Name: 대장 HT29 유래 암 줄기 와 같은 종양스피어에서 드라이버 유전자의 발견 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: 발견하세요 RNA-Seq 및 생물정보학을 활용하여 HT29 유래 대장암 종양스피어에서 과발현된 드라이버 유전자를 식별하는 방법을 배우세요. 이 프로토콜은 암 줄기세포의 분자 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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저자는 방사선 연구 연구소의 방사선 생물학 핵심 연구소, 장궁 기념 병원, 기술 지원을 감사드립니다. 이 연구는 장궁 기념 병원 (CMRPD1J0321), 청 신 종합 병원 (CHGH 106-06), 맥케이 메모리얼 병원 (MMH-CT-10605 및 MMH-106-61)의 보조금에 의해 지원되었다. 자금 조달 기관은 연구 및 데이터 수집, 분석 및 해석 또는 원고 작성에 영향을 미치지 않았습니다.

1. 세포 배양 및 종양권 형성
<ol><li>배양 HT29 세포는 덜벡코의 변형된 독수리 배지(DMEM)를 함유한 10cm 접시에 10%의 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린-연쇄상구균 항생제(P/S)를 함유하고 있다.</li>
	<li>37°C에서 인큐베이터에서 세포를 5% CO2 및 95% 습도로 성장하여 80%의 합류에 도달할 때까지 무균 조건에서 습도를 증가시면 됩니다.</li>
	<li>37°C에서 5분 동안 0.25%의 트립신1mL로 HT29 세포를 트립시화하고, 결과적으로 10% FBS 및 1% P/S로 DMEM 2mL을 추가하여 트립신을 중화시한다.</li>
	<li>혈전계를 사용하여 HT29 세포를 계산합니다.</li>
	<li>2,000 개의 셀 /웰을 1 % P / S로 혈청이없는 DMEM 2 mL로 6 웰 플레이트에 추가하고 0.2 % B27로 보충하고, 표피 성장 인자 (EGF),20 ng/mL의 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 간세포 성장 인자 (HGF)의 20 ng/mL, 인터류키인 6 (IL6)의 20 ng/mL.</li>
	<li>무균 조건하에서 5% CO2 및 95% 습도로 37°C에서 세포를 성장시하십시오.</li>
	<li>종양권이 측정할 때까지 2일마다 0.5mL의 암 줄기세포 배지를 넣고 직경이 7일 이상 측정합니다.</li>
	<li>디지털 세포 이미징 시스템을 사용하여 반전된 현미경을 사용하여 종양권 직경을 관찰하고 측정합니다.</li>
	<li>종양권이 직경이 >100 μm에 도달하면 종양구를 0.25% 트립신으로 37°C에서 5분 동안 트립신을 시도하고 성장 배지의 2배 부피를 추가하여 트립신을 중화시한다. 혈전계를 사용하여 세포를 계산합니다.</li>
	<li>1,200 rpm에서 10 분 동안 원심 분리기를 제거하고 상체를 제거합니다.</li>
	<li>5 x 104 세포를 반 LGR5-PE 2 μL, 실온에서 30 분 동안 DMEM의 100 μL에서 2 μL의 안티 CD133-PE2를 200 rpm에서 흔들어 배양합니다. 참고: CD133은 HT29 세포에서 높게 발현되는 일반적인 암 줄기세포 바이오마커이다.</li>
	<li>PBS의 900 μL을 추가하고 유동 세포측정을 사용하여 LGR5 및 CD133 발현을 분석합니다. FL2-H 채널에서 형광의 변화는 유전자 발현을 나타낸다.</li>
</ol>2. RNA 절연
참고: 제조업체의지침에 따라 RNA 격리를 위한 빠른 컬럼이 있는 상용 키트(재료 표 참조)를 사용합니다.
<ol><li>수확된 셀(2 x 105 셀)에 PBS 50 μL을 추가하고 파이펫팅으로 다시 중단합니다.</li>
	<li>베타-메르카토에탄올(β-ME)의 2μL을 함유한 용해 버퍼 200 μL을 추가합니다. 소용돌이가 빠르게 5 분 동안 서보자.</li>
	<li>10분 동안 16,000 x g의 원심분리제. 상체를 수집하고 70% 에탄올의 200 μL과 섞는다.</li>
	<li>연결된 컬럼을 사용하여 1분 동안 14,000 x g에서 원심분리로 용매를 제거합니다.</li>
	<li>워시 용액 1과 2를 사용하여 세척하여 1 분 동안 14,000 x g에서 원심 분리로 비 RNA를 완전히 제거하십시오.</li>
	<li>잔류 에탄올을 제거하기 위해 2 분 동안 14,000 x g에서 다시 원심 분리기.</li>
	<li>증류수 50μL, 원심분리기 14,000 x g를 1분 간 추가하고 용액을 수집합니다.</li>
	<li>분광계로 OD260을 사용하여 RNA 농도를 측정합니다. RNA 농도(μg/mL) = (OD260)x(40 μg RNA/mL) 및 OD260/OD280 > 2. RNA 샘플에는 RNA 무결성 번호(RIN) > 7이 있어야 합니다.</li>
</ol>3. RNAseq 프로파일링 및 생물 정보학 분석
참고: RNAseq 분석은 부모 HT29 세포에 비해 HT29 유래 종양스피어에서 차동 유전자를 조사하기 위해 상업적으로 수행되었다(재료의 표참조).
<ol><li>도서관 건설, 도서관 품질 관리 및 DNA 시퀀싱을 포함한 RNAseq 단계에 상용 서비스를 사용합니다.</li>
	<li>데이터 보고서에는 읽기 수, log2 접기 변경 및 p 값을 비롯한 중요한 정보가 포함되어야 합니다. HT29 종양권 그룹에서 읽기 카운트 >100을 가진 유전자및 HT29 부모 그룹에서 판독 수 >-100을 가진 유전자 > 1 log2 접기 변경: 다음 매개 변수에 따라 차동 유전자를 선택합니다. 이 경우 p 값 & 0.05는 허용 가능한 것으로 간주되고 데이터가 사용되었습니다(표1). 참고: 여기서, 유전자 수 >100은 특정 유전자의 연구를 계속하고 그것의 발현을 검증하기 위하여 임계값으로 이용되었습니다.</li>
	<li>통계 분석 소프트웨어(재료표참조)를 사용하여 히트맵을 표시하고 과발현 유전자를 식별하고, 과다 조절유전자를 식별하고, 1개의 로그2 접이식 변화를 확인한다.</li>
	<li>R 소프트웨어를 사용하여 화산 플롯을 x로 그립니다: log2 접기 변경; y: -log10(p 값)을 사용하여 차동 유전자를 표시합니다.<ol>
<li>R 라이브러리 설치 설치.패키지(라이브러리(보정))</li>
		<li>RStudio의 데이터를 다음과 같은 프로그램으로 읽어보십시오. res &-read.csv ("/사용자/xxx.csv", 헤더=T) 헤드(res) (res, 플롯 (log2FoldChange, -log10 (pvalue), pch = 19, 메인 = "HT29CSC 대 HT29", xlim=c (-6,6), 콜 = "#C0C0C0"))) 와(하위 집합(리셋, pvalue&lt&.05 및 log2FoldChange>gt;1), 포인트(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="red")) 와(하위 집합(리셋, pvalue&lt&.05 & log2FoldChange&lt&(-1)), 포인트(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="블루"))) (하위 집합(res, pvalue>.05), 포인트(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="#444444")) 아브라인(h=1.3, lty=2) 아블린(v=1, lty=2) abline(v=(-1), lty=2)</li>
		<li>화산 플롯을 얻기 위해 실행을 실행합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 드라이버 유전자 선택
<ol><li>네트워크 분석가에서 단일 유전자 입력을 선택합니다.</li>
	<li>유기체 및 ID 형 공식 유전자 기호로 지정된 "인간"으로 표 1에서 선택된 과발현 유전자를 복사하고 붙여 넣습니다. 참고: 또는 복사 및 붙여넣기위해 Ensembl 진 ID를 사용합니다.</li>
	<li>업로드를 클릭하여 데이터를 삽입하고 유전자 PPI에 따른 단백질 단백질 상호작용(PPI)을 사용하여 분석합니다.</li>
	<li>900의 신뢰점수 컷오프로 STRING 상호작용성 데이터베이스를 사용하여 업로드된 유전자를 교차 연결하는 종자 유전자를 표시한다. 더 개별적인 유전자와 연관된 종자 유전자는 HT29 유래 종양권의 형성을 유지하는 데 관여할 수 있는 드라이버 유전자로 선택되었다. 참고: 사용하기 위한 상호작용데이터 집합은 IMEx, STRING 및 Rolland의 세 가지가 있습니다. STRING에는 더 높은 신뢰도 실험 증거가 포함되어 있습니다. 업로드된 유전자 수가 낮을수록 IMEx를 선택하여 인터랙토메 네트워크에서 드라이버 유전자를 예측하고 선택할 수 있습니다.</li>
	<li>매핑 개요에서 진행을 선택합니다.</li>
	<li>레이아웃 노브에서 배경에서 흰색을 선택하고 레이아웃 노브에서 힘 아틀라스를 선택합니다.</li>
	<li>표범 BP를 선택하여 강화 조절 유전자 그룹을 분석합니다. 참고: 이것은 HSPA5가 이 연구 결과에서 HT29 유래 종양권에 있는 항 세포사멸에 책임 있었다는 것을 보여줍니다(그림 3A). 특정 기능 분야를 좁히기 위해, KEGG, GO 또는 표범 분류는 특정 동인 유전자를 선택하기 위해 대안적으로 사용될 수 있다.</li>
</ol>

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이 연구에서는, 배양된 암 줄기 같이 종양스피어는 사용 가능한 생물정보학을 가진 RNAseq 데이터를 분석하는 모형으로 이용되었습니다. 질병 모델의 경우 HT29 유래 종양스피어가 사용되었습니다. 종양권은 종양 치료에 대한 약물 내성을 가지고 있기 때문에, 확립 된 모델은 유전자 발현의 차이를 조사하여 저항의 상세한 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 더욱이, 사용 가능한 생물정보학을 가진 RNAseq를 사용하여 게놈 기술은 잠재적으로 관련시킨 유전자가 더 높은 신뢰로 검증될 수 있도록 연구 모형의 급속한 이해를 제공합니다. 또한, 종양스피어의 형성에 관여하는 유전자의 종류를 확인할 수 있다.
RNA 품질은 RNA에 대한분석(32)에매우 중요하다. 매핑 읽기, 매핑 유전자 및 FPKM 사이의 확실성을 증가하기 때문에 샘플에 RIN >7이 있는지 확인하십시오. RNAeq 데이터를 분석할 때 IPA2...

대장암(CRC)은 전 세계적으로 높은 유병률과 사망률을 가진 주요 사망 원인1,,2이다. 유전자 돌연변이 및 증폭으로 인해 암세포는 세포 생존 3, 항 세포멸4,4암 줄기5,,6,67에기여하는 증식 제어 없이 성장한다. 종양 조직 내에서 종양 이질성은 종양 세포가 치료 치료 중에 적응하고 생존할 수 있게 합니다8. 암 줄기세포(CSC)는 차동암 유형보다 자가재생 및 자발성율이 높은 것으로, 종양 재발9,10 및전이성 CRC11에주로 책임이 있다. CSC는 더 많은 약물내성(12,,13,,14 및 항세포증 속성15,16)을16제시하여 종양 화학요법을 생존시킨다.
여기서, 선택된 CRC 줄기 세포에서 줄기에 대한 잠재적기심을 조사하기 위해, RNAAeq는 종양 스페로이드에서 분화유전자를 선별하기 위해 수행되었다. 암세포는 낮은 준수 조건에서 성장하고 EGF, bFGF, HGF 및 IL6를 포함하여 배양 된 매체에 추가 된 성장 인자에 의해 자극 될 때 스페로이드 (또한 종양스피어라고도 함)를 형성 할 수 있습니다. 따라서, 우리는 oxaliplatin 및 irinotecon17로취급될 때 인지질 STAT3의 증가와 화학요법저항하는 CRC HT29 종양 세포를 선택했습니다. 또한, HT29는 기재된 배양 조건에서 배양할 때 더 높은 줄기 마커를 표현하였다. HT29 유래 CSC 모델은 더 많은 양의 류신-리치 반복 함유 G-단백질 결합 수용체 5(LGR5)18,CRC 줄기 세포의 특이적마커(19,,20)를발현하였다. 더욱이, CD133은암줄기세포를 위한 일반적인 바이오마커로 여겨지며, 또한 HT29세포주(21)에서도높게 발현된다. 이 프로토콜의 목적은 생물정보학 데이터 집합에 기초한 확립된 암 줄기 같이 종양권에 있는 드라이버 유전자의 단을 개별 종양발생(22)을조사하는 것과 는 반대로 발견하는 것입니다. 그것은 가능한 생물 정보학 분석 뒤에 RNAseq 분석을 통해 잠재적인 분자 기계장치를 조사합니다.
차세대 시퀀싱은 종양 치료 유도를 위한 드라이버 유전자를 포괄적으로 검사하는 데 사용되는 계산 적 도움을 기반으로 높은 처리량, 용이성 및 신뢰할 수있는 DNA 시퀀싱방법입니다(23). 이 기술은 또한 고립된 RNA샘플(24)의역전사로부터 유전자 발현을 검출하는 데 사용된다. 그러나, RNAseq로 검열할 때, 치료로 표적으로 하는 가장 중요한 유전자는 실험과 대조견본 사이 가장 높은 발현 차액이 없을 지도 모릅니다. 따라서, 일부 생물정보학은 KEGG 25, GO26,27,또는,표범(28)과같은 현재 데이터 집합을 기반으로 유전자를 분류하고 식별하기 위해 개발되었으며, 인네티웨이 분석(IPA)(IPA) (29) 및 NetworkAnalyst30을포함한다.25 이 프로토콜은 RNAseq및 NetworkAnalyst의 통합을 보여주며 부모 HT29 세포에 비해 선택된 HT29 유래 스페로이드에서 유전자 그룹을 신속하게 발견합니다. 다른 질병 모델에 이 방법의 응용 은 또한 중요한 유전자에 있는 다름을 발견하기 위한 건의됩니다.
개별 유전자 발현의 조사에 비해, 고처리량 기술은 종양 정밀 의학을 위한 잠재적인 드라이버 유전자를 쉽게 찾아내고 있는 이점을 제공합니다. KEGG, GO 또는 PantHER와 같은 유용한 데이터 세트를 사용하면 질병 모델, 신호 경로 또는 특정 기능에 따라 특정 유전자를 식별할 수 있으며, 이를 통해 구체적이고 중요한 유전자에 빠르게 초점을 맞추고 시간과 연구 비용을 절약할 수 있습니다. 이전 연구에서도 유사한 적용이 사용된다14,,18,,31. 특히, 종양의 다른 모형은 생존과 증식을 위한 구별되는 유전자 그리고 통로를 표현하기 때문에 종양은 더 복잡합니다. 따라서, 이 프로토콜은 상이한 상황에서 다른 종양 유형을 구별하는 유전자를 선택할 수 있다. 특정 유전자 발현의 메커니즘을 이해하여 암에 대한 효과적인 전략을 찾을 수있는 잠재력이 있습니다.

<table><tbody><tr><td>iRiS 디지털 세포 이미징 시스템</td><td>Logos Biosystems, Inc</td><td>I10999</td><td>종양 형성 관찰</td></tr><tr><td>유세포 분석</td><td>BD biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td>종양에서 LGR5 및 CD133 검출</td></tr><tr><td>항 LGR5-PE</td><td>Biolegend</td><td>373803</td><td>LGR5 검출 시약</td></tr><tr><td>안티 CD133-PE</td><td>Biolegend</td><td>372803</td><td>CD133 검출 </td></tr><tr><td>종양구 배양을 위한</td>시약<td>EGF</td><td>GenScript</td><td>Z00333</td></tr><tr><td>종양구 배양을 위한</td><td>bFGF</td><td>GenScript</td><td>Z03116</td> 종</tr>양<tr><td>구 배양을 위한</td><td>HGF</td><td>GenScript</td><td>Z03229</td></tr><tr><td>종양구 배양을 위한</td><td>IL6</td><td>GenScript</td><td>Z03034</td></tr><tr><td>PureLink RNA 추출 키트</td><td>Invitrogen</td><td>12183025</td><td>isolate RNAseq 분석을 위한 총 RNA</td></tr><tr><td>RNAseq 성능</td><td>Biotools, 대만</td><td></td><td>RNAseq 분석은 Biotools, Ttaiwan</td></tr><tr><td>NetworkAnalyst</td><td>Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada</td><td></td><td>http://www.networkanalyst.ca/</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td>에</td></tr> 의해 상업적으로 수행됩니다</tbody>.</table>

대장 ht29 유래 암 줄기 와 같은 종양스피어에서 드라이버 유전자의 발견

Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres

암 줄기 세포는 종양 재발에 기여하는 임상 치료에 대하여 중요한 역할을 합니다. 종양 발생 및 암 줄기 특성의 개시에 관여하는 많은 종양 유전자가 있습니다. 대장암 유래 종양구의 형성에 있는 유전자 발현은 불분명하기 때문에, 한 번에 한 유전자에 작동하는 기계장치를 발견하는 데 시간이 걸립니다. 이 연구는 체외에서 대장암 줄기와 같은 세포의 생존에 관여하는 운전자 유전자를 신속하게 발견하는 방법을 보여줍니다. 구체형으로 배양되고 CD133 줄기마커를 동반하여 LGR5를 발현하는 대장 HT29 암세포가 이 연구에서 선택되고 사용되었다. 제시된 프로토콜은 가능한 생물정보학을 가진 RNAseq를 능력을 발휘하기 위하여 이용가능한 HT29 유래 줄기 같이 종양스피어의 대형에 있는 과발현된 드라이버 유전자를 빨리 밝히기 위하여 이용됩니다. 방법론은 다른 질병 모델에서 잠재적인 운전자 유전자를 신속하게 선별하고 발견할 수 있습니다.

암 줄기세포에서 기전을 조사하기 위한 모델을 확립하기 위해, 대장 HT29 세포는 B27, EGF, bFGF, HGF 및 IL6를 포함하는 저부착 플레이트에서 체외에서 암 줄기와 같은 종양스피어를 배양하는 데 사용되었다. 종양스피어&gt;100 μm직경은 7일(도1A)에형성되었다. 종양구는 단일 세포에 트립시화되고 LGR5 및 CD133 발현을 검출하기 위해 유동 세포측정을 사용하여 분석하였다. LGR5는 HT29 구동 종양스피어에서 1.1%에서 11.4%로 증가했으며 세포는 유동 세포측정(도1B)을사용하여 검출되었다. 또 다른 줄기 마커인 CD133도 부모 HT29세포(도 1C)에비해 배양된 HT29 유래 종양스피어에서 61.8%에서 81.1%로 증가하였다. 그런 다음 종양권은 RNAseq 조사를 위해 준비되었습니다.
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여기에 제시된 대장 HT29 세포로부터 유래된 확립된 암 줄기 유사 세포를 유지하는 과발현 드라이버 유전자를 발견하는 프로토콜이다. 사용 가능한 생물정보학을 가진 RNAseq는 표적 종양 세포의 생존에 관여하는 잠재적인 기계장치를 해명하기 위한 유전자 발현 네트워크를 조사하고 스크린하기 위하여 수행되었다.

대장 HT29 유래 암 줄기 와 같은 종양스피어에서 드라이버 유전자의 발견

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the ...

우리의 프로토콜은 RNA-Seq 및 생체 포맷 도구를 사용하여 줄기와 같은 대장 종양스피어의 형성에 기여하는 과발현 운전자 유전자를 신속하게 발견했습니다. 이 프로토콜은 선택적 대장암에서 암 줄기를 위한 분자 메커니즘을 조사하기 위해 차별화적으로 발현된 유전자 및 신호 경로를 선별하는 데 사용됩니다. 문화의 7일째에, 디지털 세포 화상 진찰 시스템을 가진 반전된 현미경을 사용하여 종양권의 직경을 관찰하고 측정합니다.종양권이 100 마이크로미터 직경보다 큰 도달하면 배양을 0.25%의 트립신으로 치료합니다. 섭씨 37도에서 5분 후, 트립신을 성장 배지의 2배의 부피로 중화시키고 혈종계를 사용하여 세포를 세어보세요. 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다.그리고 중간 농도의 100 마이크로리터 당 4개의 세포에 5회 10에서 펠릿을 재중단한다. 각 튜브에 관심있는 1 차 항체의 2 개의 마이크로 리터를 추가하고 실온에서 30 분 동안 세포를 배양하고 분당 200 회전합니다. 인큐베이션의 끝에서, PBS의 900 마이크로리터로 각 튜브를 세척하고 표준 프로토콜에 따라 세포 측정을 유동하여 관심있는 단백질의 발현을 위해 세포를 분석한다.트라이신 수집 후 RNA 절연을 위해, PBS 농도의 50 마이크로리터 당 50 마이크로리터 당 두 번 10에서 다섯 번째 세포로 세포를 다시 중단하고 튜브 당 베타 mercaptoethanol의 2 개의 마이크로 리터로 보충 된 용해 완충제 200 마이크로 리터로 각 샘플을 용액. 짧은 소용돌이와 실온에서 5 분 배양 후, 원심 분리에 의해 lysates를 수집하고 각 튜브에 70 %의 마이크로 리터 200 마이크로 리터를 추가합니다. 샘플을 빠른 컬럼으로 옮기고 원심분리로 용매를 제거합니다.400 마이크로리터의 워시 용액 1개와 600 마이크로리터의 시료를 세척하여 원심분리에 의해 비RNA를 완전히 제거하고, 동일한 원심분리 조건하에서 2분 원심분리를 추가하여 잔류 에탄올을 제거합니다. 그런 다음 체급물을 함유하는 RNA를 수집하기 전에 튜브 당 증류수 50 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단하고 샘플을 원심분리합니다. RNA 염기서열 분석 후 부모 종양 세포에 비해 종양권 세포 간의 차분 유전자 발현을 조사한다.종양권 및 부모 그룹에서 100개 이상의 읽기 수를 가진 1~1개의 log2 접이식 변경을 뺀 유전자를 선택합니다. 그리고 표시된 대로 명령을 사용합니다. 데이터의 화산 플롯을 획득하여 차동 유전자 발현을 결정한다.네트워크 분석가에서 의 구동 유전자 선택을 위해, 단일 유전자 입력을 선택하고 선택된 과발현 유전자를 인간과 함께 복사하고 붙여넣은 인간과 함께 유기체 및 공식 유전자 기호로서 ID 유형으로 지정한다. 업로드를 클릭하고 진행합니다. 단백질 단백질 상호 작용을 사용하여 데이터를 삽입하고 분석하려면 유전 단백질-단백질 상호 작용에 따라 900의 신뢰도 점수가 차단된 STRING 상호작용 데이터베이스를 사용하여 종자 유전자를 표시합니다.업로드된 유전자를 교차 연결합니다. 더 개별적인 유전자와 연관되는 종자 유전자는 종양권의 형성을 유지하는 데 관여할 수 있는 드라이버 유전자로서 선택될 수 있다. 레이아웃 노브에서 배경 및 포스 아틀라스의 매핑 개요 흰색에서 진행을 선택합니다.그런 다음 표범 염기 쌍을 선택하여 강화 조절 유전자 그룹을 분석합니다. 경배도 7일 이내에 직경이 100 마이크로미터 이상인 종양스피어. 유동 세포 측정 분석은 부모 HT29 세포에 비해 HT29 유래 종양스피어에서 LGR5 및 CD133 발현의 증가를 나타낸다.RNA 시퀀싱 후, 열지도에 의해 결정된 바와 같이 0.05 미만의 P-값으로 1개 이상의 log2 접기 조절을 가진 유전자는 HT29 유래 종양스피어 와 부모 HT29 세포 사이의 중요한 유전자를 구별하도록 플롯될 수 있다. 이 대표적인 실험에서, 1개의 log2 배 보다 큰 위로 조절된 유전자의 분석은 유전자 네트워크를 교차 연결하는 10개의 종자 유전자귀착되었습니다. 팬더 기본 쌍 분석은 2개의 유전자가 세포멸증의 부정적인 규칙과 연관되었다는 것을 표시했습니다.더욱이, 선택된 유전자는 HT29 유래 종양권에서 그들의 증가한 발현을 확인하는 정량적인 PCR에 의해 결과적으로 검증되었다. 차동 유전자 선택은 절차의 가장 중요한 단계입니다. 기준으로 100보다 큰 재검표를 가진 log2 접기 변경 을 사용해야 합니다.이 프로토콜을 사용하여, 대장 유래 종양권에서 선택된 유전자는 종양권 형성에 있는 그들의 잠재적인 역할을 밝히기 위하여 쓰러지거나 과발현될 수 있습니다.

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이 문서는 기본 셀 문화, 및 종양 세포에서 적혈구와 섬유 아세포의 contaminations를 제거하는 방법에 신선한 얻은 흑색 증 조직의 준비에 대해 설명합니다. 마지막으로, 우리는 어떻게 묘사...

환자 유래 세포 배양 및 CD133의 절연<sup&gt; +</sup흑종에서&gt; Putative 암 줄기 세포

시험관 분야 분석법은 암 줄기세포를 식별하는 데 일반적으로 사용됩니다. 여기에서는 단일 분석과 다중 세포 기반 구체 분석을 비교합니다. 더 힘든 단일 세포 기반 분석 또는 메틸셀룰로오스 보충제는 더 정확한 결과를 제공하는 반면, 액체 배지에서 수행되는 다중 세포 기반 분석은 세포 밀도의 영향을 크게 받을 수 있습니다.

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발견하세요 RNA-Seq 및 생물정보학을 활용하여 HT29 유래 대장암 종양스피어에서 과발현된 드라이버 유전자를 식별하는 방법을 배우세요. 이 프로토콜은 암 줄기세포의 분자 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

대장 HT29 유래 암 줄기 와 같은 종양스피어에서 드라이버 유전자의 발견

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