RNA 샘플의 품질을 확인하기 위해 제조업체의 지침에 따라 RNA QC 시스템에서 샘플을 실행하고 적절한 생체 분석 소프트웨어를 사용하여 샘플 내의 RNA 단편의 분포를 분석하고 100 및 200 뉴클레오티드보다 긴 단편의 비율을 계산한다. QC 메트릭에 기초하여, 100뉴클레오티드보다 더 긴 단편의 40% 미만으로 샘플을 식별하여 이러한 샘플을 처리에서 배제할 수 있도록 한다. 시퀀싱을 위해 실온 수조에서 실행 매개 변수에 따라 적절한 시퀀싱 시약 키트를 해동하고 해동 후 시약 트레이를 섭씨 4도로 놓습니다.유동 셀 패키지를 실온에 30분 간 놓습니다. 패키지가 온난화되는 동안 일루미나 실험 관리자 응용 프로그램을 열고 샘플 시트 만들기를 선택합니다. 사용할 시퀀서를 선택하고 다음을 클릭합니다.시약 키트 바코드 및 기타 적절한 워크플로 매개 변수를 입력합니다. 그런 다음 일루미나 시퀀스 기준에 따라 생성된 샘플 시트를 업로드합니다. 샘플 라이브러리 및 제어 라이브러리 PhiX를 준비하려면 라이브러리를 적절한 농도로 분해하고 희석하고 샘플 및 PhiX 제어 라이브러리를 혼합하여 5% PhiX 제어 부피 비율을 얻습니다.유동 세포가 준비되면 랩핑을 제거하고, 보풀이 없는 알코올 닦아로 유리 표면을 청소하고, 낮은 보풀 실험실 조직으로 유리를 건조시다. 시약 카트리지를 섭씨 4도에서 제거하고 카트리지를 5번 반전하여 시약을 혼합합니다. 벤치의 카트리지를 부드럽게 탭하여 기포를 줄이고 디네이처및 희석된 샘플을 지정된 저수지의 시약 카트리지에 적재합니다.유량 셀, 버퍼 카트리지 및 시약 카트리지를 시스템에 로드합니다. 그런 다음 자동 검사를 수행하고 출력을 검토하여 실행 매개 변수가 시스템 검사를 통과할 수 있도록 합니다. 자동 검사가 완료되면 시퀀싱 실행을 시작하도록 선택합니다.사전 처리 QC 및 정렬 후 QC 결과를 시각화하려면 멀티 QC를 실행하여 HTML 형식으로 집계된 보고서를 생성합니다. 배치 효과를 결정하고 지정된 데이터 집합의 품질 맵을 평가하기 위해 R 스크립트를 사용하여 주 구성 요소 분석을 실행합니다. 그런 다음 샘플 상관 관계 분석은 다른 샘플 간의 Pearson 상관 관계를 사용하여 수행될 수 있습니다.100개 이상의 뉴클레오티드 보다 긴 단편의 비율의 추정은 고분해된 RNA 시료에 대한 작은 단편 크기의 비율을 정확하게 측정하기 위해 더 민감하기 때문에 200뉴클레오티드보다 긴 단편의 추정보다 더 유용하다. 샘플 세트에서 높은 수준의 분해를 감안할 때, 총 RNA 라이브러리 준비 방법이 권장됩니다. 예를 들어, 여기에 네 가지 샘플에서 준비된 시퀀싱 라이브러리가 표시됩니다.여기서는 원시 FastQ 파일 시퀀싱 품질 및 샘플 어댑터 콘텐츠에 대한 개요가 표시됩니다. FastQC 스크리닝은 샘플 내의 세균 또는 마우스 오염과 같은 오염을 감지하는 데 도움이 될 수 있습니다. STAR 정렬은 참조 게놈에 매핑된 판독의 비율, 참조 게놈에 고유하게 매핑된 판독의 비율 및 매핑되지 않은 읽기의 비율 또는 여러 loci로 매핑된 읽기의 비율을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.카드 및 RSeQC 통계는 매핑된 판독값에 존재하는 메신저 RNA, 내성 및 상호 간 기지의 백분율을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 대표적인 분석에서 일부 저격된 라이브러리에는 5개의 프라임 엔드보다 더 많은 읽기가 3개의 프라임에 더 가깝게 매핑되는 세 가지 주요 편향이 있었습니다. 또한, 주 성분 분석은 각 시료의 생물학적 복제를 위해 주성분에 의해 포획된 총 변이의 백분율을 결정하기 위해 수행될 수 있다.샘플 분해를 방지하고, 각 샘플에 대한 복제 및 여러 코트를 준비하고, 적절한 메트릭을 사용하여 샘플 품질을 평가하고, 올바른 라이브러리 준비 방법을 사용하십시오. 이 방법론을 사용하여, 더 큰 NGS 연구는 다양한 저장 시간 및 조건에 이전에 사용할 수 없는 FFPE 견본으로 수행될 수 있습니다 다양한 질병 상태에 통찰력을 얻기 위하여. 이 기술은 연구원이 풍부한 임상 정보를 가진 FFPE 견본의 기존 큰 기록보관소를 연구하고 인구 기지를 둔 암 연구 결과를 크게 향상할 수 있는 쪽을 포장했습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

RNA 시퀀싱과 생물 정보학 분석은 마우스 EMLcells의 린-CD34 + 린-CD34- 부분 집단에서 유의 및 발현 된 전사 인자를 식별하는 데 사용되었다. 이들 전사 인자는 자기 갱신 린-CD34 +를 부분적으로 분화 된 린 - CD34- 세포 사이의 스위치를 결정하는데 중요한 역할을 할 수도있다.

RNA 시퀀싱 분석하여 EML 조혈 전구체 세포의자가 재생 (self-renewal)과 분화를 조절하는 중요한 요소의 식별

유전자 발현, 돌연변이 및 유전자 융합에 대해 선택된 전사체를 조사하기 위한 데이터 분석을 사용한 색인화된 cDNA 라이브러리 준비, 혼성화 및 캡처를 포함하는 표적 RNA 염기서열분석 기반 방법을 설명합니다. Targeted RNAseq를 사용하면 데스크톱 염기서열분석기에서 선택된 전사체를 비용 효율적이고 신속하게 평가할 수 있습니다.

RNA 시퀀싱 분석은 유전자 발현 및 게놈 변경을 특성화를 대상으로

이 프로토콜 칩 seq, 4sU-seq, seq-총 RNA, 리보솜 세포 선 및 1 차 셀에 대 한 프로 파일링의 조합 사용을 설명 합니다. 전사-요소 바인딩, 드 노 보 전사, RNA 가공, 회전율 및 시간이 지남에, 번역 활성화 및 급변 셀에서 이벤트의 전체 과정을 표시 하 고 변경 내용을 추적을 수 있습니다.

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

포 르 말린 고정 파라핀 끼워 넣어진 표본 인간의 질병의 분자 biomarkers의 귀중 한 소스를 나타냅니다. 여기 우리는 실험실 기반 cDNA 라이브러리 준비 프로토콜, 처음 신선한 냉동된 RNA로 설계 하 고 최적화 된 조직에서 보관 된 microRNAs 분석 저장 최대 35 년 제시.

회고전 예측에 관한 시퀀싱: 보완 DNA 도서관 준비 프로토콜 포 르 말린 고정 파라핀 포함 RNA 견본을 사용 하 여

이 프로토콜 여러 모델 생물에서 녹음의 품질을 모니터링 하는 새로운 도구와 연구를 제공 합니다.

진 핵 생물의 전사 오류의 게놈 넓은 감시

우리는 표준 방법 보다는 더 적은 편견을 가진 상세한 작은 RNA 라이브러리 배상 프로토콜 및 2'-O-메틸 RNA를 위한 증가한 감도를 제시합니다. 이 프로토콜은 비용을 절감하기 위해 수제 시약을 사용하거나 편의를 위해 키트를 사용하여 따를 수 있습니다.

작은 RNA-seq 개선: 2'-O-메틸 RNA의 더 적은 편견 및 더 나은 검출

치료 저항은 수시로 향상된 전립선암을 가진 환자에서 발전하고, 어떤 경우에는, 암은 신경 내분비 전립선암에게 불린 치명적인 특수형으로 점진합니다. 이 전이를 촉진하는 작은 비 코딩 RNA 매개 분자 변경을 평가하면 신경 내분비 전립선암의 발달로 이어지는 인과 메커니즘의 더 나은 질병 계층화 및 식별이 가능합니다.

거세 저항하는 전립선암 환자에게서 포르말린 고정 조직 및 혈청 유래 엑소좀에서 작은 비코딩 RNA를 시퀀싱

여기에서는 cDNA 중간체 없이 짧은 RNA(실행당 &lt;35nt)를 염기서열분석하는 직접 방법과 단일 염기 정밀도에서 단일 연구에서 다른 뉴클레오티드 변형을 염기서열분석하는 일반적인 방법으로 사용할 수 있는 LC-MS 기반 염기서열분석 방법에 대한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다.

2D-HELS MS 염기서열분석(2D-HELS MS SEQ): 뉴클레오티드 변형이 다른 RNA 혼합물의 직접 및 새로운 염기서열분석을 위한 일반적인 LC-MS 기반 방법

이 프로토콜은 돌연변이 프로파일링 실험을 위해 디메틸 설페이트로 RNA를 변형하기 위한 지침을 제공합니다. 여기에는 두 가지 대체 라이브러리 준비 방법을 사용한 시험관 내 및 생체 내 프로빙이 포함됩니다.

디메틸 설페이트를 사용한 RNA 구조 프로빙 시험관 내 및 세포에서 시퀀싱을 사용한 돌연변이 프로파일링

이 프로토콜은 생물정보학 경험이 제한된 습식 실험실 생물학자를 위한 RNA-seq 실험에 대한 초기 품질 관리를 허용합니다.

Rup(RNA-seq 사용성 평가 파이프라인) - 진핵생물의 대량 RNA-seq 실험을 위한 품질 관리

학습하세요 FFPE-RNA 시료의 시퀀싱 최적화 방법을 통해 저하된 RNA 품질을 개선하고 유전자 발현 데이터를 향상시키는 기술입니다. 이 프로토콜은 생물학 및 임상 샘플의 전사체 특성 분석에 필수적입니다.

저하된 FFPE-RNA 시료의 시퀀싱 및 분석을 위한 최적화

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