쥐 모델에서 집중 초음파를 사용하여 위치 특정 혈액 뇌 장벽 개방에 대한 벤치 탑 접근

마이크로 버블 에이전트를 가진 집중한 초음파는 혈액 두뇌 장벽을 초점하고 일시적으로 열 수 있습니다. 이 기술은 혈액 뇌 장벽을 통해 에이전트의 넓은 범위를 제공하기 위해 사용되었습니다. 이 문서에서는 MRI 지침유무이드 없이 설치류 뇌에 국소화된 전달을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

회람 마이크로 거품과 조화하여 집중된 초음파는 혈액 뇌 장벽에 있는 임시 밀리미터 크기 오프닝을 제공하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이를 통해 전신 순환 제제를 표적 뇌 영역에 비침습적으로 전달할 수 있습니다. 시작하려면 카테터 마개에 식염수를 채우고 램프로 쥐의 꼬리를 따뜻하게 하되 동물이 과열되지 않도록 주의합니다.

마이크로 버블, Evans 블루 염료, MRI를 사용하는 경우 gadobutrol MRI 조영제 및 관심 실험제를 전달하는 데 사용할 24게이지 꼬리 정맥 카테터를 삽입합니다. 정맥이 부딪히면 피가 칼집을 채울 것입니다. 천천히 내부 바늘을 제거하면서 칼집을 정맥 안으로 더 밀어 넣습니다.

포트에 혈액이 채워지는 즉시 카테터 플러그를 카테터 포트 끝에 나사로 고정합니다. 카테터와 꼬리 주위에 실험실 테이프를 조심스럽게 감아 제자리에 고정하고 상단의 작은 조각부터 꼬리 방향으로 작업합니다. 카테터 플러그의 맨 끝을 노출된 상태로 두십시오.

마취 라인을 정위 프레임의 마취 커넥터에 꽂습니다. 그런 다음 입을 바이트 바에 놓고 이어바를 양쪽 외이도로 안내하고 고정 나사를 조여 동물의 머리를 프레임에 고정합니다. 동물을 MRI 침대로 옮깁니다.

텍스트 원고에 설명된 매개변수를 사용하여 좌표 측정을 위해 MRI 기준점뿐만 아니라 전체 뇌를 캡처하는 관상 및 축 T2 가중 이미지를 수집합니다. 관상 이미지에서 기준점이 가장 크고 기준점의 중심을 나타내는 이미지를 찾습니다. 기준점 상단에서 관심 있는 뇌 영역까지의 거리를 내측-외측 방향과 등-복부 방향 모두에서 밀리미터 단위로 기록합니다.

축 이미지에서 기준점의 맨 위를 보여주는 이미지를 찾고 기준점 중심의 X 및 Y 좌표와 관심 뇌 영역의 X 및 Y 좌표를 기록합니다. 기준점의 중심에서 표적 뇌 영역까지의 거리를 상부-꼬리 및 내측-외측 방향 모두에서 계산합니다. 좌표를 수집한 후 사전 스캔 이미지를 수집합니다.

이 입체 안경테에 동물을 보관하고 MRI 침대에서 벤치 탑 FUS 설정으로 빠르게 운반하십시오. 동물이 마취의 영향으로 잠을 자고 있는지 확인하십시오. 프레임을 프레임 홀더에 밀어 넣고 제자리에 단단히 끼웁니다.

이발기를 사용하여 동물의 머리를 면도한 다음 여분의 털을 털어내고 두피에 헤어 리무버 크림을 바릅니다. 3분 동안 그대로 두었다가 물과 거즈로 닦아냅니다. MRI 안내를 사용하는 경우 포인터를 연결하고 포인터를 MRI 기준점의 위치로 이동합니다.

그런 다음 MRI 이미지의 모든 거리가 계산된 지점인 MRI 기준점의 맨 위와 중앙에 포인터를 놓습니다. 포인터를 제거하고 포지셔너를 내측-외측 좌표 및 로스트랄-꼬리 좌표로 이동합니다. null 위치 버튼을 핥고 up 50 버튼을 눌러 포지셔너를 위로 올리면 수조와 초음파 젤이 배치될 수 있습니다.

동물의 두피에 초음파 젤을 바르고 폴리이미드 테이프 창을 젤에 눌러 젤에 기포가 없는지 확인한 상태에서 동물 위에 수조를 놓습니다. 수조에 가스가 제거된 물을 채웁니다. 고출력 변환기를 사용하는 경우 자석이 물 바로 위에 있도록 포지셔너를 낮추십시오.

변환기를 비스듬히 물 속으로 조심스럽게 내리고 자석을 연결하여 변환기를 포지셔너에 부착합니다. 포지셔너를 등쪽-복부 좌표로 낮추고 RF 전원을 켭니다. 3%Evans blue 염료 1kg당 1밀리리터를 카테터 플러그에 바늘 끝을 꽂고 주사하여 주입합니다.

몇 초 안에 동물 전체가 파란색으로 변해야 하며, 이는 카테터가 꼬리 정맥에 적절하게 배치되었음을 나타냅니다. 염료가 5분 동안 순환하도록 한 다음 버블 셰이커로 격렬하게 흔들어 마이크로 버블을 활성화합니다. 이 주사기를 여러 번 뒤집어 마이크로 버블의 균일한 분포를 얻은 다음 날개 달린 주입 세트를 부착하고 채웁니다.

주입 펌프에 주사통을 두고, 2 분 FUS 노출에 마이크로 거품의 느린 주입을 제공하는 시간 당 6 밀리리터의 비율로 0.2 밀리리터를 전달하기 위하여 주입 펌프를 놓으십시오. 날개 달린 바늘을 카테터 플러그에 삽입합니다. 먼저 주입 펌프를 실행하고 3초 동안 기다린 다음 켜기 버튼과 함수 발생기를 눌러 FUS 치료를 시작합니다.

마이크로 거품이 맑게 하는 것을 허용하기 위하여 5 분을 가진 지구 당 이것을 두번 반복하십시오. 함수 발생기의 켜기 버튼을 다시 누르면 주입 펌프가 2분에 멈출 때 FUS 처리가 중지됩니다. 마이크로 기포가 제거될 때까지 5분 동안 기다린 다음 주입과 두 번째 FUS 치료를 시작합니다.

두 번째 FUS 치료 직후, gadobutrol 조영제와 관심있는 제제를 주입하십시오. 모든 약제의 총 공급량은 킬로그램당 5밀리리터를 초과해서는 안 됩니다. BBB 개구부를 확인하려면 동물을 정확히 같은 위치에 있는 MRI 침대에 다시 눕히고 마취 라인을 연결합니다.

BBB 개방 영역에서 gadobutrol MRI 향상을 확인하기 위해 사전 스캔 이미지와 동일한 이미징 매개변수로 MRI 사후 스캔을 수집합니다. 이 프로토콜은 저전력 침수 변환기와 고출력 집속 초음파 변환기를 모두 사용하여 국소 혈액 뇌 장벽 개방을 유도하는 데 사용되었습니다. 첫째, 저전력 침수 변환기는 전방 또는 내측 뇌 반구를 대상으로 했습니다.

동물은 관류를 사용하거나 사용하지 않고 희생되었으며 BBB 개구부는 Evans blue dye 자동 형광을 통해 시각화되었습니다. 이후의 실험에서, FUS 트랜스듀서는 해마 또는 전대상피질(anterior cingulate cortex)을 표적으로 삼았습니다. Evans 블루 염료 외에도 MRI 조영제 gadobutrol을 사용하여 VIVO에서 BBB의 표적 개방을 확인했습니다.

동물을 제물로 바친 후 Evans blue dye 자동 형광으로 개방 위치를 확인했습니다. 이 기술이 표적 유전자 전달에 사용될 수 있는지 여부를 평가하기 위해 녹색 형광 단백질과 가도부트롤 조영제를 발현하는 AAV nine을 해마에서 혈액 뇌 장벽이 열린 직후 주입했습니다. 동물은 가도부트롤 대비로 개구부를 확인하기 위해 이미지화되었습니다.

그런 다음, GFP 발현에 의해 유전자 전달을 확인하였다. 이 프로토콜은 MRI 유도 초점 초음파 매개 혈액-뇌 장벽 개방에 대한 벤치탑 접근 방식을 제공하며, 정위 수술에 대한 비침습적 중개 대안을 제공하기 위해 다른 실험실에서 쉽게 적용할 수 있습니다.