개별 초파리 멜라노가스터의 알코올 침전 시간을 측정하기위한 높은 처리량 방법

Drosophila는 통제된 유전 배경 및 환경 조건하에서 정확하게 알콜 감도를 정량화할 수 있기 때문에 알콜 감도의 유전 기초를 연구하는 우수한 모형을 제공합니다. 플라이의 Drosophila 테스트 그룹에서 알코올 감도를 측정하는 현재 방법. 우리는 단일 파리의 많은 수의 알코올 민감도를 평가하는 간단하고 저렴한 고처리량 방법을 제시합니다.

Drosophila에 있는 알콜 감도에 있는 변이는 파리가 인간 정형전환과 그들의 유전자의 대략 75%를 공유하기 때문에 인간에 있는 유사한 표현형으로 번역될 수 있습니다. 우리가 개발 한 분석은 또한 다른 비행 종 또는 질병 벡터를 포함하여 다른 곤충에 휘발성의 급성 독성의 효과를 측정하기 위해 적용 될 수있다. 24웰 세포 배양판의 판지 템플릿을 만드는 것으로 시작합니다.

접시 주변을 추적하고 지정된 영역을 잘라냅니다. 그런 다음 골판지 템플릿을 사용하여 접시 크기의 작은 곤충 화면 메쉬 조각을 만듭니다. 24웰 컬쳐 플레이트 둘레에 작은 핫 접착제라인을 놓고 우물 위에 화면 메쉬를 부착합니다.

그런 다음 뜨거운 접착제 총을 사용하여 문화 판의 세 면에 나무 공예 스틱을 고정하십시오. 촬영실에 들어갈 수 있는 만큼 플레이트를 준비합니다. 촬영 챔버를 만들려면 폴리스티렌 상자의 한쪽에 비디오 카메라 렌즈의 크기를 구멍과 반대쪽에 조명 패드의 크기에 추가 슬릿을 잘라.

조명 패드를 슬릿에 삽입하고 카메라를 조명 패드 위의 렌즈 구멍에 배치합니다. 모든 시험재료를 제어된 환경에 배치하고, 바람직하게는 습도 약 30%, 섭씨 25도, 균일한 기류 및 소음 수준이 65데시벨 미만인 행동 챔버를 배치합니다. 이전에 만든 골판지 템플릿을 사용하여 치즈 천 두 조각을 잘라냅니다.

그런 다음 각 우물에 화면 메쉬를 통해 100 % 에탄올의 파이펫 1 밀리리터. 메쉬를 말리고 치즈천 두 조각을 위에 놓습니다. 골판지 템플릿을 짧은 면 중 하나에서 1~2센티미터로 확장하는 가이드로 사용하여 얇고 유연한 플라스틱 도마의 작은 조각을 잘라냅니다.

절단 후 플라스틱이 여전히 테스트 장치에 세 개의 나무 공예 스틱 사이에 맞는지 확인하지만 한쪽 끝에 매달려 있습니다. 원고 의 지시에 따라 흡인기를 준비하고, 유연한 플라스틱으로 이전에 흡인 된 파리로 모든 우물을 덮는 24 웰 세포 배양 판으로 잘 당 하나의 비행을 전송하는 데 사용합니다. 각 비행의 우물 위치와 관련 유전자형 또는 표현형 정보를 기록합니다.

플라이를 포함하는 세포 배양판의 상단과 유연한 플라스틱 플러시를 잡고, 에탄올을 사용하여 변형된 세포 배양판의 상단에 플레이트를 반전시킨다. 공예 스틱을 사용하여 반전된 세포 배양 판을 정렬하여 에탄올을 잘 사용하여 파리를 포함하는 각 우물과 잘 정렬되도록 합니다. 조명 패드가 전체 밝기로 켜지고 비디오 카메라로 녹화를 시작합니다.

두 접시 사이에 플라스틱을 조심스럽게 제거하여 에탄올에 파리를 노출하여 치즈 천을 빼내지 않도록 하십시오. 모든 파리가 자세 조절권을 잃었다고 의심되는 경우 접시 중앙을 단단히 누릅니다. 움직임이 있는 경우 이동이 발생하지 않습니다 때까지 1~2분마다 계속 녹화합니다.

움직임이 없는 후에 레코딩을 종료합니다. 파리를 복구하려면 테스트 장치에서 상단 플레이트를 제거하고 개별 파리를 선택한 용기로 흡인합니다. 변형된 세포 배양 판에서 에탄올을 시간당 적어도 한 번 교체하여 분석 전반에 걸쳐 일관된 에탄올 노출을 유지하고 원하는 만큼의 시료에 대한 실험을 반복한다.

비디오 녹화를 시청하여 플라이가 자세 제어 및 운동 능력을 잃는 순간으로 정의된 플라이 세빙 시간을 결정합니다. 정확도를 보장하려면 필름을 역으로 보고 비행이 이동하기 시작하는 시간을 기록합니다. 이 방법을 사용하여 10분 이내에 많은 수의 플라이에서 데이터를 생성할 수 있습니다.

24웰 플레이트 2개는 알코올에 대한 민감도가 다른 두 개의 DGRP 라인의 48개의 개별 파리에 대해 에탄올 체멸 시간을 동시에 측정하는 데 사용되었습니다. 샘플 크기가 큰 경우 정확도를 높이고 환경 변화에 대한 오차를 줄입니다. RAL_555 파리는 RAL-177 파리보다 덜 민감했다.

RAL_177 남성과 여성은 성적으로 이질적인 영향을 미치지 않는 반면, RAL_555 선의 여성은 남성보다 에탄올 노출에 덜 민감했습니다. 이 프로토콜을 시도할 때, 원하는 결과를 달성하기 위해 정밀하게 파리의 포부와 세포 배양판의 반전을 수행하는 것이 중요합니다. 단일 파리를 평가하는 능력은 그룹 상호 작용으로 인한 혼동 효과를 피하기 때문에,이 분석은 알코올 노출의 급성 효과에 대한 높은 처리량 연구에 대한 Drosophila 모델의 유용성을 향상시킵니다.