대형 정자 세포의 3D 공초점 분석을 위한 전산 Drosophila 고환의 면역 염색
August 27th, 2020
우리는 여기에 공초점 현미경 검사법에 적합하고 재현 가능하고 신뢰할 수있는 라벨을 허용 Drosophila 고환의 전체 마운트 준비 및 면역 스테인링을위한 향상된 프로토콜을 제시합니다. 우리는 대형 S4-S5 정자 세포에 대한 공동 지역화 실험의 3D 표현 및 정량화에 의해이 프로토콜을 설명합니다.
고환 샘플과 같은 초파리 조직의 전체 마운트 염색은 항체 침투가 제한되어 있기 때문에 종종 문제가 됩니다. NP40 및 헵탄을 사용하는 당사의 고정 프로토콜은 균일하고 재현 가능한 라벨링을 가능하게 합니다. 이 절차는 항체가 깊숙이 침투할 수 있도록 하면서 조직 형태를 유지함으로써 단독으로 또는 공동 국소화 연구에서 3차원으로 재현 가능하고 정량화할 수 있는 면역염색 획득을 용이하게 합니다.
이배체 생식 세포 평가의 경우, 박리 후 0-15시간 후에 이산화탄소에 잠시 노출되어 파리를 마취하고 파리를 플라이 패드로 옮깁니다. 패드를 10X 배율의 해부 현미경 아래에 놓고 집게를 사용하여 5-10마리의 수파리의 머리를 제거합니다. 목이 잘린 파리 시체를 검은색 배경 지지대의 실리콘 코팅된 유리 슬라이드에 있는 100마이크로리터의 Ringer's buffer로 옮기고 40X 배율과 숫자 5 집게를 사용하여 흉부와 복부 사이의 파리를 잡습니다.
그런 다음 복부를 흉부에서 떼어내고 고환과 인접 조직을 파리 사체에서 빠르게 분리한다. 모든 고환이 수집되면 남아 있는 조직의 샘플을 세척하고 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 절개된 고환 주변에서 과도한 버퍼를 제거합니다. 그런 다음 4%파라포름알데히드 한 방울을 고환에 떨어뜨리고 20%NP40과 헵탄이 보충된 갓 준비한 4%파라포름알데히드 용액 2밀리리터가 들어 있는 튜브로 조직을 빠르게 옮깁니다.
고환 샘플의 철저한 고정을 위해 튜브를 30초 동안 수직으로 흔든 후 실온의 회전식 믹서에서 고환을 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 튜브를 튜브 랙으로 옮기고 고환이 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 헵탄과 정착 용액을 모두 제거하고 PBS로 고환을 세 번 빠르게 헹굽니다.
마지막 세척 후 고환을 새 200 마이크로리터 튜브로 옮기고 10 마이크로리터 피펫 팁이 장착된 200 마이크로리터 피펫을 사용하여 여분의 버퍼를 제거합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 새 PBS-를 튜브에 넣고 고환을 얼음 위에 놓습니다. 고환 샘플의 항체 라벨링을 위해 PBS를 200마이크로리터의 0.3%PBS-T로 교체하여 실온에서 30분 동안 배양합니다.
투과화 후 0.3%PBS-T와 5%일반 염소 혈청으로 1시간 동안 비특이적 결합을 차단한 후 0.3%PBS-T와 5%일반 염소 혈청으로 희석한 1차 관심 항체 200마이크로리터를 첨가하여 섭씨 4도 또는 실온에서 하룻밤 배양합니다. 다음 날 아침, 새로운 0.3%PBS-T로 15분 동안 3회 세척하고 세척당 실온에서 흔들어 샘플을 세척하고 고환이 중력에 의해 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 적절한 2차 항체 200마이크로리터를 튜브에 추가하여 빛을 차단한 실온에서 흔들면서 4시간 동안 배양한 후 세척당 0.3%PBS-T의 신선한 샘플로 샘플을 세척합니다.
0.3%PBS-T 세척 후 로커에서 0.2%PBS-T에서 한 번, 0.1%PBS-T에서 한 번 세척한 후 PBS에서만 마지막 30분 세척을 합니다. PBS 세척 후 빛으로부터 보호된 실온에서 15분 동안 PBS에 180마이크로리터의 1마이크로리터 DAPI 용액을 넣은 다음 세척당 새 PBS에서 5분 세척 3회 라벨을 붙입니다. 마지막 세척 후 소수성 배리어 펜을 사용하여 깨끗한 슬라이드에 원을 그리고 0.1%PBS-T 프라이밍 피펫 팁을 사용하여 고환을 슬라이드로 옮깁니다.
초과 PBS를 흡입하고 100마이크로리터의 Citifluor AF1을 추가합니다. 기포가 갇히지 않도록 주의하면서 조직 위에 유리 커버 슬립을 부드럽게 놓고 투명 매니큐어를 사용하여 커버 슬립을 슬라이드에 밀봉한 후 컨포칼 형광 현미경으로 슬라이드를 관찰합니다. 샘플의 컨포칼 이미지를 획득한 후 이미지를 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램으로 가져옵니다.
그런 다음 수동 분할을 사용하여 각 세포 내의 핵을 정의하고 두 형광단 사이의 전체 부피 내에서 Pearson의 상관 계수를 결정합니다. 이 프로토콜을 사용하면 3D 재구성을 위해 처리하기에 충분한 품질의 컨포칼 이미지를 획득할 수 있습니다. 예를 들어, S5 정세포의 인접한 4개 연속 절편에서 핵막에서 낮은 수준의 Mad1이 관찰되고 핵 내 DAPI 염색과 함께 높은 수준의 Mad1 축적을 시각화할 수 있습니다.
이 3D 재구성 이미지에서는 핵 표면에서 Mad1의 낮은 수준의 존재와 핵 내 Mad1의 높은 수준의 축적을 DNA와 함께 관찰할 수 있습니다. 이러한 3D 재구성에서 Nucleoporin 62 및 Mad1 또는 Importin-beta 및 DAPI로 염색된 큰 S5 정세포를 관찰할 수 있습니다. 두 재구성 모두에서 핵공(nuclear pore)과 관련된 성분들은 불규칙한 크기의 점들로서 핵 테두리에 불균일하게 분포되어 있는 것으로 보인다.
이 프로토콜은 세포의 3D 부피를 보존하는 동시에 관심 항체가 모든 세포의 깊이까지 균일하게 침투할 수 있도록 하여 공동 국소화(colocalization)와 같은 정량적 분석을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 독립적인 고환의 공동 국소화를 신뢰할 수 있게 측정할 수 있기 때문에 다른 파리 유전자형의 염색을 비교하는 데에도 사용할 수 있습니다. 사용되는 NP40의 양은 충분한 투과성을 위해 매우 중요합니다.
절차를 면밀히 따른다면 재현 가능한 라벨링과 3D 핵 구조 보존을 달성할 수 있습니다. 초파리 내 조직의 전체 마운트 염색은 까다로울 수 있지만 이 프로토콜은 다른 샘플에 쉽게 적용할 수 있습니다.
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개요
이 연구는 드로소필라 정소의 전체 마운트 준비 및 면역염색을 위한 개선된 프로토콜을 제시하며, 이는 항체 침투를 개선하고 콘포컬 현미경에 대한 신뢰할 수 있는 라벨링을 보장하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜의 성공적인 적용은 큰 S4-S5 정자모세포에 대한 공공간 실험의 3D 표현 및 정량화를 통해 입증됩니다.
주요 연구 구성 요소
연구 분야
- 세포 생물학
- 현미경 및 이미징
- 발달 생물학
배경
- 드로소필라 조직의 전체 마운트 염색은 항체 침투가 불량하기 때문에 어려울 수 있습니다.
- 효과적인 고정 방법은 조직 형태를 보존하고 염색을 향상시키는 데 필수적입니다.
- 높은 품질의 콘포컬 이미징을 얻으려면 깊은 항체 침투가 중요합니다.
사용된 방법
- NP40와 헵탄을 사용한 전체 마운트 면역염색 프로토콜
- 생물학적 모델로서의 Drosophila melanogaster
- 이미징을 위한 콘포컬 형광 현미경
주요 결과
- 이 프로토콜은 정소의 재현 가능하고 정량화 가능한 면역염색을 달성했습니다.
- 3D 재구성은 DNA와 관련하여 Mad1과 같은 단백질의 뚜렷한 분포를 보여주었습니다.
- 다른 파리 유전자형 간의 공공간 분석이 성공적으로 수행되었습니다.
결론
- 최적화된 프로토콜은 항체 침투를 향상시키고 세포 구성 요소의 정확한 정량화를 가능하게 합니다.
- 이 연구는 드로소필라를 포함한 생물학적 연구에 귀중한 기술을 기여하고 다른 샘플에 적용될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a key challenge in biological imaging: achieving uniform antibody penetration in whole-mount tissues for reliable 3D confocal analysis. By enabling reproducible, quantitative immunostaining in large Drosophila spermatocytes, it supports mechanistic de-risking in target validation and phenotypic screening workflows. The method enhances predictive confidence in subcellular protein localization studies, which is critical for early discovery and assay development in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise 3D visualization of nuclear architecture and protein localization.
- Operational Value: Provides reproducible labeling across genotypes, supporting consistent target validation assays.
- Predictive Value: Facilitates quantitative colocalization measurements that improve confidence in mechanistic interpretations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantifiable fluorescence readouts suitable for assay standardization.
- Operational Value: Supports scalable preparation of validated biological systems for downstream compound screening.
- Assay Readiness: Produces reliable 3D imaging outputs that enable reliable evaluation of molecular probes or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains 3D tissue integrity, enabling correlation of molecular phenotypes with cellular morphology.
- Mechanistic De-risking: Allows comparison of protein distribution patterns across genotypes to assess functional relevance.
- Preclinical Model Support: Provides a disease-relevant system for studying nuclear architecture and meiosis-related pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by supporting hypothesis testing in early biology, enabling quantitative imaging for assay development, and providing translational readouts for preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via 3D nuclear structure analysis.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible, quantitative fluorescence measurements.
- Analytics: Delivers Pearson’s correlation coefficients and colocalization metrics for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through genotype-based staining comparisons.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable across multiple targets and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in protein localization studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of whole-mount immunostaining workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on reliable subcellular imaging data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila dissection, immunofluorescence, and confocal microscopy.
- Depends on access to confocal microscopes and image analysis software for 3D reconstruction.
- Necessitates standardization of fixation conditions (NP40/heptane ratios) across laboratories.
- Involves adaptation considerations for different tissue types or model systems beyond Drosophila testes.
- Includes practical limitations related to antibody penetration depth in larger or more complex tissues.
