Name: 공초점 현미경 검사법에 의한 단세포 인천성형광서명의 재구성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 학습하세요 공초점 현미경법을 이용한 단세포 천연형광서명 추출 및 재구성 방법을. 비침습적 태그 없이 세포 특성을 분석하고 미생물 표현형 다양성을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 일본 교육문화체육관광부(18K04843)에서 YST ERATO(JPMJER1502)에서 N. 노무라까지 과학연구보조금으로 부분적으로 지원되었다.

1. 샘플 준비
<ol><li>유리 슬라이드에 우물이 있는 1mm 두께의 실리콘 개스킷을 놓습니다.</li>
	<li>실리콘 개스킷의 우물에 1mm 두께0.8%(w/v) 아가로즈 슬래브를 놓습니다.</li>
	<li>임의미생물세포배양주의 세포밀도를 600nm(OD660) = 1.0에서 광학 밀도로 희석한다.</li>
	<li>아가로즈 슬래브에 세포 현탁액의 5 μL 알리쿼트를 놓습니다.</li>
	<li>유리 커버슬립으로 부드럽게 덮습니다.</li>
</ol>2. 현미경의 설정
참고: CRIF 기술은 공초점 반사 현미경 검사법(CRM)과 멀티채널 공초점 현미경 분석법을 결합합니다. CRM은 세포 선천성 형광과는 무관한 세포 형태학 및 공간 국소화를 위한 정보의 근원 역할을 합니다. 멀티채널 공초점 현미경 검사는 세포 선천성 형광의 스펙트럼 정보를 제공합니다. 다음 프로토콜에서, CRM 또는 공초점 형광 현미경 분석기로 취득된 모든 심상은 CRM 영상 또는 다중 채널 공초점 현미경 분광법 심상으로, 각각 지칭된다.
<ol><li>소멸된 스펙트럼 채널과 공초점 현미경을 광증 튜브(PMT) 또는 GaAsP 검출기에 연결합니다. 참고: 이러한 설정은 여러 제조업체에서 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>현미경에 높은 숫자 조리개 (NA) 목표를 적절한 배율로 장착하십시오. 참고: NA &gt; 1.4를 가진 63x 목표는 세균성 세포를 분석하기 위해 권장됩니다.</li>
	<li>현미경에 반 반사 거울(예: NT 80/20)을 장착하여 사고 광의 세포 분산에 의존하여 세포 형태를 시각화하는 CRM을 수용하십시오.</li>
	<li>멀티채널 공초점 현미경 검사법의 경우 현미경에 이색 거울을 장착하십시오. 예를 들어, MBS InVis405, MBS458, MBS458/514, MBS488/543, 또는 MBS 488/543/633 빔 스플리터 405, 458, 488, 514, 543, 또는 633 nm, excitationly를 사용합니다.</li>
	<li>레이저 파워 미터를 사용하여 각 여기 파장에 대한 조명 강도를 조정합니다. 여기 파장을 통해 현미경 의 밑에 출력을 일정하게 유지하십시오 (예를 들어, 63x 목표와 함께 50 μW를 사용하십시오).</li>
</ol>3. 이미지 수집
<ol><li>현미경 소프트웨어를 사용하여 핀홀 크기를 1AU로 설정합니다.</li>
	<li>각 여기 파장에 대해 픽셀 거주 시간(예: 스캔 속도)을 설정합니다. 참고: 픽셀 이너무 긴 픽셀 거주 시간은 세포를 손상시킬 수 있습니다. 셀의 광피해를 최소화하기 위해 픽셀이 지나치게 긴 시간을 피하십시오. 세균성 시료의 경우, 픽셀 거주 시간 &lt;55.6 μs/μm2 (현미경의 절개 출력이 ~17 μW/cm2인 경우)는 일반적으로 성장 억제를 피하기에 적합하다. 이 매개 변수는 유기체 및 실험 설정에 따라 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>스캔 해상도를 설정합니다. 박테리아와 같은 작은 세포의 경우 1,024 x 1,024의 스캐닝 영역을 사용하십시오.</li>
	<li>관심 영역이 다루어지되도록 Z 스캐닝 범위를 설정합니다. 참고: 아가로즈 슬래브에 분포된 세균 및 효모 세포 샘플의 경우, -15 μm의 Z 스캐닝 범위는 일반적으로 충분합니다.</li>
	<li>가시 파장 범위(예: 416-691 nm)를 캡처하기 위해 탈세 검출기를 설정합니다. 8-10 nm의 스펙트럼 창을 사용합니다.</li>
	<li>다중 채널 공초점 현미경 이미지를 가장 긴 에서 최단 흥분 파장에서 순서로 획득하여 형광 이미지의 Z 스택을 만듭니다.</li>
	<li>CRM 이미지를 획득합니다.</li>
	<li>획득한 이미지를 16비트 티프 파일로 디렉토리에 저장합니다. XXX가 흥분 파장인 명명 규칙 XXXcYzZZ.tif를 사용하여 파일의 이름을 지정하고, YY는 검출기 채널 번호이고, ZZ는 Z 슬라이스 번호이며, "c"와 "z"는 각각 검출기 번호와 Z 슬라이스 번호의 접두사입니다.<ol>
<li>예를 들어, 다중 채널 공초점 마이크로스펙트로스크 이미지가 405nm, 검출기 어레이의 제1 검출기 채널의 내분 파장으로 촬영되고, Z-스택의 5번째 슬라이스인 경우, "405c01z05.tif"라고 지칭한다. CRM 이미지의 경우 XXX 대신 문자열 "CRM"을 사용합니다(예: "CRMc01z05.tif"). 참고: 2D 또는 3D 세분화가 이미지 데이터에 가장 적합한지 여부를 결정합니다. 작은 세포가 2D 평면에 제약을 받는 상황에서 2D 세분화 방법을 사용합니다(예: 유리 표면에 어항을 인고하는 세균 모집단). 세포 집단이 3차원 공간(예를 들어, 생물막 및 조직 샘플)에 분포되는 상황에서 3D 세분화 방법을 사용하거나 세포 크기가 광학 슬라이스의 두께(예를 들어, 효모 세포, 포유류 세포)의 두께보다 크다. 2D 세분화의 경우 섹션 4를 참조합니다. 3D 세분화의 경우 섹션 5를 참조하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 2D 이미지 분석
<ol><li>워크스테이션에 이미지 분석 소프트웨어(예: MATLAB)를 장착합니다.</li>
	<li>단세포 선천적 형광 서명의 세포 세분화 및 재구성을 수행합니다.<ol>
<li>이미지 분석 소프트웨어를 엽니다.</li>
		<li>제공된 스크립트 "Script2D.m"를 두 번 클릭하고 엽니다.</li>
		<li>편집기 탭으로 이동한 다음 실행을 클릭합니다. 폴더 선택 창이 나타납니다.</li>
		<li>3.8단계에서 만든 디렉토리를 선택한 다음 열기 를 클릭하여 진행합니다. 분할 매개 변수의 입력을 묻는 대화 상자가 자동으로 나타납니다. 참고: 테스트 목적으로 제공된 데이터 집합("Sample_2D")을 선택합니다. 샘플 데이터 집합은 압축 된 파일로 제공되며 사전에 추출해야합니다.</li>
		<li>분할 매개 변수 입력: 이미지 비나화에 대한 이미지 Binarization (0-1) = 0.45, 셀 영역(픽셀) = 200, 셀 영역(픽셀) = 10, 검출 기 수 = 32에 대한 낮은 임계값. 확인 을 클릭하여 진행합니다. 참고: 이러한 매개 변수는 이미지 품질에 따라 조정이 필요할 수 있습니다.</li>
		<li>CRM 이미지를 표시하는 새 이미지 창이 나타나야 합니다. 백그라운드 영역(예: 셀이 없는 영역)을 선택하여 백그라운드 빼기에 사용합니다. 마우스 드래그하여 CRM 이미지 내에서 사각형을 그립니다. 선택한 영역 내에서 두 번 클릭하여 선택을 확인합니다.</li>
		<li>4.2.4 단계에서 선택한 동일한 디렉터리에서 서명 이라는 새 디렉터리를 찾습니다. 참고: 제공된 코드는 자동으로 이 디렉터리를 만듭니다. "서명" 디렉터리는 일반적인 접두사 "서명"후에 일련 번호가 매겨진 .png 파일로 각 미생물 셀의 타고난 형광 서명을 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5.3D 이미지 분석
<ol><li>워크스테이션에 이미지 분석 소프트웨어(재료 표)를 장착합니다.</li>
	<li>단세포 선천적 형광 서명의 세포 세분화 및 재구성을 수행합니다.<ol>
<li>이미지 분석 소프트웨어를 엽니다.</li>
		<li>제공된 스크립트 "Script3D.m"를 두 번 클릭하고 엽니다.</li>
		<li>편집기 탭으로 이동한 다음 실행을 클릭합니다. 폴더 선택 창이 나타납니다.</li>
		<li>3.8단계에서 만든 디렉토리를 선택한 다음 열기 를 클릭하여 진행합니다. 분할 매개 변수의 입력을 묻는 대화 상자가 자동으로 나타납니다. 참고: 테스트 목적으로 제공된 데이터 집합("Sample_3D")을 선택합니다. 샘플 데이터 집합은 압축 된 파일로 제공되며 사전에 추출해야합니다.</li>
		<li>분할 매개 변수 입력: 이미지 비나화에 대한 이미지 비나화 임계값 (0-1) = 0.01, 셀 볼륨(픽셀) = 1,000, 셀 영역(픽셀) = 20, X 픽셀 크기 [μm/픽셀] = 0.26, Y 픽셀 크기 [μm/픽셀] = 0.26, Z 픽셀 크기 [μm/픽셀] = 0.42= 0.42, 및 검출기 의 수 = 32. 확인 을 클릭하여 진행합니다. 여기 파장의 수에 대한 입력을 묻는 대화 상자가 나타납니다. 참고: 이러한 매개 변수는 이미지 품질에 따라 조정이 필요할 수 있습니다.</li>
		<li>이미지 수집에 사용되는 파장의 수를 입력합니다(예: 405, 488, 561, 630이 사용되는 경우 대화 상자에 4 를 입력). 확인을 클릭합니다.</li>
		<li>가장 짧은(즉, 상자 이름: 여기 1번)에서 대화 상자에 가장 긴 파장에 이르는 순서로 여기 파장을 입력합니다. 확인 을 클릭하여 진행합니다. CRM 이미지를 제공하는 새 이미지 창이 팝업되어야 합니다.</li>
		<li>백그라운드 빼기에는 임의백 영역(즉, 셀이 없는 영역)을 선택합니다. 마우스 드래그하여 CRM 이미지 내에서 사각형을 그립니다. 선택한 영역 내에서 두 번 클릭하여 선택을 확인합니다.</li>
		<li>5.2.4 단계에서 선택한 디렉터리에서 서명 이라는 디렉토리를 찾습니다. 참고: 제공된 코드는 자동으로 이 디렉터리를 만듭니다. "서명" 디렉터리는 일반적인 접두사 "서명"을 한 후 일련 번호가 매겨진 .png 파일로 각 단일 미생물 셀의 타고난 형광 서명을 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 통계 분석
참고: 치수 감소 기술(예: 주 성분 분석[PCA])을 수행하여 세포 집단의 하이퍼스펙트럼 분포를 시각화합니다. 제공된 스크립트(PCA.py)는 두 개의 셀 모집단(즉, 두 클래스)에 대해 PCA를 실행합니다.
<ol><li>워크스테이션에 프로그래밍 언어와 함께 제공되는 라이브러리 및 모듈(재료 표)을 장착합니다.</li>
	<li>C 드라이브(또는 이와 동등한)에 빈 디렉터리를 만들고 디렉토리 "Parent_directory"(예: C:/)의 이름을 지정합니다. Parent_ 디렉토리).</li>
	<li>두 셀 모집단의 형광 서명(예: 4.2.7단계에서 생성된 .png 파일)을 두 개의 개별 디렉터리로 저장합니다. 참고: 두 디렉터리 모두 "Parent_directory"에 있어야 합니다. C:/Parent_directory/ <img alt="image 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img1.jpg">푸티다KT2440/ <img alt="image 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img2.jpg"> <img alt="image 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">시그니처01.png <img alt="image 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img2.jpg"> <img alt="image 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">시그니처02.png <img alt="image 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img2.jpg"> <img alt="image 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">: <img alt="image 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img1.jpg">푸티다KT2442/ 
	 <img alt="image 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">시그니처01.png 
	 <img alt="image 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">시그니처02.png 
	 <img alt="image 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">:</li>
	<li>"Parent_directory"에 PCA.py 다운로드합니다.</li>
	<li>워크스테이션의 명령줄 인터페이스를 엽니다.</li>
	<li>명령줄 인터페이스에 "파이썬 C:/Parent_directory/PCA.py"를 입력합니다.</li>
	<li>'대상 디렉토리 선택'이라는 메시지가 표시된 후 'Parent_directory'을 선택합니다.</li>
	<li>"C:/Parent_directory"에서 결과 PCA 플롯이 포함된 "PCA.png"를 찾습니다.</li>
</ol>

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</ol>

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재현 가능한 결과를 얻기 위해 밀접하게 따라야 하는 두 가지 중요한 점이 있습니다: 1) 심내 목표하에서 레이저 전력 출력을 관찰하고, 2) 정확한 세포 세분화를 수행한다.
첫 번째 점은 다른 실험 중 타고난 형광 서명을 비교할 때 특히 중요합니다. 최대 전력 출력이 레이저 라인 간의 크기 순서까지 다를 수 있기 때문에 단순히 동일한 "백분율 출력" 설정을 여기 파장(예: 405, 488, 514 및 530 nm 레이저 라인 모두에 대해 5%의 전력 출력을 사용하는)에 적용하지 마십시오. 또한, 목표와 내부 광학은 일반적으로 고르지 않은 광학 흡수 특성을 가지며, 이는 또한 고려해야 한다. 이러한 이유로 레이저 파워 미터(재료 표)를 사용하여 목표하에서 출력을 측정하는 것이 좋습니다. 레이저 라인의 출력이 몇 년 동안 크게 붕괴 될 수 있기 때문에 이 측정을 몇 가지 실험마다 또는 주기적으로 하는 것이 좋습니다.
<p class="jove_c...

셀1 내의 다양한 생체 분자는 자가 형광 신호를 방출하고, 세포의 타고난 형광 서명은 이러한 신호의 조립으로 구성된다. 이 시그니처 형광은 다양한 세포 특성과 생리적 상태의 차이를 반영합니다. 선천적 형광의 분석은 최소 침습적이며 온화한 신진 대사 수정에서 완전한 세포 파괴에 이르기까지 다양한 흔적을 남기는 전통적인 침습적 미생물 프로브를 보완 할 수 있습니다. DNA 또는 세포 함량 추출2,3, 시투 혼성화4의 형광등, 그리고 게놈에 형광 기자 유전자의 도입과 같은 전통적인 기술은 세포 유형 또는 생리적 상태를 결정하는 데 효과적이지만, 일반적으로 세포의 조작또는 침습적 태깅이 필요합니다.
벌크 미생물 배양 현탁액5,6, 활성 슬러지7, 포유류 조직8,9 및 포유류 세포를 포함한 다양한 살아있는 및 그대로 미생물 식민지의 타고난 형광에 대한 연구는 선천성 형광 분석이 세포 유형 및 생리 상태의 태그 없는 분석을 용이하게 하는 것으로 나타났습니다. 선천적 형광 서명은 전통적으로 단일 세포 수준이 아닌 인구 수준에서 분석되어 클론 배양을 필요로합니다. 대조적으로, confocal refction microscopy-보조 단세포 innate fluorescence 분석 (CRIF) 기술11 여기에 설명된 각 개별 살아있는 미생물 세포의 타고난 세포 형광 서명을 재구성하고 카탈로그합니다. 더욱이, CRIF는 3차원(3D) 공간에 분포되는 집단 내에서 단일 미생물 세포의 선천적 형광 서명을 체계적으로 대조할 수 있다.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Wako Chemicals</td><td>312-01193</td><td></td></tr><tr><td>빔 스플리터</td><td>Carl Zeiss, Nikon</td><td></td><td>MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543 또는 MBS 488/543/633 빔 스플리터(Carl Zeiss)</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Carl Zeiss, Nikon</td><td></td><td>모델 LSM 880(Carl Zeiss), 모델 A1R(Nikon)</td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td>Matsunami Glass</td><td>C024601</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>Matsunami Glass</td><td>S011120</td><td></td></tr><tr><td>반 반사 거울</td><td>Carl Zeiss, Nikon</td><td></td><td>NT80/20</td></tr><tr><td>레이저 파워 미터</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>PM400 (파워 미터 콘솔) 및 S175C (센서)</td></tr> <tr><td>LB Broth</td><td>Nacalai tesque</td><td>20066-95</td><td>박테리아 배양</td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>The MathWorks</td><td></td><td>MATLAB 버전 2019a 이상, Image Processing Toolbox 필요</td></tr><tr><td>현미경 대물렌즈</td><td>Carl Zeiss, Nikon</td><td>440762-9904</td><td>(예 : 63x 계획 Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss)</td></tr><tr><td>현미경 소프트웨어</td><td>Carl Zeiss, Nikon</td><td></td><td>ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon)</td></tr><tr><td>PBS(-)</td><td>Wako Chemicals</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>프로그래밍 언어</td><td></td><td></td><td>제공된 PCA 스크립트를 실행하려면 Python 및 라이브러리, 모듈(numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter)이 필요합니다.</td></tr><tr><td>실리콘 개스킷</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P24744</td><td></td></tr><tr><td>워크스테이션</td><td></td><td></td><td>개별 GPU가 있는 고성능 워크스테이션을 사용하는 것이 좋습니다.</td></tr><tr><td>효모 추출물-펩톤-포도당(YPD) 한천 배지</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1500-250G</td><td>효모 배양용</td></tr><tr><td>YPD 배지</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1375-250G</td><td></td></tr></tbody></table>

공초점 현미경 검사법에 의한 단세포 인천성형광서명의 재구성

Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

여기서 설명된 공초점 반사 현미경 보조 단세포 인천성광 분석(CRIF),3차원(3D) 공간에 분포된 인구에서 각 개별 라이브 셀로부터 선천적인 세포 형광 시그니처를 재구성하는 최소 침습적 방법이다. 세포의 타고난 형광 시그니처는 세포 내의 다양한 생체 분자에 의해 방출되는 형광 신호의 모음입니다. 이전 연구는 타고난 형광 서명이 다양한 세포 특성과 생리적 상태의 차이를 반영하고 세포 특성화 및 식별을위한 풍부한 정보 소스임을 확립했습니다. 선천적 형광 서명은 전통적으로 인구 수준에서 분석되어 복제 배양을 필요로하지만 단일 세포 수준에서는 그렇지 않습니다. CRIF는 개별 세포에서 형광 신호의 3D 해상도 및/또는 선택적 추출을 요구하는 연구 결과에 특히 적합합니다. 형광 서명은 세포의 타고난 특성이기 때문에 CRIF는 그대로 및 단일 세포의 유형 및 / 또는 생리 적 상태의 태그없는 예측에도 적합합니다. 이 방법은 이종 집단에서 각 단일 세포의 표현형이 세포 태그없이 현미경의 밑에 그것의 자동 형광 서명에 의해 직접 평가될 수 있는 능률적인 세포 분석을 위한 강력한 공구일 지도 모릅니다.

도 1A는 전통적인 스펙트럼 플롯(top)과 히트맵(middle)으로 제시된 세균 세포의 전형적인 단세포 형광 서명을 나타낸다. 도 1B는 토양 박테리아집단의 원래 CRM 이미지 위에 중첩된 정확한 2D 세포 세분화의 결과를 나타낸다(슈도모나스 푸티다 KT2440)12. 인구에 대한 그 결과 타고난 형광 서명은 도 1D의 히트맵으로 제시됩니다. 성공적인 세포 세분화 에 따라 인구 내 변동성은 상대적으로 미미했다. 부정확한 세포 세분화의 예는 도 1B에 도시된 것과 동일한 P. putida에 겹쳐지는 도 1C에 도시된다. 인구의 타고난 형광 서명에 부정확한 세포 세분화의 영향은 상당한 수의 이...

여기서, 3차원 공간에 분포된 모든 개별 라이브 셀로부터 광적으로 추출 및 분류하는 프로토콜(즉, 세포 자동 형광)을 제시한다. 이 방법은 박테리아, 곰팡이, 효모, 식물 및 동물의 세포를 포함하여 단일 세포 해상도에서 다양한 생물학적 시스템의 타고난 형광 서명을 연구하는 데 적합합니다.

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

이 기술은 침습적 태깅 없이 단일 세포 수준에서 세포의 정체성 또는 생리학적 특성을 증명할 수 있는 고유한 연구를 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 분석을 위한 단일 셀 수준의 공간 해상도를 용이하게 하고 백그라운드 프로세스와 백그라운드 프로세스를 구별할 수 있다는 것입니다. 따라서 이 기술은 병원성 미생물의 식별 및 표현형 분석에 잠재적으로 기여할 수 있습니다.이 기술은 표현형 이질성 연구 또는 관심 미생물 집단의 생리학적 상태 모니터링에도 적용될 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 조교수인 Kyosuke Takabe입니다. 컨포칼 반사 현미경 및 다중 채널 컨포칼 현미경 분광학 설정.디스캔된 스펙트럼 채널이 있는 컨포칼 현미경을 광전자 증배관에 연결합니다. 현미경에 적절한 배율의 높은 개구수 대물렌즈를 장착합니다. 또한 현미경에 반반사 거울을 장착하여 세포 형태를 시각화하기 위해 입사광의 세포 산란에 의존하는 컨포칼 반사 현미경 검사를 수용할 수 있습니다.다중 채널 컨포칼 마이크로 분광법의 경우 현미경에 이색성 미러를 장착하고 레이저 파워 미터를 사용하여 각 여기 파장에 대한 조명 강도를 조정합니다. 그런 다음 여기 파장을 통해 일정하게 현미경 아래의 출력을 설정합니다. 현미경을 통해 박테리아를 이미지화하려면 현미경 소프트웨어에서 핀홀 크기를 1.0 면적 단위로 설정하고 각 여기 파장에 대한 픽셀 체류 시간을 설정합니다.스캔 해상도를 설정합니다. 박테리아와 같은 작은 세포의 경우 1024 x 1024의 스캔 영역을 사용합니다. 관심 영역이 포함되도록 Z-Scanning 범위를 설정합니다.그리고 8-10나노미터의 스펙트럼 창을 사용하여 가시 파장 범위를 캡처하도록 D-Scan 검출기를 설정합니다. 그런 다음 가장 긴 여기 파장에서 가장 짧은 여기 파장까지 순서대로 다중 채널 공초점 마이크로 분광학 이미지를 획득하여 형광 이미지 및 공초점 반사 현미경 이미지의 Z-Stack을 생성하고 이미지를 16비트 tiff 형식으로 저장합니다. 세포 세분화 및 단세포 선천성 형광 서명의 재구성을 수행하려면 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램을 열고 제공된 스크립트 중 하나를 두 번 클릭하여 엽니다.편집기 탭에서 실행을 클릭합니다. 폴더 선택 창이 나타납니다. Z-Stack 이미지가 저장된 디렉토리를 선택하고 열기를 클릭합니다.segmentation 매개 변수를 입력하라는 대화 상자가 자동으로 나타납니다. 이미지 이진화 임계값을 0-1로, 이미지 이진화를 0.45로, 셀 영역의 상한 임계값을 200으로, 셀 영역의 하한 임계값을 10으로, 검출기 수를 32로 설정합니다. excitation 파장의 수에 대한 입력을 요청하는 대화 상자가 나타납니다.이미지 획득에 사용된 파장의 수를 입력하고 OK를 클릭합니다. excitation 파장에 대한 입력을 요청하는 대화 상자가 나타납니다. 여기 파장을 가장 짧은 것부터 가장 긴 것 순으로 입력하고 확인을 클릭합니다.컨포칼 반사 현미경 이미지를 표시하는 새로운 이미지 창이 나타납니다. 배경 빼기에 사용할 임의의 배경 영역을 선택하고 컨포칼 반사 현미경 이미지 내에 사각형을 그립니다. 선택한 영역 내부를 두 번 클릭하여 선택 항목을 확인하고 signature라는 새 디렉터리를 찾습니다.차원 축소 기법을 수행하려면 빈 디렉토리를 만들고 디렉토리 이름을 parent_directory로 지정합니다. 두 세포 집단 각각의 형광 서명을 두 개의 별도 디렉토리에 저장하고 워크스테이션의 명령줄 인터페이스를 엽니다. 명령을 입력합니다.대상 디렉토리 선택이 표시되면 parent_directory 선택합니다. 그런 다음 parent_directory 폴더에서 PCA를 찾습니다. PNG 파일이며, 여기에는 결과 주성분 분석 플롯이 포함됩니다.여기에서는 박테리아 세포의 일반적인 단일 세포 형광 서명이 전통적인 스펙트럼 플롯과 히트 맵으로 표시됩니다. 이 그림에서는 토양 박테리아 집단의 원본 컨포칼 반사 현미경 이미지 위에 겹쳐진 부정확한 2D 세포 분할을 관찰할 수 있습니다. 그 결과 개체군에 대한 타고난 형광 서명이 히트 맵으로 제시됩니다.개체군 내 변동성은 성공적인 세포 세분화 이후 상대적으로 미미했습니다. 여기서, 부정확한 세포 분할의 예는 이전에 표시된 것과 동일한 P.putida 집단에 과도하게 부과된 것으로 표시됩니다. 부정확한 세포 분할이 개체군의 타고난 형광 서명에 미치는 영향은 해당 히트 맵에서 관찰된 상당한 수의 이상치에서 쉽게 알 수 있습니다.부정확한 세포 분할은 정확한 세포 분할 후에 얻어진 유형 클러스터와 비교하여 주요 성분 분석 후 더 느슨한 클러스터를 초래합니다. 개별 박테리아 균주 내에서 관찰되는 선천성 형광 시그니처의 사소한 변동성에도 불구하고 각 집단은 주요 성분 분석 플롯에서 뚜렷한 클러스터를 형성합니다. 이 그림에서는 발아 효모 Saccharomyces cerevisiae YM4271 집단의 원래 컨포칼 반사 현미경 이미지 위에 겹쳐진 부정확한 3D 세포 분할을 관찰할 수 있습니다.이상치(outliers)가 부족하고 그 결과로 나타나는 개체군에 대한 선천적인 형광 서명(innate fluorescent signatures)에 주목하십시오. 컨포칼 현미경을 통해 가능한 한 깨끗한 이미지를 획득하고 노이즈가 후속 분석의 정확도를 손상시킬 수 있으므로 신호 강도 포화를 피하는 것이 중요합니다. 분류 또는 예측 작업에 사용하기 위해 타고난 서양 시그니처 데이터 세트로 기계 학습 모델을 훈련하여 태그 없는 모집단 분석 및 표현형 예측을 제공할 수 있습니다.

reconstruction-single-cell-innate-fluorescence-signatures-confocal

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 형광 광 활성화 국소화 현미경(FPALM)을 사용하여 세포 내에서 여러 유형의 형광 표지 분자를 동시에 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 설명된 기술은 단일 세포 내에서 수십 나노미터의 정밀도로 수천 개에서 수십만 개의 개별 형광 표지 단백질의 국소화를 산출합니다.

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy(형광 광활성화 국소화 현미경을 사용한 생물학적 구조의 동시 다색 이미징)

조혈 줄기 및 전구 세포의 표시 조합 5 형광 단백질은 재생 중에 골수 조혈 아키텍처에 대한 통찰력을 제공하는 공 초점과 두 광자 현미경을 통해 생체 클론 추적에 있습니다. 이 방법은 이식 다음 시간의 광범위한 기간에 대한 손상 조직의 스펙트럼으로 구분 HSPCs 유래 세포의 비 침습적 운명 매핑 할 수 있습니다.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

이 프로토콜은 전반사 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포 표면의 단일 수용체를 시각화 및 추적하여 수용체 측면 이동성, 수용체 복합체의 크기를 분석하고 일시적인 수용체-수용체 상호 작용을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 막 단백질로 확장될 수 있습니다.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

생체 내 생체 분자에 대한 연구는 생물학적 맥락에서 분자 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기에서는 DNA 또는 단백질과 같은 형광 생체 분자를 살아있는 미생물로 내재화할 수 있는 새로운 방법을 설명합니다. 형광 현미경 검사로 기록된 생체 내 데이터 분석도 제시되고 논의됩니다.

일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

이 원고 시각화 및 subcellular 구획에서 지역화 된 번역 이벤트를 계량 하는 방법을 설명 합니다. 이 원고에 제안 접근 기본 confocal 이미징 시스템 및 시 약을 필요로 하 고 신속 하 고 비용 효율적인.

정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역

이 프로토콜에는 포스터 공명 에너지 전달, 및 현미경 이미징 형광 수명에 따라 무 단백질의 복잡 한 형성의 양적 시각화에 대 한 허용 하는 새로운 방법을 설명 합니다.

형광 일생 화상 현미경 검사 법에 의해 인신 매매 세포내 올 무를 떠 올 리

바인딩할 대상 수용 체 세포 표면에 항 체 구조와 클러스터링 변경 부여 수 있습니다. 이러한 동적 변경 내용이 대상 셀에 약물 개발 특성화에 대 한 영향을 미칠. 이 프로토콜 confocal 현미경 검사 법 및 이미지 상호 관계 분광학 ImageJ/피지 수용 체 세포 표면에 클러스터링의 척도를 통해 활용 합니다.

Confocal 현미경 검사 법 밝혀 세포 표면 수용 체 이미지 상관 분광학을 통해 집계

Efferocytosis, phagocytic 제거 apoptotic 세포의 항상성 유지 하는 데 필요한 하 고 수용 체와, engulfment, 인식과 apoptotic 세포의 국제화에 대 한 허용 하는 신호 통로 의해 촉진 된다. 여기, 우리는 efferocytosis의 정량화와 efferocytic 신호 통로의 활동에 대 한 형광 현미경 검사 법 프로토콜을 제시.

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

우리는 살아있는 세포의 혈장 막에서 리간드 결합에 의해 유도된 mEGFP 태그-수용체 올리고머의 평균 올리고머 상태의 측정을 위한 이미징 접근법을 기술한다. 이 프로토콜은 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경 검사법과 숫자 및 밝기(N&amp;B) 분석을 기반으로 합니다.

총 내부 반사 형광 현미경 검사법에 의해 살아있는 세포에 있는 세포 표면 수용체의 올리고머화 역학 은 수 및 밝기 분석과 결합됩니다

IBEX(Spectral Iterative Bleaching Extends Multiplexity)는 헤파린 차단을 추가하여 비특이적 결합을 최소화하고 스펙트럼 검출과 전산 혼합 해제를 활용하여 자가형광을 억제함으로써 기본 IBEX 기술을 기반으로 합니다. 이 접근 방식은 배경 소스를 줄이면서 이미지 획득을 가속화하여 강력한 다라운드, 고파라미터 공간 단백질체 분석을 가능하게 합니다.

비특이적 조직 형광을 최소화하기 위해 스펙트럼 공초점 현미경을 사용한 하이플렉스 이미징

이 프로토콜은 고해상도 셀룰러 및 아셀룰러 이미징을 위한 다중화 배열 검출기와 통합된 레이저 스캐닝 공초점 현미경 시스템의 첨단 영상 응용과 공유 자원 관리를 상세히 설명합니다. 이 워크플로우는 단일 플랫폼 내에서 공초점에서 초해상도(~120 nm)까지 다중 모달 이미징을 가능하게 하여 나노스케일 시각화를 더욱 쉽게 접근할 수 있게 합니다.

초해상도 영상 및 공유 관리: 다중화 검출이 포함된 공초점 현미경 프로토콜

학습하세요 공초점 현미경법을 이용한 단세포 천연형광서명 추출 및 재구성 방법을. 비침습적 태그 없이 세포 특성을 분석하고 미생물 표현형 다양성을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

공초점 현미경 검사법에 의한 단세포 인천성형광서명의 재구성

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