Name: 시험관 에서 미세 유체 질환 모델 전체 혈액 내피 상호 작용 및 혈전 역학을 실시간으로 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 배우세요 미세유체칩을 활용한 시험관 내 혈관 질환 모델로 전혈과 내피세포 상호작용 및 혈전 형성 역학을 실시간 분석하는 방법. 환자 유래 세포를 이용해 항응고제 효능을 평가하고 맞춤형 의료에 활용할 수 있습니다.

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우리는 플라즈마 단백질의 부서에서 얀 Voorberg 감사합니다, 산퀸 연구 및 랜드 스타이너 연구소, 암스테르담 UMC, 학술 의료 센터, 암스테르담, 네덜란드, 이 원고에 자신의 입력에 대한. 이 작품은 네덜란드 심장혈관 동맹 (DCVA) [2012-08, 2014-11]에 의해 지원되었다 파에드라와 다시 연결 컨소시엄뿐만 아니라 펄스 보조금 2018 파에드라 IMPACT 컨소시엄에 수여. 이러한 보조금에는 네덜란드 심장 재단, 네덜란드 대학 의료 센터 연맹, 네덜란드 건강 연구 개발 기구 및 네덜란드 왕립 과학 아카데미의 집단 기금이 포함됩니다. 또한, 이 작품은 고급 보조금 'VESCEL'프로그램에 따라 유럽 연구 위원회에 의해 지원되었다 (그랜트 번호: 669768). XDM은 네덜란드 암스테르담의 VU 대학 의료 센터에서 심장 혈관 연구 연구소 (ICaR-VU)의 연구 보조금에 의해 투자됩니다.

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저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

응고는 내피 성분과 혈액 성분 사이의 복잡하고 일시적으로 조절된 상호 작용의 결과입니다. 이 시험관 내 분석법은 내피 세포의 혈전 생성 특성을 실시간으로 조사하는 방법을 제시한다. 1 차적인 인간 내피 세포의 각종 모형은 기관 및 환자 특정 방식으로 시투 혈전증에서 촉진하는, 이용될 수 있습니다. 이 연구에서는, 우리는 CTEPH 환자 대 건강한 기증자에서 고립된 PAECs의 혈전 생성 특성을 비교하는 이 프로토콜의 사용을 설명했습니다. 살아있는 혈전 형성은 히스타민 활성화 내피를 통해 건강한 과목에서 전혈의 관류에 의해 연구되었다, DOAC의 효과는 항 혈전제로 테스트하는 동안.
대표적인 결과에 도시된 바와 같이 상업적으로 이용 가능한 마이크로 채널을 사용하는 것 외에도, 맞춤형 마이크로 유체 채널의 도입은 혈전 형성에 대한 혈관 기하학 변화의 영향에 대한 연구를 가능하게 한다. 예를 들어, 분기점이나 협착에서 의 흐름이 감소하면 전단 응력증가및 혈소판활성화(36)가증가한다. 그러나, 이러한 맞춤형 마이크로유체 채널의 상당한 제한은 2.3.2 단계에서 설명된 바와 같이 안정적인 단일레이어를 형성하기 위한 높은 세포 수의 요구 사항이다. 이것은 환자 유래 세포가 부족할 때 제한적인 인자를 제출할 수 있습니다. 시판되는 마이크로슬라이드의 강점은 표면영역이 세포 배양에 맞게 변형되고 성장 영역이 더 커서 EC가 컨실릭하고 안정적인 단층층을 형성할 수 있다는 것이다. 반면에, 더 큰 표면적으로 인해 더 큰 루멘이 생성됩니다. 방정식 1에따르면, 이것은 사용자 정의 된 미세 유체에서와 유사한 유량에 도달하기 위해 더 높은 혈액 볼륨을 필요로한다.
이 프로토콜의 개선은 실시간 EC 손실 또는 장벽 무결성의 변화를 조사하는 것입니다. 이 프로토콜의 EC 손상은 실험이 끝날 때만 측정됩니다. 라이브 트래킹의 경우, 예를 들어37mCherryVE-cadherin으로 EC에 태그를 지정할 수 있습니다. 그러나, 이것은 효율적인 바이러스 형질과 고도로 최적화 된 프로토콜을 필요로 하므로, 전기 세포 기질 임피댄스 감지 (ECIS) 내피 무결성 및 장벽 기능을 연구하는 대안으로 사용될 수있다(38). 특수 ECIS 흐름 채널에 대한 관류를 통해 흐름 하에서 내피 장벽 무결성을 세로 모니터링할 수 있습니다. 이러한 특정 ECIS 기능을 사용하면 내피 장벽 특성 및 혈전 형성의 병렬 측정이 가능합니다. 병렬 EC 장벽 측정을 위한 대체 방법, 특히 사용자 정의 된 배열에서 형광 덱스트랜스의 사용을 포함, 이는 루멘에서 확산, EC 장벽 특성에 따라.
설명된 프로토콜의 한계는 IC가 인체에서 제거되고 조직 배양 플라스틱에 배양되어 뻣뻣하고 인공기판이 된다는 것입니다. 세포는 그들의 생물 물리학 환경에 적응합니다. 이것은 혈소판 활성화와 벽강성(39)사이의 연관성이 있기 때문에 혈소판 활성화에 대한 내피 반응에 영향을 미칠 수 있다. 배양 플라스틱에 이러한 적응에도 불구하고, 세포는 혈액 관류의 5 분 후에 혈소판 접착 및 fibrin 증착의 다른 패턴을 발휘하는 대조군, CTEPH-PAEC 및 HUVEC와 같이 건강한 기증자에서 파생된 IC와 직접 비교에서 확인할 수 있는 질병 특정 특성을 유지합니다.
다른 프로토콜과는 달리, 이 시스템은 전혈을 사용하는 반면, 다른 시스템은 혈소판 및백혈구(19,,20,,21)와같은 단일 혈액 성분과 EC 상호 작용을 연구한다. 둥근 혈관 기하학 및 부드러운 세포외 매트릭스를 가진 혈관 모형에 있는 내피 기능의 연구를 허용하는 더 진보된 미세 유체 모형이 개발되었습니다. 그러나, 이들은 HUVEC40,,41,,42로최적화됩니다. 설명된 프로토콜의 참신은 전혈전과 결합된 1차 IC의 사용으로, 생체 내 에서 한 걸음 더 가까이 시투 혈전증의 모델링을 가져오는 것이다. 환자 유래 EC 및 환자 유래 혈액의 사용을 위한 프로토콜을 최적화한 결과 시험관 내질병 모델링을 더욱 최적화하여 개인화된 혈전 형성 및 약물 치료를 평가할 수 있습니다.
기술된 프로토콜은 환자 유래 세포에 대한 항응고 요법의 효과를 연구하기 위해 적용될 수 있다. 우리는 혈전 형성을 억제하기 위해 다비가트란을 사용했지만, 응고 폭포에서 인자 Xa를 직접 억제하는 리바록사반과 같은 다른 항응고제를 사용할 수 있습니다. 클로피도그렐 또는 아스피린과 같은 직접 혈소판 억제제는 혈소판이 IC에 결합하는 헤모스티스의 1차 단계에 작용하기 때문에 연구될 수 있습니다. 궁극적으로, 환자의 혈액과의 상호 작용에서 환자 특정 ECs의 혈전 생성 용량은 개별 환자에 대한 항 응고 치료의 개인적인 효과를 예측하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 특정 단백질의 녹다운은 추가 적인 기능 정보를 제공할 수 있습니다.
성공적인 관류 실험에 중요한 설명된 프로토콜에는 몇 가지 단계가 있습니다. 첫째, 1차 세포의 격리 중에 매우 순수한 EC 배양을 얻을 필요가 있다. 둘째, EC가 안정적인 컨실릭 모노레이어를 형성하는 것이 중요합니다. 그렇지 않은 경우, 전단 응력의 약간의 변화는 응고 캐스케이드의 내피 손상 및 활성화를 일으킬 수 있으며, 또는 혈소판은 지하 막에 결합을 시작할 수 있으며, 이는 거짓 양성 결과를 제공할 것이다. 셋째, 기포를 방지하는 것이 필수적이며, 이는 내피를 손상시키고 그 결과로 영향을 미칠 수 있기 때문에.
염화칼슘과 염화 마그네슘으로 정산 혈액을 재보정한 후, 즉시 관혈 실험을 시작하는 것이 중요하다. 회화는 혈소판 활성화 및 혈전 형성에 있는 급속한 반응을 유도하고, 견본에 있는 빠른 응고의 결과로.
결론적으로, 우리는 혈전증 도중 전체 혈액 내피 세포 상호 작용을 공부하기 위하여 고도로 다재다능한 프로토콜을 기술합니다.

내피는 혈관의 내세포 층을 형성하고 주변 조직으로부터 혈액을 분리합니다. 그것은 적극적으로 마이크로 환경을 조절하고 외부 자극1에반응동적 기관으로 설명되었다. 흐르는 혈액과의 직접적인 접촉으로 인해 내피는 혈전및 혈전증의 조절에 중추적인 역할을 하며 혈소판 응집, 응고 및 세혈2를제어하는 많은 주요 규제 분자의 주요 공급원입니다. 건강하고, 비활성화되지 않는 내피 세포(EC)는 혈소판 활성화를 중화하고 프로스타시클린, 혈전보모둘린 또는 조직 인자 통로 억제제(TFPI)2,3과같은 혈류를 유지하기 위해 응고 및 혈전 형성을 방지하는 여러분자를 생산한다. 이것은 혈소판, 혈소판 응집 및 혈전 형성의 접착을 방지합니다. 혈관 벽의 부상 또는 활성화는 국소화된 혈소판 접착 및 응고 형성2,,4를시작하는 프로코아굴란트 내피타입을 초래한다. 내피 활성화 혈소판이 폰 윌레브란트 팩터(VWF)를 부착하면, EC에서 방출되는 다혈성 단백질또는 기본 서브엔도피알 매트릭스의 노출된 결합 부위에 부착된다. 이어서, 혈소판의 분자 변화와 조직인자(TF)에 대한 노출은 응고 시스템의 활성화를 개시하여, 이는 피브린중합제5,,6에의한 혈전 형성을 유도한다. 함께, 결과 응고는 재내피화7에의한 상처 폐쇄의 기초를 제공한다. 응고 시스템의 왜곡은 폰 윌레브란트 질병, 혈우병 또는 혈전증과 같은 출혈 장애를 초래할 수 있으며, 이는 종종 내피 성 혈전 경로2,,3의난독증 프로 및 항혈전성 균형에서 비롯된다.
hemostasis의 과정은 동맥 및 정맥 순환 모두에서 발생합니다. 그러나, 동맥 및 정맥 혈전증의 근본적인 기계장치는 근본적으로 다릅니다. 동맥 혈전증은 허혈성 심장 질환에서 볼 수 있듯이, 주로 높은 전단 스트레스의 조건에서 죽상 경화성 플라크의 파열에 의해 구동되지만, 정맥 혈전증은 주로 정지8,,9,,10의조건에서 내피 손상의 부재에서 발생합니다. 깊은 정맥 혈전은 폐 색전증을 일으키는 폐 동맥쪽으로 색전및 여행할 수 있습니다. ,이는 만성 혈전색전성 폐고혈압(CTEPH)11,12,13,14의발달을 포함하여 초닉 폐 질환의 발달을 촉진할 수 있는 유의한 기능성 용량으로 이어지는 만성 혈관 방해가 발생할 수있다., CTEPH는 혈전색전성 물질에 의한 폐동맥의 방해로 인한 높은 폐압이 특징이며, 적어도 3개월간의 항응고요법(15)에따른다. 폐 색전증 이외에, 폐 내피는 CTEPH에서 혈전증과 폐 동맥의 만성 장애물을 용이하게 하는 in situ 보혈증 환경을 제공한다고 가정되어 궁극적으로 치료되지 않은경우 16,,17.
지난 몇 년 동안, 다양한 연구는 혈소판 기능 및 응고 를 측정하여 혈전 형성을 검사하는 애약의 개발을 주도하고있다18. 그러나, 그들 대부분은 콜라겐 또는 피브린과 같은 단일 세포 외 매트릭스 구성 요소와 전혈의 상호 작용을 연구하거나 내피 혈소판 또는 내피 -백혈구 상호 작용19,,20,,21,,22와같은 단일 혈액 성분과의 상호 작용에서 내피 기능을 연구한다. 이러한 분석서는 이러한 세포가 쉽게 얻을 수 있기 때문에 인간 배꼽 내피 세포(HUVEC)로 가장 일반적으로 수행됩니다. 그러나, 혈전성 유전자는 혈관나무, 혈관 유형 및 장기시스템(23,,24)을통해 분화되어, 이는 HUVEC를 사용하여 동맥 혈전증 또는 폐 색전증에 관여하는 내피 세포를 나타내게한다(23).
EC 가소성 이외에, 질병 별 혈역학적 변화 및 혈관 형태에 있는 변경은 일반적인 내피성(25)에서혈전 형성을 촉진할 수 있습니다. 높은 전단 속도, 때문에 국소 혈관 수축 또는 혈관 기하학의 변화, 예를 들어, 급성 혈전 형성을 초래할 수 있습니다, 혈류의 중단을 가속화 협착증을 일으키는(26). 맞춤형 마이크로 엔지니어링 유량 채널을 사용하면 (patho) 생물학을 대표하는 혈관 기하학을 구체적으로 설계할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 건강하거나 병든EC(27)에대한 국소 생체역학력의 효과를 연구할 수 있다.
응고 폭포에 있는 다른 단계 및 분자를 표적으로 하기 위하여 유효한 항응고 치료가 있습니다, 이는 모든 특정 무질서에 특정한 특정 한 리스크 및 이득을 제기합니다. 이 논문에 설명된 질병 모델링의 접근은 혈전 역학에 대한 다양한 항응고 및 항혈소판 치료의 효과를 테스트하는 데 특히 적합합니다.
목표는 1 차적인 IC를 포함하는 혈전증의 모형을 제시하는 것입니다, 사용된 1 차적인 IC의 모형에 따라 혈전증의 각종 양식의 분석에 적합한 다목적 모형을 산출하는 것입니다. 그림으로, 우리는 혈전 형성에 관여하는 모든 구성 요소 (혈소판, 백혈구, 적혈구, 응고 단백질 및 공동 인자)를 포함하는 전체 인간 혈액과 상호 작용에 CTEPH 환자에서 폐 동맥 내피 세포를 사용했다. 이 방법은 상업적 병렬 흐름 채널 또는 특정 혈관 설계를 가진 맞춤형 미세 유체 흐름 채널에 적용될 수 있습니다. 이와 같이, 모델은 결국 혈전 형성 및 해상도의 연구, 질병 모델링의 염증 반응 평가, 항혈소판 또는 항응고 요법, 궁극적으로 개인화 된 의학에 사용될 수 있습니다.
이 연구는 1 차적인 인간 폐 동맥 내피 세포의 격리를 기술합니다. 다른 1차 인체 내피 세포 유형의 분리를 위해, 우리는 폐 미생물 내피세포(25),인간 배빌루칼 정맥 내피세포(28)및 혈액 순환 내피 내피 세포 형성 세포를 포함하는 이전에 발표된 방법을 지칭한다.29

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>20 mL 주사기</td><td>BD</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>20X 대물렌즈</td><td>Olympus</td><td>N1492900</td><td>LUCPLFLN20XPH/0.45</td></tr><tr><td>2-프로판올(IPA)</td><td>붐</td><td>760514555000</td><td></td></tr><tr><td>알라딘 주사기 펌프</td><td>워드 정밀 기기</td><td>AL-4000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488-Fibrinogen</td><td>Invitrogen</td><td>F13191</td><td>15 ug/mL</td></tr><tr><td>Alexa647-Goat anti Rabbit</td><td>Invitrogen</td><td>A21245</td><td>1:100</td></tr><tr><td>생검 펀치 1mm 직경</td><td>Ted Pella</td><td>15110-10</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM-Red</td><td>Invitrogen</td><td>C3099</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>CD42b-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-208</td><td>1:100</td></tr><tr><td>구연산</td><td>Merck</td><td>100244</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 I형, 쥐 꼬리</td><td>Corning</td><td>354249</td><td>0.1 mg/mL</td></tr><tr><td>Corning CellBIND 표면 60 mm 배양 접시</td><td>Corning</td><td>3295</td><td></td></tr><tr><td>직교류 후드</td><td>Basan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Duran</td><td>2478269</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Merck</td><td>14431-43-7</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Medium (ECM)</td><td>ScienCell</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin Human Plasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>Flow tubing</td><td>ibidi</td><td>10831, 10841</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Merck</td><td>104070</td><td>0.1%</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>미크론 슬라이드 VI 0.4 플로우 챔버</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>v1.49</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>실험실 오븐</td><td>Quincy</td><td>10GC</td><td></td></tr><tr><td>LS720 형광 현미경</td><td>Etaluma</td><td>LS720</td><td></td></tr><tr><td>Luer 커넥터</td>, <td>ibidi</td><td>10802, 10825</td><td>수 엘보 커넥터, 암 튜브 커넥터,</td></tr><tr><td>MACS 마그네틱 비드(anti-CD144)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-857</td><td>1:5</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드, 76 x 26 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAAA000001##12E</td><td></td></tr><tr><td>네거티브 포토레지스트, SU-8</td><td>Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids (NEAA)</td><td>Lonza</td><td>13-114E</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 (PFA)</td><td>Merck</td><td>818715</td><td>4% PFA in PBS</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 (P/S)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>1%</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>칼슘 또는 마그네슘</td></tr><tr><td>플라즈마 없음 챔버, CUTE</td><td>Femto Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리디메틸실록산(PDMS), Sylgard 184</td><td>Dow</td><td>101697</td><td></td></tr><tr><td>구연산나트륨 채혈</td>관 <td>BD</td><td>363048</td><td></td></tr><tr><td>구연산삼나트륨</td><td>Merck</td><td>106448</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA(0.05%), 페놀 레드</td><td>Gibco</td><td>25300-045</td><td></td></tr><tr><td>VE-Cadherin(D87F2)-XP</td><td>세포 신호 전달</td><td>2500</td>년 <td>1:300</td></tr></tbody></table>발표

시험관 에서 미세 유체 질환 모델 전체 혈액 내피 상호 작용 및 혈전 역학을 실시간으로 연구

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

혈전의 형성은 내피 세포, 그들의 근본적인 매트릭스, 각종 혈액 세포 및 단백질 사이 복잡한 상호 작용을 관련시킵니다. 내피는 혈소판 응집, 응고 및 세혈을 제어하는 많은 주요 혈전 성 분자의 주요 소스입니다. 혈전증의 기계장치가 수십 년 동안 조사되었지만, 체외 연구는 주로 체내 성 매트릭스가 노출되는 혈관 손상의 상황 또는 단일 혈액 성분을 가진 세포 간의 상호 작용에 초점을 맞춥니다. 우리의 방법은 전혈과 손상되지 않은, 컨할 수 있는 혈관 세포 네트워크 사이의 상호 작용을 연구할 수 있습니다.
1 차적인 인간 내피 세포를 이용함으로써, 이 프로토콜은 혈전 역학에 내피 세포의 영향을 연구하고 혈전증 질병의 병생리학에 귀중한 통찰력을 제공하는 유일한 기회를 제공합니다. 맞춤형 미세 유체 흐름 채널을 사용하면 질병별 혈관 기하학을 적용하고 특정 형태학적 혈관 변화를 모델링할 수 있습니다. 혈소판 부착 및 피브린 증착을 특징으로 하는 혈소판 의 발달은 실시간으로 기록된다. 변경된 혈전 역학에서 내피 기능의 효과는 특정 분자의 면역 형광 염색을 통해 사후 분석에 의해 결정됩니다.
대표적인 결과는 실험 적인 설정, 데이터 수집 및 데이터 분석을 설명합니다. 연구 질문에 따라 세포 유형, 전단 속도, 채널 지오메트리, 약물 치료 및 사후 분석 절차를 포함하여 모든 섹션에 대한 매개 변수를 조정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 만성 혈전색전성 질환 환자의 폐 동맥 내피성상에 혈전 형성을 정량화함으로써 검증된다.

대표적인 결과는 각각 실험 설정, 데이터 수집 및 데이터 분석의 각 단계를 나타내는 세 부분으로 나눌 수 있습니다. 연구 질문에 따라 각 단계에 대한 매개 변수를 변경할 수 있습니다. 제시된 데이터는 혈전 형성에 대한 내피의 영향을 연구하기 위해 적용됩니다.
실험 설정 내피 세포는 건강과질병(23)에서위치 및 시간에 따라 구조및 기능에 매우 이질성이 있다는 것이 잘 확립되어 있다. 내피 세포의 다양한 공급원은 내피 상호 작용을 연구하는 데 사용될 수 있으며, 이 경우 시판적으로 사용 가능한 HUVEC 및 PAEC(도1A). HUVECs는 실험실 모형에서 가장 일반적으로 이용되고, PAIC는 폐 동맥에서 환자 유래 한 고립된 세포인 동안. 더욱이, 폐순환 또는 혈액 순환성 내피 콜로니 형성 세포(ECFC)25,28,29로부터미생물 내피 세포(MVEC)를 분리할 수 있는 잘 확립된프로토콜이있다.
격리 후, 내피 세포는 내피형을 확인하기 위해 VE-cadherin, CD31 및 TIE2 염색을 특징으로 하였다. αSMA 및 사이토케라틴의 존재에 대한 특성화는 섬유아세포 또는 상피와 같은 표현형(도1B)의부재를 나타냈다. EC의 고순수 인구를 얻은 후, 3-5세포를 통과하여 상용 마이크로슬라이드 또는 맞춤형 미세유체 흐름채널(도 1C)을시드하는 데 사용되었다. 시판되는 마이크로슬라이드는 주로 평행 유량 챔버, 또는 높이 또는 분기 각도에서 특별히 정의된 파라미터를 가진 Y자형 채널이지만, 미세유체 슬라이드를 사용하면 생체 내 혈관 기하학 및 혈류역학(31)에실험 파라미터를 조정할 수 있다. in vivo 그러나, 맞춤형 미세유체 크기는 더 작고 세포 확산을 제한하고 더 많은 세포 사멸을 유도하는 경향이있다 32,,33. 셀의 잉여를 사용하면 셀의 작은 비율만 부착된다는 사실을 보상합니다. 이는 협착증이 도입되었을 때 관찰되었으며, 여기서 내피 세포는 병렬 미세 유체채널(도 1D)에비해 더 긴 표현형을 보였다. 상업용 유량 챔버는 세포가 결합할 수 있는 더 큰 표면적을 가지고 있습니다. 이렇게 하려면 시드를 위한 세포 수가 줄어듭니다.
내피 상호 작용을 연구하기 위해, 전체 혈액은 내피 단층 위에 퍼져졌다. Citrated 혈액은 실험 당일과 관류가 재발하기 직전에 수집되었다. 세포는 관류 전에 30분 전에 VWF 방출 및 혈소판 접착을 유도하기 위해 히스타민으로 자극하였다(도1E)34,,35. 작은 차원 때문에, 사용자 정의 만든 미세 유체 채널은 작은 혈액 볼륨의 사용을 허용했다.
데이터 수집 PAECs에 혈전 형성을 조사하기 위하여는, Calcein AM-Red 형광표시 혈액 세포 및 Alexa488-conjugated fibrin는 2.5 dyne/cm2 (그림 2A-C)에서5 분 동안 perfed되었습니다. 신봉혈액세포와 증착된 피브린은 정량화되었다. 이미지는 30s마다 획득되어 ImageJ로 정량화되었습니다. 비부착 된 혈소판의 자동 불광을 제거하기 위해 배경을 빼는 것이 중요했습니다. 임계값을 위한 삼각형 알고리즘은 최소한의 배경을 정의하는 데 사용되었습니다. 그것은 작은 혈소판 골재(도 2D)의측정을 허용했다.
예상, 비 자극 조건에서, 내피혈소판과 피브린의 결합이 없었다. 폭스바겐F 방출 및 혈소판 결합을 촉진하기 위해 PAECs는 히스타민으로 자극되어 2.5 분 후에 고원에 도달한 혈소판 접착력이 즉시 증가했습니다. 이 때, 혈소판은 혈소판 응집및 피브린로 혈소판 응집 및 fibrinogen 분열을 유도하는 자동 크리인 인자를 분비하기 시작했다. 피브린은 3분 후에 증착되었고 4분 후 혈소판으로 안정적인 골재를 형성하였다(도2E).
이 효과가 직접적인 경구 항응고제(DOAC)에 의해 억제될 수 있는지 여부를 조사하기 위해 혈액은 10 nM 다비가트란으로 치료되었다. 다비가트란은 응고 경로에서 인자 IIa를 억제하고 피브린 섬유를 형성하기 위해 피브리노겐의 분열을 방지하는 혈액 희석에 첨가되었다. 다비가트란 처리혈액이 자극된 PAEC에 침투했을 때, 혈전 형성은 피브린 증착을 지연시킴으로써 주로 직접적으로 억제될 수있다(도 2F).
데이터 분석 혈전 형성에 대한 다양한 내피 소스의 영향을 연구하기 위해 5 분 혈액 관류시 세포 변화가 분석되었습니다. 내피는 고정되었고 응집성 혈소판은 공초점 현미경으로 이미징하기 전에 CD42b로 표시되었다. 이것은 혈액에 있는 기능 장애 응고 요인을 나타낼 수 있는 혈소판 및 fibrin의 colocalization를 위한 상세한 분석을 제공했습니다. 응고 형성에서 EC의 영향은 표준 면역 형광 염색에 의해 결정되었다. 내피 세포-세포 접촉은 VE-cadherin 염색에 의해 확인된 바와 같이 유지되었으며, 내피 갭 사이의 기본 매트릭스보다는 내피 단층 위에 형성된 혈전이 있음을나타낸다(도 3). 더욱이, 상이한 세포 근원의 사용은 내피에 형성하는 혈전의 상이한 패턴 귀착되었다. HUVECs는 정맥 내피 세포이고 제한된 혈소판 접착 및 피브린 증착을 보였으며, CTEPH 환자로부터 병에 걸린 1 차 PAEC는 건강한 PAEC에 비해 히스타민 자극에 풍부한 혈소판 부착 및 더 많은 피브린 증착을 보였다. 이것은 CTEPH 환자의 내피성이 증가한 혈전 대형 결과 혈관 활성화에 더 높은 반응성을 보여줍니다 건의합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61068/61068fig1.jpg"> 그림 1: 프로토콜의 회로도 개요입니다. (A)다양한 소스와 상이한 유형의 내피 세포는 관류 실험을 위한 미세유체 흐름 채널에서 사용을 위해 분리및 배양되었다. 내피 세포의 다른 모형의 대표적인 밝은 필드 심상. 스케일 바 = 50 μm.(b)절연 된 세포는 내피성 표현형을 확인하기 위해 면역 형광 염색을 특징으로하였다. 스케일 바 = 50 μm.(C)셀은 상업용 유량 슬라이드 또는 맞춤형 마이크로 유체 채널에서 시드될 수 있습니다. (D)다양한 채널 기하학에서 자란 HUVEC의 대표적인 브라이트필드 이미지. 스케일 바 = 50 μm.(E)혈액 관류 실험의 실험 설정. 정액 혈액을 채취하고, 식염수 완충제로 희석하고, 주사기 펌프로 내피 세포에 침투하였다. 이 그림의 폐와 배꼽 정맥은 창조적 인 공통 저작자 3.0 일반 라이센스에 따라 허가 된 세르비어 의료 예술에서 수정되었습니다. http://smart.servier.com/이 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61068/61068fig1large.jpg" target="_blank">그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61068/61068fig2.jpg"> 그림 2: 혈전 형성의 이미지 수집 및 정량화. (A)부착된 칼신 AM-레드 라벨혈소판과 1, 3, 5분에 부착된 Alexa488-conjugated fibrin의 대표적인 시간 경과 영상자극을 통해 자극되지 않은 PAEC(B)와 히스타민 자극 PAIC를 통해 전혈 후 1, 3, 5분.B (C)혈소판 부착 및 피브린 증착의 대표적인 타임랩스 이미지는 히스타민 자극 PAEC에 침투하는 다비가트란으로 배양된 전혈으로 1, 3, 5분 동안 관류를 가중시켰다. 스케일 바 = 50 μm.(D)ImageJ에서 이미지 정량화의 회로도 개요. (E)자극되지 않은 히스타민에 대한 매 30s마다 혈소판 부착 및 피브린 증착의 정량화는 내피를 자극하였다. (F)혈소판 부착 및 피브린 증착에 의해 정량화된 혈전 형성에 대한 다비가트라의 효과를 정량화한다. 데이터는 평균 ± SD, n = 3으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61068/61068fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61068/61068fig3.jpg"> 도 3: 내피 세포에 혈소판 부착 및 피브린 증착에서 혈전 형성을 특성화하기 위한 유동 실험의 대표적인 공초점 영상. 내피 세포-세포 접접촉은 VE-cadherin에 의해 특징지어지고 제어 PAECs, 환자 유래 CTEPH PAECs 및 HUVEC에서 측정되었습니다. 스케일 바 = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61068/61068fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리는 환자 유래 내피와 전혈 상호 작용을 조사하기 위하여 체외 혈관 질병 모형을 제시합니다. 이 시스템은 다양한 상황에서 1 차적인 내피 세포의 혈전 생성 특성의 연구를 허용합니다. 이 방법은 응고의 상이한 단계 도중 시혈전증 및 항응고 요법에서 평가하기위하여 특히 적합합니다.

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...

이 체외 질환 모델은 혈전성 및 항응고제의 효과를 평가하기 위해 전혈 및 환자 유래 세포의 상호 작용을 연구하는 데 사용될 수 있다. 이는 내피 세포가 다양한 상황에서 사용될 수 있으며, 맞춤형 미세유체를 도입하거나 혈류 파라미터를 조정하여 수정할 수 있다. 또한,이 모델은 염증 조건에서 혈전 역학을 연구하거나 항응고제 및 항혈소판 치료의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.궁극적으로, 이러한 접근 법은 개인화 된 의학의 방법으로 사용할 수 있습니다. 외과 인간 폐 동맥 조직 샘플을 얻은 후, 밀리리터 피보로넨틴 당 5 마이크로그램의 2 밀리리터와 결합 하는 60 밀리 리터 세포 배양 접시를 코팅 하 고 적어도 15 분 동안 섭씨 37도에서 접시를 배양. 인큐베이션의 끝에서, 멸균 조건하에서 라미나르 흐름 캐비닛에 멸균 포셉을 사용하여 조직을 PBS의 페트리 접시로 옮겨 넣습니다.조직이 여전히 고리에 있는 경우 내피가 쉽게 손상되고 제거되기 때문에 혈관의 가장 안쪽 층을 만지지 않도록주의하면서 가위로 동맥을 잘라냅니다. fibronectin을 제거 한 후, 접시에 완전한 내피 세포 배지의 4 밀리리터를 추가하고 매체로 조직 샘플을 전송하는 집게를 사용하여 메스를 사용하여 혈관의 내부 층을 배지로 조심스럽게 긁어 내고 용기 벽에서 관찰되는 지질 축적을 피하기 위해주의를 기울입니다. 세포가 수확된 후에는 접시를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다.섬유아세포가 배양을 오염시면 제조업체의 지시에 따라 CD144에 자기 친화성 세포 분리를 사용하여 세포를 정화합니다. 일반적으로 배양은 순수하게 정의되며, 유동 세포측정이 10% 이하의 오염 세포를 감지할 때. 내피 세포의 충분한 수가 실험용으로 수득되었을 때, 1차 내피 세포는 내피 세포 특이적 마커의 존재와 부드러운 근육 및 상피 세포 마커의 부재를 특징으로 할 수 있다.유량 챔버 준비를 위해, 0.1%젤라틴30 마이크로리터로 6개의 웰 플로우 슬라이드의 1개의 채널을 코딩하고 이 슬라이드를 섭씨 37도에서 최소 15분 동안 배양합니다. 상용 유량 챔버 외에도 특정 치수를 가진 맞춤형 유동 챔버를 사용하여 혈전 역학에 대한 혈관 형상의 영향을 연구할 수 있습니다. 슬라이드가 인큐베이팅되는 동안, EDTA와 트립신 및 퇴적물을 가진 컨물류 내피 세포 배양으로부터 세포를 수집하고, 전체 내피 세포 배지의 600 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 100 마이크로리터의 세포를 각 채널에 추가, 추가로 50 마이크로리터를 추가, 전체 세포 채널의 마이크로 리터를 추가, 내측 세포의 추가 50 마이크로 리터를 추가, 내측 세포의 마이크로 리터 를 추가, 전체 세포 의 마이크로 리터를 추가, 전체 세포의 마이크로 리터를 추가, 전체 세포 의 마이크로 리터를 추가, 전체 세포의 마이크로 리터를 추가, 전체 세포의 마이크로 리터의 추가 500 마이크로 리터 , 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%에서 하룻밤 잠복에 충분한 매체를 제공하기 위해 다음 날 배지를 변경하여 언바운드 세포를 씻어내도록 한다.배양 6일 후, 세포는 안정적인 컨실릭 단층층을 형성했어야 한다. 폐 동맥 내피 세포 배양의 7 일째에, 109 개의 단일 나트륨 구질항제 항응고제 튜브로 항응고 치료를받지 않는 피험자로부터 정맥 혈액 샘플을 획득하고 혈액을 50 밀리리터 튜브로 옮긴다. 혈액은 바이러스 및 그밖 전염하는 에이전트를 포함할 수 있습니다.따라서 항상 장갑을 착용하고 인간의 재료로 작업하기위한 안전 지침을 따르는 것이 중요합니다. 형광으로 1 에서 10, 000 농도의 칼신 AM 레드와 밀리리터 당 50 마이크로 그램의 혈액 세포를 표시하고 알렉사 488 fibrinogen을 추가 한 다음 완전한 흡수를 허용하기 위해 섭씨 37도에서 혈액을 배양합니다. 관류 30분 전에 내피 세포 배지에 1개의 마이크로몰라 히스타민의 100마이크로리터와 다른 첨가제 없이 1%의 태아 소 혈청을 가진 폐 동맥 내피 세포를 치료하십시오.그리고 워시 버퍼로 채워진 20 밀리리터 주사기를 사용하여 유동 시스템 튜브를 헹굴하고, 세 번째에서 20 밀리리터 주사기를 세척 버퍼 2밀리리터로 적재하고 주사기를 주사기 펌프에 적재합니다. 두 번째 20 밀리리터 주사기를 사용하여 히피와 1%소세럼 알부민을 함유한 버퍼와 1%의 소굴 알부민을 포함하는 버퍼를 채우고 팔꿈치 모양의 로라 커넥터를 사용하여 튜브를 마이크로 슬라이드에 조심스럽게 연결하고 슬라이드의 출구를 주사기에 연결하고, 슬라이드의 출구를 주사기에 연결하고, 슬라이드를 무대에 배치하여 현미경 검사용에서 수리하여 실험을 위한 세트를 조립합니다. , 현미경을 조정하고 이미징을위한 매개 변수를 설정합니다. 단호한 피의 회화.그리고 이것은 응고의 행복한 공동 후원자이며, 내피 세포 층을 손상시키고 결과에 영향을 미치기 때문에 기포 형성을 피하십시오. 관류 직전에, 회화 완충으로 혈액을 두 번 희석하고 마이크로 슬라이드의 입구 튜브를 혈액 튜브에 넣고 주사기 펌프에서 시작합니다. 혈액이 내피 위로 흐르기 시작하자마자 현미경을 눌러 미리 선택된 활성 채널 및 관심 위치 영역을 사용하여 이미지를 수집하여 5 분 동안 15 초마다 이미지를 얻습니다.분석이 끝나면 레코딩과 주사기 펌프를 중지하고 제대로 청소하십시오. 칼신 AM 레드와 알렉사 488 접합 피브리노겐의 첨가와 소소판을 라벨링, 혈소판 부착 및 섬유 및 증착에 의해 혈전 형성의 조사를 허용. 비 자극 조건에서, 내피류에 혈소판 또는 피브린의 결합이 없습니다.히스타민을 가진 자극은 혈소판 유착의 즉각적인 증가를 초래하며, 이는 2.5 분 후에 고원에 도달하며,이 시점에서 혈소판 응집 및 피브리노겐 분열을 유도하는 자가 크린 인자를 분비하기 시작하여 3 분 후에 섬유 및 증착을 초래하고 4 분 후에 혈소판으로 안정적인 골재의 형성을 초래합니다. 직접 항응고제로 치료하는 것은 치료되지 않은 혈액에 비해 응고 형성과 혈소판 접착력을 모두 억제합니다. 폐 동맥 내피 세포 혈소판 상호 작용의 면역 형광 분석은 5 분 후 내피 세포 혈소판 상호 작용을 밝혀, 내피 세포의 유지 보수를 밝혀, 세포 접촉, 혈관 내피 카헤린 염색에 의해 확인, 내피 모델 층에 혈전 형태보다는 내피 성 모형 층에 형성되는 것을 나타내는 오히려 내피 갭 틈새 사이의 기본 매트릭스에.인간 탯줄 정맥 내피 세포는 폐 동맥 내피에 비해 혈소판 부착 및 피브린 증착을 적게 보여줍니다. 특히, 만성 혈전색전성 폐 고혈압 환자로부터 병에 걸린 1차 폐 동맥 내피 세포는 건강한 세포에 비해 혈소판 부착및 더 많은 피브린 증착을 나타낸다. 내피의 혈전성혈관은 혈관 침대의 기원 또는 생물학적 배경의 부분과 같은 여러 요인에 의존한다.이 프로토콜을 사용하여 혈관 및 혈액 성분의 본질적인 기능 장애뿐만 아니라 항 응고 요법의 효과는 혈전증 혈전증 혈전증 의 다른 단계에서 테스트 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 혈액 과 테오 상호 작용을 이해하는 데 사용할 수 있습니다, 항 응고 치료에 환자 특정 반응을 예측하는 궁극적 인 잠재력을 가진 다양한 혈전색전성 질환.

in-vitro-microfluidic-disease-model-to-study-whole-blood-endothelial

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

microvascular 크기의 채널 (&lt;30 μm의)와 microfluidic 장치의 전체 내부 3D 표면에 걸쳐 문화 내피 세포 단일층를하는 방법이 설명되어 있습니다.

Hematologic 질환의 Microvascular 상호 작용 유학을위한 Endothelialized Microfluidics

마이크로 - 온 - 칩 플랫폼은 포토 리소그래피 리플 로우 레지스트 기술, 소프트 리소그래피, 그리고 미세 유체의 조합에 의해 개발되었다. endothelialized 마이크로 플랫폼은 생체 내 미세 혈관에서의 3 차원 (3D) 구조를 모방 제어 지속적인 혈류의 흐름에서 실행하고, 고품질의 실시간 영상을 허용하고 미세 혈관 연구에 적용 할 수 있습니다.

멀티 깊이 원형 단면 Endothelialized 마이크로 채널 - 온 - 칩의 개발을위한 절차

인간의 혈관 혈액 상호 작용을 조사하기 위한 신뢰할 수 있는 모델의 접근성이 부족합니다. 우리는 혈액(ELISA)과 혈관 구획(현미경) 모두에서 세포 상호 작용을 조사하기 위해 인간 전혈과 결합된 배양된 1차 인간 내피 세포의 체외 모델을 제시합니다.

소설 시험관 인간의 전체 혈액과 내피 세포 사이의 상호 작용 유학을위한 모델

이 프로토콜은 질환 병상의 세포 응답을 결정하는 데에 도움이 시험관 내에서 생리 학적 또는 병리학 적 혈류를 복제. 혈액 펌프의 하류 챔버 압력 감쇠를 도입하여, 맥관 걸쳐 혈류량 효과적으로 요약 될 수 있고, 혈관 내피 또는 유사체 공동 배양 단층 부과.

혈관 세포 리모델링의 조사에 생리의 체외 모델 및 응용 프로그램과 함께 병리학 혈액 흐름

혈소판 수혈 및 지혈은 혈액 은행 혈소판의 기능을 조사하기 위해 혈액 재구성 및 미세유체 유동 챔버를 사용하여 모델링되었습니다. 이 데이터는 혈소판 저장 병변이 지혈에 미치는 영향을 in vitro에서 보여줍니다.

미세 유체 흐름 챔버 지혈 및 혈소판 수혈을 모델링하기 위해 재구성 된 혈액을 사용하여<em&gt; 체외</em

1차 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)는 미세유체 네트워크 장치 내에서 합류하도록 성장했습니다. 내피 세포 접합부와 F-액틴 분포를 설명하고 아데노신 삼인산(ATP)에 대한 반응으로 세포 내 칼슘 농도 및 산화질소 생성의 변화를 개별 세포 수준에서 실시간으로 정량화했습니다.

개발 및 특성화의<em&gt; 체외</em&gt; 미세 혈관 네트워크 및 내피의 정량적 측정 [칼슘<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; 전</sub&gt; 및 질소 산화물 생산

이 논문은 동시에 혈소판 기능과 응고를 측정 지혈의 실험 모델을 설명합니다. 혈소판 및 피브린 형광을 실시간으로 측정하고, 혈소판의 부착 율, 응고 속도 및 응고의 개시가 결정된다. 모델은 수혈 농축 플로우하에 혈소판 응고 특성을 결정하는데 사용된다.

혈소판 수혈 및 지혈을위한 미세 유체 유량 용기 모델은 실시간으로 혈소판 증착 및 섬유소 형성을 측정합니다

우리는 전체, 비 anticoagulated 혈액에서 응고의 분석과 연구를 허용 하는 체 외에서 모델 제시. 그리고 시스템에 anticoagulation 건강 한 내 피 세포의 자연 anticoagulation 효과에 따라 내 피 세포 활성화 응고 귀 착될 것 이다.

3D 세포 배양 및 비 anticoagulated 전 혈을 사용 하 여 내 피 세포의 항 응 혈 약 그리고 항 염증 제 속성에 대 한 평가

여기에 제시된 시험관 내 혈역학 루프 모델에 대한 표준화된 프로토콜이 있습니다. 이 모델은 ISO(국제표준화기구) 표준 10993-4에 따라 관류 관 또는 혈관 스텐트의 혈중 호환성을 테스트할 수 있습니다.

혈관 의료 기기의 혈혈성 호환성 및 호스트 세포 활성화를 조사하는 시험관 헤모역학 루프 모델

체외 혈전용해 분석은 소화되는 모델 혈전이나 혈전용해가 발생하는 환경에서 생체 내 조건을 복제하는 데 어려움을 겪는 경우가 많습니다. 여기에서는 챈들러 루프와 RT-FluFF(Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay)를 결합하여 고충실도, 생체 외 혈전 용해 모니터링을 수행하는 방법을 살펴봅니다.

체외 혈전용해 모델에서 전단 흐름에 따른 Chandler Loop-Formed 전혈의 Fibrinolysis 추적

여기서는 내피세포를 동기화된 진동성 고혈당과 맥동성 전단 스트레스에 노출시키는 마이크로유체 시스템을 제작하고 작동시키는 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 당뇨병 내피 기능 장애 연구를 위한 생리학적으로 적합한 시험관 내 모델을 제공합니다. 이 프로토콜은 산화 스트레스와 내피 세포 반응의 정량적 측정을 가능하게 합니다.

생리적 맥박성 전단 응력과 진동성 고혈당 하에서 내피 기능 장애를 모델링하는 마이크로플루이딕 시스템

배우세요 미세유체칩을 활용한 시험관 내 혈관 질환 모델로 전혈과 내피세포 상호작용 및 혈전 형성 역학을 실시간 분석하는 방법. 환자 유래 세포를 이용해 항응고제 효능을 평가하고 맞춤형 의료에 활용할 수 있습니다.

시험관 에서 미세 유체 질환 모델 전체 혈액 내피 상호 작용 및 혈전 역학을 실시간으로 연구

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