지카 바이러스를 사용하여 Aedes aegypti 모기에 벡터 역량 분석

아르보바이러스(arbovirus)에 의해 매개되는 발생 사례에서 대응책은 주로 모기 박멸에 국한됩니다. 따라서 매개체 적합성 분석은 특정 아르보바이러스의 매개체가 될 수 있는 모기 집단과 종을 결정하여 방제 대상을 설정할 수 있게 하므로 매우 중요한 예방 전략입니다. 따라서 모기와 기타 매개체의 감염성 질환 전파 역할을 평가하기 위한 도구 상자에서 가장 중요한 구성 요소 중 하나가 바로 매개체 적합성 연구입니다. 이러한 실험을 통해 우리는 모기나 진드기의 종뿐만 아니라 지리적 계통, 그리고 서로 다른 바이러스나 기타 감염성 유기체의 매우 특정한 균주까지 매우 정밀하게 제어할 수 있으며, 이를 통해 세계 특정 지역에서 서로 다른 병원체를 전파하는 다양한 종의 위험성에 대해 매우 정확하고 잘 제어된 데이터를 얻을 수 있습니다. 감염된 모기를 다루는 작업에는 실험자에 대한 위험과 감염된 모기의 유출 위험을 최소화하기 위해 전용 시설, 교육, 경험 및 세심한 계획이 필요합니다. 따라서 이 시설의 신입 연구원이 비감염 혈액 모기를 사용하여 기술과 작업 흐름을 익히는 시간을 갖는 것이 매우 중요합니다.

노출 당일에 절지동물 격리 시설의 전원을 켜서 급이 장치를 예열합니다. 갓 채취한 시트르산염 또는 헤파린 처리된 인간 혈액과 바이러스 스톡을 1:1 부피 비율로 혼합하고, 표준 3 mL 저장조 장치 위에 감염되지 않은 일반 마우스의 피부를 덮습니다. 덮개가 있는 저장조를 흰색 종이 타월 위에 놓고, 감염성 혈액 약 2 mL를 1 mL씩 나누어 저장조에 추가합니다.

그 다음, 키친타월로 확인하여 누출이 없는지 점검하십시오. 감염 분석을 수행하기 24시간 전에 Vero 세포가 담긴 24-웰 세포 배양 플레이트를 준비하고, 각 웰에 모기의 식별 정보와 샘플명을 표시하십시오. 모기가 감염된 혈액 식사를 하게 될 날 아침에, 물에 젖은 솜 뭉치를 제거하고 투명 플라스틱 밀폐 글로브 박스를 사용하여 인공 혈액 식이 저장조를 급이 장치 리드에 부착하십시오.

굶긴 모기가 들어있는 판지 상자를 급여 장치 아래의 글로브 박스 안에 넣습니다. 급여가 완료되면 저장조를 꺼내어 갓 준비한 10% 표백제 용액에 담급니다. 글로브 박스 내에서 냉각 마취된 모기를 얼음 위에 놓인 페트리 접시에 붓고, 흡혈한 모기와 흡혈하지 않은 모기를 분류합니다.

흡혈한 모기들을 다시 판지 상자에 넣고, 빠르게 망과 뚜껑으로 덮습니다. 상자 밖으로 나온 과도한 망 부분을 잘라내고, 뚜껑을 테이프로 고정합니다. 멸균 여과된 10%sucrose에 적신 솜 뭉치를 망에 추가하고, 습도를 유지하기 위해 젖은 스펀지가 들어 있는 커다란 플라스틱 2차 용기에 상자를 넣습니다.

2차 용기를 27°C에서 배양하며, 실험이 완료될 때까지 모기가 설탕물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 합니다. 기계식 흡입기를 사용하여 카톤에서 정해진 수의 배양된 모기를 수집하고, 수집이 끝나면 수집 튜브의 입구를 코튼 라운드로 막습니다. 글로브 박스 내에서, 저온 마취된 모기를 얼음 위에 놓인 페트리 접시에 붓습니다.

모기 한 마리당 여섯 개의 다리를 모두 제거하여, 멸균된 스테인리스강 볼 베어링과 500 µL의 모기 수집 배지(MCM)가 들어 있는 라벨링 된 2 mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. 모기의 머리나 구침에 오일이 닿지 않도록 주의하며 미네랄 오일 한 방울 위에 모기를 조심스럽게 놓습니다. 10 µL의 열 불활성화 FBS가 채워진 마이크로 피펫 팁에 구침을 삽입하고, 모기가 30분 동안 타액을 분비하도록 둡니다.

타액이 묻은 피펫 팁을 100 µL의 MCM이 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브에 배출하고, 사체는 멸균된 스틸 볼 베어링과 500 µL의 MCM이 들어 있는 별도의 2 mm 튜브에 넣습니다. 튜브를 생물안전작업대 내의 비드 밀링 조직 균질화 장치로 옮겨, 모든 신체 및 다리 시료를 26 Hz에서 5분 동안 분쇄하여 상층액으로 바이러스 입자를 용출시킵니다. 세포 잔해를 침전시키기 위해 모든 시료를 200 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 청징화합니다.

시료를 접종하기 직전에, 이전에 준비한 Vero 세포에서 배지를 제거합니다. 펠릿의 모기 세포 잔해를 건드리지 않도록 주의하며, 몸통 또는 다리에서 얻은 정제된 상층액 100 µL를 각 웰에 조심스럽게 분주합니다. 그런 다음, 플레이트를 1시간 동안 배양합니다.

배양 후, 각 웰에 1 mL의 메틸셀룰로오스 오버레이를 추가하고 플레이트를 인큐베이터에 넣어 3~7일 동안 배양합니다. 오버레이 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 생물안전작업대(BSC)로 옮깁니다. 메틸셀룰로오스 오버레이를 10% 표백제가 담긴 트레이 팬에 버리고, 각 웰을 PBS로 2회 세척하며 각 세척액은 트레이 팬에 버립니다.

PBS를 제거하고, 웰당 1 mL의 메탄올-아세톤을 첨가하여 30분 동안 세포가 플레이트에 고정되도록 합니다. 그 후, 고정액을 버리고 플레이트를 건조시킵니다. 오비탈 플레이트 로커(orbital plate rocker)에서 웰당 3회씩, 회당 15분 동안 비멸균 PBS로 세척한 다음, 각 웰에 1 mL의 블로킹 용액을 첨가하고 다시 15분 동안 플레이트를 흔들어 줍니다.

각 웰에 100 µL의 anti-Zika Virus 또는 anti-flavivirus 1차 항체를 첨가하고, 플레이트를 흔들어주며 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 1차 항체를 제거하고 PBS로 세척 과정을 반복합니다. 마지막 세척 후, 100 µL의 2차 항체를 첨가하고 흔들어주며 1시간 동안 배양합니다.

PBS로 세척 과정을 반복한 다음, 웰당 100 µL의 기질 발색 시약을 첨가하고 플레이트를 15분 동안 흔들어 줍니다. 초점(foci) 또는 플라크(plaques)가 형성되면, 플레이트를 수돗물로 헹구어 반응을 중단시킵니다. 수돗물을 따라 버리고 플레이트를 공기 중에서 건조시킨 후, 바이러스 초점의 수를 정량하여 해당 시료에 존재하는 초점 형성 단위(focus forming units)의 수를 결정합니다.

세 가지 모기 집단을 다양한 혈액 식사 역가의 지카 바이러스 유행 균주에 노출시켰습니다. 이후 2주 동안 모기 하위 집단을 처리하여 감염, 전파 및 잠재적 전송률을 결정하였습니다. 낮은 혈액 식사 역가에서 브라질 살바도르 출신 모기들은 4일, 10일, 14일의 외부 잠복기 후에 감염되었으며, 분석한 다리에서는 전파된 감염의 증거가 관찰되지 않았습니다.

가장 높은 역가에서 바이러스가 모기의 다리에서는 검출되었으나, 타액에서는 검출되지 않았습니다. 도미니카 공화국 출신 모기가 감염에 가장 민감했으며, 테스트한 모든 혈액 식사 역가에서 전송 능력이 가장 뛰어난 것으로 나타났습니다. 세 가지 용량을 모두 섭취한 모기는 감염 7일째에 바이러스 확산이 확인되었으며, 감염 후 14일째에 전송 능력을 보였습니다.

낮은 혈액 식사 역가에 노출된 텍사스 리오그란데 밸리(Rio Grande Valley) 유래 모기들은 감염 후 이르면 4일째에 감염되었으며, 전신 감염은 14일 후에 발견되었습니다. 가장 높은 역가에 노출된 코호트에서는 감염 후 2일째부터 감염이 관찰되었고, 4일, 10일, 14일에 정점에 도달했습니다. 전신 감염은 7일째에 관찰되었으며, 10일째에는 단 한 마리의 모기만이 전파 능력을 갖추었습니다.

이 프로토콜을 수행할 때는 신속함보다 안전하게 작업하는 것이 중요합니다. 따라서 감염되었거나 감염 가능성이 있는 모기는 다리나 날개를 제거할 때까지 반드시 글로브 박스나 생물 안전 작업대(bio safety cabinet) 내에서 취급하십시오. 기본적인 매개체 역량 분석 워크플로우는 전파 연구와 같은 후속 분석을 위한 감염 모기를 생성하거나, 모기, 바이러스 및 마이크로바이옴 간의 상호작용을 조사하는 데 응용될 수 있습니다.

매개체 적합성은 바이러스성 질병의 유행 시기에 바이러스 전파에서 모기가 수행하는 역할을 이해하는 데 있어 수십 년 동안 매우 중요한 도구였습니다. 또한 이 방법은 바이러스와 모기 매개체 간의 상호작용에 대해 새롭게 밝혀지는 정보들을 반영하며 수년에 걸쳐 발전해 왔습니다. 두 가지 예를 들자면, 모기 내 바이러스 집단의 유전적 다양성과 그 복잡성이 전파 능력에 매우 중요하다는 사실이 밝혀졌으며, 이제는 바이러스 집단에 대한 새로운 시퀀싱 방법을 통해 매개체 적합성 연구에 이러한 내용을 포함시킬 수 있게 되었습니다.

또한 우리는 모기의 위장관에 서식하는 박테리아 및 기타 생물군이 모기의 전파 능력에 큰 영향을 미칠 수 있다는 점을 알게 되었으며, 이제 새로운 시퀀싱 방법을 통해 해당 생물군을 평가할 수 있습니다. 따라서 벡터 능력(vector competence) 측정법은 이러한 복잡한 상호작용에 대해 더 많이 알게 됨에 따라 발전해 왔으며 지금도 계속 진화하고 있는 방법입니다.