Name: 감자에서 감자 바이러스 X 기반 마이크로RNA 침묵 (VbMS) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: 배우세요 감자 바이러스 X 기반 마이크로RNA 침묵(VbMS) 기법으로 감자에서 내인성 microRNA의 기능을 신속하고 효율적으로 분석하는 방법입니다. 안정적 형질전환 없이 miRNA 기능 연구가 가능합니다.

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우리는 PVX-LIC 벡터를 제공한 칭화 대학의 율류 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 텍사스 A&M 농업 연구및 미국 농무부(USDA) 국립 식품 농업 연구소에서 JS에 이르기까지 해치 프로젝트 TEX0-1-9675의 스타트업 펀드에 의해 지원되었습니다.

1. 감자 식물을 성장.
<ol><li>무라시게와 스쿠그(MS) 미디어와 감보르그 비타민(MS 기저염 혼합물, 감보리의 비타민, 30g/L 수당, 3.5g/L agar, pH = 5.7)을 함유한 배양 튜브(25 x 150mm)에 체외 감자 식물을 전파합니다. 20-22°C, 16h 라이트/8h 다크 포토기간, 빛 강도 120 μmol/m2∙s1 아래 성장실에 튜브를 놓습니다. 참고 : 새로운 싹과 뿌리는 일반적으로 식물에서 1-2 주에 개발됩니다. 매달 신선한 MS/감보르그의 비타민 미디어를 통해 식물을 전파합니다.</li>
	<li>4주 후, 체외 식물을 토양으로 이식하고 20-22°C, 16h 빛/8h 어두운 광기간, 빛 강도 120 μmol/m2∙s1 아래 온실에서 자랍니다. 참고: 새로 발달된 뿌리와 잎이 있는 식물은 이식에 적합합니다. 처음 3-4 일 동안 갓 이식 된 식물에 대한 수분을 유지합니다.</li>
</ol>2. VbMS 벡터를 구성합니다.
<ol><li>짧은 탠덤 TM 분자(STTM, 도 1)22,53을 설계 및 복제하여 관심 있는 miRNA에 대해. 참고: 실험 데이터 또는 miRbase 데이터베이스54,55,56,57,58,59를 기반으로 miRNA 서열을 획득합니다. 이 연구에서 사용되는 miR166 서열은 이전에 설명되었다60.<ol>
<li>TM 모듈을 miRNA의 10-11뉴클레오티드에 대응하는 부위에 miRNA의 역형 체열에 일반적으로 5'-CTA-3'을 삽입하여 TM 모듈을 설계한다. 참고: 예를 들어, Stu-miR160 서열은 5'-UGUGGCUCCCUGUAUGCC-3'61이며, 여기서 10-11번째 뉴클레오티드가 굵게 있다. 역보체 서열(탈옥뉴클레오티드)은 5'-GGCATACAGAGCCAGCA-3'이며 불일치 벌지 삽입 부위는 굵게 표시됩니다. TM 분자 서열(탈옥핵증)은 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3'이어야 한다.</li>
		<li>STTM 조각을 복제하기 위한 리머를 디자인합니다(그림 1). 48nt 스페이서 서열과 함께 DNA 올리고뉴클레오티드를 PCR 복제를 위한 템플릿으로 사용하십시오. 포워드 프라이머는 LIC1 링커(5'-CgACgACAAGACCgT-3'), TM 분자용으로 설계된 위의 전방 서열, 48nt 스페이서(5'-GTTGTTGTTTATGGT-3')의 부분 5' 서열로 구성된다. 역프라이머는 LIC2 링커(5'gAgAgAgCCgT-3'), TM 분자의 역형 보체 서열, 48nt 스페이서(5'-ATTCTTCTTTTAGACCAT-3')의 3'시퀀스에 대한 부분역 보체로 구성된다. 참고: 48nt 스페이서 시퀀스는 5'-GTTGTTGTTATTTCTAATTCTAATTCTAATTCTAAA아가AT-3'입니다. 예를 들어, STTM-miR160의 경우, 포워드 프라이머는 5'-CgACgACAAGACCgT-GGCATACAGGG-CTA-GAGCCAGCA-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'이어야 한다. 역프라이머는 5'-gAgAgAgCCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CTGTATGCC-ATTCTCTTCTTTAGACCAT-3'(그림 1)이어야 한다.</li>
		<li>합성된 범블 48nt 스페이서를 템플릿및 높은 충실도 DNA 폴리머라아제로서 합성된 범용 48nt 스페이서를 사용하여 PCR에 의해 50 μL의 부피로 STTM 단편을 증폭시한다.<ol>
<li>각 프라이머(40 μM), 48nt 스페이서 올리고(40 μM), 10x PCR 버퍼의 5μL, 5μL을 혼합하여 PCR 반응을 설정, dNTP 혼합물(각 10mM), 고충실도 DNA 폴리머라제(10U/μL)의 0.1 μL, ddH2O의 43μL은 총 50μL의 부피로 표준 PCR 증폭을 수행합니다. 94°C 3분, 94°C의 32사이클은 45s, 60°C는 45s, 72°C는 60초용.</li>
		</ol>
</li>
		<li>에탄올 강수량에 의해 STTM 조각을 정화합니다. PCR 제품에 2.5권의 에탄올과 1/10 부피를 3M 아세테이트(pH = 4.0)를 추가합니다. 14,000 x g 에서 10분 간 활발하게 원심분리기를 섞습니다. 상체를 제거하고 70 % 에탄올의 1 mL로 펠릿을 헹구십시오. 펠릿을 건조시키고 ddH2O의 20 μL로 녹입니다. 참고: DNA 전기전도를 사용하여 STTM PCR 제품의 증폭을 확인합니다.</li>
		<li>정제된 STTM PCR 제품의 2.5 μL, 10x T4 DNA 폴리머라제 버퍼의 0.5 μL을 혼합하여 얼음에 T4 DNA 폴리머라제 반응을 설정, 0.05 μL 의 1 M 디티오트리톨 (DTT), 0.25 μL 100 mM dATP, T4 DNA 폴리머라제의 0.1 μL (3 U/μL), 및 ddH2O의 1.6 μL은 총 부피 5 μL. 37 °C에서 혼합물을 37°C에서 배양합니다. T4 DNA 폴리머라아제의 비활성화를 위해 제품을 75°C에서 20분 동안 치료한다.</li>
	</ol></li>
	<li>PVX 기반 VbMS 구조를 준비합니다.<ol>
<li>100 μL의 부피에서 2.5 μL의 SmaI (20 U/μL)를 가진 PVX-LIC 플라스미드38의 5 μg를 소화합니다.</li>
		<li>페놀:클로로폼:이소프로파놀(25:24:1, pH = 6.7/8.0)을 소화된 PVX-LIC 제품에 동일한 볼륨을 추가하고 격렬하게 혼합합니다. 14,000 x g 의 원심분리기는 10분 동안 상체부를 새로운 원심분리기 튜브로 옮긴다. 동일한 부피의 클로로폼을 추가: isopropanol (24:1) 적극적으로 소용돌이. 10 분 동안 14,000 x g 에서 원심 분리기. 참고: PVX-LIC 벡터는 복제를 위해 LIC 카세트를 항구합니다. PVX-LIC 벡터의 LIC 카세트는 ccdB 유전자와 클로람페니콜 내성 유전자를 포함하고 있으며, 가나마이신(50 μg/L) 및 클로람페니콜(15 μg/L)을 함유하는 LB 배지를 사용하여 대장균 DB3.1에서 유지/전파될 필요가 있다.</li>
		<li>새로운 원심분리기 튜브로 상체를 옮는다. 에탄올 2.5부와 아세테이트 1/10부(pH = 4.0)를 넣고 적극적으로 섞는다. 14,000 x g 의 원심분리기는 10분 동안 상복부를 제거합니다.</li>
		<li>펠릿을 70% 에탄올과 소용돌이의 1mL로 강하게 헹구세요. 14,000 x g 의 원심분리기는 10분 동안 상복부를 제거합니다. 펠릿을 건조시키고 소화된 PVX-LIC 플라스미드를 ddH2O 100 μL로 녹입니다.</li>
		<li>소화된 PVX-LIC 벡터 DNA의 2.5 μL을 혼합하여 얼음에 T4 DNA 폴리머라제 반응을 설정, 0.5 μL 의 10x T4 DNA 폴리머라제 버퍼, 0.05 μL 1 M DTT, 0.25 μL 100 mM dTTP, T4 DNA 폴리머라제 (3 U/μL)의 0.1 μL은 총 부피5 μL에서 혼합물을 37 °C에서 15 분 동안 37 °C로 배양하고 25 분에서 치료하는 데 20 분 T4 DNA 폴리머라아제비활성화.</li>
	</ol></li>
	<li>STTM 시퀀스를 LIC 반응을 사용하여 PVX-LIC 벡터로 복제합니다. T4 DNA 폴리머라제 처리 STTM PCR 제품(5 μL)과 T4 DNA 폴리머라제 처리 PVX-LIC 플라스미드(5 μL)를 혼합한다. 70°C에서 5분간 배양하고, 0.1°C/s의 경사로에서 22°C까지 식히고, PCR 기계를 사용하여 30분 동안 22°C로 보관하십시오. 참고: LIC 복제의 높은 효율을 달성하기 위해 잠복기 시간을 4°C에서 하룻밤로 연장합니다.</li>
	<li>LIC 반응 제품의 5 μL을 대장균 DH5α로 변환하고 50 μg/mL kanamycin62,63을 포함하는 LB 플레이트에서 성장한다. PVX-LIC 벡터에 대한 복제 프라이머및 범용 프라이머로 PCR에 의해 양수 콜로니를 선택하고 검증한 다음 시퀀싱합니다.<ol>
<li>양성 클론을 식별하기 위해 STTM 복제용 역 프라이머와 함께 PVX-LIC(5'GTTGGCTTGCAACTAGAT-3')의 포워드 프라이머로 콜로니 PCR을 수행합니다. PCR 대역의 크기는 ~300 bp여야 합니다. 참고: 종료기 주기 시퀀싱64,65에 의해 STTM 조각의 시퀀스를 확인합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>검증된 클론으로부터 PVX-STTM 플라스미드를 분리하여 그로박테리움 균주 GV3101, GV2260 또는 EHA10562,63으로 변환합니다. PCR에 의해 아그로박테리움 식민지를 확인합니다. 참고: PVX-LIC의 전방 프라이머와 STTM 복제를 위한 역 프라이머를 사용하여 PCR에 의한 아그로박테리움 콜로니를 확인합니다.</li>
</ol>3. 감자 식물에서 PVX 기반 VbMS 분석 작업을 수행합니다.
<ol><li>체외 감자 식물을 토양으로 이식합니다. 이식된 식물은 3-4일 후에 VbMS 분석의 대상이 됩니다.</li>
	<li>PVX-STTM 플라스미드를 함유한 아그로박테리움 을 함유한 감자 식물을 접종한다. 참고: 감자의 VbMS 분석의 경우 , 아그로박테리움 매개 침투 및 이쑤시개 긁힘 접종이 동시에 수행됩니다.<ol>
<li>50 μg/mL 카나마이신 및 50 μg/mL 리팜피신을 포함하는 액체 LB의 50mL로 PVX-STTM 벡터를 포함하는 양성 변압제를 선택하고 접종합니다. OD600 = 1.0까지 16 시간 동안 220 rpm에서 28 °C 인큐베이터에서 성장합니다.</li>
		<li>동시에, 양성 아그로박테리움 콜로니를 50 μg/mL 카나마이신 과 50 μg/mL 리팜피신을 포함하는 적어도 2개의 새로운 LB 플레이트에 줄이며 1일 동안 28°C에서 자랍니다. PVX-LIC38,66 벡터를 대조군으로 포함시키고 PVX-GFP67,68을 모니터링하여 바이러스 확산을 모니터링한다.</li>
		<li>Agrobacterium 액체 배양을 원심분리로 3,400 x g에서 실온에서 10분 동안 수집합니다. 침투 완충제(10m MgCl2, 10mM MES 및 200 μM 아세토시링곤, pH = 5.6)의 동일한 부피로 아그로박테리움 세포를 재차 중단하고 OD600 = 1.0으로 조정한다. 6 시간 동안 실온에서 배양하십시오.</li>
		<li>1 mL 바늘없는 주사기로 완전히 확장 된 잎의 축축 측에 Agrobacterium 문화에 침투하십시오.<ol>
<li>한 손으로 잎을 뒤집어 들고 한 손가락을 사용하여 침투 부위의 adaxial 측에서 잎 라미나를 지원합니다. 주사기를 다른 손으로 잎 표면에 수직으로 유지하고 Agrobacterium 문화에 침투하여 라미나의 축축한 면으로 침투합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>LB 플레이트에서 Agrobacterium 배양을 긁어 내고 이쑤시개를 가진 침투 된 감자 식물의 첫 번째 하나 또는 두 개의 상호 노드의 줄기 표면을 긁습니다. 줄기의 표피를 부드럽게 긁습니다. 식물에 심각한 손상을 일으킬 수있는 줄기를 관통하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>16h 빛/8h 어두운 광기간과 온실에서 120 μmol/m2∙ s1 의 광강도로 22°C에서 침투된 식물을 성장시다. 참고: miRNA 침묵으로 인한 표현형은 일반적으로 2-4주 후 접종에 나타납니다(그림 2, 그림 3). VbMS 표현형이 침투 후 나타나는 데 는 일반적으로 10-20 일이 걸립니다. VbMS 표현형은 특정 miRNA 및 표적 유전자, 성장 조건 및 감자 품종의 특성에 달려 있습니다.</li>
</ol>4. 식 분석을 수행합니다.
<ol><li>표현형이 2-4주 후 접종에 나타나면 VbMS 식물의 현상형과 가위를 가진 대조군 식물의 피노타입이 있는 사격, 잎, 꽃 또는 뿌리와 같은 조직을 수집합니다. 수집된 조직에서 총 RNA를 분리합니다.</li>
	<li>전기전도62,63에 의한 RNA 품질을 확인하고 분광광계로 OD260 흡광도를 측정하여 RNA 농도를 정량화한다.</li>
	<li>줄기 루프 실시간 역전사 PCR(RT-PCR)을 사용하여 miRNA 발현을 분석한다.<ol>
<li>특정 miRNAs의 경우 줄기 루프 역전사 프라이머를 디자인합니다. 줄기 루프 RT 프라이머는 보편적 인 5 '백본과 특정 miRNA의 3'6 nt 확장을 포함합니다. 줄기 루프 구조를 형성하는 5'- GTCTCTGGTGGGGAgggtgggtgtattcGCACCAGAGGAGAC-3')를 설계합니다. (대문자는 역반복 시퀀스와 루프 영역에 대한 소문자에 해당한다).</li>
		<li>루프를 형성하는 5' 백본 서열의 일부는 후속 PCR 증폭을 위한 역프라이머 역할을 한다(백본 서열에서 굵은 기울임꼴 시퀀스). 줄기 루프 프라이머에 관심 있는 miRNA의 3'말에 역보완적 인 6 nt 확장 서열을 추가하여 역전사에 대한 특이성을 제공합니다(보충 도 1A). 참고: 첸 외.69 및 에리카 바르코니-가스 외.70,71,72에 의해 설명된 바와 같이 줄기 루프 역 전사 프라이머를 설계한다. 예를 들어, 스튜-miR160용 줄기 루프 역전사 프라이머는 5'-GTCTCCTGTGGCagggtattcGCACCAGAGGAGACGGCATA-3'로 설계되었습니다. 감자 miR165/166 제품군을 위한 줄기 루프 역전사 프라이머는 5'-GTCTCCTGTGGCagggtgtattcGCACCAGAGGAGACGGGGGG(A/G)A-3'로 설계되었습니다. (굵은 대문자 시퀀스는 특정 miRNA에 대한 역 전사의 특이성을 제공합니다).</li>
		<li>총 RNA의 50-200 ng를 혼합하여 역전사 반응을 설정, 줄기 루프 역전사 프라이머(100 μM), 10x 버퍼의 2μL, RNase 억제제의 0.2 μL(40 U/μL), dNTP의 0.25 μL(각 10mM), 그리고 얼음 에 대한 역전사 1μL(200 U/μL)의 1μL. 20 μL의 총 부피에 뉴클레아제 없는 ddH2O를 추가합니다.</li>
		<li>펄스 역 전사 절차를 사용하여 역전사를 수행합니다. 역전사 반응 혼합물을 16°C에서 30분 동안 배양하고, 30초동안 30°C, 30s용 42°C, 1초에 대해 50°C의 온도 주기를 수행하고, 총 60사이클동안, 5분 동안 85°C에서 배양하여 역전사를 비활성화한다.</li>
		<li>miRNA 발현의 실시간 PCR 분석을 위해 miRNA 서열을 기반으로 전방 프라이머를 설계하지만 위에서 설계된 줄기 루프 역전사 프라이머와 겹치는 서열을 포함하지 않는다. 길이, 용융 온도 및 GC 콘텐츠를 최적화하기 위해 전방 프라이머의 5'에 3-7nt 확장을 추가합니다(보충 도 1). 참고 : 보편적 인 역 프라이머는 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'입니다. 예를 들어, 스튜-miR160용 줄기 루프 역전사 프라이머는 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3'로 설계되었습니다. miR165/166 제품군을 위한 줄기 루프 역전사 프라이머는 5'-CGGCTCGGACCACCAGGCTT-3'입니다. 굵은 시퀀스는 프라이머 최적화를 위한 5' 확장 역할을 합니다. miRNA용 줄기 루프 역전사 프라이머 및 실시간 PCR 프라이머는 miRNA 프라이머 디자인 Tool73을 사용하여 설계할 수 있다.</li>
	</ol></li>
	<li>표준 역전사 PCR(RT-PCR)에 의해 대상 mRNA의 cDNA를 합성합니다. 역전사 반응 혼합물을 37°C에서 60분 동안 배양하고 5분 동안 85°C로 가열하여 역전사를 비활성화한다. 참고: (1) 표적 mRNA가 알려지지 않은 경우 psRNATarget program74 를 사용하여 표적 mRNAs를 예측한다. (2) mRNA를 위한 보편적인 역전사 프라이머는 고정된 프라이머 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'이다.</li>
	<li>관심있는 miRNA와 대상 mRNAs 모두에 대한 실시간 PCR 반응을 설정합니다. 템플릿 cDNA의 0.5 μL, 2배 실시간 PCR 버퍼 5μL, 각 전방 및 역 프라이머(40 μM)의 0.05 μL, ddH2O의 4.4 μL을 얼음에 5μL의 총 부피로 혼합합니다.</li>
	<li>3 분 동안 95 °C에서 배양하고, 30 s용 95 °C의 40 사이클과 60 °C에서 30 초동안 배양하십시오. 다음과 같이 후속 용융 곡선 해석을 수행 : 15 초에 대한 95 °C에서 인큐베이션, 20 °C / s의 경사로에서 60 °C로 냉각, 60 s에 대한 60 °C에서 유지, 0.2 ° C /s의 경사로에서 95 °C에 가열, 15 s에 대한 95 °C에서 유지. ΔΔCt 메서드76,77을 사용하여 Ct 값을 분석하고 표준 오류로 수단을 플롯합니다. 참고: (1) 대상 mRNA용 실시간 PCR 프라이머는 설명된 것으로 설계될 수 있다75. (2) 감자 폴리비퀴틴 10 유전자는 감자의 정상화를 위한 내부 통제역할을 할 수 있다. 감자 폴리우비퀴틴 10 유전자의 포워드 프라이머는 5'-ATGTTGCCTTGTGTGTGTGTTTGTTG-3'과 역프라이머 5'-TTATTATTCACATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGTTCAACC-3'이다. (3) 실시간 PCR 분석의 경우, 오염 및 프라이머-디머 형성은 거짓 양성 결과를 생성할 수 있다. 비특이적 증폭을 모니터링하고 실시간 PCR 분석의 책임을 높이기 위해 실시간 PCR 분석용 템플릿 및 역전사 없이 컨트롤을 포함하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>

STTM 설계를 PVX 벡터에 통합하여 감자내성 miRNAs의 기능을 특성화하기 위해 PVX 기반 miRNA 침묵 시스템을 제시합니다. VbMS 시스템은 식물 종에 걸쳐 매우 보존 된 miRNA 가족인 감자에서 miRNA165/166을 침묵시키는 데 효과적이라는 것이 입증되었습니다.
TM 접근법은 표적 miRNA의 격리 및 그 활동의 체포를 초래하는 miRNA 보충 서열 내의 예상 분열 부위에서 불일치 루프를 생성하도록 설계된 인공 miRNA 표적 모방에 기초하여 miRNAs의 발현을 방해하기 위해 개발되었습니다22,35,78,79 . TM 분자와 표적 miRNAs 사이의 페어링은 표적 mRNAs의 상향 조절으로 이어지는 특정 miRNA 또는 miRNA...

식물 microRNAs (miRNAs)는 20-24 뉴클레오티드 길이의 핵 으로 인코딩 된 규제 RNAs1로 특징 지어지며 성장 및 개발, 광합성 및 신진 대사4,5,6,7, 호르몬 합성 및 신호 8,9, 생물학적 반응 10, 생물학적 및 생물학적 반응을 포함하여 식물 생물학적 과정의 거의 모든 측면에서 근본적인 역할을합니다. 11,12,13, 영양 및 에너지 조절14,15. 식물 miRNA의 규제 역할은 잘 프로그래밍되고 대상 mRNA를 분개하거나 번역하여 전사 후 수준에서 일반적으로 충족됩니다.
감자 16,17,18,19,20,21에서 miRNAs의 식별, 전사 프로파일링 및 표적 예측을 향한 엄청난 진전이 이루어졌습니다. 그러나 감자를 포함한 식물에서 miRNAs의 기능적 특성화는 효율적이고 높은 처리량 유전 적 접근법의 부족으로 인해 다른 유기체보다 뒤쳐졌습니다. 대부분의 miRNAs는 상당한 유전 중복을 가진 가족에 속하기 때문에, 기능 분석의 표준 손실에 의해 개별 miRNA의 기능 분석을 수행하는 것은 도전적입니다222. 또한, 단일 miRNA는 다중 표적 유전자23 및 여러 상이한 miRNA를 제어할 수 있어 동일한 분자 경로를 공동으로 조절할 수 있다24,25. 이러한 특성은 특정 miRNA 또는 miRNA 제품군의 기능을 특성화하기 어렵게 만듭니다.
miRNAs의 기능 적 분석의 대부분은 명백한 한계가있는 기능의 이득 접근 방식에 크게 의존했습니다. 상기 인공 miRNA(amiRNA) 방법은 내인성 1차 성적증명서(pri-miRNAs)를 높은 수준에서 생성하여 표적 유전자 발현의 억제로 이어집니다26,27,28,29. 그러나, 강력한 구성 35S 프로모터를 이용한 활성화 태깅 및 miRNA 과발현은 종종 생체 내 조건을 대표하지 않는 miRNAs의 고조된 발현으로 이어지므로 miRNAs30의 내인성 기능을 반영하지 않을 수 있다. 결합 및/또는 분열 부위에 항만 돌연변이를 포함하는 미RNA 내성 형태의 표적 유전자의 발현을 포함하는 대안적인 접근법이 개발되었다31,32,33. 그러나 이 접근법은 또한 잠재적으로 형질화 성 유물로 인해 miRNA 내성 표적 트랜스진에서 파생된 표현형의 오해를 일으킬 수 있다. 따라서 이러한 기능 의 이득 연구에서 결론주의34 그려야 한다. 위에서 설명한 접근 방식의 또 다른 주요 제한사항은 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되는 변환이 필요하다는 것입니다. 또한, 트랜스진 의존성 접근법은 변성 식물 종에 거의 적용되지 않습니다. 따라서 miRNAs의 기능을 해명하기 위해 빠르고 효율적인 기능 상실 접근 법을 개발하는 것이 필수적입니다.
변환 절차의 전제 조건인 바이러스 기반 마이크로RNA 침묵(VbMS)은 표적 모방(TM) 전략을 바이러스 유래 벡터와 결합하여 확립되었다. VbMS 시스템에서 인공 적으로 설계된 TM 분자는 바이러스 백본에서 일시적으로 발현되어 강력한 고처리량 및 시간 절약 도구를 제공하여 식물 내인성 miRNAs35,36의 기능을 해부합니다. VbMS는 처음에 N에서 개발되었습니다. 담배 딸랑이 바이러스(TRV)35,36,37 을 사용한 벤타미안과 토마토는 감자 X(PVX)38, 면잎 구겨진 바이러스(ClCrV)39, 오이 모자이크 바이러스(CMV)40,412,CWM바이러스(CMV)를 포함한 다양한 바이러스 발현 시스템을 사용하여 아라비도시스, 면, 밀 및 옥수수로 확장되었습니다. , 보리 스트라이프 모자이크 바이러스 (BSMV)44,45.
감자(Solanum tuberosum)는 영양가가 높고 에너지 생산량이 높고 입력 요건이 상대적으로 낮기 때문에 주로 세계에서 가장 중요한 식품 작물이자 가장 널리 재배된 비시리얼 작물입니다. 감자의 몇 가지 특징은 매력적인 이질 모델 식물을 만든다. 그것은 높은 횡단 속도 식물성 전파 폴리 플로이드 작물, 이종성, 유전 적 다양성. 그러나 현재까지 VbMS를 사용하여 감자에서 miRNAs의 기능을 특성화하는 보고서는 없습니다. 여기서는 감자 식물38에서 miRNAs의 기능을 평가하기 위해 리그션 독립적 복제(LIC) 조정 된 감자 PVX 기반 VbMS 접근 방식을 제시합니다. miR165/166 제품군과 대상 mRNA 및 클래스 III 동종 도메인/Leu zipper(HD-ZIP III) 전사 요인이 광범위하게 특징지어졌기 때문에 VbMS 분석방법을 설명하기 위해 miR165/166 제품군을 선택했습니다222,47,48. HD-ZIP III 유전자는 메리스템 발달 및 장기 극성의 주요 조절제이며, miR165/166 기능의 억제는 HD-ZIP III 유전자의 발현이 증가하여 잎 극성의 감소된 어포형 지배력 및 비정상적인 패턴과 같은 흉부 발달 결함의 결과로 22,35,411 . miRNA165/166의 침묵과 상관관계가 있는 쉽게 접할 수 있는 발달 표현형은 PVX 기반 VbMS 분석의 효과를 정확하게 평가할 수 있게 해주다.
이 연구에서는 PVX 기반 VbMS 시스템이 감자에서 miRNAs의 기능을 효과적으로 차단할 수 있음을 보여줍니다. PVX 기반 바이러스 유도 유전자 침묵(VIGS) 시스템은 다수의 감자 품종에 설치되어 있기 때문에49,50,51,52, 이 PVX 기반 VbMS 접근법은 광범위한 디플로이드 및 테트라피드 감자 종에 적용될 가능성이 있다.

<table><tbody><tr><td>100 &마이크로; M dATP 및 100 & 마이크로; M dTTP</td><td>Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071, 미국</td><td>TQAC136</td><td></td></tr><tr><td>3M 아세트산나트륨, pH 4.0.</td><td>Teknova, Hollister, CA 95023, USA</td><td></td><td></td></tr>#S0297 <tr><td>Acetosyringone</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, USA</td><td>D2666-25G</td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens 균주: GV3101, GV2260 또는 EHA105.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, 미국</td><td>VWRV0757-950ML</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드, DMSO</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, USA</td><td>D0798-25G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0281-25G</td><td></td></tr><tr><td>대장균 DB3.1</td><td></td><td></td><td>ccdB 유전자를 포함하는 PVX-LIC 및 pTRV2e 유지 관리</td></tr><tr><td>대장균 DH5&alpha;</td><td></td><td></td> LIC 복제 비료에 <td>의해 생성된 목적지 구성</td></tr>물<tr><td>: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed</td><td>ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA</td><td>G99260</td><td></td></tr><tr><td>고충실도 PCR 시약: dNTP를 사용한 KAPA HiFi DNA 중합효소</td><td>Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA, USA</td><td>7958960001</td><td></td></tr><tr><td>이소아밀 알코올</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, 미국</td><td>VWRV0944-1L</td><td></td></tr><tr><td>Koptec 순수 에탄올 &ndash; 200 Proof</td><td>Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA</td><td>V1005M</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, USA</td><td>M0606-250G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451</td><td>MFCD00149781</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV 역전사효소</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0253L</td><td></td></tr><tr><td>나노 드롭 분광계: NanoDrop OneC Wi-Fi 기능이 있는 Microvolume UV-Vis 분광 광도계</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td><td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>PCR 기계: Bio-Rad MyCycler PCR 시스템</td><td>Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA</td><td>170-9703</td><td></td></tr><tr><td>PCR 기계: Eppendorf Mastercycler pro</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA</td><td>950030010</td><td></td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td>Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, 미국</td><td>벤치탑 pH/mV 측정기 - 860031</td><td></td></tr><tr><td>페놀:클로로포름:이소아밀 알코올(25:24:1), pH 6.7/8.0.</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, 미국</td><td>VWRV0883-400ML</td><td></td></tr><tr><td>피타젤: Gellan Gum</td><td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA</td><td>J63423-A1</td><td></td></tr><tr><td>PVX VIGS 벡터: PVX-LIC</td><td></td><td></td><td>Zhao et al., 2016</td></tr><tr><td>Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td><td>4485697</td><td></td></tr><tr><td>Real-time PCR 시약: KAPA SYBR&reg; FAST qPCR 마스터 믹스(2x) 키트</td><td>Roche 염기서열분석 및 생명 과학, Kapa Biosystems, Wilmington, MA 01887, USA</td><td>7959389001</td><td></td></tr><tr><td>제한 효소: SmaI</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>역전사 시약: qScript cDNA SuperMix</td><td>Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877, USA</td><td>95107-100</td><td></td></tr><tr><td>RNA 추출 키트: E.Z.N.A. 식물 RNA Kit</td><td>Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA</td><td>SKU: D3485-01</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor Murine</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0314L</td><td></td></tr><tr><td>RNAzol RT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA</td><td>R4533</td><td></td></tr><tr><td>토양: Metro-Mix 360</td><td>Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA</td><td>Metro-Mix 360</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 중합효소 및 완충</td>기 <td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0203S</td><td></td></tr></tbody></table>

감자에서 감자 바이러스 x 기반 마이크로rna 침묵 (vbms)

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.

바이러스 기반 마이크로RNA 침묵(VbMS)은 식물에서 microRNAs(miRNAs)의 기능적 특성화를 위한 신속하고 효율적인 도구입니다. VbMS 시스템은 니코티아나 벤타미안, 토마토, 아라비도시스, 면, 밀과 옥수수 와 같은 모노코트 식물 등 다양한 식물종에 개발 및 적용되었습니다. 여기에서는 PVX 기반 VbMS 벡터를 사용하여 감자내생 내성 miRNAs를 침묵시키기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 특정 miRNA의 발현을 무너뜨리기 위해, 관심 있는 miRNA의 표적 모방(TM) 분자는 설계되고, 식물 바이러스 벡터에 통합되고, Agrobacterium 침투에 의해 감자에 발현되어 내인성 miRNA에 직접 결합하고 그 기능을 차단한다.

도 2 는 정맥을 따라 잎 라미나의 축축측에서 잎 조직의 자궁 내성장을 가진 PVX-STTM165/166 감자 식물(Katahdin)을 나타낸다. 나팔 모양의 잎 형성과 같은 더 심각한 표현형도 관찰되었다. 대조적으로, PVX 대조공장에서는 현상이 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 VbMS 시스템이 테트라클로드 감자 식물에서 내인성 miRNA 기능을 억제하는 데 효과적이었으며 PVX-VbMS 시스템은 특정 miRNA 또는 miRNA 제품군의 기능을 결정하는 견고한 유전 적 도구였다는 것을 보여준다.
도 3 은 정맥을 따라 잎 라미나의 축축측에서 자궁외 잎 조직 성장을 가진 PVX-STTM165/166 감자 식물(Russet Burbank)을 나타낸다. 이러한 결과는 PVX-VbMS 시스템이 주요 감자 품종을 포함한 다른 감자 종에 적용될 수 있음을 보여줍니다.
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감자에서 내인성 마이크로RNA(miRNA)를 기능적으로 특성화하기 위해 감자 바이러스 X(PVX)기반 의 미생물RNA 침묵(VbMS) 시스템에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 미RNA의 표적 모방(TM) 분자는 PVX 벡터에 통합되고 표적 miRNA 또는 miRNA 제품군을 침묵시키기 위해 감자에서 일시적으로 발현된다.

감자에서 감자 바이러스 X 기반 마이크로RNA 침묵 (VbMS)

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has ...

식물에서 microRNA의 기능을 분석하는 전통적인 접근 방식은 주로 안정적인 녹다운 식물의 생성에 의존합니다. 이 바이러스 기반 microRNA 침묵 시스템은 지루하고 시간이 많이 소요되는 변형이 필요하지 않습니다. 바이러스 기반 microRNA 침묵은 식물에서 microRNA의 기능적 특성화를 위한 빠르고 효율적인 도구로, 광범위한 이배체 및 사배체 감자 종에 적용할 수 있습니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사 후 연구원인 Jinping Zhao입니다. 타겟 모방 모듈을 설계하려면 microRNA의 10번째 - 11번째 뉴클레오티드에 해당하는 부위에서 관심 있는 microRNA의 역보체 서열에 불일치 염기서열을 삽입합니다. 짧은 tandem 타겟 모방 단편을 증폭하기 위해 관심 있는 각 프라이머, 48 nucleotide space oligo, 10 times PCR buffer, dNTP mixture, high fidelity PCR DNA polymererase 및 double distilled water를 최종 부피 50 microliters까지 PCR 반응을 설정합니다.그런 다음 표시된 매개변수를 사용하여 표준 PCR로 microRNA를 증폭합니다. 짧은 탠덤 타겟 모방을 정제하려면 2.5 부피의 에탄올과 1/10 부피의 3 몰 나트륨 아세테이트를 PCR 산물에 첨가하십시오. 14, 000 시간 G에 반응을 원심분리하기 전에 격렬하게 섞으십시오 10 분.상등액을 제거한 후 펠릿을 1 밀리리터의 70 % 에탄올로 헹구고 펠릿을 건조 한 다음 펠릿을 20 마이크로 리터의 이중 증류수에 용해시킵니다. T4 DNA 중합효소 반응을 설정하려면 정제된 짧은 탠덤 타겟 모방 PCR 산물을 10배 T4 DNA 중합효소 완충액, 1몰 디티오트레이톨, 100밀리몰 dATP, T4 DNA 중합효소 및 이중 증류수와 얼음 위에서 최종 부피 5마이크로리터로 혼합합니다. 그런 다음 혼합물을 섭씨 37도에서 15분 동안 배양한 다음 섭씨 75도에서 20분 배양하여 T4 DNA 중합효소를 비활성화합니다.PVX 기반 VBMS 구조를 준비하기 위해 총 부피 100μm에서 2.5μl의 SMA1과 함께 5μg의 PVX 결찰 독립 클로닝 플라스미드를 분해합니다. 클로로포름에 동일한 부피의 페놀을 이소아밀 알코올에 첨가하고, 격렬한 혼합으로 분해된 PVX 결찰 독립 클로닝 산물에 25 - 24:1 비율을 첨가하고 원심분리로 생성물을 수집합니다. 튜브 내용물을 두 번째 원심분리하기 전에 와류가 있는 상등액에 동일한 부피의 클로로포름을 이소아밀 알코올에 24:1 비율로 첨가합니다.스핀이 끝나면 상층액을 새 원심분리기 튜브로 옮기고 2.5 부피의 에탄올과 1/10 부피의 3 몰 아세트산 나트륨을 격렬하게 혼합하여 첨가합니다. 튜브를 원심 분리하고 1ml의 70% 에탄올과 격렬한 와류로 펠릿을 헹굽니다. 튜브를 다시 원심분리하고 상등액을 제거하여 펠릿이 자연 건조되도록 합니다.그런 다음 분해된 PVX ligation independent cloning plasmid pellet를 100 microliter의 이중 증류수에 용해시킵니다. T4 DNA 중합효소 반응을 설정하려면 분해된 PVX 결찰 독립 클로닝 벡터 DNA를 10배 T4 DNA 중합효소 완충액, 1몰 디티오트레이톨, 100밀리몰 dTTP 및 T4 DNA 중합효소와 얼음 위에서 최종 부피 5마이크로리터로 혼합합니다. 그런 다음 혼합물을 섭씨 37도에서 15분 동안 배양한 다음 섭씨 75도에서 20분 배양하여 T4 DNA 중합효소를 비활성화합니다.짧은 탠덤 타겟 모방 염기서열을 PVX ligation independent cloning vector에 복제하려면 5마이크로리터의 T4 DNA 중합효소 처리된 짧은 tandem 타겟 모방 PCR 산물을 5마이크로리터의 T4 DNA 중합효소 처리된 PVX ligation independent 클로닝 플라스미드와 혼합하고 혼합물을 섭씨 70도에서 5분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 PCR 기계에서 초당 섭씨 0.1도의 속도로 튜브 내용물을 섭씨 22도까지 냉각하고 목표 온도에 도달하면 튜브를 열 순환기에 30분 동안 그대로 둡니다. 배양이 끝나면 표준 형질전환 프로토콜을 사용하여 5마이크로리터의 결찰 독립 클로닝 반응 산물을 E.coli DH5 알파로 형질전환하고 밀리리터 카나마이신당 50마이크로그램을 함유한 LB 플레이트에서 형질전환된 박테리아를 성장시킵니다.터미네이터 주기 염기서열분석(terminator cycle sequencing)을 통해 짧은 탠덤 표적 모방 단편의 염기서열을 검증한 후, 검증된 클론에서 PVX VBMS 플라스미드를 분리하고 적절한 아그로박테리움(Agrobacterium) 균주로 형질전환시킵니다. PVX VBMS 플라스미드를 함유하는 Agrobacterium을 4주 된 시험관 내 감자 식물에 접종하기 위해, PVX VBMS 벡터를 함유하는 양성 형질전환체를 선택하고 카나마이신 밀리리터당 50마이크로그램 및 리팜피신 밀리리터당 50마이크로그램을 함유하는 액체 LB 50밀리리터에 형질전환체를 섭씨 28도 및 분당 220회전에서 16시간 동안 접종합니다. 배양 중에 카나마이신과 리팜피신을 포함하는 최소 2개의 새로운 LB 플레이트에 양성 Agrobacterium 콜로니를 줄무늬 삽입하고 하루 동안 섭씨 28도에서 배양물을 성장시킵니다.600나노미터의 광학 밀도가 1.0에 도달하면 원심분리로 Agrobacterium 액체 배양물을 수집하고 펠릿을 충분한 양의 침투 버퍼에 재현탁시켜 600나노미터의 광학 밀도를 1.0으로 조정합니다. 실온에서 6시간 동안 배양한 후 1밀리리터 주사기에 Agrobacterium 현탁액을 넣고 한 손으로 한 감자 식물의 팽창된 잎을 뒤집어 잡습니다. 한 손가락을 사용하여 원하는 침투 부위의 인접 쪽에서 잎 층을 지지합니다.그리고 다른 손으로 주사기를 잎 표면에 수직으로 잡고 100-200 마이크로 리터의 Agrobacterium 배양을 얇은 판의 abaxial side에 침투시킵니다. 다음으로, 이쑤시개를 사용하여 Agrobacterium 배양 플레이트에서 군체를 수집하고 침투 한 감자 식물의 첫 번째 하나 또는 두 개의 마디의 줄기 표면과 줄기의 표피를 긁은 다음 2-4 주 동안 온실에서 침투 된 식물을 성장시킵니다. 표현형이 나타나면 가위를 사용하여 VBMS 및 대조 식물에서 표현형이 있는 샘플을 수집합니다.수집된 조직에서 전체 RNA를 분리하고 역전사 효소 PCR을 사용하여 각 샘플에서 microRNA 및 표적 mRNA 발현을 분석합니다. 이 이미지에서 PVX 짧은 탠덤 타겟은 정맥을 따라 잎 층판의 축(abaxial side)에서 잎 조직의 이소성 성장을 가진 165/166 감자 식물을 모방하는 것을 관찰할 수 있습니다. 나팔 모양의 잎 형성과 같은 더 심각한 표현형도 관찰되었습니다.대조적으로, PVX 제어 공장에서는 표현형 이상이 관찰되지 않았으며, 이는 VBSM 시스템이 사배체 감자 식물에서 내인성 microRNA 기능을 억제하는 데 효과적임을 보여줍니다. PVX 짧은 탠덤 타겟 모방 165/166 감자 식물은 얇은 판 정맥을 따라 잎 얇은 판의 축 쪽에서 이소성 잎에서 조직으로의 성장을 나타내며, 이는 PVX VBMS 시스템이 주요 감자 품종을 포함한 다른 감자 품종에 적용될 수 있음을 보여줍니다. 잎에 동시에 침투하고 동일한 식물의 줄기에 동일한 Agrobacterium 배양을 접종하는 것이 필수적입니다.표적 모방 분자를 감자 식물에 안정적으로 도입하기 위한 형질전환 접근법은 표적 microRNA의 침묵 상태가 자손 세대에서 유지되어야 할 때 권장됩니다.

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노크를 다운 유전자 표현의에 대한 바이러스 유도된 유전자 입을 (VIGS) 메서드에 대한...

바이러스 유도 진 입을 (VIGS)에 Nicotiana benthamiana 토마토

공장 바이러스 나노 입자 (VNPs)은 생물 의약의 응용 프로그램 플랫폼을 약속하고 있습니다. 여기, 우리는 공장 VNP 전파, 정화, 특성화 및 bioconjugation에 대한 절차를 설명합니다. 마지막으로, 우리는 마우스 이종 이식 모델과 형광 이미징을 사용하여 종양 추적 및 이미징을위한 VNPs의 응용 프로그램을 보여줍니다.

에 대한 바이러스 나노 입자<em&gt; 생체에</em&gt; 종양 이미징

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시스테인 잔류 물을 용매 접근성에 대한 분석<em&gt; 옥수수 rayado fino 바이러스</em에서 생산&gt; 바이러스 같은 입자<em&gt; Nicotiana benthamiana</emVLPs에 펩티드의&gt; 식물과 교차 연결

농약침과 PVX 농병은 식물에 있는 유전자의 일시적인 자궁 발현을 위한 일상적인 기능적인 분석입니다. 이 방법은 효과적인 전략 (급속한 저항 및 비열유전자 발견)에 있는 능률적인 연구및 분자 식물 병리학에 있는 현대 연구에 결정적입니다. 그들은 공장에서 강력한 고처리량 기능 분석에 대한 수요를 충족합니다.

감자와 니코티아나 벤타미안의 농아침투 및 PVX 농병감염

바이러스에 의한 유전자 침묵은 식물의 nonhost 저항성에 관련된 유전자를 식별하기위한 유용한 도구입니다. 우리는 nonhost 병원균에 감염 유전자 침묵 식물을 식별 GFPuv을 표현 세균성 병원체의 사용을 보여줍니다. 이 방법은 빠르고, 간단하고 대규모 검사와 유사한 프로토콜이 다양한 식물 미생물 상호 작용을 연구에 적용 할 수있는 용이하게합니다.

유전자의 식별을위한 VIGS - 중재 앞으로 유전학 검사는 Nonhost 저항에 참여

여기서는 특정 microRNA를 보완하는 염기서열을 바이러스 게놈에 통합하여 피코르나바이러스 영양성을 조절하는 방법을 설명합니다.  이 프로토콜은 생명 주기의 길이와 특성에 따라 변형되어 모든 종류의 바이러스에 적용할 수 있습니다.

피 코르 나 바이러스과의 바이러스 친 화성의 마이크로 RNA-기반 규제

여기, 우리 감자 식물을 변환 하는 데 두 프로토콜을 제시. Agrobacterium tumefaciens 변환 Agrobacterium rhizogenes 야생 타입 촬영 자체 전파 될 수 있는 유전자 변형 털 뿌리를 생성 하는 동안 완전 한 유전자 변형 식물에 지도 한다. 우리는 다음 변환 된 뿌리에 얼룩이 지 거 스 여 발기인 활동 감지.

Agrobacterium tumefaciens 및 Agrobacterium rhizogenes-감자의 변환 중재와 거 스 얼룩에 의해 Suberin 유전자의 발기인 활동

여기서, 우리는 식물 병원체에서 RNA 침묵 억제제를 신속하게 스크리닝하는 데 광범위하게 사용될 수 있는 변형된 스크리닝 방법을 제시한다.

식물 병원균의 분비 이펙터에서 RNA 침묵 억제제의 스크리닝 및 식별

이 방법은 전체 RNA 추출물로부터 miRNAs를 검출하기 위해 북부 혼성화 기술의 사용을 보여줍니다.

식물 MicroRNAs의 검출 및 정량화를 위한 RNA 블롯 분석

농균 계 주사 (농업 주입) 프로토콜은 옥수수 묘목으로 여우 꼬리 모자이크 바이러스와 사탕수수 모자이크 바이러스 클론의 접종을 위해 제시된다. 이러한 방식으로 접종은 바이러스 감염, 마커 유전자의 바이러스 유발 유전자 침묵, GFP의 바이러스 과발현으로 이어집니다.

재조합 폭스테일 모자이크 바이러스와 사탕수수 모자이크 바이러스 감염 클론주사에 의해 옥수수 묘목의 직접 농경화

여기서는 세포 사멸 유도 후 접종된 잎을 지속적으로 이미징하여 프로그래밍된 세포 사멸 개시 속도를 연구하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

디지털 현미경을 사용한 세포 사멸 개시 연구

배우세요 감자 바이러스 X 기반 마이크로RNA 침묵(VbMS) 기법으로 감자에서 내인성 microRNA의 기능을 신속하고 효율적으로 분석하는 방법입니다. 안정적 형질전환 없이 miRNA 기능 연구가 가능합니다.

감자에서 감자 바이러스 X 기반 마이크로RNA 침묵 (VbMS)

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