자기 측정을 사용하여 화학적으로 합성된 산화철 나노 입자의 세포 통합 및 후속 생분해를 모니터링합니다.

이 비디오는 자기 나노 입자의 합성과 생물학적 환경에서의 변형을 촬영하기 위해 자기 측정법을 사용하는 빠르고 효율적인 방법을 소개합니다. 자기 나노 입자는 생체 의학 응용 프로그램에 대한 증가 관심을 끌고있다, 그리고 한 번 세포에서 내면화 그 운명을 이해하는 것이 중요하다. 이것은 세포 자성을 측정하여 여기에서 달성됩니다.

자기 나노 입자 합성 및 측정 모두, 결과 오염에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 잘 세척된 화학 용 바이알을 사용하고 자기계 장비가 오염이 없는지 확인하십시오. 자기 측정 샘플 홀더는 일반적으로 분말 샘플에 사용됩니다.

우리는 액체 또는 생물학적 샘플에 홀더의 사용을 적응하는 방법을 보여줍니다. 30 밀리리터 마나 웨이브 유리 유리 바이알에서 400 밀리그램의 철 3개 아세틸라토네이트를 10밀리리터의 벤질 알코올로 녹입니다. 전자레인지 원자로를 사용하여 현탁액을 섭씨 25도에서 섭씨 250도로 가열하여 분당 섭씨 11.25도의 속도로 가열하고 섭씨 250도에서 유지합니다.

나노 입자를 분리하려면 30 분 동안 네오디뮴 자석을 적용하십시오. 나노입자를 펠릿하기 위해 지정된 세척액10밀리리터를 사용하여 5분 동안 네오디뮴 자석을 적용하여 일련의 세척을 수행합니다. 여과를 제거하고 마이너스 2 개의 어금니 염산에 10 밀리리터 12 밀리리터를 추가합니다.

서스펜션과 100킬로달톤 필터를 2, 200배 G에서 10분간 원심분리합니다. 그런 다음 나노 입자를 10 밀리리터에서 마이너스 2개의 어금니 염산으로 재차 축한다. 원고에 설명된 바와 같이 코팅 분자 용액을 준비한다.

코팅 분자와 나노입자 사이의 질량 비율로 코팅 분자 용액에 10 밀리리터 나노입자 수성 분산을 추가합니다. 그런 다음 자기 교반기를 사용하여 실온에서 2 시간 동안 혼합물을 교반합니다. 반응이 완료된 후, 수산화나트륨 1개를 사용하여 혼합물의 pH를 7개로 조절한다.

인간 중간엽 줄기 세포의 배양물이 5및 90%의 컨fluent 통로에 있을 때, 배지를 제거하고 글루타민 없이 혈청이 없는 RPMI로 세포를 헹구는다. 각 150 평방 센티미터 배양 플라스크에 나노 입자 서스펜션의 10 밀리리터를 추가하십시오. 플라스크를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 30분간 배양합니다.

그런 다음 나노 입자 현탁액을 포함하는 매체를 버리고 혈청이없는 RPMI 1640으로 세포를 한 번 씻는다. 10%의 FBS와 1%페니실린 연쇄절제술로 보충된 DMEM을 추가합니다. 나노 입자의 완전한 내산화를 허용하기 위해 섭씨 37도 및 이산화탄소 5 %에서 하룻밤 동안 배양하십시오.

자기 라벨이 부착된 MSC의 각 플라스크에 섭씨 37도에 예동된 0.05%의 트립신 EDTA 10밀리리터를 추가합니다. 2~3분 후에 세포가 분리되면 미리 경고된 DMEM 의 부피의 3분의 1을 추가하여 트립신을 즉시 비활성화합니다. 분리된 세포를 5분 동안 260배 G로 원심분리합니다.

배지를 흡인시키고 50 마이크로리터 당 약 200, 000 세포의 농도로 소량의 세포-스페로이드 배양 배지에서 세포를 재연한다. 15 밀리리터 멸균 원심 분리튜브에 갓 준비된 세포-스페로이드 배양 배지 1밀리리터를 넣습니다. 그런 다음 200, 000 셀에 해당하는 셀 현탁액의 부피를 추가합니다.

원심분리기는 튜브 의 바닥에 세포 펠릿을 형성하기 위해 3 분 동안 180 배 G에서 자기 로 표지 된 세포를 형성한다. 그런 다음 인큐베이터에 튜브를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배치하여 가스 교환을 위해 캡을 약간 열어 두십시오. 자기 나노 입자또는 고정 된 단일 세포 스페로이드 현탁액을 진동 시료 자력계 또는 VSM 시료 홀더에 놓습니다.

필요한 경우 PTFE 테이프를 사용하여 누출을 방지할 수 있습니다. 샘플 홀더를 VSM에 삽입하고 샘플 오프셋을 검사합니다. 자화 최대값에 해당하는 위치에 샘플을 배치합니다.

음수 1, 500 Oersteds 및 양수 1, 500 Oersteds 사이의 낮은 자기장에서 초당 20 Oersteds의 속도로 첫 번째 측정을 수행합니다. 초당 200 Oersteds의 속도로 제로 Oersteds와 양성 30, 000 Oersteds 사이의 높은 자기장에서 두 번째 측정을 수행합니다. 수성 용액에 분산된 나노입자의 10마이크로리터는 진동 시료 자력계에서 측정하였다.

곡선의 두 번째 부분의 경사는 물과 샘플 홀더로부터의 횡자기 신호를 나타내는 다자기 상수이다. 이러한 횡자기 상수는 나노입자의 자기 모멘트만 을 얻기 위해 용액의 자기 순간으로부터 빼었다. 그런 다음 채도에서 자그마슬이 결정되었습니다.

코팅된 나노입자는 줄기세포에서 내면화되었다. 전자 현미경 이미지는 내시경에 국한된 구연산 코팅 및 PAA 코팅 나노 입자를 보여줍니다. 세포가 원심분리에 의해 펠릿화된 후에, 그(것)들은 연장된 기간 동안 배양에서 보관될 수 있는 세포 구체성 형성했습니다.

개별 세포-스페로이드는 또한 VSM을 사용하여 측정되었고 포화 자기 모멘은 세포 샘플에서 나노 입자의 양을 계산하는 데 사용되었다. 나노 입자의 섭취는 그들의 잠복 농도에 따라 달라 진 것으로 나타났다. 시간이 지남에 따라 세포-스페로이드의 자성의 감소는 전자 현미경 검사법에 의해 확인된 나노 입자의 생분해를 나타냈다.

열화는 PAA 코팅 나노 입자보다 구연산 코팅 나노 입자에서 더 실질적이었습니다. 자기 측정을 사용하여 세포 내의 자기 나노 입자의 분해는 정확하게 정량화 될 수 있으며, 원시 거동에 관심이있는 나노 입자의 선물의 영향을 평가 할 수있다. 이 프로토콜에서, 자기 측정은 세포 구체에, 그러나 정지 또는 기관으로 세포로 확장될 수 있습니다.

설명된 방법을 사용하면 서로 다른 세포 시스템에서 새로 설계된 자기 나노 입자의 상호 작용을 탐구 할 수 있지만 생체 분포 및 운명에서 그들의 상호 작용을 따를 수도 있습니다.