공초점 현미경 검사법에 의한 단세포 인천성형광서명의 재구성

이 기술은 침습적 태깅 없이 단일 세포 수준에서 세포의 정체성 또는 생리학적 특성을 증명할 수 있는 고유한 연구를 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 분석을 위한 단일 셀 수준의 공간 해상도를 용이하게 하고 백그라운드 프로세스와 백그라운드 프로세스를 구별할 수 있다는 것입니다. 따라서 이 기술은 병원성 미생물의 식별 및 표현형 분석에 잠재적으로 기여할 수 있습니다.

이 기술은 표현형 이질성 연구 또는 관심 미생물 집단의 생리학적 상태 모니터링에도 적용될 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 조교수인 Kyosuke Takabe입니다. 컨포칼 반사 현미경 및 다중 채널 컨포칼 현미경 분광학 설정.

디스캔된 스펙트럼 채널이 있는 컨포칼 현미경을 광전자 증배관에 연결합니다. 현미경에 적절한 배율의 높은 개구수 대물렌즈를 장착합니다. 또한 현미경에 반반사 거울을 장착하여 세포 형태를 시각화하기 위해 입사광의 세포 산란에 의존하는 컨포칼 반사 현미경 검사를 수용할 수 있습니다.

다중 채널 컨포칼 마이크로 분광법의 경우 현미경에 이색성 미러를 장착하고 레이저 파워 미터를 사용하여 각 여기 파장에 대한 조명 강도를 조정합니다. 그런 다음 여기 파장을 통해 일정하게 현미경 아래의 출력을 설정합니다. 현미경을 통해 박테리아를 이미지화하려면 현미경 소프트웨어에서 핀홀 크기를 1.0 면적 단위로 설정하고 각 여기 파장에 대한 픽셀 체류 시간을 설정합니다.

스캔 해상도를 설정합니다. 박테리아와 같은 작은 세포의 경우 1024 x 1024의 스캔 영역을 사용합니다. 관심 영역이 포함되도록 Z-Scanning 범위를 설정합니다.

그리고 8-10나노미터의 스펙트럼 창을 사용하여 가시 파장 범위를 캡처하도록 D-Scan 검출기를 설정합니다. 그런 다음 가장 긴 여기 파장에서 가장 짧은 여기 파장까지 순서대로 다중 채널 공초점 마이크로 분광학 이미지를 획득하여 형광 이미지 및 공초점 반사 현미경 이미지의 Z-Stack을 생성하고 이미지를 16비트 tiff 형식으로 저장합니다. 세포 세분화 및 단세포 선천성 형광 서명의 재구성을 수행하려면 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램을 열고 제공된 스크립트 중 하나를 두 번 클릭하여 엽니다.

편집기 탭에서 실행을 클릭합니다. 폴더 선택 창이 나타납니다. Z-Stack 이미지가 저장된 디렉토리를 선택하고 열기를 클릭합니다.

segmentation 매개 변수를 입력하라는 대화 상자가 자동으로 나타납니다. 이미지 이진화 임계값을 0-1로, 이미지 이진화를 0.45로, 셀 영역의 상한 임계값을 200으로, 셀 영역의 하한 임계값을 10으로, 검출기 수를 32로 설정합니다. excitation 파장의 수에 대한 입력을 요청하는 대화 상자가 나타납니다.

이미지 획득에 사용된 파장의 수를 입력하고 OK를 클릭합니다. excitation 파장에 대한 입력을 요청하는 대화 상자가 나타납니다. 여기 파장을 가장 짧은 것부터 가장 긴 것 순으로 입력하고 확인을 클릭합니다.

컨포칼 반사 현미경 이미지를 표시하는 새로운 이미지 창이 나타납니다. 배경 빼기에 사용할 임의의 배경 영역을 선택하고 컨포칼 반사 현미경 이미지 내에 사각형을 그립니다. 선택한 영역 내부를 두 번 클릭하여 선택 항목을 확인하고 signature라는 새 디렉터리를 찾습니다.

차원 축소 기법을 수행하려면 빈 디렉토리를 만들고 디렉토리 이름을 parent_directory로 지정합니다. 두 세포 집단 각각의 형광 서명을 두 개의 별도 디렉토리에 저장하고 워크스테이션의 명령줄 인터페이스를 엽니다. 명령을 입력합니다.

대상 디렉토리 선택이 표시되면 parent_directory 선택합니다. 그런 다음 parent_directory 폴더에서 PCA를 찾습니다. PNG 파일이며, 여기에는 결과 주성분 분석 플롯이 포함됩니다.

여기에서는 박테리아 세포의 일반적인 단일 세포 형광 서명이 전통적인 스펙트럼 플롯과 히트 맵으로 표시됩니다. 이 그림에서는 토양 박테리아 집단의 원본 컨포칼 반사 현미경 이미지 위에 겹쳐진 부정확한 2D 세포 분할을 관찰할 수 있습니다. 그 결과 개체군에 대한 타고난 형광 서명이 히트 맵으로 제시됩니다.

개체군 내 변동성은 성공적인 세포 세분화 이후 상대적으로 미미했습니다. 여기서, 부정확한 세포 분할의 예는 이전에 표시된 것과 동일한 P.putida 집단에 과도하게 부과된 것으로 표시됩니다. 부정확한 세포 분할이 개체군의 타고난 형광 서명에 미치는 영향은 해당 히트 맵에서 관찰된 상당한 수의 이상치에서 쉽게 알 수 있습니다.

부정확한 세포 분할은 정확한 세포 분할 후에 얻어진 유형 클러스터와 비교하여 주요 성분 분석 후 더 느슨한 클러스터를 초래합니다. 개별 박테리아 균주 내에서 관찰되는 선천성 형광 시그니처의 사소한 변동성에도 불구하고 각 집단은 주요 성분 분석 플롯에서 뚜렷한 클러스터를 형성합니다. 이 그림에서는 발아 효모 Saccharomyces cerevisiae YM4271 집단의 원래 컨포칼 반사 현미경 이미지 위에 겹쳐진 부정확한 3D 세포 분할을 관찰할 수 있습니다.

이상치(outliers)가 부족하고 그 결과로 나타나는 개체군에 대한 선천적인 형광 서명(innate fluorescent signatures)에 주목하십시오. 컨포칼 현미경을 통해 가능한 한 깨끗한 이미지를 획득하고 노이즈가 후속 분석의 정확도를 손상시킬 수 있으므로 신호 강도 포화를 피하는 것이 중요합니다. 분류 또는 예측 작업에 사용하기 위해 타고난 서양 시그니처 데이터 세트로 기계 학습 모델을 훈련하여 태그 없는 모집단 분석 및 표현형 예측을 제공할 수 있습니다.