Name: 실시간 세포 분석을 사용하여 호스트 외부인플루엔자 바이러스 생존 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 학습하세요 실시간 전기 임피던스 모니터링을 이용한 감염 세포 내 바이러스 입자 정량화 방법을. 이 기술은 MDCK 세포에서 인플루엔자 A 바이러스 생존율을 정밀하게 측정하여 환경 조건이 바이러스 안정성에 미치는 영향을 분석합니다.

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적절한 생체 안전 수준 요구 사항 (BSL-2 이상 하위 유형에 따라) 모든 인플루엔자 바이러스를 처리하십시오. 낮은 통로 기록 (MDCK 세포에 5 배 미만)을 가진 IAV 균주를 사용하여 실험 사이의 낮은 변화를 보장하십시오.
1. 시약 및 시작 재료의 준비
<ol><li>MDCK 세포 및 멸균 세포 배양 배지의 준비<ol>
<li>10% 열 불활성 태아 종아리 혈청(FCS) 및 항생제(100단위/mL 페니실린, 100 mg/mL 연쇄절제술)로 보충된 변형 독수리 의 매체(MEM)에서 Madin-Darby Canine 신장(MDCK) 세포를 육성합니다.</li>
		<li>해동 후, MDCK 세포를 감염시키기 전에 적어도 2배 이상 완전한 회복을 보장합니다(그러나 세포 표현형의 드리프트를 피하기 위해 30개 미만의 통로).</li>
		<li>종자 75cm2 조직 배양 플라스크(s)는 7.5 x 106 MDCK 세포와 함께 멸균 1x MEM30mL을 함유하고 가습 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>임피던스 모니터링 장비 준비<ol>
<li>인큐베이터에 계측기를 35°C로 놓고 2시간 이상 따뜻하게 해보도록 합니다.</li>
		<li>인큐베이터 외부에 배치된 제어 장치에 연결합니다.</li>
		<li>실험의 나머지 부분을 시작하기 전에 제조업체에서 권장하는 대로 세척 절차를 진행합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MDCK 셀에 IAV 주식 생산<ol>
<li>H1N1 바이러스를 전파하고 증폭하기 위해, 종자 7.5 x 106 MDCK 세포는 75cm2 조직 배양 플라스크에 24시간 동안 37°C에서 24시간 동안 배양하여 90%-100% 합류에 도달한다.</li>
		<li>75cm2 플라스크에서 세포 단층으로부터 세포 배양 배지를 데산한다. 멸균 1x PBS의 5mL로 세포를 씻으시다.</li>
		<li>PBS를 제거하고 1x PBS5mL을 추가하여 세포를 다시 세척합니다.</li>
		<li>단일 레이어에 15mL의 바이러스 전파 매체(0% FCS가 있는 1x MEM)를 추가하기 전에 한 플라스크를 컨트롤로 표시하고 PBS를 제거합니다. 인큐베이터에서 이 플라스크를 5% CO2로 35°C로 유지하여 배양합니다. 3일간의 전파 후 비교에 사용하십시오.</li>
		<li>RT에서 IAV 주식의 1유리병을 해동하여 바이러스 전파 매체를 포함하는 1.5mL 튜브(0% FCS를 가진 1x MEM)에서 적절한 농도로 바이러스를 희석시희석한다.</li>
		<li>75cm2 플라스크에서 1x PBS를 제거하고 세포 단층층에 희석 바이러스의 1mL을 추가하여 세포당 1 x 10-3 또는 1 x 10-4 플라크 형성 단위의 감염(MOI)의 복합성에서 MDCK 세포를 감염시 감염(MOI)을 감염시 감염시 감염(MOI)을 감염시 1mL를 첨가한다.</li>
		<li>15분마다 정기적으로 플라스크를 교반하여 RT에서 45분 동안 MDCK 세포에 흡착 바이러스를 흡착합니다.</li>
		<li>무분뇨를 부드럽게 제거하고 1 μg /mL TPCK-trypsin (트립신 / L-1 - 토실아미드 - 2-페닐을 포함하는 플라스크 당 바이러스 전파 매체의 15 mL을 추가 아틸 클로로메틸 케톤), 바이러스 헤마글루티닌 HA0을 HA1 및 HA2 서브유닛으로 절단하기 위해(내도막과 HA 융합에 필요한 이벤트 및 바이러스 게놈의 방출)22.</li>
		<li>플라스크를 35°C 및 5% CO2 에서 바이러스를 복제하기 위해 적어도 3일 동안 배양한다.</li>
		<li>40x 배율에서 현미경하에서 MDCK 세포를 관찰하고 세포에 세포 병증 효과 (CPE)를 찾습니다 (세포 제어 플라스크와 비교하여). CPE가 완전하지 않은 경우(즉, 세포의 약 80%가 기판에서 분리됨), 플라스크를 인큐베이터에 다시 넣어 24시간 추가로 한다.</li>
		<li>CPE가 완료되면 세포 배양 상류체 및 원심분리기를 300 x g 에서 10분 동안 셀룰러 이물질을 펠릿으로 장식합니다.</li>
		<li>15mL 튜브 및 알리쿼트 자손 바이러스를 일회용 멸균 극저온 바이알로 분리한다. 동결 및 재고 바이러스를 위해 즉시 냉동 튜브를 -80 °C에 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 세포 감염에 적합한 세포 수량 의 결정
참고: 모든 실험 에서 포장에서 종이 랩과 같이 항상 정전기가 아닌 표면에 플레이트를 유지합니다. 전자 마이크로티터 플레이트(E-Plate로 설계)에서 종향되는 세포의 가장 적절한 농도를 결정하기 위해 아래 섹션 2를 따르십시오.
<ol><li>75cm2 플라스크에서 MDCK 세포를 준비하여 실험 전에 24시간 신선하게 분할된 세포(약 80%의 합류)를 얻습니다.</li>
	<li>1x PBS5mL로 셀을 세척하고 0.25% 트립신-EDTA 용액의 3mL를 추가하여 분리합니다.</li>
	<li>7mL의 신선한 세포 배양 배지를 추가하고 trypan blue 염색기능이 있는 자동 셀 카운터를 사용하여 셀을 계산합니다.</li>
	<li>세포 배양 배지로 세포 농도를 400,000 세포/mL로 조정합니다. 200,000의 세포 밀도를 얻기 위하여 추가 관에 있는 2 배 직렬 희석을 수행합니다; 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; 및 6,250 세포 /mL. 세포 유형 및 성장 거동에 따라 세포의 희석 범위를 조정합니다.</li>
	<li>전자 플레이트(재료 표)를 RT에 몇 분 간 두고 다중 채널 파이펫을 사용하여 각 웰에 100 μL의 세포 배양 매체를 추가합니다. 전자 플레이트의 전극을 만지지 마십시오.</li>
	<li>요람의 잠금을 해제하고 임피던스 측정 기기 (재료의 표)의 요람 주머니에 플레이트 프론트 엔드를 삽입합니다. 인큐베이터의 문을 닫습니다.</li>
	<li>소프트웨어를 엽니다.<ol>
<li>"기본 실험 패턴 설정"에서 선택한 요람을 선택하고 상단 페이지에서 두 번 클릭한 다음 실험 이름을 입력합니다. "레이아웃"을 클릭하고 플레이트의 각 선택 된 우물에 필요한 샘플 정보를 입력; 그런 다음 완료되면 "적용"을 클릭합니다. "일정" | 클릭 "단계" | "단계 추가". 이 소프트웨어는 자동으로 배경 임피던스 (CI)를 측정하기 위해 1의 단계를 추가합니다.</li>
		<li>"실행" 탭에서 "시작/계속"을 클릭합니다. "플롯"을 클릭하고, 적절한 우물을 선택하여 모든 샘플을 추가하고 CI가 -0.1에서 0.1 사이인지 확인한 후 다음 단계로 진행합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>요람에서 접시를 제거합니다.</li>
	<li>각 셀 현탁액의 100 μL을 2.4 단계에서 복제하여 적절한 우물과 100 μL의 세포 매체를 대조군으로 사용한다. 우물 의 바닥에 세포의 균일 한 분포를 허용하기 위해 RT에서 30 분 동안 라미나르 흐름 후드에 E 플레이트를 둡니다.</li>
	<li>E 플레이트를 요람 주머니에 넣습니다. "일정" | 클릭 소프트웨어에서 "단계 추가"를 입력하고 값을 입력하여 200회 반복을 위해 30분마다 셀을 모니터링합니다. 그런 다음 "시작/계속"을 선택합니다.</li>
	<li>소프트웨어의 "플롯" 버튼을 클릭하여 CI 데이터를 확인하고 플롯합니다. 바이러스 감염 중 성장 단계에 있는 세포를 얻기 위하여, 플레이트에 파종 한 후 정지 단계 24 h 직전에 세포의 농도를 선택합니다. CI가 최대일 때 고정 단계에 도달합니다.</li>
</ol>3. CIT50 값과 감염의 복합성 사이의 상관 관계
<ol><li>E 플레이트의 각 웰에 멸균 1x MEM 배양 배지 100 μL을 추가합니다. 35°C에서 기기의 요람 주머니에 E 플레이트를 삽입합니다. 2.7 단계에서 설명된 대로 배경을 측정합니다.</li>
	<li>요람에서 E 플레이트를 제거합니다.</li>
	<li>종자 3 x 104 전자 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 갓 분할 MDCK 세포와 IAV 감염 중 복제 단계에 있도록 5 % CO2 와 35 ° C에서 24 시간 동안 성장.</li>
	<li>H1N1 바이러스의 알려진 6 log10 TCID50/mL 티터의 다른 10배 희석제로 MDCK 세포를 감염시키고, 아래 단계를 수행하여 재현성을 위해 역피팅을 사용하십시오.<ol>
<li>FCS가 없는 MEM의 100 μL을 가진 MDCK 세포 2x를 헹구는 (바이러스 전파 매체). 접종의 추가 희석을 피하기 위해 두 번째 세척 후 모든 미디어를 제거하십시오.</li>
		<li>단일 채널 파이펫을 사용하여 각 웰에 100 μL의 바이러스 현탁액을 추가합니다. 오염을 방지하려면 왼쪽에서 오른쪽으로 시작한 다음 플레이트의 위쪽에서 아래쪽으로 진행하면서 나머지 우물을 뚜껑으로 덮습니다.</li>
		<li>35°C에서 기기의 요람 주머니에 플레이트를 삽입합니다. 오염으로 이어질 가능성이 있는 갑작스런 움직임을 피하기 위해 부드럽게 하십시오.</li>
		<li>2.10 단계에서 설명된 바와 같이 적어도 100시간 동안 15분마다 세포 임피던드를 모니터링하기 시작합니다.</li>
		<li>측정의 두 주기 후 (즉, 30 분), "실행"탭에서 "일시 중지"를 클릭하여 장치를 일시 중지하고 요람에서 전자 플레이트를 제거합니다.</li>
		<li>바이러스 전파 매체에 1 μg/mL TPCK-트립신을 추가하여 바이러스 헤마글루티닌을 절단합니다.</li>
		<li>TPCK-트립신이 들어있는 바이러스 전파 매체 100μL을 각 우물에 넣고 전자 플레이트를 요람 주머니에 삽입합니다.</li>
		<li>"실행" 탭에서 "시작/계속"을 클릭합니다. 참고: 바이러스 성 현탁액을 바이러스 전파 매체로 대체하여 모의 감염 세포에 해당하는 부정적인 제어를 만드는 것을 잊지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. IAV 생존 운동
<ol><li>IAV를 35°C에서 식염수에 노출시키고 세포 임피던스 감소를 측정하여 시간이 지남에 따라 감염성을 테스트합니다.<ol>
<li>증류수에 35g/L의 최종 농도에 NaCl을 추가하여 식염수 증류수를 준비합니다. 식염수 900μL을 2mL 냉동튜브에 넣습니다.</li>
		<li>식염수에 바이러스 성 육수 100 μL을 추가하고 1 시간, 24 시간 또는 48 h에 대한 인큐베이터 (35 ° C, 5 % CO2)에 냉동 튜브를 배치합니다.</li>
		<li>16개의 잘 미세화판에 갓 분할된 MDCK 세포의 100 μL(3 x 104 함유)을 종자 100 μL(3x 104 함유)으로 37°C 및 5% CO2에서 24시간 동안 자랍니다.</li>
		<li>3.4항을 반복하여 재현성을 위한 역피 파이펫팅 방법을 사용하여 노출된 바이러스(배양 매체에서 이전에 희석된 10배)의 100μL를 가진 세포를 감염시보라고 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>적어도 100 시간 동안 15 분마다 세포 임피던드를 모니터링하십시오.</li>
</ol>5. 감염손실 평가
<ol><li>CIT50 값을 가진 바이러스 유발 세포 요법 효과로 인해 CI 감소를 정량화하기 위한 CIT50 값의 결정.<ol>
<li>"플롯"을 클릭하고 "모두 추가"를 클릭하여 모든 샘플을 추가합니다. "실험 정보 내보내기"를 클릭하여 결과를 스프레드시트로 내보냅니다. 초기 CI를 노출된 바이러스에 의해 세포 감염 후 5시간 측정된 세포 임피던스 값으로 고려하십시오(즉, 마이크로티터 E 플레이트에 MDCK 세포를 파종한 후 24시간).</li>
		<li>초기 CI에서 50 % 감소를 측정하는 데 필요한 시간에 해당하는 CIT50 값을 계산합니다. CIT50 값을 계산하려면 각 샘플에 대해 CI 값을 5hpi로 기록합니다. 그런 다음 스프레드시트에서 인덱스 및 일치 함수를 사용하여 CI 값이 5hpi에서 CI 값의 절반과 동일한 시간점을 찾습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>평균 불활성화 경사 계산<ol>
<li>노출된 각 바이러스 현탁액에 대한 CIT50 값을 서로 다른 노출 시간(일)에 결정합니다.</li>
		<li>CIT50 플롯값에서 선형 회귀 경사를 계산하여 비활성화 경사라고 하며 CIT50.day-1로 표현됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

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RTCA는 세포 준수, 증식, 마이그레이션 및 세포 독성과 같은 세포 특성의 실시간 모니터링에 점점 더 많이 사용되는 임피던스 기반 기술입니다. 이 연구에서는, 호스트 외부의 IAV 생존을 평가하는 이 기술의 능력은 바이러스 불활성화 경사를 측정하여 입증된다. TCID50 및 플라크 애세와 같은 까다로운 기술은 세포 생존가능성에 대한 객관적인 실시간 평가로 대체되므로 바이러스에 의해 유발된 세포병증 효과를 반영합니다. TCID50 또는 플라크 성형 유닛(pfu)과 유사하게, CIT50 은 또한 감염의 복합성(도 2)과 선형적으로 상관관계가 있다. 이 접근법의 한계 중, 이 방법은 비 세포 병원성 바이러스에 감염된 세포를 정확하게 감시하지 못합니다.
예를 들어, 바이러스 게놈으로 새로운 돌연변이의 도입은 바이러스를 강하게 감쇠시키고 그것의 세포 병원성 감소시킬 수 있습니...

바이러스의 전송은 몇몇 요인의 조합에 의존합니다. 환경에서 분비된 바이러스의 경우, 전송은 호스트 외부의 조건에서 지속되는 능력에 따라 달라집니다. 일반적으로 바이러스 성 불활성화를 연구하는 것은, 그러므로, 국가 보건 당국과 정책 입안자가 통제 및 생물 안전 조치를 실행하는 것을 돕는 중요한 단계입니다.
자연 및 실험실 설정에서 바이러스 지속성에 대 한 지식은 지난 10 년 동안 상당히 증가 했다. 인플루엔자 A 바이러스(IAV)의 경우, 이들의 전송 경로는 광범위한 환경 조건에 바이러스 입자를 제출합니다. 구체적으로, 1) 배설구 경로를 통해 물(즉, 조류 바이러스) 또는 2) 오염된 포미트뿐만 아니라 에어로졸 및 호흡기 방울(즉, 가금류 및 포유류 바이러스)에 의한 직접 또는 간접 접촉을 통해 전달될 수 있다. 어쨌든, IAV는 다양한 물리화학적 매개변수(즉, pH, 염분, 온도 및 습도)에 제출되며, 이는 감염성에 다소 빠르게 영향을 미칩니다2,3,4,5,6,7,8,9. 특히 동물노닉 및 전염병 바이러스에 관한 매우 중요하며, 바이러스 역학에 영향을 미치는 환경 요인의 잠재력과 노출 및 종 간 전염의 위험을 평가하는 것이 매우 중요합니다.
지금까지, 전통적인 바이러스학 기술 (즉, 플라크 애스터또는 50% 조직 배양 전염성 용량 추정을 통해 바이러스 성 titer 결정) 시간이 지남에 따라 IAV 감염성을 평가하는 데 사용되었습니다; 그러나 이러한 기술은 시간이 많이 소요되며 많은 공급이 필요합니다10,11,12. 감염된 세포를 마이크로 전극으로 시간이 지남에 따라 임피던드를 측정하는 것은 일반적으로 바이러스 성 불활성화뿐만 아니라 다른 환경 조건에서 IAV 생존을 모니터링하는 유용한 도구역할을합니다. 이 방법은 세포 병증 효과의 주관적인 인간 관찰을 대체하는 객관적인 실시간 데이터를 제공합니다. 그것은 바이러스 적정을 결정하는 데 사용할 수 있습니다, 따라서 낮은 신뢰 간격으로 기존의 측정을 대체하고 노동 집약적 인 엔드 포인트 측정을 피할 수 있습니다.
선형 상관 관계는 세포 임피던드의 측정과 고전적인 플라크 분석또는 TCID50 방법에 의해 얻어진 적정 결과 사이에 존재한다. 따라서, 임피던스 기반 적정 법으로 얻은 데이터는 바이러스의 직렬 희석을 이용한 표준 곡선을 생성하여 TCID50 또는 pfu 값에서 쉽게 변형될 수 있다13,14,15,16,17. 혈청 시료에 존재하는 항체중화의 검출, 정량화 및 효능또한 이러한 실험접근법18,19를 사용하여 달성될 수 있다. 최근에는 임피던스 기반 세포 소가 Equid alphaherpesviruses20에 대한 항바이러스 화합물을 선별하고 평가하는 데 사용되었습니다.
이 기술은 다른 온도에서 식염수에서 IAV의 지속성을 평가하고 환경에서 IAV 지속성을 증가또는 감소IAV의 헤마글루티닌에서 돌연변이를 식별하는 데 사용되었습니다21. 이러한 심사는 전통적인 적정 방법을 사용하는 경우 광범위한 작업이 필요합니다. 그러나, 이 방법론은 세포 형태, 세포 수 및 세포 표면 부착 강도에 영향을 미치는 모든 바이러스에 사용될 수 있다. 또한 다양한 환경 조건(예: 공기, 물 또는 표면)에서 지속성을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.
여기에 설명된 프로토콜은 물에 IAV 생존을 예로 적용합니다. 인간 인플루엔자 바이러스는 장기간 다른 물리화학 적 매개 변수에 노출됩니다. 식염수(35g/L NaCl)의 35°C에서 의 물은 이전 결과에 기초하여 환경 모델로 선택되었다9. 노출된 바이러스의 잔류 감염성은 세포 감염을 통해 상이한 시점에서 정량화된다. IAV 증폭을 위한 기준 세포 형인 MDCK 세포는 마이크로 전광제 센서로 코팅된 16개의 잘 된 마이크로티터 플레이트에 시드되고 24시간 후에 노출된 바이러스에 의해 감염된다. 세포 임피던스는 매 15분마다 측정되고 세포 지수(CI)라고 불리는 임의단위로 표현된다. 인플루엔자 바이러스에 의해 유도된 세포요법 효과는, 그 개시의 비율은 세포 배양에 접종된 전염하는 바이러스성 입자의 수에 직접적으로 의존합니다, CI 감소로 이끌어 내고, 이는 그 후에 CIT50 값으로 정량화됩니다. 이 값은 초기 CI(즉, 바이러스 첨가 전)로부터 50% 감소를 측정하는 데 필요한 시간에 해당합니다. 여러 환경 노출 시간에 대해 계산된 CIT50 값은 CIT50 값의 선형 회귀 후 바이러스의 불활성화 경사를 공제할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.25%Trypsin</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 조직 배양 플라스크</td><td>Falcon</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>E-Plate 16 (6 플레이트)</td><td>ACEA Biosciences, Inc</td><td>5469830001</td><td>E-플레이트는 다양한 패키징에서 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>FCS</td><td>Life technologies (gibco)</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>MEM 1X</td><td>Life technologies (gibco)</td><td>31095029</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Life technologies(gibco)</td><td>14040091</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Life technologies(gibco)</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>TPCK-Trypsin</td><td>Worthington</td><td>LS003740</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence 실시간 세포 분석 기기 S16</td><td>ACEA Biosciences, Inc</td><td>380601310</td><td>xCELLigence RTCA S16 기기는 다양한 형식(16-well, 96-well, 단일 또는 다중 플레이트)으로 제공됩니다.</td></tr></tbody></table>

실시간 세포 분석을 사용하여 호스트 외부인플루엔자 바이러스 생존 모니터링

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

바이러스 입자 정량화에 대한 방법은 많은 바이러스학 연구의 중요한 측면을 나타냅니다. 몇 가지 신뢰할 수 있는 기술이 존재하지만 시간이 많이 걸리거나 작은 변형을 감지할 수 없습니다. 여기에 제출된 것은 감염된 세포의 전기임피던스 변이를 실시간으로 분석하여 바이러스 성 티터의 정확한 정량화를 위한 프로토콜이다. 세포 임피던스는 마이크로 플레이트의 세포 아래에 위치한 금 마이크로 전기 전전자 바이오 센서를 통해 측정되며, 크기는 세포의 수와 크기와 모양에 따라 달라집니다. 이 프로토콜을 사용하면 향상된 감도로 세포 증식, 생존 가능성, 형태 학 및 마이그레이션을 실시간으로 분석할 수 있습니다. 또한 시간이 지남에 따라 바이러스 감염에 영향을 미치는 다양한 물리화학 적 매개 변수 (즉, 온도, 염도 및 pH)에 제출 된 인플루엔자 A 바이러스 (IAV)의 부패를 정량화하여 실용적인 응용 프로그램의 예가 제공됩니다. 이러한 응용 프로그램의 경우 프로토콜은 전염성 바이러스 입자의 정확한 정량화 데이터를 생성하는 동시에 필요한 워크로드를 줄입니다. 그것은 주어진 환경에서 지속 할 수있는 용량을 반영하는 다른 IAV 사이의 불활성화 슬로프의 비교를 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 수행하기 쉽고, 매우 재현 가능하며, 세포 배양에서 세포 병증 효과를 생성하는 모든 바이러스에 적용 될 수 있습니다.

MDCK 세포의 상이한 농도를 가진 120시간 후에 얻어진 원시 데이터는, 15,000에서 120,000세포당, 도 1에 도시된다. 24시간 후, CI 측정은 30,000개의 세포로 시드된 우물의 세포가 여전히 기하급수적인 성장 단계에 있었으며, 이 세포 농도가 추가 실험을 위해 사용되었다는 것을 보여준다. 도 2 는 CIT50 값과 초기 감염 복합성 사이의 선형 상관관계를 보여 줍니다. MDCK 세포는 24시간 동안 배양된 다음 A/Paris/2590/2009 H1N1 바이러스 균주에 감염된 다른 복합성감염으로 감염됩니다. 초기 CI는 감염 후 5시간 측정됩니다.
도 3 은 실험(패널 A)에 사용되는 실험 절차를 보여 줍니다. 바이러스 유발 세포병증 효과로 인해 CI 감소를 나타내는 전형적인 결과는 ...

여기에 보고된 감염한 세포의 전기 임피던스 에 대한 실시간 모니터링을 이용한 전염성 바이러스 입자의 정량화를 위한 프로토콜이 있다. 이 방법의 실용적인 적용은 환경 조건을 모방하는 다른 물리화학 적 매개 변수하에서 인플루엔자 A 바이러스 부패를 정량화하여 제시된다.

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

다양한 입자 정량화를 위한 방법은 대부분의 생물학 연구의 중요한 측면을 나타냅니다. 이 프로토콜을 사용하면 바이러스 성 데이터의 정확한 정량화를 실시간으로 허용합니다. 이 기술은 바이러스 데이터의 전통적인 측정을 대체합니다.객관적인 실시간 데이터를 통해, 우리는 평가된 노동 집약적인 엔드포인트를 피하면서 신뢰 도면에 미치지 못하고 있습니다. 이 방법은 세포 병증 효과를 유도하는 모든 바이러스에 사용할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 실험실 기술자 인 쿠엔틴 그라신 (Quentin Grassin)이 될 것입니다.H1N1 바이러스를 전파하고 증폭하기 위해 표준 프로토콜에 따라 75 평방 센티미터 조직 배양 플라스크에 6 MDCK 세포에 7.5 배 10을 씨앗, 90 ~ 100 %의 합류에 도달하기 위해 섭씨 37도에서 24 시간 동안 세포를 배양. 다음 날, 세척당 플라스크 당 멸균 PBS 5 밀리리터로 세포를 두 번 세척하고 플라스크 를 대조군으로 라벨을 붙입니다. 다음으로, 신선한 바이러스 전파 배지를 함유한 1.5밀리리터 튜브에서 적절한 실험 농도로 인플루엔자 A 바이러스 스톡의 해동 유리병을 희석한다.희석된 주식의 1밀리리터를 사용하여 MDCK 세포를 1배 10의 감염으로 감염하여 음수 3, 또는 1회 10을 셀당 음수 4플라크 형성 단위로 감염시키고, 대조군 플라스크에 바이러스 전파 배지 1밀리리터를 첨가한다. 15분마다 저어주면서 실온에서 45분 동안 바이러스를 세포에 흡착시합니다. 인큐베이션의 끝에서, 접종을 제거하고 HA1 및 HA2 서브 유닛으로 바이러스 헤마글루티닌 HA0의 분열을 용이하게하기 위해 TPCK 트립신의 밀리리터 당 1 마이크로그램으로 보충된 바이러스 전파 매체의 15 밀리리터로 대체한다.그런 다음 플라스크를 섭씨 35도 인큐베이터에 3일 동안 놓습니다. 인큐베이션의 끝에서, 세포에 대한 세포 병증 효과를 평가하기 위해 가벼운 현미경에 40배 의 목표 하에서 각 배양에서 세포를 비교한다. 세포병증 효과가 완료되면 세포 배양 슈퍼나티를 15mm 튜브에 추가하고 원심분리에 의해 각 배양에서 세포 이물질을 수집합니다.이어서, 15밀리리터 튜브로 명확한 바이러스 배양 상수체를 전송하고, 자손 바이러스를 영하 80도 저장을 위한 일회용 멸균 극저온 바이알로 알리쿼트한다. 세포 감염에 적합한 세포 수량을 결정하기 위해 PBS로 세포를 세척하고 플라스크 당 0.25 %의 3 밀리리터에서 45 분 배양으로 수확하기 전에 입증 된 대로 24 시간 약 80 %의 COfluent MDCK 세포 배양을 준비하십시오. 세포가 분리되면 플라스크 당 신선한 배양 배지의 7 밀리리터로 반응을 멈추고 각 배양에서 세포를 계산합니다.세포 배양 배지의 밀리리터 당 5세포에 4배 10번으로 세포를 희석시키고 지시된 바와 같이 세포의 2배 연속 희석을 수행한다. E 플레이트의 전극을 만지지 않고 각 웰에 세포 배양 배지 의 100 마이크로 리터를 추가하기 전에 몇 분 동안 실온에서 전자 플레이트를 놓습니다. 요람의 잠금을 해제하고 임피던스 측정 기기의 요람 주머니에 플레이트 프런트 엔드를 삽입합니다.인큐베이터의 문을 닫고 소프트웨어를 엽니다. 기본 실험 패턴 설정에서 선택한 요람을 강조 표시하고 상단 페이지를 두 번 클릭하여 실험 이름을 입력합니다. 레이아웃을 클릭하고 플레이트의 각 선택된 웰에 필요한 샘플 정보를 입력합니다.일정, 단계 및 단계를 클릭합니다. 이 소프트웨어는 자동으로 배경 임피던스 클릭 실행 및 시작, 계속을 측정하기 위해 1 초 단계를 추가합니다. 플롯을 클릭하고 추가하여 적절한 우물을 선택하여 배경 임피던스가 다음 단계로 진행하기 전에 음수 0.1에서 0.1 사이임을 확인합니다.다음으로, 요람에서 플레이트를 제거하고 각 셀 서스펜션의 100 마이크로리터를 복제하여 적절한 우물에 추가합니다. E 플레이트를 적층 유동 후드에 30분 동안 두어 E 플레이트를 요람 주머니에 적재하기 전에 우물 바닥에 셀을 균일하게 분배할 수 있도록 합니다. 일정 및 단계 추가값을 클릭하고 값을 입력하여 시작, 계속을 선택하기 전에 200회 반복을 위해 30분마다 셀을 모니터링합니다.세포 임피던스 데이터를 확인하고 플롯하려면, 플롯을 클릭하고 바이러스 감염 중 여전히 성장 단계에있는 세포를 얻기 위해 시드 후 24 시간 고정 단계 24 시간 앞에 있는 세포의 농도를 선택합니다. CIT50 값과 감염의 복합성 사이의 상관관계를 결정하기 위해, 4회 갓 분할된 MDCK 세포를 전자 마이크로티터 플레이트의 각 웰로 3배 10배 배양한 후, 세척당 100마이크로리터의 신선한 바이러스 전파 배지로 세포를 2회 세척하고, 각 10개의 마이크로리터에 10개의 마이크로리터를 추가하여 10개의 마이크로리티터를 첨가한다. 모든 바이러스 희석제가 첨가되면 플레이트를 35도의 요람 주머니에 부드럽게 적재하고, 입증된 바와 같이 15분마다 세포 임피던스 모니터링을 시작한다.측정의 두 주기 후, 장치를 일시 중지하려면 클릭하고 요람에서 전자 플레이트를 제거합니다. TPCK 트립신으로 보충된 100마이크로리터의 바이러스 전파 매체를 각 웰에 넣고 E 플레이트를 요람 포켓에 넣습니다. 그런 다음 분석을 시작합니다.인플루엔자 A 바이러스 생존 운동학을 평가하기 위해 증류수의 리터당 35그램의 최종 농도에 염화나트륨을 추가하고, 결과식염수 의 900 마이크로리터를 2밀리리터 저온튜브에 추가합니다. 각 저온 튜브에 100 마이크로리터 바이러스 성 스톡을 추가하고 적절한 실험 기간 동안 35도 섭씨 인큐베이터에 튜브를 배치합니다. 인큐베이션이 끝나기 전날, 종자 3배 10~4차 갓 분할된 MDCK 세포와 16웰 마이크로티터 플레이트당 100마이크로리터의 바이러스 전파 배지를 반복단계로 반복하여, 웰 의 바닥에 있는 세포의 배경 임피던스 및 균일한 분포를 측정할 수 있다.그런 다음 섭씨 37도및 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 세포를 성장시면 됩니다. 다음 날, 세포를 두 번 세척한 다음, 식염수 증류 바이러스의 100 마이크로리터로 세포를 감염시키고, 입증된 바와 같이 신선한 배양 배지에서 10회 희석하고, 적어도 100시간 동안 15분마다 세포 임피던스를 모니터링한다. 여기서, MDCK 세포의 상이한 농도로 120시간 후에 얻어진 원시 데이터가 도시된다.24시간 후, 세포 지수 측정결과, 4세포에 3배 10으로 시드된 우물의 세포가 여전히 기하급수적인 성장 단계에 있었다는 사실이 밝혀졌으며, 따라서 이러한 세포 농도는 후속 실험에 사용되었다. MDCK 세포 배양은 인플루엔자 바이러스에 의한 CIT50과 초기 감염 복합성 사이의 명확한 선형 관계를 입증한다. 전형적인 생존 운동 실험에서 결과는 바이러스 유도 세포 병증 효과로 인한 세포 지수의 감소를 보여줍니다.CIT50은 연구된 환경에서 가장 큰 안정성을 가진 바이러스의 판정을 위해 각 조건에서 각 바이러스에 대한 바이러스 불활성화 경사를 계산하는 데 사용될 수 있다. 바이러스의 안정성은 간접적으로 불활성화 경사와 상관관계가 있으며, 예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스 생존에 관여하는 헤마글루티닌 당단백질내의 아미노산 잔류물이 확인될 수 있도록 한다. 이 기술은 작은 변화에 매우 민감합니다.따라서, 실험 사이에 재현 가능한 결과를 얻기 위해 자동 세포 카운터를 사용하는 것이 좋습니다. 이 방법은 또한 다른 바이러스의 복제를 비교하는 데 사용할 수 있습니다, 한 번에 여러 세포주에 대한 바이러스 트로피즘을 조사, 또는 바이러스 주기의 특정 단계를 연구.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 방법은 높은 감도에 감염된 생쥐들의 bronchioalveolar 세척 (BAL) 유체에서 H1N1의 탐지를위한 적외선 염료 기반 이미징 시스템의 사용을 설명합니다. 이 방법론은 96에서 수행할 수 있습니다 - 또는 판 384 자, 시험 물질 &lt;10 μl 볼륨이 필요하고 여러 병원체의 동시 상영을위한 잠재력을 가지고 있습니다.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

이 비디오에서는 세포 임피던스 분석을 통해 부착 세포의 증식을 포함한 세포 이벤트를 실시간으로 모니터링하는 과정을 보여줍니다. 여기서 접착 셀은 절연체 역할을 하여 전극 사이의 전류 흐름을 제한하고 임피던스를 증가시킵니다.

세포 과정을 실시간으로 모니터링하기 위한 세포 임피던스 기반 분석

이 비디오에서는 CIT50과 바이러스 감염의 다양성 사이의 상관 관계에 대해 논의합니다. 바이러스에 감염된 세포는 세포병성 효과를 나타내어 세포를 사멸시키고 금 미세전극에서 분리되어 임피던스를 감소시킵니다.

인플루엔자 바이러스 감염의 다양성을 측정하기 위한 임피던스 기반 세포 분석

이 비디오는 세포요법 효과를 유도하는 바이러스의 생존 역학을 연구하기 위한 세포 임피던스 기반 기술에 대해 설명합니다. 이 방법은 식염수로 전처리된 바이러스에 감염된 부착 세포의 전기 임피던스를 측정합니다.

바이러스 생존을 평가하기 위한 세포 임피던스 기반 생존 역학 분석

우리는 인플루엔자 A 바이러스가 A549 세포에 부착하는 것과 유세포 분석을 통해 바이러스 입자가 표적 세포로 내재화되는 것을 모두 측정하기 위한 반정량적 방법을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

유동 세포 계측법에 의해 A549 세포의 부착 및 국제화 인플루엔자의 바이러스를 측정

이 연구는 설명   영상 기반의 마이크로 중화 분석은 바이러스의 항원 성 관계를 분석합니다. 이 프로토콜은 평판 스캐너를 사용하고 적정, 적정 정량, 중화, 중화 정량 등 4 단계가있다. 분석은 현재 순환 인플루엔자 A (H1N1) pdm09, A (H3N2)와 B 바이러스와 함께 잘 작동합니다.

정량적 마이크로 중화 분석의 최적화

설명한 quantitate 96 유전자의 표현 하는 방법론 이며 단일 셀 전 비보, 차동의 식별을 위해 허용 하 여 18 표면 단백질 유전자와 감염 되지 않은 세포에 상대적으로 바이러스에 감염 된 세포에 있는 단백질을 표현. 우리는 접근 연구 SIV에 감염 된 CD4+ T 적용 붉은 털 원숭이에서 분리 하는 세포.

단일 셀 정량 mRNA와 유인원 면역 결핍 바이러스에 감염 된 CD4에 표면 단백질 표정+ T 세포 격리에서 붉은 털 원숭이

인플루엔자 A 바이러스 (IAV)는 연간 전염병과 간헐적 인 전염병을 일으키는 전염성 호흡기 병원체입니다. 여기서, 우리는 새로운 재조합 루시퍼라제 및 형광 발현 바이 리포터 IAV(BIRFLU)를 사용하여 생체 내에서 바이러스 감염을 추적하는 프로토콜을 기술한다. 이 접근법은 연구원에게 생체 내에서 IAV를 연구할 수 있는 훌륭한 도구를 제공합니다.

루시퍼라제-형광 리포터 인플루엔자 바이러스 감염 의 실시간 이미징 및 정량화

여기에 제시된 것은 형광 이미징 접근법, D NA, RNA및 protein (MICDDRP)의 궁극적 인 형광 C ell 기반dtection을위한 프로토콜이며, 이는 바이러스 단백질 및 다양한 유형 및 가닥의 핵산의 동시 형광 단일 세포 시각화가 가능한 방법입니다. 이 접근법은 다양한 범위의 시스템에 적용될 수 있습니다.

바이러스 핵산 및 단백질을 시각화하고 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염을 모니터링하기 위한 단일 세포 다중화 형광 이미징

현재 연구는 실시간 세포 분석(RTCA) 시스템을 사용하여 바이러스 감염 중 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)의 변화를 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다.

임피던스 기반 실시간 세포 분석을 이용한 바이러스 감염 시 인간 제대 정맥 내피 세포의 변화 모니터링

여기서 보고된 TCID50 분석법은 라벨 없는 실시간 임피던스 측정과 시스템의 바이러스학 모듈을 활용하여 바이러스 유발 세포병리 효과(CPE)를 실시간으로 객관적으로 모니터링합니다. 이 간소화된 분석법은 직접 손을 대고 작업하는 시간을 크게 줄이면서 고처리량의 정량적 동역학 CPE 측정을 지원하고 자동화된 실시간 TCID50 계산을 가능하게 합니다.

임피던스를 이용한 자동화된 바이러스 역가 정량을 위한 간소화되고 라벨이 없는 실시간 50% 조직 배양 감염 선량(TCID50) 분석법

학습하세요 실시간 전기 임피던스 모니터링을 이용한 감염 세포 내 바이러스 입자 정량화 방법을. 이 기술은 MDCK 세포에서 인플루엔자 A 바이러스 생존율을 정밀하게 측정하여 환경 조건이 바이러스 안정성에 미치는 영향을 분석합니다.

실시간 세포 분석을 사용하여 호스트 외부인플루엔자 바이러스 생존 모니터링

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