Name: 쥐에서 만성 이식을 위한 말초 신경 자극 전극의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 학습하세요 쥐에서 만성 이식 가능한 말초 신경 커프 전극을 제작하는 간단하고 저렴한 방법을. 이 기술은 뇌졸중 회복 연구를 위한 미주 신경 자극(VNS) 전임상 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 달라스에 있는 텍사스 대학 및 리젠트의 UT 위원회에 의해 투자되었습니다. 솔로몬 골딩, 빌랄 하산, 마르기 자니, 칭츠 칭에게 기술 지원을 부탁드립니다.

이 프로토콜에 설명된 모든 절차는 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 NIH 가이드에 따라 수행되며 달라스에 있는 텍사스 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 자극 커프 전극 제작
<ol><li>커프 튜빙을 준비합니다.<ol>
<li>면도날을 사용하여 길이 2.5mm의 폴리머 튜브 조각을 잘라냅니다. 튜브를 통해 집게 팁이나 종이 클립을 삽입하고 칼날을 사용하여 커프의 한쪽에 있는 튜브 벽을 통해 길이로 슬릿을 만듭니다.</li>
		<li>튜브에서 집게를 제거하고 긴 축에 수직, 커프의 중간선을 통해 큰 바느질 바늘을 삽입합니다. 슬릿(위)을 통해 바늘을 튜브 의 중앙(아래쪽)에 삽입합니다. 나머지 조립 단계 동안 커프를 제자리에 고정하기 위해 폼 보드에 바늘을 놓습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>이식 중에 커프 클로저 를 확보하기 위한 봉합사를 배치합니다.<ol>
<li>커프의 벽을 통해 작은 바느질 바늘을 삽입, 중간라인에, 한쪽의 상단 슬릿에서 약 0.5 mm. 커프 튜빙을 손상시키지 않도록 내부에서 외부로 바늘을 삽입합니다. 바늘의 눈을 통해 6/0 봉합사의 2cm 길이를 삽입하고 커프에 봉합사를 스레드 튜브의 벽을 통해 바늘을 당깁니다.</li>
		<li>실을 제자리에 두고 바늘을 제거하고 커프의 중간선을 따라 첫 번째 구멍 아래 약 0.5mm 의 튜브 벽을 통해 두 번째 구멍을 뚫습니다. 바늘의 눈을 통해 봉합사를 삽입하고 다시 커프를 통해 봉합사를 스레드 튜브 벽을 통해 바늘을 당기.</li>
		<li>봉합사 실의 양쪽 끝은 이제 커프의 외부 쪽에 있어야 합니다. 봉합사를 조정하여 상단 구멍에서 ~1.5cm, ~0.5mm가 아래 구멍에서 확장되도록 합니다.</li>
		<li>낮은 구멍에서 연장봉합사의 짧은 끝에 소량의 UV 경화 접착제를 적용하고 낮은 꼬리가 튜브의 외벽과 거의 플러시 될 때까지 더 긴 봉합사 끝을 당깁니다. UV 지팡이를 사용하여 접착제를 치료하고 봉합사를 제자리에 단단히 고정시하십시오.</li>
		<li>커프의 반대편에 있는 1.2.1 ~1.2.3 단계를 반복합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>플래티넘: 이리듐(Pt:Ir) 와이어 리드를 놓습니다.<ol>
<li>커프 벽에 4 개의 구멍을 만들기 위해 작은 바느질 바늘을 사용합니다. 각 구멍은 수직 중간선에서 약 0.5-0.8mm를 배치해야 하며, 커프의 양쪽에 있는 상단 슬릿에서 약 0.5~0.8mm의 구멍이 있습니다. 주의: 리드의 가장 일관되고 정확한 배치를 위해 내부에서 외부로 바늘을 삽입하여 봉합사 배치를 가이드로 사용하여 모든 구멍을 만듭니다.</li>
		<li>봉제 바늘을 다시 삽입, 이번에는 리드 홀 을 통해 외부에서 내부로 작동1. Pt의 길이 7.5cm의 약 0.5cm를 삽입: 바늘의 눈을 통해 Ir 와이어와 커프 벽을 통해 와이어 리드를 스레드 튜브를 통해 바늘을 당깁니다. ~4.5cm가 커프의 외부 면에 확장되도록 와이어를 조정합니다(도1A).</li>
		<li>1번 리드 홀을 통해 바늘을 다시 삽입하고, 다시 외부에서 내부로 작동하며, 리드 홀 2를 통해 바늘을 1번 리드 홀 바로 맞은편에 삽입합니다. Pt의 짧은 (내부) 끝의 ~ 0.5cm를 삽입 : 바늘의 눈을 통해 Ir 와이어를 삽입하고 튜브를 통해 바늘을 당겨 와이어가 커프 벽을 통해 리드 스레드. 참고: Pt:Ir 와이어의 양쪽 끝은 이제 커프의 외부 측면에 있어야 하며, 와이어 루프는 슬릿 엣지 주위와 리드 홀1(그림 1B)을통해 형성됩니다.</li>
		<li>1.3.1에서 1.3.3까지 반복하여 리드 홀 3과 4를 통해 Pt:Ir 와이어를 배치합니다.</li>
		<li>부탄 라이터를 사용하여, 조심스럽게 리드 홀 2와 리드 홀 4에서 확장 Pt : Ir 와이어의 끝에 5-6mm 길이에서 절연을 제거합니다. 주의: 커프 조립의 나머지 부분에서 리드의 끝을 조심스럽게 분리하여 커프에 손상을 입히지 않도록 합니다. 손상을 방지하기 위해 전선을 보유하는 도구를 사용합니다.</li>
		<li>커프스 내부에 베어 와이어를 정렬하여 최종 위치에 리드를 배치합니다. 이렇게 하려면 1번 홀에서 와이어의 절연되지 않은 부분이 1번 홀과 함께 플러시될 때까지 Pt:Ir 와이어의 끝을 부드럽게 당깁니다. 다른 리드와 반복하여 리드 홀 3및 4를 통해 나사로 연결된 와이어의 절연되지 않은 끝을 정렬합니다.</li>
		<li>리드 홀 1과 3에서 커프의 외부 측에 와이어 루프에 소량의 UV 경화 접착제를 적용합니다. UV 지팡이를 사용하여 접착제를 치료하고 리드를 제자리에 고정시하십시오.</li>
		<li>작은 파이펫 팁을 사용하여 절연되지 않은 Pt:Ir 와이어가 커프의 내부 벽에 연결됩니다. 리드가 제자리에 있으면 리드 홀 2와 4에서 연장되는 전선의 끝을 잘라서 약 1mm의 와이어가 커프 벽의 외부를 넘어 확장되도록 합니다.</li>
		<li>와이어의 1mm 꼬리를 커프의 외부 표면에 평평하게 접어서 함께 짧게 하지 않도록 주의하십시오. 소량의 UV 경화 접착제를 적용하여 두 개의 꼬리를 덮고 접착제를 치료하여 납 배치를 확보하고 전기 절연을 제공합니다. 주의: 외부노출Pt:Ir 표면을 접착제로 완전히 덮어 전선을 절연하고 오프 타겟 자극을 피하는 것이 중요합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>합수 고정을 통해 Pt:Ir 와이어 리드를 제자리에 고정합니다.<ol>
<li>폼 보드에서 커프 어셈블리로 큰 바늘을 제거합니다. 바늘의 눈을 통해 6/0 봉합사의 길이 3cm를 삽입하고 중간점에서 커프의 바닥을 통해 봉합사를 스레드 튜브를 통해 바늘을 당기다.</li>
		<li>Pt:Ir 납 보안에 대한 봉합사 스레딩을 완료하기 위해 작은 바느질 바늘로 전환합니다. 튜브와 와이어 리드의 변형을 피하기 위해 내부에서 외부로 다시 작업, 같은 중간 구멍을 통해 바늘을 삽입합니다. 바늘의 눈을 통해 봉합사의 외장 꼬리를 삽입하고 커프 스프 벽을 통해 바늘을 당겨 커프스(도 1C)의가장자리 주위에 봉합사의 루프를 만듭니다. 참고: 집안일을 사용하여 현미경으로 작업하여 봉합사가 커프의 긴 축을 따라 방향이 되고 튜브에 평평하게 놓이도록 하십시오. 이 단계는 리드가 커프스의 내부 측면에 분리되어 있고 커프 스미드라인에 측면으로 유지됩니다.</li>
		<li>커프의 외부 쪽에 반 매듭에 봉합사의 끝을 묶어 커프의 반대쪽 끝에 두 번째 루프를 만듭니다. 봉합사가 커프의 긴 축을 따라 달리고 튜브에 평평하게 놓여 있는지 확인하십시오. 매듭을 단단히 잡고 튜브에 평평하게 놓이면서 소량의 UV 경화 접착제를 반 매듭에 적용하고 제자리에 고정하는 경화.</li>
		<li>봉합사 실의 끝을 가능한 한 매듭에 가깝게 조심스럽게 잘라냅니다. 필요한 경우 소량의 UV 경화 접착제를 사용하여 봉합사의 짧은 끝을 접착제로 붙이면 튜브(도 1D)에평평하게 놓습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Solder 커넥터핀을 Pt:Ir 와이어 리드에 연결합니다.<ol>
<li>부탄 라이터를 사용하여 각 Pt:Ir 와이어 리드의 끝에서 ~ 3mm의 절연을 제거합니다. 골드 핀의 컵 면을 납땜(재료 표 참조)을 각 리드의절연되지 않은 끝으로 감게 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>조립된 장치의 임피던스를 테스트합니다.<ol>
<li>금핀을 LCR 미터 또는 전극 임피던스 검사 모듈의 입력에 연결하고 테스트 주파수를 1kHz로 설정합니다. 식염수로 채워진 작은 비커에 커프 튜빙(및 Pt:Ir 자극이 커프스 내부와 접촉함)을 잠수하여 골드 리드 핀과 프로브 커넥터를 건조하게 유지합니다. 조립 된 커프가 이식을 진행하기 전에 2 kΩ 미만의 1 kHz에서 임피던스를 가지고 있는지 확인하십시오. 참고 : 높은 임피던스는 종종 절연의 부족 제거, 커프 내부에 접착제의 우발적 인 적용, 깨진 와이어 가닥 등등의 요인으로 인해 발생할 수있는 부적절한 Pt : Ir 표면적 노출을 나타냅니다. 커프스는 또한 장기간 사용으로 짧은 접촉을 초래할 수있는 파손되거나 제대로 배치 된 와이어 가닥에 대해 검사해야합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 헤드 캡 건설
참고: 헤드캡 어셈블리 절차는 이전에 게시된 절차(어린이 등17)와유사하며 편의를 위해 여기에 요약되어 있습니다.
<ol><li>
헤드캡17 조립
	<ol>
<li>길이 1 ~13mm, 길이 1 ~10mm의 작은 2장AWG 와이어 랩을 잘라냅니다. 두 전선의 각 끝에서 ~ 1.5mm의 절연을 제거합니다. 골드 핀의 핀 면을 각 와이어의 한쪽 끝으로 납땜하여 컵에 최대한 가깝게 감습니다. 와이어 커터를 사용하여 솔더 조인트 너머의 과도한 핀 길이를 차단합니다.</li>
		<li>AWG의 다른 쪽 끝을 4핀 마이크로스트립 커넥터의 두 개의 중앙 솔더 컵으로 납땜합니다.</li>
		<li>와이어 헤드캡을 구부리면 커넥터쪽으로 이어지고 그림 2A에표시된 것처럼 금 핀이 서로 평행하게 연결함에 대해 평평하게 놓습니다. 짧은 와이어에 연결된 핀은 긴 와이어에 연결된 핀 아래에 배치되어야 합니다. 네일 아크릴, 치과 시멘트 또는 UV 경화 접착제를 사용하여 헤드캡 리드를 제자리에 고정하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 장치 사용
<ol><li>만성 미주 신경 자극을 위해 커프 전극을 이식합니다. 참고: 모든 외과 적 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 지침및 현지 IACUC 승인을 통해 적절한 마취 하에 멸균 또는 무균 기술을 사용하여 수행해야합니다. 다음 절차는 장치의 대표적인 사용을 설명하기 위한 것이며 포괄적인 것이 아닙니다.<ol>
<li>쥐를 스테레오탁 프레임에 놓고 정수리와 후수 뼈 위에 처진 절개를 하여 헤드캡/커넥터의 이식을 위해 두개골 표면을 드러냅니다. 조심스럽게 두개골에 4 구멍을 드릴과 주얼러의 나사를 배치합니다. 두개골과 나사에 헤드 캡을 확보하기 위해 치과 아크릴을 사용합니다.</li>
		<li>스테레오탁프레임에서 쥐를 제거하고 오른쪽에 놓습니다. 목 왼쪽의 피부에 수직 절개를 하고, 흉골과 스테인디스 근육 과 이모로이드 근육 아래에 위치한 경동맥에서 왼쪽 미주 신경을 조심스럽게 해부한다.</li>
		<li>커프가 두개골을 향해 피하로 이어지는 터널. 골드 핀을 사용하여 리드를 헤드캡에 연결합니다.</li>
		<li>미주 신경을 커프스 내부에 놓고 커프 봉합사에 이중 매듭을 묶어 장치를 닫습니다. 무딘, 비전도성 후크로 신경을 조작하거나 신경을 둘러싼 결합 조직을 파악하여 이식 하는 동안 신경을 손상 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
		<li>장치에 자극을 적용하여 임플란트를 테스트합니다(0.8mA, 30Hz, 100 μs 바이파티즘 펄스의 10s 열차). 적절한 이식은 호흡이 중단되고 SpO2의 5% 이상에서 감소합니다.</li>
		<li>골드 핀과 노출된 리드를 치과 아크릴로 덮고 봉합사로 상처를 닫고 식염수, 알코올 및 포비도네 요오드 용으로 절개 부위를 청소하십시오.</li>
		<li>NIH 지침 및 IACUC 승인에 따라 대체 유체, 진통제 및 수술 후 치료를 제공합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>깨어있는 행동 도중 미주 신경을 자극합니다. 참고: 동물이 특정 모터 작업을 수행함에 따라 VNS를 전달하는 것은 이전에 작업 관련 근육의 모터 맵 표현을 확장하는 것으로 나타났습니다. 당사는 이 검증된 패러다임을 사용하여 장치 사용의 대표적인 예를 제공하지만, 다른 많은 행동 패러다임 및/또는 자극 매개 변수는 대체 응용 프로그램과 관련이 있을 수 있습니다. 쥐는 장치 이식 전에 여기에 사용되는 레버 프레스 작업에 숙련도를 훈련했다. 수술 후, 좋은 성능은 VNS 납품 전에 다시 확인되었습니다: 쥐는 하루에 2개의 30 분 훈련 세션에서 적어도 100의 성공적인 시험을 수행했습니다. VNS는 5일 동안 10회의 후속 교육 세션에서 올바른 레버 프레스와 페어링되었습니다.<ol>
<li>이식된 헤드 캡을 통해 쥐를 자극 발생기에 연결하고 적절한 자극 설정에 적응합니다. VNS유도 모터 피질 맵의 재구성을 위해 각 올바른 레버 프레스를 15개의 이중맥 펄스 단일 열차와 페어링하며, 각 열차의 너비는 100μs, 진폭 800 μA로 30Hz의 주파수로 전달됩니다.</li>
		<li>자극 열차는 10 30 분 훈련 세션 동안 각 성공적인 레버 프레스를 감지 한 후 즉시 전달됩니다. VNS 전달 중에 오실로스코프를 사용하여 전류 자극의 성공적인 전달을 모니터링합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>만성 이식 된 커프 기능을 검증하십시오.<ol>
<li>마지막 VNS 페어링,교육 세션의 24 시간 내에서, 모터 피질(19,20,21,22)에서기능성19,소모토피 맵을 정량화하기 위해 두개내 현미경 자극(ICMS)을 사용한다.,</li>
		<li>모터 피질의 ICMS 매핑을 위한 마취를 유도한 후, 30Hz의 10s 열차, 0.8 mA 전류 자극(100 μs biphasic 펄스)을 적용하여 커프 기능을 다시 검증하여, SpO2 레벨의 호흡 중단및 감소는 Hering-Breuer 와 일치합니다. 참고: 응용 프로그램에 따라, 커프 기능은 5% 미만의 신뢰할 수 있는 SpO2 드롭이 관찰되거나, 전류 진폭(최대 1.6mA)이 SpO2에서최소 5% 이상 감소할 경우 허용가능한 것으로 간주될 수 있다. 호흡 중단 및/또는 SpO2의 신뢰할 수 있는 감소를 관찰하지 못하는 것은 임플란트 장애를 나타냅니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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여기에서 우리는 설치류에 사용하기 위하여 만성 이식성 자극 개 전극의 조립을 위한 간단하고 저렴한 접근 법을 기술하고, 이 새로운 치료의 전임상 조사를 촉진합니다. 이 단순화된 방법은 전문 교육이나 장비가 필요하지 않으며, 대부분의 연구실에서 쉽게 접근할 수 있는 소수의 도구와 소모품을 사용하여16, 26,,27,,28에비해 장치 제조의 금전적 및 인건비를 모두 절감한다.,26 조립 전반에 걸쳐 UV 경화 접착제를 과도하게 적용하지 않도록 주의해야 하며, 봉합사와 Pt:Ir의 적절한 기계적 안정성을 보장하여 장기적인 커프 기능을 사용할 수 있습니다. 과도한 접착술은 장치 이식을 복잡하게 하고 수술 후 주변 조직을 자극할 수 있으며, 불충분한 접착제는 시간이 지남에 따라 리드가 신경과의 좋은 접촉을 유지...

최근에는 말초 신경 자극을 위한 만성 이식형 커프 전극에 대한 수요가 증가하고 있으며, 수많은 염증성 질환1,,,,,,,,,,22,3 및 신경 장애4,5,,7,8,9,10,711,,12,13,14,15의치료를 위한 이 기술의 전임상 유용성을 점점 더 입증하는 연구가 증가하고있다. 만성 VNS는 예를 들어, 다양한 학습 맥락에서 신코르티컬 가소성을 향상시키는 것으로 나타났으며, 모터 재활4,,5,,6,,7,,8,멸종 학습10,11,,12,,13,,14및 감각 차별15를개선하는 것으로 나타났다., 시판되는 말초 신경 소맷전극은 종종 주문 이행을 위한 연장된 시간과 상대적으로 높은 비용과 관련이 있어 접근성을 제한할 수 있습니다. 또는 만성 이식형 커프 전극의 "사내" 제조를 위한 프로토콜은 제한되어 있으며 설치류 해부학은 작은 크기로 인해 특정 한 과제를 제시합니다. 만성 설치류 실험을 위한 커프 전극을 구축하기 위한 현재 프로토콜은 종종 복잡한 장비와 기술뿐만 아니라 광범위하게 훈련된 인력의 사용을 필요로 합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 이전에 출판되고 널리 사용되는방법(16,17)에기초하여 커프 전극 제조에 대한 단순화된접근법을보여 준다. 우리는 쥐에 있는 우리의 만성 이식된 전극의 기능을, 왼쪽 자궁 경부 미주 신경의 주위에 커프 이식의 시간에, 커프 전극에 적용된 자극이 성공적으로 SpO2에 있는 호흡 및 낙하의 중단을 생성한다는 것을 보여 줌으로써, 증명해서. 발포성 폐 수용체 혈관 섬유의 자극은 뇌간에서 여러 호흡 핵의 억제가 억제영감(18)을초래하는 헤링-브루어 반사를 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 헤링-브루어 반사와 일치하는 호흡 중단, SpO2의 결과 저하는 마취된 쥐에서 적절한 전극 이식 및 커프 기능에 대한 간단한 테스트를 제공합니다. 만성 이식 된 커프 전극의 장기 기능을 검증하기 위해 이식 시 반사 반응을 측정하고 이식 후 6 주 후에 동일한 동물에서 얻은 반응과 비교하여 반사 반응을 측정했습니다. 쥐의 두 번째 그룹은 레버 압박 작업에 행동 훈련 후 VNS 커프 전극으로 이식되었다. 이러한 쥐에서, VNS는 올바른 작업 성과와 짝을 이루어 이전에 발표된연구(19,,20,,21,22)와일치하여 피질 모터 맵의재구성을생산했다. 장치 이식 후 5~10주 후에 발생한 마취 하에 모터 피질 매핑시 VNS가 성공적으로 호흡 중단을 유도하고 SpO2에서5% 이상 떨어지는 것을 확인함으로써 VNS 처리 동물의 커프 기능을 더욱 검증했습니다.
어린이 외 17 및 리오스 외,,,,,,16에서 최근에 발표 된 프로토콜은,설치류,1,2,3,4,5,6,7,68,9,10,11에서만성 VNS 연구를 수행하는 여러 실험실에서 사용되는 바와 같이 단순화 된 커프 전극 제조 접근 방식에 대한 잘 검증 된출발점을제공합니다.16 원래 방법은 커프 전극 제작이 완료하는 데 1 시간 이상 걸리는 미세 마이크로 와이어를 조작하기위한 몇 가지 고정밀 단계와 안정적으로 수행하기 위한 광범위한 교육을 포함합니다. 여기에 설명된 단순화된 접근 방식은 재료와 도구가 훨씬 적어야 하며 최소한의 교육을 받은 인력에 의해 1시간 이내에 완료할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>생체 적합성 폴리우레탄 기반 폴리머 튜브, 0.080" OD x 0.040" ID</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE080 36 FT</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>AM 스코프</td><td>#SM-6T-FRL</td><td></td></tr><tr><td>미세 톱니 가위, 직선, 22mm 절단 가장자리</td><td>Fine Science Tools</td><td>#14058-09</td><td>Pt/Ir 와이어 및 봉합사</td></tr><tr><td>펜치 절단용, #5 Dumont 펜시, 스트레이트, 11 cm, 0.1 x 0.06 mm 팁</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11626-11</td><td></td></tr><tr><td>집게, 세라믹 팁 집게, 0.3 mm x 30 mm 팁</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>#78127-71</td><td></td></tr><tr><td>골드 핀, PCB 프레스 핏 소켓</td><td>Mill-Max</td><td>#1001-0-15-15-30-27-04-0</td><td>또는 이와 유사한 작은 핀으로 커프 리드를 헤드캡에 연결하기 위한</td></tr> 이<tr><td>소부탄 라이터</td><td>BIC</td><td>#LCP21-AST</td> 절연 <td>Pt/Ir 와이어 제거</td></tr><tr><td>래치가 있는 마이크로 스트립 커넥터, 4핀</td><td>Omnetics</td><td>A24002-004 / PS1-04-SS-LT</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁, 10 uL</td><td>VWR</td><td>89079-464</td><td></td></tr><tr><td>백금-이리듐(90/10%) 와이어, 0.001"(직경) x 9 가닥, PTFE 절연</td><td>Sigmund Cohn</td><td>10IR9/49T</td><td></td></tr><tr><td>면도날, 단일 가장자리,</td><td>MicroRenathane 튜빙</td><td></td><td></td> 절단용 수술용 탄소강 No.9 VWR#55411-050</tr><tr><td>재봉 바늘, ca. 길이 4.0cm x 직경 0.7mm (크기 6-7)</td><td>Singer</td><td>00276</td><td>Pt/Ir 와이어 실을 꿰기 위한 작은 바늘</td></tr><tr><td>재봉 바늘, ca. 길이 4.5cm x 지름 0.8mm(크기 2-3)</td><td>Singer</td><td>00276</td><td>조립 중 커프 고정 및 봉합사 실을 꿰기 위한 더 큰 바늘</td></tr><tr><td>작은 폼 보드</td><td>Juvo+/Amazon</td><td>B07C9637SJ</td><td>제작 플랫폼을 위해; 우리의 치수는 약 2.5" x 3.5" x 1" (L x W x H)</td></tr><tr><td>솔더, 멀티코어 무연, 0.38mm 지름</td><td>Loctite/Multicore</td><td>#796037</td><td></td></tr><tr><td>납땜 스테이션</td><td>Weller</td><td>WES51</td><td>또는 긴 원뿔형 팁과 호환되는 유사한 납땜용 인두 (이 부품은 중단되었습니다)</td></tr><tr><td>납땜 팁, 긴 원뿔형, 0.01" / 0.4 mm</td><td>Weller</td><td>1UNF8</td><td></td></tr><tr><td>봉합사, 비흡수성 꼰 실크, 크기 6/0</td><td>Fine Science tools</td><td>#18020-60</td><td></td></tr><tr><td>UV(405nm) 스포트라이트</td><td>Henkel/Loctite</td><td>#2182207</td><td></td></tr><tr><td>UV Light Cure Adhesive 25ml</td><td>Henkel/Loctite</td><td>AA 3106</td><td>또는 이와 유사한 생체 적합성 UV 경화 접착제</td></tr><tr><td>와이어 래핑 와이어, 30 AWG</td><td>Digikey</td><td>K396-ND</td><td></td></tr></tbody></table>

쥐에서 만성 이식을 위한 말초 신경 자극 전극의 준비

Preparation of Peripheral Nerve Stimulation Electrodes for Chronic Implantation in Rats

말초 신경 커프 전극은 오랫동안 신경 과학 및 관련 분야에서 미주 또는 시정 신경의 자극을 위해 사용되어 왔습니다. 몇몇 최근 연구는 모터 재활, 소멸 학습 및 감각 차별을 향상시키기 위하여 중추 신경계 가소성을 향상에 있는 만성 VNS의 효력을 보여주었습니다. 이러한 연구에서 사용하기 위해 만성 이식 형 장치의 건설은 쥐의 작은 크기로 인해 도전적이며, 일반적인 프로토콜은 인력의 광범위한 교육과 시간이 많이 소요되는 미세 제조 방법을 필요로합니다. 또는, 시판되는 이식형 커프 전극은 상당히 높은 비용으로 구입할 수 있다. 이 프로토콜에서는, 우리는 쥐에 사용하기 위한 작고 만성 이식가능한 말초 신경 개근 전극의 건설을 위한 간단하고 저렴한 방법을 제시합니다. 우리는 케타민/자일라진 마취쥐의 VNS가 이식 시 및 장치 이식 후 최대 10주까지 헤링-브루어 반사의 활성화와 일치하는 호흡 속도의 감소를 생성한다는 것을 입증함으로써 커프 전극의 단기 및 장기적신뢰성을 검증합니다. VNS와 숙련된 레버 프레스 성능을 결합하여 모터 피질 맵 가소성을 유도함으로써 만성 자극 연구에 사용하기 위한 커프 전극의 적합성을 더욱 입증합니다.

미주 신경 커프 전극 및 헤드캡은 이전에 발표된 수술 절차에 따라 쥐에 만성적으로 이식되었다17,,19,,20,,21, 22.,22 이식 전에, 1 kHz에서 임피던스는 식염수에 잠긴 커프 튜빙으로 커프 리드를 가로질러 측정하였다(임피던스 = 1.2 ± 0.17 kΩ [평균 ±std]; N = 9). 식염수에 2 kΩ 미만임피던스를 가진 커프스만 이식되었습니다. 모든 커프스는 이 기준을 충족했습니다(0/9 소맷부리는 제외). 이식 수술 중, 모든 커프스의 기능적 검증은 Hering-Breuer 반사에 기인하는 혈액 산소 포화도의 자극 유도된 짧은 호흡 중단 및 후속 투하를 위한 시험을 통해 수행되었습니다. 이러한 반응을 불러일으키기 위해, ...

작은 설치류에 사용하기 위해 만성 이식형 말초 신경 소맷전극을 구축하기 위한 기존 접근 법은 종종 특수 장비 및/또는 고도로 훈련된 인력이 필요합니다. 이 프로토콜에서 우리는 만성 이식형 커프 전극을 제작하기위한 간단하고 저렴한 접근 방식을 시연하고 쥐의 미주 신경 자극 (VNS)에 대한 효과를 보여줍니다.

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. ...

말초 신경 자극은 염증성 질환 및 신경 질환을 포함한 다양한 질병에 대한 치료제로서 점점 더 조사되고 있습니다. 작은 실험실 동물을 위한 만성 이식형 말초 신경 개근 전극의 건설은 시간이 많이 걸리고 비쌀 수 있습니다. 이 프로토콜은 쥐에서 사용하기 위해 만성적으로 이식 할 수있는 말초 신경 자극 전극을 구성하기위한 간단하고 저렴한 비용 접근 방식을 설명합니다.이 방법은 매우 소수의 쉽게 접근 할 수있는 재료와 공급과 장치의 비용과 인력 및 장치 조립을 훈련하는 데 필요한 시간을 모두 줄이는 유사한 기술에 비해 위험하거나 기술적으로 요구되는 단계의 감소가 필요합니다. 이 기술은 뇌졸중 회복 또는 메트로 기능 장애의 다른 유형 동안 만성 라스베가스 신경 자극의 효과를 테스트 하는 전임상 연구를 가능하게 하기 위해 설계 되었습니다. 커프 튜빙을 준비하여 시작합니다.면도날을 사용하여 2.5mm 의 폴리머 튜브 조각을 잘라냅니다. 그런 다음 튜브를 통해 종이 클립이나 힘 팁을 삽입하고 커프의 한쪽에 튜브의 벽을 통해 세로 미끄러. 튜브에서 집게를 제거하고 커프의 중간선을 통해 큰 바느질 바늘을 삽입합니다.나머지 조립 단계 동안 커프를 제자리에 고정하기 위해 폼 보드에 바늘을 놓습니다. 이식 중에 커프 클로저를 고정하기 위한 봉합사를 배치하여 한쪽의 상단 슬릿에서 약 5밀리미터 떨어진 미드라인의 커프스 벽을 통해 작은 바느질 바늘을 삽입한다. 그런 다음 바늘의 눈을 통해 6 개의 봉합사의 2 센티미터를 삽입하고 튜브의 벽을 통해 바늘을 당겨 봉합사를 커프스에 실어 냅니다.튜브 벽을 통해 두 번째 구멍을 뚫는 것은 커프의 중간선을 따라 첫 번째 구멍 아래 약 5 밀리미터 를 가리킵니다. 바늘의 눈을 통해 봉합사를 삽입하고 튜브 벽을 통해 바늘을 당깁니다. 낮은 구멍에서 연장봉합사의 짧은 끝에 소량의 UV 경화 접착제를 적용하고 낮은 꼬리가 튜브의 외벽과 거의 플러시 될 때까지 더 긴 봉합사 끝을 당깁니다.그런 다음 UV 지팡이로 접착제를 치료합니다. 이 과정을 반복하여 커프의 반대편에 다른 봉합사를 배치합니다. 다음으로 플래티넘 이리듐 와이어 리드가 있습니다.커프 벽에 네 개의 구멍을 만들기 위해 작은 바느질 바늘을 사용합니다. 그런 다음 봉제 바늘을 다시 삽입하고, 이번에는 첫 번째 리드 홀을 통해 외부에서 내부로 작업합니다. 바늘의 눈을 통해 7.5 센티미터 백금 이리듐 와이어의 약 점 5 센티미터를 삽입하고 커프 벽을 통해 와이어 리드를 스레드 튜브를 통해 바늘을 당깁니다.약 4.5센티미터가 커프의 외부 쪽에 확장되도록 와이어를 조정합니다. 첫 번째 리드 구멍을 통해 바늘을 다시 삽입한 다음 두 번째 리드 홀을 통과합니다. 바늘의 눈을 통해 와이어의 짧은 끝의 5 센티미터 점을 삽입하고 커프 벽을 통해 와이어 리드를 스레드 튜브를 통해 바늘을 당깁니다.세 번째 및 네 번째 리드 구멍을 통해 와이어를 스레드하는 프로세스를 반복합니다. 부탄 라이터를 사용하여, 조심스럽게 두 번째와 네 번째 리드 구멍에서 연장 와이어의 5 ~ 6 밀리미터에서 절연을 제거 한 다음 부드럽게 와이어의 절연 되지 않은 부분이 구멍으로 플러시 될 때까지 첫 번째 구멍에서 연장 와이어의 끝에 당겨. 다른 리드와 함께 이 것을 반복하여 세 번째 및 네 번째 리드 구멍을 통해 나사로 연결된 와이어의 절연되지 않은 끝을 정렬합니다.첫 번째 및 세 번째 리드 홀에서 커프의 외부 측의 와이어 루프에 소량의 UV 경화 접착제를 적용합니다. 그런 다음 UV 지팡이를 사용하여 접착제를 치료하고 리드를 제자리에 고정시하십시오. 작은 파이펫 팁을 사용하여 절연되지 않은 와이어 리드를 커프의 내부 벽에 밀어 넣습니다.와이어의 1밀리미터 꼬리를 커프의 외부 표면에 평평하게 당기고 함께 짧게 하지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 소량의 UV 접착제를 적용하여 두 개의 꼬리를 덮고 치료하십시오. 폼 보드에서 커프 어셈블리로 큰 바늘을 제거합니다.바늘의 눈을 통해 6 0 봉합사의 3 센티미터 길이를 삽입하고 중간 점에서 커프의 바닥을 통해 봉합사를 스레드 튜브를 통해 바늘을 당깁니다. 변형, 튜브 및 와이어 리드를 피하기 위해 내부에서 외부로 작동하는 동일한 중간 구멍을 통해 작은 재봉 바늘을 삽입합니다. 그런 다음 바늘의 눈을 통해 봉합사의 외부 꼬리를 삽입하고 커프 스프 벽을 통해 바늘을 당겨 커프의 가장자리 주위에 봉합사의 루프를 만듭니다.봉합사의 끝과 커프의 외부 쪽에 반 매듭을 묶어 커프의 반대쪽 끝 주위에 두 번째 루프를 만듭니다. 튜브에 대해 매듭을 평평하게 유지하면서 소량의 UV 접착제를 반 매듭에 적용하여 치료하십시오. 봉합사 실의 끝을 가능한 한 매듭에 가깝게 조심스럽게 잘라냅니다.그런 다음, 부탄 라이터를 사용하여 각 백금 이리듐 와이어 리드의 끝에서 약 3밀리미터에서 절연을 제거합니다. 골드 핀의 컵 면을 각 리드의 절연되지 않은 끝으로 납땜합니다. 이식 테스트를 진행하기 전에 조립 된 커프가 1 킬로 헤르츠에서 2 킬로 미만의 임피던스를 가지고 있는지 확인하기 위해 조립 된 장치의 임피던스.헤드 캡을 조립하고 원고 방향에 따라 커프 전극을 이식 한 후 쥐가 깨어있는 동안 미주 신경을 자극합니다. 이식된 헤드 캡을 통해 자극 발생기에 쥐를 연결하고 자극 설정을 조정합니다. VNS 유도 모터 피질 맵의 재구성을 위해, 15개의 격면 펄스의 단일 열차를 제공하며, 각각 100 마이크로초의 폭을 자랑하며, 30 헤르츠의 주파수에서 800 마이크로 암페어의 진폭을 제공합니다.자극 열차는 10분, 30분 동안 각 레버 프레스를 감지한 직후 에 전달됩니다. 오실로스코프를 사용하여 전류 자극의 성공적인 전달을 모니터링합니다. 이 프로토콜은 쥐의 미주 신경 커프 전극 및 머리 캡을 만성 적으로 이식하는 데 사용되었습니다.이식 하는 동안, 모든 커프스의 기능 검증 은 혈액 산소 포화도에 있는 VNS 유도 된 낙하에 대 한 테스트에 의해 수행 되었다. 이 반응을 연상시키기 위해, 30 헤르츠 펄스의 10 초 열차, 각각 100 마이크로 초의 폭, 그리고 800 마이크로 앰프의 진폭은 커프 리드에 걸쳐 전달되었다. 모든 커프의 경우, 10초 이상의 자극 기간 동안 VNS 유도 호흡 중단을 관찰했으며, 이는 적어도 5%의 혈액 산소 포화도 저하와 함께 커프 기능 및 적절한 이식을 확인하였다.장치의 장기 기능을 테스트하기 위해, 쥐는 이식 후 6 주 마취되었고 VNS가 다시 적용되었습니다. 9개의 장치 중 7개에 대해, 자극의 크기는 혈액 산소 포화도의 변화를 불러 일으켰으며, 초기 이식시 관찰된 것과 다르지 않았으며, 이는 우수한 성능을 지속했다는 것을 시사한다. 나머지 두 장치는 자극 진폭을 1.6 밀리암페어로 증가시켜 이러한 장치가 계속 작동한다는 것을 시사하는 적어도 5 %의 혈액 산소 포화도의 신뢰할 수있는 감소를 불러 일으키기에 충분했습니다.그러나 임피던스, 신경 손상 또는 커프 방향의 변화로 인해 성능이 저하되었을 수 있습니다. 만성 이식 장치의 장기 기능을 추가로 테스트하기 위해 두 번째 쥐 그룹은 숙련 된 도달 레버 프레스 작업의 단순화 된 버전에 대해 훈련되었습니다. 쥐는 레버를 완전히 누르고 2 초 이내에 해제하기 위해 훈련 부스 밖에서 2 센티미터에 도달해야합니다.미주 신경 자극이 작업 관련 모터 맵 표현의 확장을 유도한다는 것을 보여주는 이전 연구와 일치, VNS 처리 쥐는 Sham 처리 쥐보다 훨씬 더 큰 근위 앞다리 표현을 나타냈다. 이 프로토콜은 다른 실험실 종이나 다른 말초 신경 부위의 만성 자극 실험을 수용하기 위해 쉽게 적응 할 수 있습니다. 예를 들어.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 만성 신경 기록 전극을 이온 주입하는 과정을 배우고있는 외과의에 대한 유용한 정보를 제공합니다. 관통 및 표면 양쪽 전극 시스템을위한 기술은 쥐 동물 모델에 설명되어 있습니다.

단일 유닛 활동과 Electrocorticographic 신호를 녹음하기 위해 만성 신경 전극 외과 이식

출처: Sanchez, CA, et al. 쥐의 만성 이식을 위한 말초 신경 자극 전극의 준비. J. Vis. 경험. (2020).이 비디오는 깨어 있는 쥐의 미주 신경 자극을 보여줍니다. 만성 말초 신경 커프 전극을 이식하고 레버 누르기 작업을 훈련받은 쥐는 이식된 헤드 캡을 통해 자극 발생기에 연결됩니다. 미주 신경은 레버를 성공적으로 누를 때마다 즉시 자극되어 운동 지도가 확장됩니다.

쥐에게 만성적으로 이식된 말초 신경 커프 전극을 통한 미주 신경 자극

이 비디오는 무선 양방향 다채널 전극 장치를 쥐의 뇌에 이식하여 다채널 신경망을 기록하고 자극하는 절차를 보여줍니다.

쥐의 뇌에 무선 양방향 미세전극 시스템 이식

무선, 멀티 채널 신경 녹음 및 자유롭게 쥐 행동에 자극에 대 한 양방향 시스템 도입. 시스템은 가볍고 콤팩트, 따라서 animal´s 행동 레 퍼 토리에 최소한의 영향을 미치고. 또한,이 양방향 시스템 두뇌 활성화 패턴 및 행동 간의 인과 관계를 평가 하는 정교한 도구를 제공 합니다.

무선, Vivo에서 녹음 하 고 자유롭게 행동 하는 쥐에서 신경 활동의 자극에 대 한 양방향 인터페이스

이 상세한 프로토콜 transcranial 전기 자극 자유롭게 이동 하는 쥐에서의 단기 및 장기 효과 조사 하기 위하여 측 뼈에 transcranial 자극 전극 배치를 설명 합니다.

만성 Transcranial 전기 자극 및 쥐 Intracortical 녹음

아래에 기재된 것은 자유롭게 움직이는 쥐에서 만성 전기생리학적 기록을 위해 해부학적으로 먼 뇌 영역에 걸쳐 다중 폴리머 전극 어레이를 이식하는 방법이다. 준비 및 외과 이식은 다른 종에서 사용하기 위해 이러한 방법의 적응을 안내하는 디자인 원칙에 중점을 두고 자세히 설명됩니다.

다중 유연한 폴리머 전극 어레이의 만성 이식

이것은 말초 신경을 위한 무선 전원 인터페이스의 외과적 이식 및 작동을 위한 프로토콜입니다. 우리는 쥐의 좌골 신경이나 횡격막 신경에 배치된 신경 자극기의 예를 통해 이 접근법의 유용성을 입증합니다.

말초 신경 인터페이스를 위한 배터리가 필요 없는 무선 시스템의 이식 및 제어

이 프로토콜은 생체외 전기생리학적 자극을 위한 래트 전체 좌골 신경 조직의 제조를 기술하고, 환경적으로 조절된, 두 구획, 관류 식염수 욕조에서 기록한다.

Ex Vivo 신경 생리학을위한 쥐 좌골 신경의 제조

우리의 목적은 epimysial electromysial electromyography 전극의 제조 및 테스트에 대한 업데이트되고 따라하기 쉬운 가이드를 제공하는 것이었습니다. 이를 위해 재료 소싱에 대한 지침과 제조 및 테스트 프로세스에 대한 자세한 안내를 제공합니다.

저비용 Epimysial Electromysial Electromyography Electroode 개발: 제조 및 테스트를 위한 간소화된 워크플로우

우리는 전극 제조를 위한 간단하고 비용 효율적인 접근 방식을 개발했으며 자유롭게 움직이는 마우스에서 여러 영역에 걸쳐 신호를 기록했습니다. 다중 지역 전기 생리학 및 칼슘 신호 기록과 함께 광유전학을 활용하면 발작 점화 모델에서 여러 지역의 신경 활동을 밝힐 수 있었습니다.

Multi-Region In vivo Recording을 위한 유연하고 편리한 전기생리학적 Optrodes를 제작하기 위한 통합 방법

학습하세요 쥐에서 만성 이식 가능한 말초 신경 커프 전극을 제작하는 간단하고 저렴한 방법을. 이 기술은 뇌졸중 회복 연구를 위한 미주 신경 자극(VNS) 전임상 연구에 활용됩니다.

쥐에서 만성 이식을 위한 말초 신경 자극 전극의 준비

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