개별 Drosophila melanogaster의 알코올 진정 시간을 측정하기 위한 고처리량 방법

초파리는 통제된 유전적 배경과 환경 조건 하에서 알코올 민감도를 정확하게 정량화할 수 있기 때문에 알코올 민감성의 유전적 토대를 연구할 수 있는 훌륭한 모델을 제공합니다. 파리의 초파리 테스트 그룹에서 알코올 민감도를 측정하는 현재 방법. 우리는 많은 수의 단일 파리에서 알코올 민감도를 평가하기 위한 간단하고 저렴하며 처리량이 많은 방법을 제시합니다.

초파리의 알코올 감수성 변화는 파리가 인간 ortholog와 유전자의 약 75%를 공유하기 때문에 인간에서 유사한 표현형으로 번역될 수 있습니다. 우리가 개발한 분석법은 다른 파리 종 또는 질병 매개체를 포함한 다른 곤충에 대한 휘발성 물질의 급성 독성의 영향을 측정하는 데에도 적용할 수 있습니다. 먼저 24웰 세포 배양 플레이트의 판지 템플릿을 만듭니다.

접시 주위를 추적하고 지정된 영역을 잘라냅니다. 그런 다음 판지 템플릿을 사용하여 접시 크기의 작은 곤충 스크린 메쉬 조각을 만듭니다. 24웰 배양 플레이트의 둘레에 뜨거운 접착제의 작은 선을 놓고 웰 위에 스크린 메쉬를 부착합니다.

그런 다음 뜨거운 글루건을 사용하여 배양 플레이트의 3면에 나무 공예 스틱을 고정합니다. 촬영실에 들어갈 수 있는 한 많은 플레이트를 준비합니다. 촬영 챔버를 만들려면 폴리스티렌 상자의 한쪽 면에 비디오 카메라 렌즈 크기의 구멍을 뚫고 반대쪽에 있는 조명 패드 크기의 추가 슬릿을 자릅니다.

조명 패드를 슬릿에 삽입하고 조명 패드 위의 렌즈 구멍에 카메라를 배치합니다. 모든 테스트 재료를 통제된 환경, 가급적이면 습도 약 30%, 섭씨 25도의 온도, 균일한 공기 흐름 및 소음 수준이 65데시벨 미만인 동작 챔버에 배치하십시오. 이전에 만든 판지 템플릿을 사용하여 두 조각의 무명천을 자릅니다.

그런 다음 100% 에탄올 1밀리리터를 스크린 메쉬를 통해 각 웰에 피펫팅합니다. 메쉬를 말리고 그 위에 두 조각의 무명천을 놓습니다. 판지 템플릿을 가이드로 사용하여 얇고 유연한 플라스틱 도마의 작은 조각을 잘라 짧은 면 중 하나에서 1-2cm 영역을 확장하십시오.

절단 후 플라스틱이 테스트 장치에 있는 세 개의 나무 공예 스틱 사이에 여전히 맞지만 한쪽 끝이 매달려 있는지 확인하십시오. 원고 지침에 따라 흡인기(aspirator)를 준비하고, 이를 사용하여 웰당 플라이 1개를 24웰 세포 배양 플레이트로 옮기고, 이전에 흡인된 플라이가 있는 모든 웰을 유연한 플라스틱으로 덮습니다. 웰 위치와 각 파리의 관련 유전자형 또는 표현형 정보를 기록합니다.

파리가 들어 있는 세포 배양 플레이트의 상단과 같은 높이의 유연한 플라스틱을 잡고 에탄올이 포함된 변형된 세포 배양 플레이트의 상단에 플레이트를 뒤집습니다. 크래프트 스틱을 사용하여 거꾸로 된 세포 배양 플레이트를 정렬하고 에탄올이 있는 각 웰이 파리가 들어 있는 각 웰과 정렬되도록 합니다. 조명 패드가 최대 밝기로 켜져 있는지 확인하고 비디오 카메라로 녹화를 시작합니다.

두 판 사이의 플라스틱을 조심스럽게 제거하여 파리를 에탄올에 노출시키고 무명천이 빠지지 않도록 합니다. 모든 파리가 자세 조절을 잃었다고 의심되는 경우 플레이트 중앙을 세게 두드립니다. 움직임이 있으면 아무 움직임이 없을 때까지 1-2분 간격으로 탭하여 계속 녹음합니다.

움직임이 없으면 녹음을 종료합니다. 파리를 회수하려면 테스트 장치에서 상판을 제거하고 선택한 용기에 개별 파리를 흡인합니다. 변형된 세포 배양 플레이트의 에탄올을 한 시간에 한 번 이상 교체하여 분석 전반에 걸쳐 일관된 에탄올 노출을 유지하고 원하는 만큼 샘플에 대해 실험을 반복합니다.

비디오 녹화를 보고 파리가 자세 조절과 운동 능력을 잃는 순간으로 정의되는 파리 진정 시간을 확인하십시오. 정확성을 보장하려면 필름을 거꾸로 보고 파리가 움직이기 시작하는 시간을 기록하십시오. 이 방법은 10분 이내에 많은 수의 파리에 대한 데이터를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

2개의 24웰 플레이트를 사용하여 알코올에 대한 민감도가 다른 2개의 DGRP 라인의 개별 파리 48마리에 대한 에탄올 진정 시간을 동시에 측정했습니다. 표본 크기가 크면 정확도가 향상되고 환경 변화에 대한 오류가 줄어듭니다. RAL_555 파리는 RAL-177 파리보다 덜 민감했다.

RAL_177의 수컷과 암컷은 성적으로 이형성 효과를 보이지 않은 반면, 라인 RAL_555의 암컷은 수컷보다 에탄올 노출에 덜 민감했습니다. 이 프로토콜을 시도할 때는 원하는 결과를 얻기 위해 파리의 흡인과 세포 배양 플레이트의 반전을 정밀하게 수행하는 것이 중요합니다. 단일 파리를 평가할 수 있는 능력은 그룹 상호 작용으로 인한 교란 효과를 피하기 때문에 이 분석은 알코올 노출의 급성 영향에 대한 고처리량 연구를 위한 초파리 모델의 유용성을 향상시킵니다.