2020년 5월 12일
티오바르비투릭 산 반응성 물질 분석의 목표는 532 nm에서 가시파장 분광측을 사용하여 지질 과산화 제품, 주로 말론다이얼데히드의 생산을 측정하여 생물학적 샘플에서 산화 스트레스를 평가하는 것입니다. 여기에 설명된 방법은 인간 혈청, 세포 리스, 저밀도 지단백에 적용될 수 있다.
따라서 TBARS 분석은 생물학적 샘플의 산화 스트레스에 대한 실험실 내 일반 평가에 가장 적합하며, 함께 저장 및 처리된 샘플 간에 상대적 TBARS 수치를 직접 비교합니다. 이러한 분석은 약 400개의 비용이 드는 상용 키트에 비해 96개의 샘플을 테스트하는 데 약 3의 매우 저렴한 비용을 가지며 단일 배치 샘플만 분석할 수 있습니다. 여기에 설명된 방법은 생체 시료, 안정성 연구, 분석 전에 항산화제 또는 기타 유형의 시료 방부제를 추가하는 것이 적절하거나 의무적인 응용 분야를 포함한 특정 응용 분야에 추가로 적용할 수 있습니다.
매우 가변적인 결과를 피하려면 새로운 시약을 준비하여 색상 시약의 pH가 4보다 크지 않은지 확인하고 흡광도를 측정하기 전에 니데스 팽창 플레이트의 기포를 제거합니다. 티오바르비투르산의 0.8% 수용액을 준비하는 것으로 시작합니다. 4g의 수산화나트륨 비드를 20ml의 물에 용해시켜 5몰 수산화나트륨 용액을 준비합니다.
용액을 플라스틱 용기에 보관하십시오. 각 배치에 대해 신선하게 준비해야 합니다. 450ml의 탈이온수에 티오바르비투르산 4g을 넣고 마그네틱 교반 막대를 사용하여 부드럽게 녹입니다.
약 4ml의 수산화나트륨 용액을 100마이크로리터 단위로 천천히 첨가하여 티오바르비투르산 입자가 용해될 때 pH를 확인합니다. 모든 입자가 용해될 때까지 수산화나트륨을 계속 첨가하십시오. pH 스트립으로 용액의 pH가 4 이하인지 확인한 다음 탈이온수로 최종 부피를 500ml로 가져오고 티오바르비투르산 수용액을 실온에서 보관합니다.
MDA 비스 디메틸 아세탈 표준 곡선 용액을 2밀리리터 스냅 캡 폴리프로필렌 튜브에 준비합니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 200마이크로몰 스톡 용액을 물에 희석하여. 샘플을 소용돌이치십시오.
분석할 샘플의 유리관에 라벨을 붙인 다음 준비된 샘플 100마이크로리터를 각 튜브에 추가합니다. 각 샘플에 200마이크로리터의 8.1% SDS를 추가하고 유리관을 원을 그리며 부드럽게 휘젓습니다. 각 샘플에 1.5 밀리리터의 3.5 몰 아세트산 나트륨 완충액을 첨가 한 다음 1.5 밀리리터의 0.8 % 티오 바르 비투르 산 용액을 첨가하십시오.
700마이크로리터의 탈이온수를 추가하여 각 튜브의 최종물을 4밀리리터로 만듭니다. 유리관을 단단히 닫고 섭씨 95도로 설정된 가열 블록에서 1시간 동안 배양합니다. 튜브를 알루미늄 호일로 덮어 응결을 방지한 다음 블록에서 튜브를 제거하고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
외피 후에, 1, 4 섭씨 온도에 10 분 동안 500배 G에 표본 및 기준을 원심 분리하십시오. 각 튜브에서 150마이크로리터의 상등액을 96웰 플레이트의 웰로 옮기고 피펫 팁으로 기포를 제거합니다. 532 나노미터에서 샘플의 흡광도를 측정한 다음 다른 모든 흡수제 판독값에서 빈 샘플의 평균 흡수 판독값을 뺍니다.
표준 곡선을 생성하고 이를 사용하여 알 수 없는 시료 농도를 계산할 수 있습니다. MDA bis 디메틸 아세톨 표준 곡선을 생성하여 세 가지 다른 생물학적 샘플에서 검출 한계 및 분석의 민감도와 산화 수준을 결정했습니다. 서로 다른 날에 3개의 샘플에 대해 총 9개의 TBARS 분석이 수행되었습니다.
검출 한계를 결정하기 위해 빈 샘플의 흡광도를 3일 동안 측정했습니다. 감지 가능한 비잡음 흡수 신호를 제공하는 데 필요한 TBARS 물질의 최소 농도는 1.1마이크로몰입니다. 그리고 분석의 민감도는 농도 증가 마이크로 몰 당 약 0.0016 흡수제 단위입니다.
TBARS 분석은 다양한 생물학적 매트릭스의 지질 과산화 변화를 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 이를 입증하기 위해 인간 혈청 HEPG2 세포 용해물과 저밀도 지단백질의 체외 산화를 유도하기 위해 2 염화구리를 사용했습니다. EDTA를 함유한 LDL 샘플에 대해 TBARS 분석을 수행했으며 구리 2개의 처리된 LDL 샘플과 처리되지 않은 LDL 샘플 간에 TBARS 수준은 변하지 않았습니다.
그러나 EDTA가 스핀 여과에 의해 제거된 후 LDL은 구리 2 매개 산화를 거쳤습니다. 인간 혈청에서 TBARS 분석의 동적 범위를 설명하기 위해 2개의 밀리몰 구리 2개 이온 농도를 샘플에 첨가하여 TBARS를 6-7배 증가시켰습니다. 이 프로토콜을 시도할 때 샘플을 얼음 위에 10분 이상 방치하지 말고 원심분리 후 실온에 두십시오.
원래 함께 수집, 처리 및 보관되지 않은 생물 표본의 배치 또는 하위 집합의 경우, 배치 효과에 대한 데이터를 통계적으로 평가하여 인공물 산화가 결과에 기여하지 않았는지 확인해야 합니다. 저밀도 지단백질을 벗어난 의도적이고 정량화 가능한 체외 산화를 통해 산화가 기능 생물학에 어떤 영향을 미치는지 이해할 수 있습니다.
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티오바르비투르산 반응성 물질(TBARS) 분석은 생물학적 시료에서 지질 과산화 산물을 측정하여 산화 스트레스를 평가하는 비용 효율적인 방법입니다. 이 방법은 함께 처리된 시료 간의 상대적 TBARS 수준을 비교하는 데 특히 유용합니다.
The TBARS assay provides a cost-effective, intra-laboratory method for relative oxidative stress assessment in biological samples, supporting early discovery workflows where comparative lipid peroxidation data informs target validation and mechanistic de-risking. Its low cost and adaptability enable reproducible screening of compound effects across sample sets, reducing false positives in lead identification. Proper reagent handling and pH control ensure data reliability for go/no-go decisions in preclinical prioritization.
The TBARS assay fits within the discovery continuum from early hypothesis testing to lead identification, providing oxidative stress readouts that help prioritize compounds before preclinical investment.