Name: 유해 성 평가를 위한 상피 세포 및 1 차적인 면역 세포로 구성된 다세포 인간 폐포 모형 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 배우세요 상피세포와 1차 면역세포로 구성된 다세포 인간 폐포 모형을 이용한 유해성 평가 방법을. 이 프로토콜은 급성 면역 반응 연구에 활용됩니다.

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저자는 그림 3의 공동 문화 계획에 대한 박사 미겔 Spuch-Calvar과 중요한 독서에 대한 박사 베디아 베검 카라코카크에게 감사드립니다. 이 연구는 보조금 협정에 따라 유럽 연합 (EU)의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에 의해 지원되었다, 아돌프 머클 재단에 의해. B.D. 재정적 지원을 위한 피터 und 트라우들 엥겔혼 재단에 감사드립니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

화학 물질과 약물을 포함한 새로운 물질의 새로운 생산은 점차 시험관 내 모델의 예측 필요성을 증가시킵니다. 동물 실험32의교체, 감소 및 정제의 세 가지 원칙을 준수하기 위해, 체외 세포 모델은 약물 또는 물질의 작용8,9,,10,,11의회피 메커니즘에 대한 교체 및 감소 측면에 관한 강력한 도구가 되었다., 여기에 제시된 것은 이전에 냉동 된 단핵구에서 갓 분리되거나 해동된 면역 세포를 사용하여 다세포 모델을 조립하는 상세한 프로토콜입니다. 또한 ALI에서 모델의 재배를 설명합니다. 마지막으로, 프로토콜은 선동자극에 노출되는 예를 설명하고 신선하거나 냉동된 단핵구를 포함하는 두 모델의 반응을 비교한다.
기존의 침수 노출7,,22,,31에비해 ALI 조건하에서 성장하고 노출된 모델의 향상된 복잡성의 부가가치를 확인하고 정당화하기 위해 다양한 연구가 수행되었다. 상피 세포의 단일 배양에 비해 공동 배양에서 더 높은 염증 반응의 관찰은 이전 연구를 확인합니다. 이 연구는 제시된 공동배양 모델(LPS로 자극)을 사용하고 A549 단일배양 등가 모델7에비해 TNF 및 IL1B의 유전자 발현 수준에서 더 높은 반응을 보였다. 한편, 두 모델 모두 A549 단배양에 비해 측정된 염증 성 중재자 방출 값 내에서 더 높은 변이를 보였다. 이는 이전에도시된바와 같이 생물학적 반복(즉, 반복 1회, 기증자 1개)에서 면역 세포를 사용하여 설명할 수 있다. 원하는 경우, 복제 사이의 변이는 1) 동일한 기증자로부터 해동 된 PBM을 사용하여 또는 2) 세포를 동결하기 전에 다른 기증자로부터 PBM을 풀링한 다음 각 반복에서 동일한 풀을 후속으로 사용할 수 있습니다. 더 많은 생물학적 반복을 포함 하는 것도 좋습니다.
세포 동결 기술은 중요한 단계로 간주될 수 있습니다. 그러나, 그것은 현상 및 기능 분석을 위한 세포를 보존하기 위한 일반적인 실험실 절차입니다. 다양한 연구는 냉동 PBM의 품질이 생존에 필수적임을 입증하고, 적절한 동결 기술은 동일한 세포(28,,32)와후속 연구 결과의 성공에 열쇠이다. 프로토콜의 수정은 일반적으로 버피 코트의 가용성이 제한되어 있기 때문에 실험 설정에서 유연성을 제공하는 PBM을 동결하여 수행 할 수 있습니다. 새로 고립된 것 보다 냉동 PBM(여러 바이알)을 사용하는 또 다른 장점은 1년 후에도 후속 실험에서 사용할 수 있다는 것입니다. 이것은 실험에서 원하는 또는 필요한 매개 변수인 경우 기증자 - 기증자 가변성의 잠재적 인 문제를 감소시다.
최대 13개월 후에 수행된 실험실 간 비교의 결과는 PBM이 액체 질소 탱크에 적절하게 저장될 때 세포 생존가능성 또는 세포회수(33)에아무런 영향 없이 장기간 사용할 수 있음을 보여준다. 실험을 수행하기 전에 세포 생존가능성 및 세포 반응성을 신중하게 검증하면 저장 시간(1년 이상)이 길어질 수 있다. 또한 액체 질소 탱크의 온도는 항상 안정적으로 유지되어야합니다. 냉동 보존 된 PBM의 생존가능성에 영향을 미치는 주요 요인은 10%-20 %(v/ v)28의최적의 농도로 DMSO 농도로 나타났습니다. 동결의 잠재적으로 유해한 효과를 최소화하기 위해, 단백질의 다른 소스, FBS 또는 BSA (40% 최대 100 %34까지농도의 넓은 범위)는 종종 세포 생존을 증가시킬 수있는 천연 보호 성분으로 동결 배지에 추가됩니다.
DMSO의 높은 세포 독성 잠재력으로 인해 먼저 FBS에서 PBM을 분산한 다음 이미 FBS에 분산된 PBM에 DMSO를 추가하는 것이 좋습니다. 특히, FBS 농도가 높지만 (>40%) 세포 생존능력이 개선되지 않았고, 동시에세포(28)에해를 끼치지 않았다. 그럼에도 불구하고, 모노사이클을 동결하는 것은 제한된 버피 코트 가용성의 문제를 극복하는 가능한 방법입니다. 그러나, 신선한 PBM로부터 MDDC 및 MDM을 사용하는 것이 바람직한 경우, 면역 세포는 분리7,,16,,17,35,,,36, 37,37후에 5-8일 후에 분화되고 사용될 수 있다. 실험 계획이 허용하는 경우 MDDC와 MDM 모두에서 최소 6일간의 차별화를 권장합니다. 그러나 동일한 실험에서 서로 다른 반복 간의 일관성과 특정 표면 마커 표현식의 일상적인 검사는 매우 중요합니다. 분화 시간 후에 LPS와 같은 선동적인 자극에 대한 반응성은 또한 정기적으로 확인되어야 합니다.
A549 세포주사용으로 많은 조사가 ALI에서 수행되었거나, 단일배양으로 또는 다른 세포 유형(대식세포, 수지상 세포 또는 섬유아세포)과 결합하여 3D 공동배양모델(22,,24,,29,38)로수행되었다., 본 3D 공문화 모델을 이용하여, 세포독성, 산화스트레스, 또는 (나노-) 물질의 염증효과를 최대 72h1,,17,,21,,24,,29까지조사하였다. 모델의 생체 내 조직과 유사성은 이전에 모델16의공초점 레이저 스캐닝 이미징을 기반으로 조사되었다. 모델을 조립할 때, 세포 증식(여기에 제시된 모델에서 A549에 영향을 미칠 수 있음)과 1차(증식 하지 않음) 면역 세포의 성능(여기, MDDC 및 MDM)을 모두 고려하는 것이 중요합니다. 또한 모든 CD14 양성 단핵구가 MDDC 및 MDM으로 분화되는 것은 아니며, 세포가 부착된 형태와 일시 중단된 형태로 모두 존재할 수 있다는 점도 고려해야 합니다. 공동배양 어셈블리의 특성에 기초하여(여기서, 두 세포 유형 모두 기존 상피 층에 부착해야 함), 두 면역 세포 유형의 부착 된 하위 집단만 사용하는 것이 좋습니다. 또한 LPS에 대한 단핵구, MDDC 및 MDM 단일배양 반응성 및 특정 표면 마커(CD14, CD163, CD86, CD93 또는 CD206, CD206, 데이터 표시 되지 않음)의 일상적인 분석은 6일 및 7일간의 차별화가 최적의 타임포인트임을 시사하였다.
인간 폐에서 의 실적인 수의 폐포 상피 세포가 ~160,000 세포/cm2에해당하지만, 모델에서 계산된 A549 세포의 수는삽입체 16,,18에서배양된 9일 후 ~1,000,000세포/cm2이다. 따라서, 이러한 시험관 내 모델의 한계를 고려해야 합니다. 첫째, 상피 세포의 밀도는 성장하는 막에 컨물층을 형성하는 능력에 기초하여 확립되었다. 또한 A549가 평평하고 확산되는 상피 형 I 세포와는 반대로, 입체 형 II 세포를 나타내는 것이 중요합니다. 한편, 필요한 수의 면역세포는 문헌에 기초하여 확립되었고, 이 프로토콜에서 세포수/표면적(39,39,40,41)으로41제시되었다. 400세포/mm2(4세포/cm2) 16의 범위에서 MDDC의 세포 밀도는 500-750세포/mm2(5-7 세포/cm2)의 정상 상태 세포 밀도와 비교된다(5- 7 세포/cm22)에서생체 내연구39에서보고된다. 이 모델에서 MDM의 밀도는 인간 폐포영역(40)에서생체 내 의 생체 내 상황과 동일한 범위 내에 있다.
성숙한 대식세포 마커 염색(25F9)은 기저측뿐만 아니라 기저측(즉, 수지상 세포의 부위)에서 모두 관찰되었다. 막 삽입 모공을 통해 면역 세포의 전좌가 가능하고 또한 염색 강도에 관찰 된 차이를 설명 할 수있는이 모델(16)을사용하여 관찰되었습니다. 그러나, 또 다른 가능한 설명은 성숙한 대식세포 마커도 수지상 세포에 표현될 수 있지만, 발현은 매우 공여자 특이적42이다. 또한, 25F9 발현의 강도는 MDM에서 훨씬높다(도 7, 도 8). 두 염증 자극 (LPS 및 TNF-α) 두 공동 문화에서 폐 상피 장벽의 무결성에 영향을(그림 7, 도 8). 이는 이전간행물(43,44)에,44 기초하여 선동적인 사이토카인 및 세균성 제품이 상피 장벽의 무결성을 방해한다는 것을 보여주었습니다.
인간 폐포 상피의 3D 다세포 모델은 이전에17년에확립되고 특징지어지며,,생체 외21,,24,25,,45에서생물학적 반응(즉, 급성 염증 반응, 산화 스트레스 반응, 입자 분포 및 세포 통신)을 평가하기 위한 강력하고 유용한 도구로 작용하였다. 결과는 프로염증 자극(여기, LPS 및 TNF-α)에 대한 공동배양 모델의 재조함을 확인한다. 반응은 신선한 PBM에서 면역 세포를 사용할 때 약간 증가했다; 그러나, 신선한 대 해동 된 PBM을 사용 하 여 공동 문화 사이 통계적으로 유의 한 차이가 없었다. 더욱이, 두 동배 모델의 선동반응은 동일한(ALI) 조건하에서 재배된 상피 세포 단배배의 반응보다 높았다. 요약하자면, 프로토콜은 MDM 및 MDDC로의 분화를 위해 신선하거나 해동된 PBM을 사용하여 3D 인간 폐포 상피 조직 공동 배양 모델의 조립을 설명합니다. 두 모델 모두 염증 자극에 매우 반응하는 것으로 나타났습니다. 따라서 잠재적 위험 및 독성 평가를 위한 강력한 도구역할을 할 수 있습니다.

체외 폐 세포 배양은 에어로졸1의위험을 평가하기 위해 비용 효율적이고 견고하며 잘 제어되는 플랫폼을 제공합니다. 인간 폐포 폐렴구체에 대한 모델 세포 시스템으로서, 폐아암에서 분리된 상피 A549 세포주는 종종2로사용된다. 이들 세포는 폐포 영역3으로부터 편평상피 세포(II)를 나타내며 위험성 및 독성평가1,4,,5,,66,7,,,8,9,9,10에널리 사용되는 폐 세포주이다. A549 세포주는 조밀하게 포장된인지질3를포함하는 특징적인 라멜라 바디의 존재와 같은 폐포 상피 형 II 세포의 관련 특징을 가지고 있습니다.
세포가 공기-액체 인터페이스(ALI)에서 배양될 때, 계면활성제는 공기 노출 상피 세포의 정압측에 방출되어 표면장력(11,,12,13)을13감소시키는 것으로 나타났다. 이 기능은 나노 물질 호흡기 위험 및 독성 조사에서 특히 중요합니다. 흡입된 나노 물질/독성물질이 폐포 부위에 증착되면, 그들은 먼저 폐 계면활성제와 상호 작용하고 폐 세포와의 상호 작용이 일어나는 수성 저상으로 습윤하는 힘에 의해 대체된다14,,15. A549 세포가 단층(ALI에서 재배될 때 나중에 다층으로 과도하게 성장할 수 있음)을 형성하고 계면활성제를 생성하더라도, 단점은 부족한 접합 형성으로 인해 낮은 환전성 전기 저항 값을 초래하지만 여전히 세포간(nano) 입자전좌(16,,17,18)에18대한 기능적 장벽을 제시한다.
폐에서는, 항상성을 통제하고 유지하기 위하여 세포 세포 접촉 또는 세포 간 신호를 통해 직접 통신하는 phagocytic 및 직업적인 항원 제시 세포 (즉, 대식세포 및 수지상 세포)를 포함하여 다양한 면역 세포 집단이 있습니다. 대식세포 및 수지상 세포는 적응성 면역반응(19)의중요한 타고난 면역 효과및 개시자이다. 상피 의 내부 또는 아래에 거주하는 수지상 세포는 항원을 잡기 위해 루멘에 상피를 가로 질러 돌출부를 형성 할 수 있습니다. 폐포 대식세포는 상피의 정표면에 위치하며 파신 세포로 작용하며, 세균성, 바이러스 및 곰팡이 감염뿐만 아니라 이물질에 대한 첫 번째 세포 방어를 나타냅니다. 이들의 페노티픽 가소성은 이러한 자극에 반응하여 염증 반응을 빠르게 유도할 수 있게 해주며, 항염증제(즉, 억제)반응(20)을발동하는 것으로 이동한다.
인간 폐포 상피 조직 장벽을 시뮬레이션하기 위해, 우리는 각각17에인간 혈액 단화 유래 대식세포 (MDM) 및 수지상 세포 (MDDC)로 보충된 A549 세포와 함께 삼중 공동 배양 모델을 확립했다. ALI에서 이 모델의 재배는 이전에16,심지어 72 h 노출후 노출 21까지보고되었습니다. 탄소 나노튜브 노출에 대한 급성 면역 반응은 침수된조건(22)과비교하여 ALI에 노출된 세포 배양에서 현저히 향상되었다. ALI에서 상이한 물질에 배양되고 노출된 이 문화 모델은 산화 아연에 노출되면 세포독성, 산화 스트레스 및 염증 반응을 조사하는 데 사용되었으며,24개,금 나노입자25,23 26,탄소 나노튜브21,화산재 및 디젤 배기입자(27)에대한 노출시.,
더욱이, 체외 인간 폐 모델에서 면역 이펙터 세포로서 대식세포 및 수지상 세포의 중요한 역할이 확인되었다. 특히, 모델에서 증가된 염증 반응은 단일배양 시스템에 비해 면역 세포의 존재에서만 관찰되었다7. 1 차적인 단핵구 유래 면역 세포를 사용하는 잠재적인 단점은 PBM의 제한된 접근성뿐만 아니라 기증자 - 기증자 변이입니다. 이러한 잠재적 단점에 대한 해결책으로서, 여기에 제시된 것은 세포 배양 모형 조립을 위한 갓 고립된 PBM28의 냉동 보존을 도입하는 프로토콜이다. 이 연구의 목적은 인간 버피 코트에서 PBM의 격리를 포함하여 3D 인간 폐포 상피 조직 모델 조립을 입증하는 것입니다. 염증 자극에 대한 응답성은 신선한 PBM과 차별화되거나 냉동/해동된 PBM과 차별화된 MDM 및 MDDC로 구성된 모델과 비교됩니다.
테스트되지 않은 인간 혈액 샘플과 함께 일하는 것은 HIV (인간 면역 결핍 바이러스), B형 간염 및 C형 간염과 같은 감염증의 잠재적 인 전염을 방지하기 위해 특정 치료를 포함합니다. 따라서 장갑, 가운, 마스크 및 눈 보호와 같은 개인 보호 조치의 사용은 매우 중요하며 좋은 실험실 연습 원칙에 따라야합니다. 이러한 보호는 잠재적으로 전염성 있는 액체에 피부 또는 점막을 드러내기의 리스크를 감소시킵니다. 또한, 버피 코트와 PBM을 취급하는 관련시킨 사람들을 위해, B형 간염 바이러스에 대하여 예방 접종은 필수이고, 항체 항체 반대로 B형 간염의 혈액 타이터 수준은 100 IU/L 이상이어야 합니다 (국가 특정 입법 요구 사항은 해결되어야 합니다). 또한 모든 작업은 생물 안전 수준 2 실험실에서 수행되어야합니다 (국가 별 입법 요구 사항을 해결해야함). 실험실 환경에서 작업하고 폐기물 처리를 포함한 포유류 세포 배양을 처리하는 것과 관련된 표준 건강 및 안전 예방 조치는 전체 프로토콜을 수행 할 때 채택되어야합니다.

<table><tbody><tr><td>벤치마크 마이크로플레이트 리더</td><td>는 특이적일 필요가 없습니다(예: BioRad, Cressier, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 인큐베이터</td><td>는 특이적</td><td></td><td></td>일 필요가 없습니다</tr>) <tr><td>세포 동결 용기(예: Mr. Frosty)</td><td>는 특이</td><td></td><td></td>적일 필요가 없습니다</tr>. <tr><td>원심분리기</td><td>는 특이적</td><td></td><td></td>일 필요가 없습니다</tr>. 컨<tr><td>포칼 레이저 스캐닝 </td><td>현미경은 특이적일 필요가 없습니다, 예를 들어</td><td>Zeiss LSM 710 메타</td><td></td></tr><tr><td>혈구 분석기 또는 자동 세포 계수기는</td><td>특이</td><td></td><td></td>적일 필요가 없습니다</tr><tr><td>층류 생물 안전 후드 클래스 II</td><td>는 특이적</td><td></td><td></td>일 필요가 없습니다</tr><tr><td>MultiStand Macs (Macs Cell Separator)</td><td>Miltenyi, Germany</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>는 필요하지 않습니다. 특정</td><td></td><td></td></tr><tr><td>위상차 반전광 현미경</td><td>은 특이</td><td></td><td></td>적일 필요가 없습니다</tr><tr><td>피펫 보이, 피펫(다른 부피)</td>은 특이<td></td><td></td>적<td>일 필요가 없습니다</td></tr><tr><td>가위</td><td>는 특이</td><td></td><td></td>적일 필요가 없습니다</tr><tr><td>진공 펌프</td><td>는 특정</td><td></td><td></td>할 필요가 없습니다</tr><tr><td>수조</td><td>는 특정적일 필요가 없습니다</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>일회용 소형 장비/유리 제품</td><td></td><td>카탈로그 번호</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 및 50 mL 원추형 원심분리 튜브</td><td>는 특정</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6웰 및 12웰 세포 배양 플레이트, 평평한 바닥, 저증발 뚜껑, 멸균</td><td>Falcon, 스위스</td><td>353046 및 353043</td>일 필요가 없습니다.<td></td></tr><tr><td>세포 배양 인서트, 투명 PET 멤브레인, 12-well, 3 &mu; m 기공 크기</td><td>Falcon, 스위스</td><td>353181</td><td></td></tr><tr><td>셀 스크래퍼</td><td>는 특이적일 필요가 없습니다(예: VWR, 스위스</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td>는 특이<td></td><td></td>적<td>일 필요가 없습니다</td></tr><tr><td>유리 오토클레이브 페트리 접시</td><td>는 특이</td><td></td><td></td>적일 필요가 없습니다</tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi, Germany</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>진공 여과용 멸균 여과 컵, 0.2 &mu; m 기공 크기는</td><td>특이적일 필요가 없습니다(예: VWR, 스위스</td><td>10040-446</td><td></td></tr><tr><td>여과 컵(최소 100mL)와 호환되는 멸균 실험실 병</td><td>은 특이적</td><td></td><td></td>일 필요가 없습니다</tr><tr><td>. 멸균 피펫은</td><td>특이</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>적<tr><td><강한>화학물질</강할</td> 필요가 없습니다><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich, 스위스</td><td>A7030-100g</td><td></td></tr><tr><td>CD14 + MicroBeads 인간 - 자기 구슬</td><td>Miltenyi, 독일</td><td>130-097-052</td><td></td></tr><tr><td>Deattachnig 제 Trypsin-EDTA, 0.05 %, 페놀 레드</td><td>Gibco, 스위스</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>밀도 구배 매체 Lymphoprep</td><td>Alere Technologies AS, 노르웨이</td><td>1114547</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭 사이드 (디엠소)</td><td>Sigma Aldrich, 스위스</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich, 스위스</td><td>E6758-100g</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(열 불활성화)</td><td>Gibco, Switzerland</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>인간 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 프리미엄 등급</td><td>Miltenyi, 독일</td><td>130-093-864</td><td></td></tr><tr><td>인간 인터루킨 4 (IL-4), 프리미엄 등급</td><td>Miltenyi, 독일</td><td>130-095-373</td><td></td></tr><tr><td>인간 대식 세포 집락 자극 인자 (M-CSF), 프리미엄 등급</td><td>Miltenyi, 독일</td><td>130-096-485</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Gibco, 스위스</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr>대장균 <td>시그마-알드리치의</td><td>리포다당류(LPS)</td><td>4524-5mg</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, 스위스</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycin</td><td>Gibco, Switzerland</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td><td>Gibco, Switzerland</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI)</td><td>Gibco, Switzerland</td><td>42401-018</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypan 블루 용액 (0.4 %)</td> <td>Sigma Aldrich, 스위스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>종양 괴사 인자 알파 (TNF-&alpha;)</td><td></td><td></td> 세포 독성, (프로)염증 반응</강력>세포 독성 검출 키트(LDH)에 사용되는 Immunotools 11343015<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Assay</td>)Roche, Switzerland 11644793001 Human IL-6 DuoSet ELISA R&<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> D, Biotechne, 스위스</td><td>DY206</td><td></td></tr><tr><td>인간 IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA</td><td>R& D, Biotechne, 스위스</td><td>DY208</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immunostaining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), 농도 2 &mu; g/mL</td><td>Sigma-Aldrich, 스위스</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG(H+L) Alexa Fluor 647 접합, 농도 20 &mu; g/mL</td><td>Abcam, UK</td><td>ab150115</td><td></td></tr><tr><td>염소 항토끼 IgG 항체(H+L) Dylight 488 conjugated, 농도 10 &mu; g/mL</td><td>Agrisera, 스웨덴</td><td>AS09 633</td><td></td></tr><tr><td>성숙한 대식 세포 마커 단클론 항체, 농도 50 &mu; g/mL</td><td>eBioScience, Thermo Fischer, 스위스</td><td>14-0115-82</td><td></td></tr><tr><td>팔로이딘 로다민, 농도 0.264 &마이크로; M</td><td>Molecular Probes, Life Technologies, 스위스</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>재조합 항-CD83 항체, 1:50 딜루션</td><td>Abcam, 영국</td><td>ab244204</td><td></td></tr></tbody></table>

유해 성 평가를 위한 상피 세포 및 1 차적인 면역 세포로 구성된 다세포 인간 폐포 모형

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

인간 폐포 세포 컬배시 모델은 폐포 상피 형 II 세포와 두 가지 유형의 면역 세포(즉, 인간 단핵구 유래 대식세포[MDM] 및 수지상 세포 [MDDC])로 구성된 폐포 상피 조직 장벽의 시뮬레이션을 위해 여기에 설명된다. 다세포 모델을 조립하기 위한 프로토콜이 제공됩니다. 폐포 상피 세포(A549 세포주)는 2챔버 우물의 투과성 인서치에 대한 침수된 조건하에서 재배되고 분화된 다음 분화된 MDM 및 MDDC와 결합된다. 마지막으로, 세포는 며칠 동안 공기 액체 인터페이스에 노출됩니다. 인간 1차 면역 세포가 인간 버피 코트로부터 분리되어야 하기 때문에, 신선한 또는 해동된 단핵구로부터 분화된 면역 세포는 실험적 필요에 따라 방법을 맞춤화하기 위해 비교된다. 새로 분리되거나 해동된 단핵구 유래 면역 세포를 가진 폐포 세포로 구성된 3차원 모델은, 미처리된 세포에 비해 염증성 자극(lipopolysaccharide 및 종양 괴사인자 α)에 노출되면 세포카인(interleukins 6 및 8)의 통계적으로 유의한 증가를 보여준다. 한편, 공동배양에서 관찰되는 사이토카인 방출 사이에는 통계적으로 유의한 차이가 없다. 이는 제시된 모델이 신선하거나 해동된 말초 혈액 모노사이클(PBM)과 차별화된 MDM 및 MDDC의 존재에서 선동성 자극에 반응한다는 것을 보여준다. 따라서, 에어로졸화 약물이나 나노물질을 포함한 상이한 물질에 대한 급성 생물학적 반응에 대한 조사를 위한 강력한 도구이다.

폐포 상피 세포및 면역 세포로 구성된 인간 폐 공동 배양 모델은 신선하거나 냉동 된 MDDC 및 MDM 선조자 (여기, 인간 말초 혈액 유래 단핵구)에서 조립되었다. 도 1에제시된 바와 같이, A549 세포는 단핵 분리/해동을 포함하는 첫 번째 단면도 후에 3일 후에 시드하였다. 6일간의 차별화 된 MdM은 둥근 모양으로 나타났고 MDDC는 관찰 가능한 돌출부로 더 긴 모양을 형성했습니다. 그들은 또한 특히 신선한 단세포(그림 2, 그림 3)와차별화 될 때 응집체로 나타났습니다. 상피 세포는 3일간의 성장 후 세포의 조밀한 세포층을 형성하여 막 인서트가 조립되었을때(도 4). 24h의 조립과 ALI 조건을 추가로 24시간 동안 거친 후, 공존은 노출을 위해 준비되었다.
3D세포 배양 모델의 반응성은 이전에 설명된 바와 같이 의사-ALI 접근법을 사용하여 알려진 프로염증 자극에 노출될 때 조사되었다. 염증 자극, LPS 및 TNF-α는, 공기 노출 세포 모델의 정표면에 낮은 부피(100 μL)에 첨가되었다. 동시에, 세포 독성의 척도로서 막 파열의 부재는 LDH 분석기를 통해 평가되었다. 기저구의 CCM에서 의 LDH 방출이 현저한 증가를 관찰하였고, 막 파열에 대한 양성 제어에 노출되면, 세제 트리톤-X 100(그림5). 이러한 결과는 세포독성 물질에 대한 모델의 반응성을 입증한 반면, LDH 방출의 증가는 TNF-α 또는 LPS를 가진 정량적 자극시 관찰되지 않았다.
신선하거나 이전에 냉동된 PBM로 조립된 샘플에서 LDH의 서로 다른 측정값에 대한 가능한 이유는 샘플 저장소에 기인할 수 있다. -80°C에서 신선한 PBM의 샘플은 더 오랜 시간 동안 저장되었다; 따라서, LDH 효소의 활성은 떨어질 수 있다. 특히, LDH는 CCM에서 최대 4일 동안만 안정적입니다. 따라서, 수퍼네이트 수집 후 최신 2일 의 분석 작업을 수행하는 것이 좋습니다. 또는 수집 후 직접 슈퍼네티츠를 동결할 수 있습니다. 그러나 동결은 LDH의 효소 활동을 감소시킬 수 있다는 점을 고려하는 것이 중요합니다.
프로염증 중제기의 분비(여기, TNF-α 및 인터류킨 6 [IL-6] 및 8 [IL-8])을 기저 CCM로 의 분비하여 ELISA를 통해 정량화하였다. 통계적으로 유의한(p&amp;0.05, 단방향 ANOVA)의 방출에서 IL-6 및 IL-8의 증가는 LPS-및 TNF-α-처리된 샘플 모두에서 각각의 처리되지 않은 세포에 비해, 뿐만 아니라 PBM 소스로부터 조립된 세포 배양모델(도 6)에서관찰되었다. 기저 CCM에서 모든 테스트된 사이토카인의 농도(pg/mL)가 신선한 PBM으로 구성된 공동배양에서 높았지만, 두 개의 동문화와 단일배양 간의 차이는 통계적으로 유의하지 않았다(p&gt; 0.05)(그림 6). 2D 상피 세포 배양에 대하여 공동배양 모델의 부가가치를 확인하기 위해, A549 단배양은 LPS 또는 TNF-α에도 노출되었다. 예상대로, A549 단문화에서 조사된 모든 중개자의 출시는 두 공동 재배 모델에 비해 낮았다. 비록, 그들 사이의 차이는 통계적으로 유의하지 않았다 (p &gt; 0.05, 단방향 ANOVA).
3D 인간 폐포 상피 조직 장벽의 세포 형태는 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사(LSM)를 통해 평가되었다. 각 모델의 조성을 시각화하기 위해, MCULTURE 모델(MDM) 내의 대식세포는 성숙한 대식세포 마커 25F9로 염색하였다. MDDC는 활성화된 수지상세포(30)에중요한 마커인 CD83로 염색되었다. 세포 형태에 관해서는, 해동 된 PBM을 사용하는 것과 비교하여 신선한 PBM에서 MDM과 MDDC를 사용하는 공동 문화 모델 사이에 차이가 관찰되지 않았습니다. LPS-및 TNF-α-노출된 코배기에서는 신선하고 냉동된 면역 세포로 구성되며, LSM 이미지에서 중단된 상피층을 관찰하였으며, 이는 치료되지 않은 세포의 경우는아니었다(도 7, 도 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig01.jpg"> 그림 1: 프로토콜의 회로도 타임라인입니다. 3D 공동문화 모델 제제, 조립 및 응용 분야(시험된 물질에 대한 노출)의 프레젠테이션. ALI = 공기 액체 인터페이스, MDDC = 단핵구 유래 수지상 세포, MDM = 단세포 유래 대식세포, PBM = 말초 혈액 단핵구. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig02.jpg"> 그림 2: MDM 및 MDDC는 신선한 PBM과 차별화되었습니다. 상아항미세현미경이미지(A)MDM 및(B)MDDC의 신선한 PBM로부터(세포 격리 후 6일). MDM은 둥근 모양이며 MDDC는 종종 응집로 관찰됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig03.jpg"> 그림 3: 냉동 PBM과 차별화된 MDM 및 MDDC. 상아항미세현미경이미지(A)MDM 및(B)MDDC의 해동 된 PBM로부터 (해동 후 6 일). MDM은 둥근 모양이지만 일부 길쭉한 세포를 관찰 할 수 있습니다. MDDC는 돌출부가 있는 둥근 모양의 모양도 나타납니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig04.jpg"> 그림 4: 막 인서트가 성장하는 상피 세포. 파종 후 4일 만에 막 인서트가 자라는 동류 A549의 위상-조영 현미경 이미지는 조밀한 세포 층을 형성한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig05.jpg"> 그림 5: 세포 독성 결과 막 파열 기지를 통해 조사 (LDH) 분석. 데이터는 처리되지 않은 세포에 비해 접힌 증가로 제시된다 (평균 ± SD, n = 3, 별표는 처리되지 않은 세포에 비해 통계적으로 유의한 증가를 나타냅니다, **p &lt; 0.01, ****p &amp; 0.0001). 녹색 모델에서 신선한 PBM에서 MDM및 MDDC가 표현되고, 해동 된 PBM에서 조립 된 보라색 모델이 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig06.jpg"> 그림 6: 동문화 및 단일 배양에 있는 선동적인 반응. 선동적인 중재자(TNF-α, IL-6 및 IL-8)는 LPS 또는 TNF-α를 사용하여 24h 챌린지에 따라 공동배양에서 방출된다. 데이터는 처리되지 않은 세포(평균 ± SD, n = 3, **p &amp; 0.01, ***p &amp; 0.001, ****p &amp; 0.0001)에 상대적인 것으로 제시됩니다. 녹색 모델에서 신선한 PBM에서 MDM및 MDDC가 표현되고, 해동 된 PBM에서 조립 된 보라색 모델이 표시됩니다. 회색은 A549 단일 컬쳐를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig07.jpg"> 그림 7: 신선한 면역 세포로 구성된 동배의 형태. 새로운 PBM의 MDM 및 MDDC를 사용하여 모델의 압정 측면의 정색 및 기저 면의 LSM 이미지는 핵(DAPI), 마젠타는 세포골격(로다민-팔로이드), 화이트는 MDM(25F9), 녹색을 나타내는 MDDCs(CD83)를 나타낸다. 흰색 화살표는 MDM을 나타내고 녹색 화살표는 MDDC를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig08.jpg"> 그림 8: 냉동 면역 세포로 구성된 동배의 형태. 상응하는 Xz 프로젝션을 이용한 공동배양 모델의 액면및 해동 된 PBM으로부터 MDM 및 MDDC를 사용하는 모델의 기저측의 LSM 이미지. 시안은 핵(DAPI),자젠타가 세포골격(rhodamine-phalloidin), 백색은 MDM(25F9)을 나타내고, 녹색은 MDDC(CD3)를 나타낸다. 흰색 화살표는 MDM을 나타내고 녹색 화살표는 MDDC를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에 제시된 1 차적인 인간 혈액 단화 절연을 위한 프로토콜은 대식세포 및 수지상 세포로의 분화뿐만 아니라 다세포 인간 폐 모델로 상피 세포를 조립한다. 염증 성 자극에 노출되면 갓 분리되거나 해동 된 단핵구로부터 분화 된 면역 세포로 구성된 공동 배양의 생물학적 반응이 비교됩니다.

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...

이러한 개별 적인 인간 오디오 모델은 나노 물질 및 지식 약물을 포함 하 여 물질의 급성 면역 반응을 예측 하는 강력한 도구로 관련 된 면역 세포를 사용 합니다. 이 의학은 그 특정 반응을 평가하기 위하여 인간 상피 세포 및 인간 적인 1 차적인 면역 세포를 결합합니다. 신선하고 냉동된 모노사이클을 사용하면 실험 계획에 유연성을 제공합니다.수많은 연구는이 모델은 행동 감각과 면역 감각 사이의 성간 통신에 대한 통찰력을 제공 할 수 있음을 보여 주었다. 이 데모에는 모델을 세포 배양의 개인적인 특성으로 스터딩하기 위한 모든 중요한 세부 사항을 포함하므로 실험을 복제하는 시각적 지침이 포함됩니다. 방광 프로토콜의 여러 단계는 복잡하고 특별한 취급이 필요합니다.따라서 쉽게 따를 수 있는 모든 필수 세부 정보로 시연됩니다. 인간 버피 코트에서 말초 혈액 모노사이클을 분리하기 위해 수확버피 코트 백 내용물들을 250밀리리터 원추형 튜브 사이에 고르게 분할합니다. 각 튜브 250 밀리리터의 총 볼륨을 PBS와 조심스럽게 가져와 튜브를 세 가지 부드러운 반전과 혼합합니다.그런 다음 버피 코트 PBS 용액을 4개의 새로운 50 밀리리터 튜브 사이에 균등하게 분할한 다음, CD 14 양성 자성 구슬의 마이크로리터 10마이크로리터를 튜브에 7번째 총 세포를 추가하고 파이펫팅으로 잘 섞습니다. 충전시 파이펫을 피펫에서 분리하고 즉시 피펫의 상부 개구부를 엄지 손가락으로 연결한 다음 충전된 파이펫을 한 튜브의 바닥에 놓고 파이펫 개구부를 분리하여 밀도 그라데이션 매체가 버피 코트 PBS 혼합물 아래에 천천히 흐를 수 있도록 피펫 개구부를 분리하여 밀도 그라데이션 매체의 1밀리리터가 파이펫 내부에 남게 됩니다. 밀도 그라데이션 배지가 동일한 방식으로 각 튜브에 첨가되었을 때 밀도 그라데이션 원심분리에 의해 세포를 분리하고 혈장과 밀도 그라데이션 중간 층 사이의 백색 2~3mm 두께의 말초 혈액 단핵 세포 층을 수집하기 위한 혈청 피펫을 사용합니다.레이어를 연결하는 가장 좋은 방법은 플라즈마를 먼저 제거한 다음 논리적 파이펫을 억제하여 셀을 수집하는 것입니다. 두 개의 튜브 의 각 세트에서 말초 혈액 단핵 세포를 하나의 새로운 50 밀리 리터 튜브로 당기고 세척 당 신선한 PBS의 총 부피 50 밀리리터로 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 상체를 버리고 신선한 PBS의 5 밀리리터로 각각 파이펫을 다시 중단하고 셀 서스펜션을 단일 튜브로 풀로 짜서 계산합니다.계산 후, 원심 분리하고 일곱 번째 세포에 참석 당 자기 분리 버퍼의 80 밀리리터에 펠레트를 다시 중단. 그런 다음 튜브에 일곱 번째 총 세포에 참석하고 파이펫팅에 의해 잘 혼합 당 CD 14 양성 자기 구슬의 10 마이크로 리터를 추가합니다. 섭씨 4도에서 15분 동안 인큐베이션을 한 후 자기 분리 버퍼 3밀리리터로 자기 컬럼을 헹구고 컬럼에 세포를 추가합니다.세척당 3밀리리터 버퍼로 컬럼을 세 번 세척하고 1밀리리터의 신선한 자기 분리 버퍼가 들어 있는 15밀리리터 튜브로 컬럼을 옮겨 넣습니다. 그런 다음 플런저와 5밀리리터의 버퍼를 사용하여 CD 14 양성 세포를 튜브로 플러시합니다. 자기 비드 절연 CD 14 양성 세포의 분화를 유도한다.먼저, 세포 배양 배지에서 밀리리터 농도당 6개의 세포에 1회 중단한다. 또는 MDDC 분화, 과립 부위 대식세포 식민지 자극인자의 밀리리터당 10나노그램을 튜브에 추가하고 6개의 잘 세포 배양판의 각 웰에 3밀리리터의 세포를 추가하거나, MDM 분화는 세포및 판세포에 대식세포 식민지 자극 인자의 밀리리터당 10나노그램을 첨가한다. 인간 폐포 상피 세포 조직 삼중 세포 공동 배양 모델을 설정하기 위해, 먼저 12웰 플레이트의 웰의 적절한 수로 전침 전 세포 배양 배지의 1.5 밀리리터를 전송하고 각 웰에 세포 배양 삽입을 배치한다.다음으로 500마이크로리터의 상피 세포 현탁액을 밀리리터당 5배 10의 밀도로 각 삽입물의 정량면에 넣고 세포 배양 인큐베이터에서 4일 간 배양하기 위해 플레이트를 덮는다. 또는 MDDC 파종은 MDDC 분화에 사용되는 6개의 웰 플레이트의 우물에서 상류체를 대체하며, 신선한 웜 셀 배양 배지의 1밀리리터로 셀 스크레이퍼를 사용하여 각 우물에서 부착 세포를 분리합니다. 각각의 슈퍼네이트와 각 우물로 세 번 씻고 모든 세포 솔루션을 단일 원심 분리 튜브에 결합합니다.수확된 MDDC는 원심분리및 멸균 핀셋에 의해 12개의 웰 플레이트의 인서트를 멸균 페트리 접시에 거꾸로 놓습니다. 삽입물의 기초 측에서 모든 상피 세포를 긁어 내고 신선한 세포 배양 배지에서 MDDC를 재중단하여 밀리리터당 이 세포의 4.2배 10분의 농도를 수행한다. 그런 다음 각 삽입에 150 마이크로리터의 셀을 추가하여 삽입의 전체 기저 표면이 거품없이 액체로 동일하게 덮입니다.MDDC에 대해 입증된 분화MDDM을 수확한 후 MDDM 파종의 경우, 신선한 세포 배양 배지 농도의 밀리리터당 4개의 세포에 2.5배 10배로 세포를 희석시키고, 각 상피 세포 및 MDDC의 벽 아래로 500 마이크로리터를 추가하여 세포 배양 삽입을 함유한 다음, 2시간 동안 플레이트에 뚜껑을 배치하여 2시간 동안 플레이트에 뚜껑을 배치하였다. 다음 날 각 세포 배양 삽입 및 우물의 정점 및 기저 부위 모두에서 상체를 흡인합니다. 그런 다음 핀셋을 살균하여 우물에서 인서트를 들어 올리고 600 마이크로 떼의 신선한 프리떼를 각 우물에 세포 배양 배지에 추가합니다.6일간의 분화 후 MDM은 둥근 모양으로 나타나고 MDDC는 더 긴 모양과 관찰 가능한 돌출부를 가진 세포로 구성된 클러스터를 형성합니다. 멤브레인 인서트에 대한 성장 3일 후, 상피 세포는 막 파열에 대한 양성 제어에 노출되면 기저구의 세포 배양 배지에서 현저한 증가와 조밀한 증가, 세포독성 물질에 대한 모델의 반응성을 입증한다. TNF 알파 또는 LPS를 통해 정량 자극시 측정된 젖산 탈수소효소 방출의 증가가 없습니다.IL6 및 IL8의 방출에서 통계적으로 유의한 증가는 처리되지 않은 세포를 대조하는 것과 비교하여 LPS 및 TNF 알파 처리된 샘플 모두에서 관찰된다. LPS 및 TNF 알파 노출 공동 배양에서 해동 세포를 사용하는 것과 비교하여 신선한 말초 혈액 단핵으로부터 MDDM 및 MDDC를 사용하는 공동 배양 모델 간에 세포 형태에 차이가 관찰되지 않고, 중단된 상피 층을 관찰하였다. 기도 또는 기관지 세포와 같은 다른 유형의 인간 세포를 사용할 수 있으며, 다른 종점도 분석될 수 있다.주로 연구원은 설정 하 고 하지만 다른 세포 유형으로 비슷한 사용 하 여이 기술에 의해 영감을 되었습니다.

multicellular-human-alveolar-model-composed-epithelial-cells-primary

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

인간 결핵 감염은 복잡한 과정으로 체외에서 모델링하기 어렵습니다. 여기에서는 생리학적 환경에서 면역 세포의 이동 및 조기 육아종 형성을 포함하여 감염 중에 발생하는 역학을 요약한 새로운 3D 인간 폐 조직 모델에 대해 설명합니다.

에 대한 기능성 연구를위한 3D 인간의 폐 조직 모델<em&gt; 결핵균</em&gt; 감염

3Rs 원리에 비추어 호흡기 모델 동물 연구 대안으로 진화 됩니다. 특히 호흡 물질의 위험 평가 대 한 적절 한 분석의 부족이 이다. 여기, 우리는 공 수 물질의 평가 대 한 인간의 정밀 컷 폐 슬라이스를 사용 하 여를 설명합니다.

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우리는 공기 액체 인터페이스 (ALI)에서 경작 된 인간 폐 세포를 노출시킴으로써 급성 폐 세포 독성에 관한 공기 중 입자의 스크리닝 및 모니터링을위한 견고하고 양도 가능하며 예측 가능한 체외 노출 시스템을 제시합니다.

공기-액체 인터페이스에서 재배된 인간 폐 세포를 노출하여 공기 중 입자의 급성 흡입 독성 평가

설명된 세포 배양 및 생체 내 기관지 모델의 세포 배양 및 노출 방법은 독성 검사를 위한 입자에 대한 사실적이고 반복적인 흡입 노출을 위한 것이다.

독성 테스트를 위해 공기 중 입자에 대한 사실적이고 반복적인 흡입 노출을 위한 공기 액체 인터페이스 기관지 상피 모델

본 프로토콜은 인간 유도만능줄기세포 유래 제2형 폐포 상피유사세포(iAT2s)를 기술한다. 이들 세포는 3D 배양물에서 자가재생 구체로서 배양되거나 공기-액체 계면(ALI) 배양에 적응될 수 있다.

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Lung-on-chip 모델은 공기-액체 계면과 내피 세포 관류를 모방하여 폐 생리학 연구에 중요한 혈류 및 영양소 교환을 시뮬레이션함으로써 기존 2D 배양을 능가합니다. 이는 폐 연구의 관련성을 높여 호흡기 감염에 대한 이해와 치료를 촉진할 수 있는 역동적이고 생리학적으로 정확한 환경을 제공합니다.

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이 논문에서는 공기-액체 계면 배양에서 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 폐 상피, 중간엽, 내피 세포 및 대식세포로 구성된 복잡한 다세포 기도 장벽 모델의 생성에 대해 설명합니다.

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감염성 실험 환경에 적응하는 신생아, 유아, 성체 쥐 폐에서 폐포 유형 II 상피세포 분리

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