감자에서 감자 바이러스 X 기반 마이크로RNA 침묵 (VbMS)

식물에서 microRNA의 기능을 분석하는 전통적인 접근 방식은 주로 안정적인 녹다운 식물의 생성에 의존합니다. 이 바이러스 기반 microRNA 침묵 시스템은 지루하고 시간이 많이 소요되는 변형이 필요하지 않습니다. 바이러스 기반 microRNA 침묵은 식물에서 microRNA의 기능적 특성화를 위한 빠르고 효율적인 도구로, 광범위한 이배체 및 사배체 감자 종에 적용할 수 있습니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사 후 연구원인 Jinping Zhao입니다. 타겟 모방 모듈을 설계하려면 microRNA의 10번째 - 11번째 뉴클레오티드에 해당하는 부위에서 관심 있는 microRNA의 역보체 서열에 불일치 염기서열을 삽입합니다. 짧은 tandem 타겟 모방 단편을 증폭하기 위해 관심 있는 각 프라이머, 48 nucleotide space oligo, 10 times PCR buffer, dNTP mixture, high fidelity PCR DNA polymererase 및 double distilled water를 최종 부피 50 microliters까지 PCR 반응을 설정합니다.

그런 다음 표시된 매개변수를 사용하여 표준 PCR로 microRNA를 증폭합니다. 짧은 탠덤 타겟 모방을 정제하려면 2.5 부피의 에탄올과 1/10 부피의 3 몰 나트륨 아세테이트를 PCR 산물에 첨가하십시오. 14, 000 시간 G에 반응을 원심분리하기 전에 격렬하게 섞으십시오 10 분.

상등액을 제거한 후 펠릿을 1 밀리리터의 70 % 에탄올로 헹구고 펠릿을 건조 한 다음 펠릿을 20 마이크로 리터의 이중 증류수에 용해시킵니다. T4 DNA 중합효소 반응을 설정하려면 정제된 짧은 탠덤 타겟 모방 PCR 산물을 10배 T4 DNA 중합효소 완충액, 1몰 디티오트레이톨, 100밀리몰 dATP, T4 DNA 중합효소 및 이중 증류수와 얼음 위에서 최종 부피 5마이크로리터로 혼합합니다. 그런 다음 혼합물을 섭씨 37도에서 15분 동안 배양한 다음 섭씨 75도에서 20분 배양하여 T4 DNA 중합효소를 비활성화합니다.

PVX 기반 VBMS 구조를 준비하기 위해 총 부피 100μm에서 2.5μl의 SMA1과 함께 5μg의 PVX 결찰 독립 클로닝 플라스미드를 분해합니다. 클로로포름에 동일한 부피의 페놀을 이소아밀 알코올에 첨가하고, 격렬한 혼합으로 분해된 PVX 결찰 독립 클로닝 산물에 25 - 24:1 비율을 첨가하고 원심분리로 생성물을 수집합니다. 튜브 내용물을 두 번째 원심분리하기 전에 와류가 있는 상등액에 동일한 부피의 클로로포름을 이소아밀 알코올에 24:1 비율로 첨가합니다.

스핀이 끝나면 상층액을 새 원심분리기 튜브로 옮기고 2.5 부피의 에탄올과 1/10 부피의 3 몰 아세트산 나트륨을 격렬하게 혼합하여 첨가합니다. 튜브를 원심 분리하고 1ml의 70% 에탄올과 격렬한 와류로 펠릿을 헹굽니다. 튜브를 다시 원심분리하고 상등액을 제거하여 펠릿이 자연 건조되도록 합니다.

그런 다음 분해된 PVX ligation independent cloning plasmid pellet를 100 microliter의 이중 증류수에 용해시킵니다. T4 DNA 중합효소 반응을 설정하려면 분해된 PVX 결찰 독립 클로닝 벡터 DNA를 10배 T4 DNA 중합효소 완충액, 1몰 디티오트레이톨, 100밀리몰 dTTP 및 T4 DNA 중합효소와 얼음 위에서 최종 부피 5마이크로리터로 혼합합니다. 그런 다음 혼합물을 섭씨 37도에서 15분 동안 배양한 다음 섭씨 75도에서 20분 배양하여 T4 DNA 중합효소를 비활성화합니다.

짧은 탠덤 타겟 모방 염기서열을 PVX ligation independent cloning vector에 복제하려면 5마이크로리터의 T4 DNA 중합효소 처리된 짧은 tandem 타겟 모방 PCR 산물을 5마이크로리터의 T4 DNA 중합효소 처리된 PVX ligation independent 클로닝 플라스미드와 혼합하고 혼합물을 섭씨 70도에서 5분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 PCR 기계에서 초당 섭씨 0.1도의 속도로 튜브 내용물을 섭씨 22도까지 냉각하고 목표 온도에 도달하면 튜브를 열 순환기에 30분 동안 그대로 둡니다. 배양이 끝나면 표준 형질전환 프로토콜을 사용하여 5마이크로리터의 결찰 독립 클로닝 반응 산물을 E.coli DH5 알파로 형질전환하고 밀리리터 카나마이신당 50마이크로그램을 함유한 LB 플레이트에서 형질전환된 박테리아를 성장시킵니다.

터미네이터 주기 염기서열분석(terminator cycle sequencing)을 통해 짧은 탠덤 표적 모방 단편의 염기서열을 검증한 후, 검증된 클론에서 PVX VBMS 플라스미드를 분리하고 적절한 아그로박테리움(Agrobacterium) 균주로 형질전환시킵니다. PVX VBMS 플라스미드를 함유하는 Agrobacterium을 4주 된 시험관 내 감자 식물에 접종하기 위해, PVX VBMS 벡터를 함유하는 양성 형질전환체를 선택하고 카나마이신 밀리리터당 50마이크로그램 및 리팜피신 밀리리터당 50마이크로그램을 함유하는 액체 LB 50밀리리터에 형질전환체를 섭씨 28도 및 분당 220회전에서 16시간 동안 접종합니다. 배양 중에 카나마이신과 리팜피신을 포함하는 최소 2개의 새로운 LB 플레이트에 양성 Agrobacterium 콜로니를 줄무늬 삽입하고 하루 동안 섭씨 28도에서 배양물을 성장시킵니다.

600나노미터의 광학 밀도가 1.0에 도달하면 원심분리로 Agrobacterium 액체 배양물을 수집하고 펠릿을 충분한 양의 침투 버퍼에 재현탁시켜 600나노미터의 광학 밀도를 1.0으로 조정합니다. 실온에서 6시간 동안 배양한 후 1밀리리터 주사기에 Agrobacterium 현탁액을 넣고 한 손으로 한 감자 식물의 팽창된 잎을 뒤집어 잡습니다. 한 손가락을 사용하여 원하는 침투 부위의 인접 쪽에서 잎 층을 지지합니다.

그리고 다른 손으로 주사기를 잎 표면에 수직으로 잡고 100-200 마이크로 리터의 Agrobacterium 배양을 얇은 판의 abaxial side에 침투시킵니다. 다음으로, 이쑤시개를 사용하여 Agrobacterium 배양 플레이트에서 군체를 수집하고 침투 한 감자 식물의 첫 번째 하나 또는 두 개의 마디의 줄기 표면과 줄기의 표피를 긁은 다음 2-4 주 동안 온실에서 침투 된 식물을 성장시킵니다. 표현형이 나타나면 가위를 사용하여 VBMS 및 대조 식물에서 표현형이 있는 샘플을 수집합니다.

수집된 조직에서 전체 RNA를 분리하고 역전사 효소 PCR을 사용하여 각 샘플에서 microRNA 및 표적 mRNA 발현을 분석합니다. 이 이미지에서 PVX 짧은 탠덤 타겟은 정맥을 따라 잎 층판의 축(abaxial side)에서 잎 조직의 이소성 성장을 가진 165/166 감자 식물을 모방하는 것을 관찰할 수 있습니다. 나팔 모양의 잎 형성과 같은 더 심각한 표현형도 관찰되었습니다.

대조적으로, PVX 제어 공장에서는 표현형 이상이 관찰되지 않았으며, 이는 VBSM 시스템이 사배체 감자 식물에서 내인성 microRNA 기능을 억제하는 데 효과적임을 보여줍니다. PVX 짧은 탠덤 타겟 모방 165/166 감자 식물은 얇은 판 정맥을 따라 잎 얇은 판의 축 쪽에서 이소성 잎에서 조직으로의 성장을 나타내며, 이는 PVX VBMS 시스템이 주요 감자 품종을 포함한 다른 감자 품종에 적용될 수 있음을 보여줍니다. 잎에 동시에 침투하고 동일한 식물의 줄기에 동일한 Agrobacterium 배양을 접종하는 것이 필수적입니다.

표적 모방 분자를 감자 식물에 안정적으로 도입하기 위한 형질전환 접근법은 표적 microRNA의 침묵 상태가 자손 세대에서 유지되어야 할 때 권장됩니다.