Name: 대형 정자 세포의 3D 공초점 분석을 위한 전산 Drosophila 고환의 면역 염색 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 배우세요 Drosophila 고환 전체 마운트 면역 염색법으로 NP40과 헵탄을 활용한 고정 기법을 통해 항체 침투를 개선하고 공초점 현미경에서 3D 재구성 및 공역화 정량 분석을 수행하는 방법을 익히세요.

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우리는 P. Verrijzer, J. 요한센 H., 항체에 대한 오쿠라와 A. Debec, 블루밍턴과 비엔나 주식 센터에 파리에 감사드립니다. 제안과 자극 토론에 대한 C. 잭슨 감사합니다.

1. 드로소필라 고환 컬렉션
참고: 젊은 남성 (0-15 h 포스트 백과) diploid 세균 세포를 검사하는 데 필요합니다 (즉, 정자 고니아 및 정자 세포).
<ol><li>정자 개발에서 간섭을 최소화하기 위해 가능한 한 많이 젊은 파리를 선택합니다.</li>
	<li>이산화탄소에 잠깐 노출되어 파리를 마취하고 플라이 패드14,15로옮김한다.</li>
	<li>해부 현미경 (10 배율)에서, 머리를 제거하기 위해 집게를 사용합니다.</li>
	<li>5~10개의 참수된 파리를 링거의 완충제(183m MM KCI, 47m NaCl, 10mM Tris-HCI, 1mM EDTA, 완전한 단백질 억제제, pH 6.8)로 이동하여 검은 배경 지지대에서 실리콘 코팅 유리 슬라이드를 장착한다.</li>
	<li>40배율에서 해부현미경으로, 흉부와 복부 사이를 날아다니는 5번 집게 1쌍을 사용하고, 다른 집게와 함께 흉부에서 복부를 끌어당깁니다. 고환과 인접한 조직을 플라이시체(15)에서 빠르게 격리하고 링거의 버퍼를 같은 슬라이드에 새로 한 방울 로 떨어뜨립니다.</li>
	<li>모든 고환이 준비되면 나머지 조직 (액세서리 선 및 외부 생식기)에서 고환을 청소하십시오.</li>
	<li>해부된 고환을 포함하는 낙하에서 초과 버퍼를 제거합니다. 일반적으로 200 μL 팁 위에 10 μL 팁이 장착된 p200 파이펫을 사용하십시오. 이렇게 하면 작은 조리개를 통해 액체 과잉을 제거할 수 있습니다. 해부 된 고환을 포함하는 드롭 위에 4 %의 파라 포름알데히드 고정을 한 다음 고환을 신선한 고정 솔루션을 포함하는 튜브로 신속하게 전송합니다.</li>
</ol>2. 파라포름알데히드 고정
<ol><li>사용하기 직전에 2mL의 고정 용액을 준비하십시오: NP40 20%의 30 μL과 2m 실리콘 마이크로센트리슈지 튜브에 1200 μL의 30μL을 가진 인산염 완충식식염(PBS)에서 희석된 4% 파라포름알데히드의 600 μL. 600 μL 알리쿼트에 제조및 -20 °C에 저장 PBS에서 4 %의 파라 포름 알데히드를 사용합니다. 주의: 헵탄과 파라포름알데히드는 독성이 있으며 연기 후드로 처리해야 합니다. 호스트 연구소의 규정에 따라 처분하십시오.</li>
	<li>PFA/NP40/heptane 용액에 넓은 조리개 팁이 있는 p200 마이크로파이펫을 사용하여 고환을 전송합니다. 튜브를 30s의 위아래로 흔들어 줍니다. 실온에서 로터리 믹서에 고환을 30분 동안 계속 고정하십시오.</li>
	<li>로터리 믹서를 중지하고 튜브랙에 튜브를 배치하여 위상 분리를 허용하고 고환이 튜브의 바닥에 정착할 수 있도록 합니다.</li>
	<li>모든 heptane 및 고정 솔루션을 제거하고 1x PBS로 고환을 세 번 빠르게 헹구습니다.</li>
	<li>깨끗한 200 μL 개별 튜브로 옮김합니다. 이 작은 관에 있는 모든 잠복기를 수행하여 채택된 항체의 양을 최소화하십시오.</li>
	<li>P200과 P10 팁이 모두 부착된 200 μL 마이크로파이프를 사용하여 초과 버퍼를 제거합니다. 고환을 흡인하지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>모든 샘플이 준비될 때까지 고환을 얼음 위에 1배 PBS로 보관하십시오.</li>
</ol>3. 용액에 항체 염색
<ol><li>PBS를 폐기하고 세포막을 투과화하기 위해 실온에서 30 분 동안 0.3 % PBS-T로 고환을 둡니다.</li>
	<li>동일한 버퍼에 사전 배양하고 1h의 일반 염소 혈청(NGS)을 5% 더한 값입니다.</li>
	<li>0.3% PBS-T 플러스 5% NGS(재료표)로 희석된 1차 항체의 200 μL을추가합니다.</li>
	<li>로커에 부드러운 동요와 함께 4 °C (또는 실온)에서 하룻밤 기본 항체를 배양.</li>
	<li>실온에서 로커에서 15 분 동안 0.3 % PBS-T에서 3 번 세척하십시오. 고환이 중력에 의해 튜브의 바닥에 정착할 수 있도록 합니다.</li>
	<li>DyLight 공액 계열에서 희석된 이차 항체 의 200 μL을 1:500로 추가합니다.</li>
	<li>실온에서 4 시간 동안 어두운 챔버에서 이차 항체를 배양하십시오.</li>
	<li>실온에서 로커에서 0.3% PBS-T로 15분 간 세척합니다. 그런 다음 0.2 % PBS-T와 0.1 % PBS-T로 반복되며 실온에서 로커에서 30 분 동안 매번 반복하십시오. 세제를 제거하기 위해 30 분 동안 1 x PBS에서 마지막 세척을하십시오.</li>
	<li>1x PBS에 1μg/mL에 180 μL의 DAPI 용액을 15분 간 추가합니다. 주식 용액은 H2O. PBS에서 재고 용액을 만들지 않도록 10 mg / mL이며, 이는 더 큰 정자 세포에서 확산 크로 마틴에 DAPI 염색 신호를 줄일 수 있습니다.</li>
	<li>각각 3배씩 5분 동안 씻으시다.</li>
	<li>소수성 장벽 펜을 사용하여 깨끗한 슬라이드에 원을 그립니다.</li>
	<li>흡습 고환을 넣고 슬라이드에 넣습니다. 0.1% PBS-T로 넓은 조리개 팁을 미리 헹구면 고환이 팁에 달라붙지 않도록 합니다. 초과 PBS를 제거합니다.</li>
	<li>Citifluor AF1의 드롭(약 100 μL)을 추가합니다.</li>
	<li>유리 덮개 를 조직 위에 부드럽게 놓고 기포를 포획하지 않도록주의하십시오.</li>
	<li>투명 매니큐어를 사용하여 커버슬립을 슬라이드에 밀봉합니다.</li>
	<li>현미경에 슬라이드를 관찰.</li>
</ol>4. 지역화 분석
<ol><li>공초점 이미지를 수집합니다. 우리는 0.5 또는 1 μm의 z 해상도와 자이스 LSM 710 공초점 현미경 (63x 계획 아포크로틱 오일)을 사용했다.</li>
	<li>독립적 인 고환에서 다른 세포를 선택합니다.</li>
	<li>이미지를 프로세싱 소프트웨어(예: Imaris)로 가져옵니다.</li>
	<li>인접한 핵을 배제하기 위해 수동 세분화에 의해 핵을 정의한다. Coloc 소프트웨어를 사용합니다. 2형형형량 사이의 전체 부피 내에서 Pearson의 상관계수(PcC)를 수집합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic%2C+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+assembly+in+Drosophila+neuroblasts+and+ganglion+mother+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).</li>
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</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 프로토콜은 전체 마운트 성인 Drosophila 고환의 성공적인 면역 라벨링을위한 방법을 제공합니다. 그밖 절차에서 보고된 바와 같이 젊은 남성은 정자를 방해하는 리스크가 있는 발달 정액의 존재를 극소화하기 위하여 (우리는 심지어 백과기 후에 20 시간 미만으로 나이를 단축했습니다) 이용되어야 합니다. 해부는 신속해야 하며 항체 희석은 신호 대 잡음비(21,22,23)를최적화하기 위해 조정되어야 한다. 다른 프로토콜을 사용했기 때문에, 우리는 고환의 깊이에 걸쳐 염색을 관찰하지 않았기 때문에, 우리는 NP40 및 heptane와 함께 PFA를 결합하는 고정 방법을 개발했습니다. 우리는 현재 PBS에서 600 μL의 4% 파라포름알데히드를 일상적으로 사용하고 있으며, 30μL의 20% NP40과 2권의 헵탄을 사용합니다. 이는 충분한 투과성화를 허용하는 데 매우...

드로소필라 고환은 핵 건축 연구를 위한 귀중한 모델입니다. 미토틱 정자 세포에서 핵 부피는 주로 크로마틴에 의해 점유됩니다. 이 세포는 16개의 1차 정자세포의 낭종을 생성하는 분열의 4라운드를 겪습니다. 다음 며칠 동안, 정자 세포는 6 개의 발달 단계 (S1-S6)를 통과하며, 부피가 크게 증가하여 20 배1,2. 그들은 또한 그들의 핵 형태를 변경. 라빈 Dm0에 의해 드러난 핵의 윤곽은 불규칙해지고 깊은 질1,3을나타낸다. 이는 크로마틴 조직1,4,5,6,7에서광범위한 유전자 발현 변화 및수정을 수반한다. 단계 간 염색체는 단계 S4-S5에서 잘 정의되어 있으며, 2개의 주요 이중성 자가솜과 뉴클레오투스로 도킹된 X-Y 쌍에 대응하는 3개의 뚜렷한 질량을 형성한다.
Mad1은 원래 미토틱 체크포인트의 핵심 성분으로격리되었습니다(8에서검토됨). 상간에서, 핵봉투에 주로 위치하는 것으로 설명되고 핵9,10,11에있다. 드로소필라 고환에서, 우리는 Mad1이 핵에 두드러진 것을 보고했습니다, 밀접하게 두 개의 주요 염색체 염색체질량과 연결되고 XY 크로마틴과 더 적은 정도에. 우리는 이 크로마틴 관련 구조를 민트(Mad1 함유 핵 영토)12로정의하였다. 네 가지 다른 단백질은 정자 세포에서 MINTs와 연관되었다: 뉴클레오포린 Mtor/Tpr, SUMO 펩티다아제 Ulp1, 미토틱 체크포인트 단백질 Mad2 및 폴리콤 과 같은 복합 Raf212의서브유닛.
MINTs의 설명을 완료하기 위하여는, 우리는 항체를 이용해야 하고 일반적으로 고환에 있는 면역 염색과 가진 기술적인 문제에 직면했습니다: 고환의 깊이에 얼룩의 중요한 비 균일성의 결과로, 특히 큰 정자 세포에. Squashed 준비는 항체 접근을 증가시켰지만 압축 된 이미지로 이어졌고, 3D 분석을 제한하고, 공동화를 포함한정량형 형광의 측정을 방지했다. 항체 침투의 문제는 또한 0.3% Na deoxycholate13과같은 permeabilizing 에이전트에 의해 해결될 수 있었습니다, 그러나 이 절차는 우리의 손에 재현가능한 결과를 산출하지 않았습니다. 우리는 많은 공동 라벨 링 실험을 수행했기 때문에, 우리는 permeabilization 프로토콜을 개선하기 위해 보았다. 1% NP40 플러스 헵탄의 조합은 특히 큰 정자 세포를 연구하는 데 더 많은 재현성을 초래했습니다.
이 프로토콜은 서스펜션에서 고환의 고정 및 면역 스테인링을 수행하여 샘플 품질을 개선하고 재현성을 향상시키고 공초점 현미경 검사에 적합합니다. 우리는 큰 정자 세포의 핵 폐색 구조와 특정 핵 봉투 단백질의 공간 관계를 더 잘 정의하기 위해 프로토콜을 사용했습니다. 이 방법은 예를 들어 크로마틴, 핵염 및 핵 모공을 포함한 핵의 동적 구조적 변화와 정자 세포 발달을 수반하는 변화에 대한 더 나은 조사를 허용할 것이다.

<table><tbody><tr><td>Drosophila srains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO</td><td></td><td></td><td>Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)</td></tr><tr><td>Mad1-GFP</td><td></td><td></td><td>J Cell Sci. 2011년 5월 15일; 124(10편):1664-71.</td></tr><tr><td>엠토르 RNAi&nbsp;</td><td>VDRC</td><td>ID 110218</td><td>Vienna Drosophila RNAi Center</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>D1306</td><td>스톡 용액은 H2O</td></tr><tr><td>Dumont # 5 Fine Forseps에서 준비해야 합니다&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MBP 와이드 보어 피펫 팁</td><td>Fisherbrand</td><td>11917744</td><td>와이드 조리개 팁</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; 0.2 mL 개별 튜브</td><td>Thermo</td><td>AB-0620</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 마이크로 원심분리 튜브&nbsp;</td><td>시그마</td><td>T3531-200EA&nbsp;</td><td>실리콘화 2ml 튜브</td></tr><tr><td>Citifluor AF1</td><td>Citifluor</td><td>AF1</td><td></td></tr><tr><td>Dakopen&nbsp;</td><td>시그마</td><td>Z377821-1EA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>일반 염소 세럼 (NGS)</td><td>Sigma</td><td>NS02L-1ML</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 4%</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G&nbsp;</td><td>파라포름알데히드(4%)는 PBS 1X에 용해됨&nbsp;; 600ml의 분취량&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Thermo</td><td>14190094</td><td>DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘</td></tr><tr><td>없음 0.1% (0.2 또는 0.3%) PBS-T&nbsp;</td><td></td><td></td><td>PBS 1X&nbsp; 0.1% (0.2% 또는 0.3%) Triton X-100 Triton</td></tr><tr><td>X-100 함유, 분자생물학용,&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP 부스터</td><td>Chromotek</td><td>gba488</td><td>1/200</td></tr><tr><td>마우스 anti-Mtor</td><td></td><td></td><td>1/40 선물 J. Johansen, Iowa State University</td></tr><tr><td>Rat anti-Nup62</td><td></td><td></td><td>1/200 선물 H. Ohkura (University of Edinburgh, UK</td></tr><tr><td>Guinea-pig anti-Ulp1</td><td></td><td></td><td>C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Raf2</td><td></td><td></td>로부터의 <td>1/200 선물 C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam</td></tr><tr><td>DyLight conjugated series&nbsp;</td><td>Thermo</td><td></td><td>1/500 당나귀 항-(기니피그, 마우스,&nbsp; 토끼 또는 쥐) 두 번째 항체</td></tr></tbody></table>

대형 정자 세포의 3d 공초점 분석을 위한 전산 drosophila 고환의 면역 염색

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Drosophila 고환은 줄기 세포 생물학을 포함하여 생물학 프로세스를 공부하기 위한 강력한 모형 시스템, 핵 건축, meiosis 및 정액 발달. 그러나, 전체 Drosophila 고환의 면역 라벨링은 항체 침투로 인한 염색의 중요한 비 균일성과 수시로 연관된다. 분석의 3D 품질을 감소하기 때문에 분쇄 된 준비는 부분적으로 문제를 부분적으로 극복합니다. 본 명세서에서는 액체 매체의 면역 라벨링과 함께 고정 시 NP40 및 heptane을 사용하여 전체 마운트 프로토콜을 설명합니다. 그것은 재현 가능하고 신뢰할 수있는 라벨과 함께 공초점 현미경 검사법에 적합한 볼륨을 보존합니다. 우리는 공초점 섹션에서 정자 세포 핵의 3D 재구성의 다른 예를 보여줍니다. 장 내 및 고환 간 재현성은 상이한 유전자형으로부터 단일 세포 간의 형광의 3D 정량화 및 비교를 허용합니다. 우리는 핵 내 MINT 구조 (Mad1 함유 인트라 핵 영토)의 다른 구성 요소뿐만 아니라 핵 모공 복합체와 관련된 두 가지 구성 요소를 사용하여 이 프로토콜과 시험의 가장 큰 세포인 S4-S5 정자 세포에 대한 응용 프로그램을 설명했습니다.

Drosophila 고환의 적당한 얼룩을 얻기에 있는 주요 장애물은 항체의 제한된 침투성입니다, 이는 부분적으로 분쇄된 준비를 사용하여 서 그러나 3D 분석의 제한을 유도하는 대가로 (예를 들면 3D 표현 또는 공동화의 측정)를 유도해서 부분적으로 해결되었습니다. 절차는 균일 한 라벨을 허용하고 고환의 모든 세포의 볼륨을 보존. 여기에서 우리는 S4-S5 정자 세포의 3D 표현에 방법의 그림을 집중했습니다, 그(것)들은 가장 큰 세포이고 따라서 스쿼시에서 변형에 더 민감하기 때문에. 우리는 미토성 단백질 Mad112에의해 기술된 핵조폐 도메인(Mad1-함유 인트라 핵 영토)의 표지를 포함하여 다른 핵 마커를 사용했다. MINTs는 여러 가지 다른 항체에 의해 드러나기 때문에, 우리는 정량적 3D 지역화를 위한 프로토콜의 견고성을 시험하기 위하여 그것을 이용했습니다, 정확한 공간 해상도를 필요로 하는 방법.
위에서 설명한 프로토콜은 3D ...

우리는 여기에 공초점 현미경 검사법에 적합하고 재현 가능하고 신뢰할 수있는 라벨을 허용 Drosophila 고환의 전체 마운트 준비 및 면역 스테인링을위한 향상된 프로토콜을 제시합니다. 우리는 대형 S4-S5 정자 세포에 대한 공동 지역화 실험의 3D 표현 및 정량화에 의해이 프로토콜을 설명합니다.

대형 정자 세포의 3D 공초점 분석을 위한 전산 Drosophila 고환의 면역 염색

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

고환 샘플과 같은 초파리 조직의 전체 마운트 염색은 항체 침투가 제한되어 있기 때문에 종종 문제가 됩니다. NP40 및 헵탄을 사용하는 당사의 고정 프로토콜은 균일하고 재현 가능한 라벨링을 가능하게 합니다. 이 절차는 항체가 깊숙이 침투할 수 있도록 하면서 조직 형태를 유지함으로써 단독으로 또는 공동 국소화 연구에서 3차원으로 재현 가능하고 정량화할 수 있는 면역염색 획득을 용이하게 합니다.이배체 생식 세포 평가의 경우, 박리 후 0-15시간 후에 이산화탄소에 잠시 노출되어 파리를 마취하고 파리를 플라이 패드로 옮깁니다. 패드를 10X 배율의 해부 현미경 아래에 놓고 집게를 사용하여 5-10마리의 수파리의 머리를 제거합니다. 목이 잘린 파리 시체를 검은색 배경 지지대의 실리콘 코팅된 유리 슬라이드에 있는 100마이크로리터의 Ringer's buffer로 옮기고 40X 배율과 숫자 5 집게를 사용하여 흉부와 복부 사이의 파리를 잡습니다.그런 다음 복부를 흉부에서 떼어내고 고환과 인접 조직을 파리 사체에서 빠르게 분리한다. 모든 고환이 수집되면 남아 있는 조직의 샘플을 세척하고 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 절개된 고환 주변에서 과도한 버퍼를 제거합니다. 그런 다음 4%파라포름알데히드 한 방울을 고환에 떨어뜨리고 20%NP40과 헵탄이 보충된 갓 준비한 4%파라포름알데히드 용액 2밀리리터가 들어 있는 튜브로 조직을 빠르게 옮깁니다.고환 샘플의 철저한 고정을 위해 튜브를 30초 동안 수직으로 흔든 후 실온의 회전식 믹서에서 고환을 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 튜브를 튜브 랙으로 옮기고 고환이 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 헵탄과 정착 용액을 모두 제거하고 PBS로 고환을 세 번 빠르게 헹굽니다.마지막 세척 후 고환을 새 200 마이크로리터 튜브로 옮기고 10 마이크로리터 피펫 팁이 장착된 200 마이크로리터 피펫을 사용하여 여분의 버퍼를 제거합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 새 PBS-를 튜브에 넣고 고환을 얼음 위에 놓습니다. 고환 샘플의 항체 라벨링을 위해 PBS를 200마이크로리터의 0.3%PBS-T로 교체하여 실온에서 30분 동안 배양합니다.투과화 후 0.3%PBS-T와 5%일반 염소 혈청으로 1시간 동안 비특이적 결합을 차단한 후 0.3%PBS-T와 5%일반 염소 혈청으로 희석한 1차 관심 항체 200마이크로리터를 첨가하여 섭씨 4도 또는 실온에서 하룻밤 배양합니다. 다음 날 아침, 새로운 0.3%PBS-T로 15분 동안 3회 세척하고 세척당 실온에서 흔들어 샘플을 세척하고 고환이 중력에 의해 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 적절한 2차 항체 200마이크로리터를 튜브에 추가하여 빛을 차단한 실온에서 흔들면서 4시간 동안 배양한 후 세척당 0.3%PBS-T의 신선한 샘플로 샘플을 세척합니다.0.3%PBS-T 세척 후 로커에서 0.2%PBS-T에서 한 번, 0.1%PBS-T에서 한 번 세척한 후 PBS에서만 마지막 30분 세척을 합니다. PBS 세척 후 빛으로부터 보호된 실온에서 15분 동안 PBS에 180마이크로리터의 1마이크로리터 DAPI 용액을 넣은 다음 세척당 새 PBS에서 5분 세척 3회 라벨을 붙입니다. 마지막 세척 후 소수성 배리어 펜을 사용하여 깨끗한 슬라이드에 원을 그리고 0.1%PBS-T 프라이밍 피펫 팁을 사용하여 고환을 슬라이드로 옮깁니다.초과 PBS를 흡입하고 100마이크로리터의 Citifluor AF1을 추가합니다. 기포가 갇히지 않도록 주의하면서 조직 위에 유리 커버 슬립을 부드럽게 놓고 투명 매니큐어를 사용하여 커버 슬립을 슬라이드에 밀봉한 후 컨포칼 형광 현미경으로 슬라이드를 관찰합니다. 샘플의 컨포칼 이미지를 획득한 후 이미지를 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램으로 가져옵니다.그런 다음 수동 분할을 사용하여 각 세포 내의 핵을 정의하고 두 형광단 사이의 전체 부피 내에서 Pearson의 상관 계수를 결정합니다. 이 프로토콜을 사용하면 3D 재구성을 위해 처리하기에 충분한 품질의 컨포칼 이미지를 획득할 수 있습니다. 예를 들어, S5 정세포의 인접한 4개 연속 절편에서 핵막에서 낮은 수준의 Mad1이 관찰되고 핵 내 DAPI 염색과 함께 높은 수준의 Mad1 축적을 시각화할 수 있습니다.이 3D 재구성 이미지에서는 핵 표면에서 Mad1의 낮은 수준의 존재와 핵 내 Mad1의 높은 수준의 축적을 DNA와 함께 관찰할 수 있습니다. 이러한 3D 재구성에서 Nucleoporin 62 및 Mad1 또는 Importin-beta 및 DAPI로 염색된 큰 S5 정세포를 관찰할 수 있습니다. 두 재구성 모두에서 핵공(nuclear pore)과 관련된 성분들은 불규칙한 크기의 점들로서 핵 테두리에 불균일하게 분포되어 있는 것으로 보인다.이 프로토콜은 세포의 3D 부피를 보존하는 동시에 관심 항체가 모든 세포의 깊이까지 균일하게 침투할 수 있도록 하여 공동 국소화(colocalization)와 같은 정량적 분석을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 독립적인 고환의 공동 국소화를 신뢰할 수 있게 측정할 수 있기 때문에 다른 파리 유전자형의 염색을 비교하는 데에도 사용할 수 있습니다. 사용되는 NP40의 양은 충분한 투과성을 위해 매우 중요합니다.절차를 면밀히 따른다면 재현 가능한 라벨링과 3D 핵 구조 보존을 달성할 수 있습니다. 초파리 내 조직의 전체 마운트 염색은 까다로울 수 있지만 이 프로토콜은 다른 샘플에 쉽게 적용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

틈새와 줄기 세포를 개발하는 동안 양식 얼마나 실용적인 의미가있는 중요한 질문이다.

해부 그리고 스테 이닝 Drosophila 애벌레 난소

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면역염색은 조직 내의 특정 세포 유형과 단백질을 시각화하는 효과적인 기술입니다. 초음파 처리를 활용함으로써, 여기에 설명된 프로토콜은 면역 염색 전에 후기 단계의 배아와 유충에서 Drosophila melanogaster 조직을 해부해야 할 필요성을 완화합니다. 우리는 포름알데히드가 고정된 전체 산 유충의 면역 염색을 위한 효율적인 방법론을 제공합니다.

늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색<em&gt; 초파리</em&gt; 조직<em&gt; 제자리에서</em

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해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

이 프로토콜의 목표는 Drosophila meiotocytes를 사용하여 살아있는 고정 세포 현미경 검사법에 의해 손상되지 않은 조직에서 세포 분열을 분석하는 것입니다. 이 프로토콜은 Drosophila 유충과 초기 번데기에서 전체, 손상되지 않은 고환을 분리하는 방법과 현미경 검사를 위해 처리하고 장착하는 방법을 보여줍니다.

살아있는, 그대로 조직에서 세포 분열의 분석을 위한 초파리 애벌레와 Pupal 고환의 준비

마이크로컴퓨터 단층 촬영을 사용하여 개발 단계에서 온전한 드로소필라 멜라노가스터를 시각화할 수 있는 프로토콜이 제시된다.

마이크로 컴퓨팅 단층 촬영을 사용하여 드로소필라 멜라노가스터의 전체 동물 이미징

여기에 제출된 것은 손상되지 않은 조직에서 초해상도 라이브 세포 이미징을 위한 프로토콜입니다. 우리는 그것의 네이티브 조직 환경에 있는 높게 민감한 성인 줄기 세포 인구를 화상 진찰을 위한 조건을 표준화했습니다. 이 기술은 살아있는 조직에서 생물학적 현상의 직접적인 관찰을 허용하는 시간적 및 공간 해상도의 균형을 포함한다.

세포 전 형 구조의 슈퍼 해상도 라이브 세포 이미징

이 프로토콜은 드로소필라 폴리텐 세포에서 이종로크로마틴 골재를 시각화하는 것을 목표로 한다.

드로소필라 살리바리 땀샘의 이종로크로마티닌 관련 단백질의 시각화를 위한 면역형성 염색

이 프로토콜들은 대조군과 돌연변이 초파리 배아 상피에서 주름 격격 접합부의 조직 및 폐쇄 기능을 어떻게 특성화할 수 있는지 개괄합니다.

초파리 배아 상피에서 코어 주름 부분 격지 접합 단백질을 규명하기 위한 면역염색 및 염료 침투 실험

배우세요 Drosophila 고환 전체 마운트 면역 염색법으로 NP40과 헵탄을 활용한 고정 기법을 통해 항체 침투를 개선하고 공초점 현미경에서 3D 재구성 및 공역화 정량 분석을 수행하는 방법을 익히세요.

대형 정자 세포의 3D 공초점 분석을 위한 전산 Drosophila 고환의 면역 염색

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