조직별 샤페론 상호 작용을 위해 검사하기 위해 Caenorhabditis elegans를 사용

유전적으로 추적 가능한 설계에 대한 다음 실험의 전반적인 목표는 Caenorhabditis elegans를 식별하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 Golan AI 피팅과 같은 사용하기 쉬운 분석과 행동 판독을 결합하여 새로운 조직 특이적 상호 작용을 드러낸다는 것입니다. 스트레스가 없는 배아 동기화를 위해 지렁이 픽을 사용하여 동기화되지 않은 웜 플레이트에서 새로 장착된 NGM 플레이트로 약 100개의 난자를 옮기고 적절한 실험 일정에 따라 동물을 배양합니다.

동물이 알을 낳는 첫날이 되면 박테리아 잔디밭에서 멀리 떨어진 접시에 1ml의 M9 완충액을 천천히 추가하고 완충액이 접시를 완전히 덮도록 접시를 회전시킵니다. 접시를 한쪽으로 기울여 액체를 제거하고 접시에서 동물을 씻습니다. 플레이트에서 모든 벌레를 씻어낸 후 표준 플라스틱 피펫 팁을 사용하여 알이 집중된 곳 주위를 사각형으로 자르고 한천 조각을 새로 장착된 NGM 플레이트에 놓습니다.

동일한 배양 조건에서 계란을 재배하십시오. 부화가 끝나면 접시는 동기화 된 난자로 덮여야합니다. 방금 시연한 것처럼 접시에서 모든 동물을 씻은 후 1ml의 새 M9 완충액을 넣고 세포 스크레이퍼를 사용하여 접시에서 계란을 꺼냅니다.

모든 계란이 분리되면 원심분리를 위해 플레이트의 전체 완충액을 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 튜브를 원심분리하고 상층액을 버립니다. 상층액을 제거한 후 플레이트와 피펫에 최대 1ml의 신선한 M9 완충액을 추가하여 난자를 다시 현탁시킵니다.

방금 시연한 대로 계란을 다섯 번 더 씻습니다. 마지막 세척 후 계란 펠릿이 흰색으로 나타나야 하며 마지막 200마이크로리터의 상등액을 제외한 모든 것을 제거할 수 있습니다. 실험을 위해 동기화된 선충을 배양하려면 약 30개의 알 한 방울을 박테리아 잔디밭과 각 간섭 RNA 시트 플레이트 가까이에 놓고 약 30개의 알 약 30개의 알을 박테리아가 포함된 빈 벡터가 있는 플레이트에 놓습니다.

그런 다음 실험 프로토콜에 따라 적절한 배양 조건에서 동물을 배양합니다. 동기화된 동물의 배아 치사율을 평가하기 위해 동물이 알을 낳기 시작할 때 약 100개의 알을 빈 접시에 옮기고 알을 줄로 펼쳐 계산을 단순화합니다. 24시간에서 48시간 후에 부화하지 않은 알의 비율을 점수화합니다.

참고로, 실험용 동물의 난자를 빈 매개체 대조 박테리아로 처리한 동물의 난자와 비교하십시오. 마비 분석을 설정하려면 동물이 성체가 될 때까지 알을 낳기 시작하기 전에 빈 벡터 제어 박테리아에서 연령 동기화 동물을 배양합니다. 미세한 마커를 사용하여 일반 NGM 한천 접시 뒷면에 선을 긋고 표시된 선에 5-10마리의 동물을 놓습니다.

타이머를 10분으로 설정하고 라인에 남아 있는 동물의 백분율을 마비된 벌레로 평가합니다. 참고로, 이 데이터를 빈 매개체 대조 박테리아에서 자란 돌연변이 동물의 비율과 비교하십시오. 단백질 녹다운(Knockdown) 검증을 위해 250-300개의 동기화된 난자를 관련 이중 가닥 RNA 발현 또는 박테리아가 포함된 빈 벡터가 있는 60mm NGM 간섭 RNA 플레이트에 놓고 적절한 실험 기간 동안 난자를 배양합니다.

배양이 끝나면 총 200마리의 어린 성인 동물을 동물 배양 온도에서 유지되는 200마이크로리터의 PBST가 들어 있는 1.5ml 튜브의 캡으로 옮깁니다. 뚜껑을 조심스럽게 닫고 동물을 1000배 G로 1분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 800마이크로리터의 새 PBST를 튜브에 넣고 웜을 다시 원심분리합니다.

상층액의 상단 900마이크로리터를 조심스럽게 제거하고 방금 설명한 것처럼 신선한 PBST에서 선충을 3번 더 세척합니다. 마지막 세척 후 상층액의 마지막 100마이크로리터를 제외한 모든 것을 제거하고 25마이크로리터의 5X 샘플 버퍼를 동물에 추가합니다. 샘플을 섭씨 92도에서 분당 1000회 회전으로 10분 동안 가열한 후 각 샘플 20마이크로리터를 SDS 페이지 젤에 로드합니다.

그런 다음 적절한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 관심 단백질의 상대적 안정성을 측정하고 농도 측정 소프트웨어를 사용하여 금지 강도를 결정합니다. 발달 과정에서 쓰러진 HSP6는 야생형 동물에서 강력한 발달 정지를 초래합니다. 동시에, 근육 조직에서 야생형 RDE1을 발현하는 근육 특이적 간섭 RNA 균주에서 녹다운된 HSP6는 발달 정지를 일으키지 않습니다.

HSP6는 장 세포에서 야생형 RDE1을 발현하는 장 특이적 RNAI 균주를 무너뜨렸지만, 강력한 발달 정지 및 표현형을 초래했습니다. 따라서 경미한 성장 지연을 유발하는 HSP6 MG585의 돌연변이는 돌연변이된 유전자를 운반하는 균주를 장 특이적 간섭 RNA 균주로 교차시키고 샤페론 간섭 RNA 라이브러리를 스크리닝하여 샤페론 상호작용을 악화시키거나 완화하는 스크리닝에 사용할 수 있습니다. STI1 AHSA1 또는 DAF41 간섭 RNA로 처리된 Myosin 조직 및 UNC45 돌연변이 동물은 네 번째 유충 단계에서 야생형 벌레와 유사합니다.

돌연변이체는 성인이 된 후 교란된 육종을 나타냅니다. 대조적으로, 빈 매개체 대조군으로 처리된 UNC45 돌연변이 동물과 야생형 동물 모두 영향을 받지 않았습니다. 유전적 상호작용은 신체적 상호작용을 나타내지 않습니다.

따라서 확인된 상호 작용의 특성을 검증하고 직접 조사하기 위해 유전적 상호 작용 스크리닝을 사용한 후속 실험을 수행해야 합니다.