Name: 크롬 마틴 면역 침전 -엑소뉴클레아제 (ChIP-Exo)를 사용하여 마우스 줄기 세포 유래 뉴런에서 단백질 DNA 상호 작용의 고해상도 매핑 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 학습하세요 ChIP-Exo를 활용한 단백질-DNA 상호작용 고해상도 매핑 방법을 마우스 줄기세포 유래 뉴런에서. 이 기술은 유전자 조절 메커니즘 연구에 필수적인 near base-pair 해상도를 제공합니다.

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게시된 데이터와 귀중한 토론을 공유해 주신 Rhee 연구소의 회원에게 감사드립니다. 이 작품은 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC) RGPIN-2018-06404 (H.R.)에 의해 지원되었다.

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이 프로토콜에서, 외핵증 소화뒤에 는 초고매핑 해상도에서 포유류 세포에서 단백질-DNA 상호 작용의 식별을 위한 DNA 라이브러리를 얻기 위하여 이용되는 외핵증 소화에 선행된 ChIP. 많은 변수가 ChIP 엑소 실험의 품질에 기여합니다. 중요한 실험 파라미터는 항체의 질, 초음파 처리의 최적화 및 LM-PCR 주기의 수를 포함합니다. 이러한 중요한 실험 파라미터는 ChIP 엑소 실험을 제한할 수 있으며 아래에서 논의될 것입니다.
모든 ChIP 프로토콜에서 항체 품질은 가장 중요한 고려 사항 중 하나입니다. ChIP 등급 항체의 사용은 ChIP-exo에 권장됩니다. 항체 품질은 ChIP 엑소 프로토콜을 수행하기 전에 확인할 수 있다. ChIP-seq 또는 ChIP-qPCR은 관심 있는 단백질의 특정 DNA 결합 위치를 확인하여 ChIP 급 항체를 검증하는 데 사용될 수 있다. 이어서, 비드에 첨가된 항체의 농도를 최적화하는 것은 단백질-DNA 복합체가 면역침전처리되어<sup cl...

단백질 DNA 상호 작용의 위치는 유전자 조절의 기계장치에 통찰력을 제공합니다. 높은 처리량 시퀀싱(ChIP-seq)과 결합된 크로마틴 면역 침전은 살아있는 세포1,2에서게놈-DNA 상호 작용을 검사하기 위해 10년 동안 사용되어 왔다. 그러나 ChIP-seq 방법은 낮은 매핑 해상도, 거짓 긍정, 부재중 전화 및 비특이적 배경 신호로 이어지는 DNA 단편화 및 불바운드 DNA 오염의 이질성에 의해 제한됩니다. ChIP와 엑소뉴클레아제 소화(ChIP-exo)의 조합은 ChIP-seq 방법을 단백질-DNA 교차 링크 점으로 트리밍하여, 근거리 쌍 분해능 및 낮은 배경 신호3,4,5를제공한다. ChIP 엑소에서 제공하는 매핑 해상도와 낮은 배경은 게놈 전반에 걸쳐 정확하고 포괄적인 단백질 DNA 결합 위치를 결정할 수 있게 합니다. ChIP-exo는 기능적으로 뚜렷한 DNA 결합 모티프, 전사 인자(TF) 및 다중 단백질-DNA 교차 링크 부위를 특정 게놈 결합 위치에서드러낼 수 있으며, 다른 게놈 매핑 방법에 의해 검출할 수 없는3,4,6,7.
ChIP-exo는 처음에 신진 효모에서 TFs의 서열 특이적 DNA 결합을 검사하고, 게놈4,8,9를통해 개별 히스톤의 전사 사전 개시 복합체 및 서브 뉴클레오소말 구조의 정확한 조직을 연구하기 위해 사용되었다. 2011년4년도입 이후, ChIP-exo는 박테리아, 마우스, 인간 세포7,10,11,12,13,14,15,16,17등많은 다른 유기체에서 성공적으로 활용되고있다. 2016년, Rhee 외14는 다른 프로그래밍 TF Isl1을 이용한 이성구복합체를 형성하는 프로그래밍 TF Lhx3의 다운규제 이후 뉴런 유전자 발현이 어떻게 유지되었는지 이해하기 위해 포유류 뉴런에 ChIP-exo를 처음으로 사용했다. 이 연구는 Lhx3의 부재에서, Isl1는 뉴런 이펙터 유전자 유전자의 유전자 발현을 유지하기 위하여 Onecut1 TF에 의해 결합된 새로운 신경 강화에 모집된다는 것을 보여주었습니다. 이 연구에서 ChIP-exo는 여러 TF가 거의 뉴클레오티드 매핑 해상도에서 복합방식으로 세포 유형 및 세포 단계별 DNA 조절 요소를 동적으로 인식하는 방법을 밝혔습니다. 그밖 연구 결과는 또한 그밖 포유류 세포주에서 단백질과 DNA 사이 상호 작용을 이해하기 위하여 ChIP 엑소 방법을 이용했습니다. 한일(7)은 ChIP-exo를 사용하여 ChIP-exo를 사용하여 마우스 에리스로이드 세포에서 GATA1 및 TAL1 TFs의 게놈 전체 조직을 검사하였다. 이 연구는 TAL1이 적혈구 분화를 통해 GATA1과의 단백질 단백질 상호 작용을 간접적으로 통해 간접적으로 DNA에 직접 모집된다는 것을 발견했습니다. 최근 연구는 또한 CTCF, RNA 폴리머라제 II, 및 히스톤 마크의 게놈 전체 결합 위치를 프로파일라기 위해 ChIP-exo를 사용하여 인간 세포주18,19에서최신유전체 및 전사 메커니즘을 연구하였다.
사용할 수있는 ChIP 엑소 프로토콜의 여러 버전이 있습니다3,5,20. 그러나 이러한 ChIP 엑소 프로토콜은 차세대 시퀀싱 라이브러리 준비에 익숙하지 않은 연구를 위해 따르기 어렵다. ChIP 엑소 프로토콜의 우수한 버전은 따라하기 쉬운 지침과 비디오21로게시되었지만 완료하는 데 상당한 시간이 필요한 많은 효소 단계가 포함되어 있습니다. 여기서 는 감소된 효소 단계와 인큐베이션 시간을 포함하는 ChIP 엑소 프로토콜의 새 버전과 각 효소단계(21)에대한 설명을 보고합니다. 최종 수리 및 dA 꼬리 반응은 엔드 준비 효소를 사용하여 단일 단계로 결합됩니다. 인덱스 및 범용 어댑터 리칭 단계의 인큐베이션 시간은 리그레이션 인핸서를 사용하여 2시간에서 15분으로 단축됩니다. 이전 ChIP 엑소 프로토콜에 기재된 인덱스 어댑터 리그션 단계 후의 키나제 반응이 제거된다. 대신, 인산염 군은 오리고 DNA 합성 중에 인덱스 어댑터(표1)의5'끝 중 하나에 첨가되며, 이는 람다 엑소뉴클레아제 소화 단계에 사용될 것이다. 이전 ChIP 엑소 프로토콜은 RecJf exonuclease 소화를 사용하여 단일 좌초 DNA 오염 물질을 제거하는 동안, 이 소화 단계는 ChIP 엑소 라이브러리의 품질에 중요하지 않기 때문에 여기에서 제거됩니다. 또한, ChIP 용출 후 역방향 DNA를 정화하기 위해, 자성 비드 정제 방법은 페놀:클로로폼:이소아밀 알코올(PCIA) 추출 방법 대신에 사용된다. 이것은 DNA 추출의 잠복기 시간을 감소시킵니다. 중요한 것은 인덱스 어댑터 리그레이션 중에 형성된 대부분의 어댑터 디머를 제거하여 계각 매개 PCR의 효율성에 영향을 미칠 수 있습니다.
여기에 제시된 ChIP 엑소 프로토콜은 마우스 배아 줄기(ES) 세포와 분화된 포유류 뉴런에서 정밀한 단백질-DNA 상호작용의 검출에 최적화되어 있다. 간단히, 수확 및 교차 연결된 신경 세포는 크롬틴이 초음파 처리에 노출될 수 있도록, 다음 적절한 크기의 DNA 단편이 얻어지도록 초음파처리(도 1)를용해한다. 항체 코팅 구슬은 그 때 관심있는 단백질에 단편화된, 수용성 크로마틴을 선택적으로 면역침전염하는 데 사용됩니다. 면역 침전 DNA는 여전히 구슬에 있는 동안, 최종 수리, 시퀀싱 어댑터의 결찰, 채우기 반응 및 5' 3' 람다 exonuclease 소화 단계수행된다. 엑소뉴클레아제 소화 단계는 ChIP 엑소에게 초고해상도와 높은 신호 대 잡음 비율을 제공하는 것입니다. 람다 엑소뉴클레아제는 교차 연결 부위로부터 면역 침전 된 DNA를 몇 가지 염기 쌍 (bp)을 트림하여 오염 DNA가 저하됩니다. 엑소뉴클레아제 처리된 ChIP DNA는 항체 코팅 구슬로부터 용출되고, 단백질-DNA 크로스링크는 반전되고, 단백질은 저하된다. DNA는 단일 좌초 된 ChIP DNA에 추출되고 변성되고, 이중 좌초 DNA (dsDNA)를 만들기 위해 프라이머 어닐링 및 확장이 뒤따릅니다. 다음으로, 외핵체 처리 단부에 대한 범용 어댑터의 결찰이 수행된다. 생성된 DNA는 정제되고, PCR이 증폭되고, 겔정제되고, 차세대 시퀀싱을 실시한다.
ChIP 엑소 프로토콜은 ChIP-seq 프로토콜보다 길지만 기술적으로 는 그리 어렵지 않습니다. 모든 성공적으로 면역 침전된 ChIP DNA는 몇 가지 추가 효소 단계로 ChIP 엑소를 실시할 수 있습니다. 초고매핑 해상도, 배경 신호 감소, 게놈 결합 부위에 대한 거짓 긍정 및 네거티브 감소 등 ChIP-exo의 주목할 만한 장점은 시간 비용을 능가합니다.

<table><tbody><tr><td>아가로스, UltraPure</td><td>Invitrogen</td><td>16500</td><td>검사 초음파 처리 (섹션 4.3.6) 및 LM-PCR 증폭 DNA의 겔 정제 (섹션 19.1)</td></tr><tr><td>알부민, 소 혈청 (BSA), 프로테아제 프리, 열 충격 격리, 최소. 98%</td><td>BioShop</td><td>ALB003</td><td>차단 솔루션</td></tr><tr><td>Isl1</td><td>DSHB</td><td>39.3F7</td><td>비즈 항체 주입 (섹션 5.6)</td></tr><tr><td>Bioruptor Pico& 주의;</td><td>Diagenode</td><td>B01060010</td><td>초음파 처리 염색질(섹션 3.3)</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA), 분자 생물학 등급</td><td>New England BioLabs</td><td>B9000S</td><td>비드 필인 반응(섹션 10.2) 및 변성, 프라이머 어닐링 및 프라이머 확장(섹션 14.2)</td></tr><tr><td>원심분리기 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000138</td><td>초음파 처리 염색질(섹션 3.5), 초음파 처리 확인(섹션 4.3.1, 4.3.3 및 4.3.4)</td></tr><tr><td>Centrifuge 5804 R</td><td>Eppendorf</td><td>22623508</td><td>Harvest, 세포 가교 및 동결(섹션 1.3), 세포 용해(섹션 2.2 및 2.3), 초음파 처리 크로마틴(섹션 3.1)</td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>로슈</td><td>4693159001</td><td>Proteinase K 완충액 및 ChIP 용리 완충액 dATP 용액을 제외한 모든 완충액에 첨가</td></tr><tr><td></td><td>New England BioLabs</td><td>N0440S</td><td>dA-테일링 반응(섹션 15.1)</td></tr><tr><td>Deoxycholic Acid Sodium Salt</td><td>fisher scientific</td><td>BP349</td><td>Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer 및 LiCl Wash Buffer</td></tr><tr><td>dNTP Mix, 분자생물학 등급</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td>비드 (Section 10.2) 및 변성, Primer Annealing 및 Primer Extension (Section 14.2)에 대한 필-인 반응 (</td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1081</td><td>결찰 매개 PCR(섹션 18.1)</td></tr><tr><td>EDTA, 0.5M, 멸균 용액, pH 8.0</td><td>BioShop</td><td>EDT111</td><td>용해 버퍼 1-3, 초음파 처리(섹션 4.1) 확인, 고염 세척 버퍼, LiCl 세척 버퍼 및 ChIP 용출 버퍼</td></tr><tr><td>에틸 알코올 무수, 100%</td> <td>상업용 알코올</td><td>P006EAAN</td><td>초음파 처리(섹션 4.3.3)</td></tr> <tr><td>포름알데히드, 36.5-38%, 10-15% 함유 메탄올</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>수확, 가교 및 동결 세포(섹션 1.1)</td></tr><tr><td>글리세롤, 시약 등급, 최소 99.5%</td><td>BioShop</td><td>GLY002</td><td>Lysis Buffer 1</td></tr><tr><td>글리신, 생명공학 등급, 최소 99%</td><td>BioShop</td><td>GLN001</td><td>수확, 가교 및 동결 세포(섹션 1.2)</td></tr><tr><td>글리코겐, RNA 등급</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0551</td><td>초음파 처리(섹션 4.3.3)</td></tr><tr><td>HEPES, 1 M 멸균 여과 용액, pH 7.3&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>HEP003</td><td>용해 버퍼 1, 고염 세척 버퍼</td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3->5 exo-)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0212S</td><td>dA-테일링 반응(섹션 15.1)</td></tr><tr><td>Lambda 엑소뉴클레아제</td><td>New England BioLabs</td><td>M0262S</td><td>비드의 Lambda 엑소뉴클레아제 분해(섹션 11.2)</td></tr><tr><td>리가제 인핸서</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645S</td><td>NEBNext Ultra II DNA 라이브러리 키트. 비드의 인덱스 어댑터 연결(섹션 9.1) 및 범용 어댑터 연결(섹션 16.1)</td></tr><tr><td>리가제 마스터 믹스</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645S</td><td>NEBNext Ultra II DNA 라이브러리 키트. 비드의 인덱스 어댑터 결찰(섹션 9.1) 및 범용 어댑터 결찰(섹션 16.1)</td></tr><tr><td>염화리튬(LiCl), 시약 등급</td><td>Bioshop</td><td>LIT704</td><td>LiCl 세척 버퍼</td></tr><tr><td>ChIP용 마그네틱 비드(Dynabeads Protein G)</td><td>Dynabeads Protein G(ChIP용 마그네틱 비드)</td><td>Dynabeads Protein G(ChIP용 마그네틱 비드)</td><td>비드를 사용한 항체 인큐베이션(섹션 5)</td></tr><tr><td>DNA 정제용 마그네틱 비드(AMPure XP 비드)</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>DNA 추출 (섹션 13.3) 및 DNA 클린업 (섹션 17.1)</td></tr><tr><td>자기 랙 (DynaMag-2 자석)</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>섹션에서 많은 단계에서 사용됩니다: 5 - 11, 13</td></tr><tr><td>MinElute Gel 추출 키트</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>28604</td><td>PCR 증폭 DNA의 겔 정제 (섹션 19.2)</td></tr> <tr><td>N-Lauroylsarcosine 나트륨 염 용액, 30 % 수용액, &ge; 97.0 % (HPLC)</td> <td>Sigma</td><td>61747</td><td>용해 버퍼 3</td></tr>- <tr><td>옥틸 페놀 에톡실 레이트 (IGEPAL CA630)</td><td>BioShop</td><td>NON999</td><td>용해 버퍼 1 및 LiCl 세척 버퍼</td></tr><tr><td>페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올, 생명 공학 학년 (25 : 24 : 1)BioShop</td><td></td> <td>PHE512</td><td>초음파 처리 검사 (섹션 4.3.1)</td></tr><tr><td>phi29 DNA 중합 효소</td><td>뉴 잉글랜드 BioLabs</td><td>M0269L</td><td>비드 (섹션 10.2) 및 변성, 프라이머 어닐링 및 프라이머 확장 (섹션 14.3 및 14.4)</td></tr> <tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)에 대한 필인 반응, 1x&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td>수확, 가교 결합 및 동결 세포(섹션 1.3) 및 초음파 염색질(섹션 3.1), 비드를 사용한 항체 주입(섹션 5.1)</td></tr><tr><td>PowerPac 기본 전원 공급 장치</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td>초음파 처리(섹션 4.3.6) 및 LM-PCR 증폭 DNA의 겔 정제(섹션 19.1)</td></tr> 확인 <tr><td>ProFlex PCR 시스템</td> 응용 <td>바이오시스템</td><td>ProFlex PCR 시스템</td><td>섹션에서 사용: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 및 18.2</td></tr><tr><td>단백질 LoBind 튜브, 2.0 mL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td>Beads (Section 5.2) 및 Chromatin Immunoprecite(Section 6.3)</td></tr><tr><td>ProteinAse K Solution, RNA grade</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td>Checking Sonication (Section 4.2) 및 Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3)</td></tr><tr><td>Qubit 4.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q33226</td><td>Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3)</td></tr><tr><td>Quibit dsDNA BR assay 키트</td><td>Invitrogen</td><td>Q32853</td><td>PCR 증폭 DNA의 겔 정제 (섹션 19.3)</td></tr><tr><td>Rnase A, Dnase 및 프로테아제가 없는</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td>초음파 처리 (섹션 4.3.2) 및 DNA 추출 (섹션 13.2)</td></tr> <tr><td>염화나트륨 (NaCl), BioReagent&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>용해 버퍼 1-3, 고염 세척 버퍼</td></tr><tr><td>소듐 도데실 설페이트 (SDS), 전기영동 등급</td><td>BioShop</td><td>SDS001</td><td>확인 초음파 처리 (섹션 4.1), 고염 세척 버퍼 및 ChIP 용출 버퍼</td></tr><tr><td>초음파 처리 비드 및 15 mL Bioruptor 튜브</td><td>Diagenode</td><td>C01020031</td><td>초음파 처리 크로마틴 (섹션 3.1 및 3.2)</td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td>섹션 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 및 16.2</td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride 용액(Tris-HCl), BioPerformance 인증, 1 M, pH 7.4</td><td>Sigma</td><td>T2194</td><td>10 mM Tris-HCl Buffer</td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 8.0</td><td>Sigma</td><td>T2694</td><td>용해 버퍼 2, 용해 버퍼 3, 초음파 처리 확인(섹션 4.1), LiCl 세척 버퍼 및 ChIP 용리 버퍼</td></tr><tr><td>Ultra II 말단 수리/dA-테일링 모듈(24 rxn -> 120 rxn)</td><td>New England BioLabs</td><td>E7546S</td><td>말단 분취 반응 혼합물 및 말단 분취 효소 혼합물. 비드에 대한 말단 수리 및 dA-테일링 반응 (섹션 8.2)</td></tr> <tr><td>VWR 미니 튜브 로커, 가변 속도</td><td>VWR</td><td>10159-752</td><td>섹션의 여러 단계로 사용 : 1, 2, 5, 6 및 7</td></tr><tr><td>2- [4- (2,4,4- 트리메틸 펜탄 -2- 일) 페녹시] 에탄올, 트리톤 X-100, 시약 등급</td><td>BioShop</td><td>TRX506</td><td>용해 버퍼 1, 초음파 처리 크로마틴 (섹션 3.4) 및 고 염 세척 버퍼</td></tr></tbody></table>

크롬 마틴 면역 침전 -엑소뉴클레아제 (chip-exo)를 사용하여 마우스 줄기 세포 유래 뉴런에서 단백질 dna 상호 작용의 고해상도 매핑

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

게놈에 특정 단백질-DNA 상호 작용의 식별은 유전자 조절을 이해하는 데 중요합니다. 높은 처리량 시퀀싱 (ChIP-seq)과 결합된 크로마틴 면역 침전은 DNA 결합 단백질의 게놈 전체 결합 위치를 식별하는 데 널리 사용됩니다. 그러나 ChIP-seq 방법은 초음파 처리된 DNA 단편 및 비특이적 배경 DNA의 길이에 있는 이질성에 의해 제한되어 DNA 결합 부위의 낮은 매핑 해상도 및 불확실성을 초래합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 ChIP와 엑소뉴클레아제 소화(ChIP-exo)의 조합은 5'에서 3' 엑소뉴클레아제 소화를 활용하여 단백질-DNA 교차 링크 부위에 이질적으로 크기의 면역 침전DNA를 다듬는다. 엑소뉴클레아제 치료는 또한 비특이적 배경 DNA를 제거한다. 라이브러리가 준비된 외핵증 소화 DNA는 고처리량 시퀀싱을 위해 전송될 수 있다. ChIP 엑소 방법을 사용하면 감지 감도가 높아지고 배경 신호가 감소하는 근거리 쌍 매핑 해상도가 가능합니다. 포유류 세포 및 차세대 시퀀싱을 위한 최적화된 ChIP 엑소 프로토콜은 아래에 설명되어 있다.

도 2A는 마우스 ES 세포로부터 분화된 모터 뉴런 세포의 다양한 사이클을 통해 세포 리시스 및 초음파 처리 후 초음파 처리 결과를 도시한다. 초음파 처리 주기의 최적 수 (예를 들어, 도 2A에서12 사이클) 100-400 bp DNA 단편에서 강한 DNA 강도를 생성. 고품질 ChIP 엑소 라이브러리는 단편화된 크로마틴 DNA의 크기와 양을 기반으로 합니다. 따라서, ChIP 엑소를 시작하기 전에 각 세포 유형 및 세포의 배치에 대해 초음파 처리의 최적화가 권장된다.
도 2B는 18-21 PCR 사이클에 의해 증폭된 ChIP 엑소 DNA 샘플의 계각 매개 PCR(LM-PCR) 제품을 나타낸다. LM-PCR은 차세대 시퀀싱을 위해 DNA 어댑터로 계게 되는 ChIP 엑소 DNA 단편을 증폭시합니다. PCR 프라이머는 D...

게놈 전반에 걸친 단백질 결합 위치의 정확한 결정은 유전자 조절을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 외핵증 소화(ChIP-exo)를 사용한 크로마틴-면역침전DNA를 치료하는 게놈 매핑 방법을 설명하고 있으며, 이어서 고처리량 시퀀싱을 한다. 이 방법은 포유류 뉴런에서 근거리 쌍 매핑 해상도 및 높은 신호 대 잡음 비와 단백질 DNA 상호 작용을 검출합니다.

크롬 마틴 면역 침전 -엑소뉴클레아제 (ChIP-Exo)를 사용하여 마우스 줄기 세포 유래 뉴런에서 단백질 DNA 상호 작용의 고해상도 매핑

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

ChIP-exo 방법의 주요 장점은 기존의 염색질 면역침전 방법에 비해 세포 내 단백질 DNA 상호 작용의 매핑 해상도가 향상되었다는 것입니다. ChIP를 위한 단백질 G 마그네틱 비드를 준비하려면 균질해질 때까지 마그네틱 비드를 혼합합니다. 그런 다음 25마이크로리터의 마그네틱 비드를 2ml 단백질 저결합 튜브에 추가합니다.비드에 차단 용액 1ml를 추가합니다. 피펫팅으로 잘 섞은 다음 튜브를 마그네틱 랙에 1분 동안 놓습니다. 상층액이 투명해지면 제거합니다.다음으로 비드에 1ml의 차단 용액을 추가합니다. 튜브를 섭씨 4도의 흔들 플랫폼에 놓고 10분 동안 흔들어 놓은 다음 튜브를 잠시 돌립니다. 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 상층액을 제거합니다.마그네틱 비드에 500마이크로리터의 차단 용액을 추가합니다. Islet-1에 대해 항체를 간단히 회전시킨 다음 자성 비드가 들어 있는 튜브에 항체 4마이크로그램을 추가합니다. 마그네틱 비드와 Islet-1 항체가 들어있는 튜브를 섭씨 4도의 흔들 플랫폼에 놓고 6-24시간 동안 흔들어 놓습니다.염색질 면역침전을 시작하려면 항체로 코팅된 비드를 1ml의 차단 용액으로 세척합니다. 항체가 코팅된 비드가 들어 있는 튜브를 섭씨 4도의 흔들 플랫폼에 5분 동안 놓습니다. 잠시 회전 한 후 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 상층액을 제거합니다.항체 코팅된 비드를 50마이크로리터의 차단 용액에 재현탁합니다. 항체 코팅된 비드에 초음파 용해물 1ml를 첨가한 다음 섭씨 4도의 흔들 플랫폼에서 밤새 샘플을 배양합니다. 샘플을 밤새 배양시킨 후 튜브를 잠시 돌려 캡에서 액체를 모은 다음 튜브를 마그네틱 랙에 놓습니다.그리고 1분 후 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 다음과 같이 일련의 세척을 수행합니다. CPI가 포함된 1ml의 냉세척 버퍼를 샘플에 추가합니다.섭씨 4도의 흔들 플랫폼에서 5분 동안 샘플을 혼합합니다. 샘플 튜브를 짧게 돌린 다음 마그네틱 랙에 놓습니다. 1분 후 피펫으로 상층액을 제거합니다.첫 번째 효소 반응 및 복구 및 DA 테일링을 위해 시료에 38마이크로리터의 오토클레이브 이중 증류수를 첨가한 다음 말단 분취 반응 혼합물 및 말단 분취 효소 혼합물을 추가합니다. 피펫팅으로 튜브의 내용물을 혼합한 다음 샘플을 섭씨 20도에서 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 앞에서 설명한 대로 고염 세척 버퍼, 염화리튬 세척 완충액 및 10 millimolar Tris 염화수소 완충액으로 샘플 비드를 세척합니다.인덱스 어댑터 결찰을 수행하려면 샘플에 27마이크로리터의 차가운 10밀리몰 Tris 염화수소 완충액을 추가합니다. 그런 다음 인덱스 어댑터, ligation enhancer 및 ligase 마스터 믹스를 추가합니다. 샘플을 섭씨 20도에서 15분 동안 배양합니다.다시 말하지만, 고염 세척 버퍼, 리튬 클로라이드 세척 버퍼 및 10 밀리몰 트리스 염화수소 버퍼로 샘플 비드를 세척합니다. 그런 다음 47마이크로리터의 차가운 10밀리몰 Tris 염화수소 완충액을 샘플에 추가합니다. 포스포다이에스테르 결합이 누락되어 DNA의 흠집을 복구하려면 11.1마이크로리터의 필-인 믹스를 샘플에 첨가합니다.샘플을 섭씨 30도에서 20분 동안 배양합니다. 일련의 세척 후 50마이크로리터의 차가운 오토클레이브 이중 증류수를 샘플에 추가합니다. ChIP DNA를 5 프라임에서 3 프라임 방향으로 분해하려면 lambda exonuclease buffer와 lambda exonuclease를 추가하고 피펫팅으로 샘플을 혼합합니다.샘플을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 소화가 완료되면 마지막으로 세 번의 세척을 반복합니다. 비드에서 ChIP 샘플을 용리하려면 75 마이크로 리터의 ChIP 용출 버퍼와 65 °C의 인큐베이터에서 130 회 G.Add 20 밀리그램 단백질 분해 효소 K의 2.5 마이크로 리터를 샘플에 재현탁시킵니다.샘플을 잠시 소용돌이친 다음 섭씨 65도에서 밤새 배양합니다. 샘플을 짧게 돌리고 마그네틱 랙에 놓습니다. 1분 후 상등액을 새 1.5ml 튜브로 옮깁니다.DNA를 정제하고 용리합니다. 용출된 DNA를 정제한 후 추출된 DNA 샘플 16마이크로리터를 PCR 튜브에 옮깁니다. 1.2마이크로리터의 변성 및 프라이머 어닐링 혼합물을 샘플에 추가합니다.원고의 표 6에 기술된 프로그램을 사용하여, 주체 DNA에 프라이머를 변성시키고 단련한다. 샘플에 3마이크로리터의 프라이머 확장 혼합물을 추가하고 원고의 표 7에 설명된 PCR 프로그램을 실행합니다. 샘플에 4.1마이크로리터의 DA 테일링 믹스를 추가하고 원고의 표 8에 있는 PCR 프로그램을 사용하여 샘플을 실행합니다.그런 다음 21.5마이크로리터의 범용 어댑터 결찰 혼합물을 샘플에 추가하고 섭씨 20도에서 15분 동안 배양합니다. 샘플에 29마이크로리터의 LM-PCR 혼합물을 첨가한 다음 원고의 표 10에 있는 프로그램을 사용하여 샘플을 실행합니다. LM-PCR의 18 사이클 후, 마우스 운동 뉴런의 ChIP-exo 샘플을 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동했습니다.ChIP-exo Islet-1에 대한 결과는 약 200 - 400개의 염기쌍이 증폭된 DNA 라이브러리를 보여주었으며, 이는 ChIP-exo 라이브러리가 LM-PCR에 의해 성공적으로 증폭되었음을 나타냅니다. 약 100개의 염기쌍 대역은 어댑터와 PCR 프라이머의 아티팩트를 나타냅니다. 항체가 없는 대조군은 비특이적 배경 DNA가 람다 엑소뉴클레아제 처리에 의해 소화되었음을 보여줍니다.ChIP-exo 및 ChIP-seq를 사용하여 Islet-1 행 위치를 식별했습니다. ChIP-exo 신호는 Islet-1 결합 부위에 고도로 집중되어 여러 군집된 Islet-1 전사 인자 결합 패턴을 감지했습니다. ChIP-seq 신호는 ChIP-exo가 Islet-1에 대한 ChIP-seq보다 더 높은 매핑 해상도를 가짐을 나타내는 더 넓은 신호를 표시했습니다.여러 전사 인자(transcription factor)는 종종 DNA를 단백질-DNA 복합체로 나란히 결합합니다. ChIP-exo를 사용하면 여러 transcription factor가 대상 DNA를 인식하고 조절하는 방법을 연구할 수 있습니다.

high-resolution-mapping-protein-dna-interactions-mouse-stem-cell

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 비디오는 표적 단백질 특이적 항체 코팅된 마그네틱 비드를 사용하여 줄기세포 유래 모터 뉴런 용해물에서 표적 단백질과 교차결합된 DNA 단편의 면역침전을 보여줍니다.

운동 뉴런 용해물에서 표적 단백질-DNA 복합체의 면역침전(Immunoprecipitation of Target Protein-DNA complexes from Motor Neuron Lysate)

출처: Mendez, F. M. et al., 쥐 뇌 종양 신경구를 사용한 네이티브 염색질 면역침전.J. vis. 특급 (2018). 이 비디오는 천연 염색질 면역침전을 사용하여 마우스 뇌종양에서 유래한 신경구 세포에서 단백질-DNA 복합체를 분리하는 방법을 보여줍니다. 염색질 준비, 면역침전, 세척 및 단백질 분해를 위한 단계를 자세히 설명하여 다운스트림 분석을 위해 DNA를 방출합니다.

신경구 세포의 네이티브 염색질 면역침전(Native Chromatin Immunoprecipitation of Neurosphere Cells)

방법 염색질 규제 및 염색질 상태의 문제는 생체 내에서 유전자가 세포 운명 결정이 배아에서 어떻게 만들어 지는지 초기에 대한 우리의 이해의 열쇠입니다 영향을 미칩니다. 칩 서열 번호 - 글로벌 수준입니다 Xenopus의 배아 여기 설명에서 크로 마틴의 기능을 조사하기 가장 인기있는 방법.

염색질 레귤레이터 및 미국에서의 게놈 전체의 스냅 샷<em&gt; 아프리카 발톱 개구리</em칩 서열 번호&gt; 태아

여기에서는 단백질-DNA 상호 작용의 염기쌍에 가까운 해상도를 달성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이는 염색질 면역침전(ChIP-exo)으로 선택적으로 농축된 DNA 단편의 엑소뉴클레아제 처리에 이어 고처리량 염기서열분석(high throughput sequencing)을 통해 얻을 수 있습니다.

칩 엑소 방법 : 가까운 자료 쌍의 정밀과 단백질 DNA 상호 작용을 확인

우리는 micrococcal nuclease (MNase) 융합 단백질로 게놈 전체 단백질 바인딩 사이트를 매핑하기위한 염색질 immunoprecipitation (ChIP) - 직교 방식 높은 처리량 시퀀싱 (ChEC - seq)와 결합 염색질 내생 절단을 설명합니다.

ChEC-seq와의 단백질 - DNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

이 작품은 성숙 마우스 T 세포 라인을 사용하여 염색질 immunoprecipitation (ChIP)에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 특정 프로모터 사이트 또는 게놈 전체에서 특정 히스톤 마크의 분포를 조사하는 데 적합합니다.

마우스 T- 세포주에서 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

우리 신경 조상 세포의 히스톤 3 리 79 dimethylation (H3K79me2)-내에 있는 히스톤 마크 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 미 발달 및 출생 후 뇌 조직에서 문화를 격리 하는 효과적이 고 재현 가능한 방법을 제시는 히스톤 3의 구형 도메인입니다.

절연 및 신경 창시자 Chromatin-Immunoprecipitation 히스톤 3 리 79 Dimethylation 마크의 뒤의 재배

여기, 우리는 칩 Seq를 수행 하는 방법을 설명 및 CARIP-Seq, 다음-세대 시퀀싱, 라이브러리 준비 등 글로벌 epigenomic 및 chromatin 관련 RNA 생성 하 ES 세포에 지도.

CARIP-Seq와 칩 Seq: Chromatin 관련 된 RNAs 및 배아 줄기 세포에 단백질 DNA 상호 작용을 식별 하는 방법

탠덤 chromatin 위한 단계별 프로토콜 설명 immunoprecipitation 시퀀싱 (tChIP-Seq) 셀 형식 관련 게놈 넓은 히스톤 수정의 분석을 가능 하 게.

TChIP-Seq: 셀 형식 관련 Epigenome 프로 파일링

이 프로토콜은 위상 연관 도메인(TAD)의 경계 및 조절 및 기타 DNA 서열 요소 간의 장거리 염색질 상호 작용을 포함하여 고해상도에서 메가 기반 크기의 표적 게놈 영역의 3D 조직을 특성화하는 데 사용되는 Capture Hi-C 방법을 설명합니다.

Capture Hi-C를 통한 고분해능 3D 염색질 조직 해독

게놈 전체 염색체 형태 캡처 방법인 Micro-C-XL을 사용하여 뉴클레오솜 분해능으로 3차원 게놈 조직을 매핑하기 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.

Micro-C-XL을 사용한 포유류 3D 게놈 상호 작용 매핑

학습하세요 ChIP-Exo를 활용한 단백질-DNA 상호작용 고해상도 매핑 방법을 마우스 줄기세포 유래 뉴런에서. 이 기술은 유전자 조절 메커니즘 연구에 필수적인 near base-pair 해상도를 제공합니다.

크롬 마틴 면역 침전 -엑소뉴클레아제 (ChIP-Exo)를 사용하여 마우스 줄기 세포 유래 뉴런에서 단백질 DNA 상호 작용의 고해상도 매핑

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