Name: 조직별 샤페론 상호 작용을 위해 검사하기 위해 Caenorhabditis elegans를 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 배우세요 Caenorhabditis elegans를 이용한 조직 특이적 샤페론 상호작용 검사 방법을 통해 단백질 기능 장애를 모니터링하는 기술입니다. 이 연구는 유전자 기능과 단백질 안정성 이해에 중요한 통찰을 제공합니다.

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우리는 선충 균주의 일부에 대한 NIH 국립 연구 자원 센터 (NCRR)에 의해 투자 Caenorhabditis 유전학 센터에 감사드립니다. H.F. 엡스타인에 의해 개발된 단클론 항체는 NICHD의 후원하에 개발되고 아이오와 대학 생물학부에 의해 유지된 발달 연구 Hybridoma 은행에서 취득되었습니다. 이 연구는 이스라엘 과학 재단 (278/18) 및 이스라엘 과학 기술부및 외교 국제 협력부, 국가 진흥, 이탈리아 공화국 (제 3-14337 권부)의 보조금에 의해 지원되었습니다. 벤-즈비 연구소 회원들에게 이 원고를 준비하는 데 도움을 주신 것에 감사드립니다.

1. RNAi에 대한 선충 성장 미디어 플레이트의 준비
<ol><li>1 L 병에는 NaCl 3 g, Bacto-Peptone 2.5 g, 17 g의 천및 증류수를 최대 1 L 및 오토클레이브에 추가하십시오.</li>
	<li>55 °C에 병을 냉각.</li>
	<li>1M KH2PO4,pH 6.0, 1 M CaCl2의1mL, 1 M MgSO4의1mL, 콜레스테롤 용액 1mL(표1)의25mL를 추가하여 선충 성장 미디어(NGM)를 만듭니다.</li>
	<li>1mL의 암피실린(100 mg/mL)과 0.5mL의 1M IPTG(표1)를추가하여 NGM-RNAi 용액을 만듭니다. 참고: 일반적으로 사용되는 HT115(DE3) 대장균 균에는 dsRNA-인코딩 플라스미드를 발현하는 데 사용되는 IPTG 유도가능한 T7 DNA 폴리머라아제가 함유되어 있습니다. 이 플라스미드는 또한 암피실린 저항을 위해 인코딩합니다.</li>
	<li>병을 소용돌이에 의해 따뜻한 용액을 섞는다.</li>
	<li>후드 또는 멸균 절차를 사용하여 NGM 용액을 플레이트에 붓거나 연동 펌프를 사용하여 용액을 플레이트에 분배합니다. 이 화면에 는 6웰, 12웰, 40mm 또는 60mm 플레이트를 사용합니다. 한천은 플레이트 깊이의 약 2/3을 채워야 합니다.</li>
	<li>접시를 실온에서 벤치에서 밤새 건조하게 하여 접시를 덮어 두십시오. RNAi용 NGM 플레이트는 최대 한 달 동안 4°C로 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>2. RNAi 박테리아를 재배하고 접시를 파종
<ol><li>후드 또는 멸균 절차를 사용 하 여, 암피실린의 1 mL를 추가 (100 mg/mL) 그리고 2.5 테트라 사이클린의 mL (5 mg/mL)(표 1)LB 용액의 사전 자동 1 L에. 참고: 일반적으로 사용되는 HT115(DE3) 대장균 박테리아는 테트라사이클린 내성입니다.</li>
	<li>후드 또는 멸균 절차를 사용하면 2mL 깊이96웰 멸균 플레이트에 각 웰에 600 μL의 LB 솔루션을 추가하십시오. 미디어를 분배하기 위해 멀티채널 파이펫을 사용하는 것이 가장 좋습니다.</li>
	<li>멸균 절차를 사용하여 HT115 (DE3) 대장균 박테리아로 굴절 된 우물은 dsRNA 인코딩 플라스미드로 변형되어 관심 있는 유전자 또는 빈 플라스미드를 대조군으로 선별합니다. 플레이트를 덮고 하룻밤 사이에 37°C에서 배양합니다. dsRNA를 발현하는 세균클론으로 구성된 라이브러리는, 예측된 C. elegans 유전자의 ~94%에 대응하는 이전에22,23을 시판하고 상용화되었다. 여기에 사용되는 샤페론 도서관은 박사 리처드 모리모토 연구소에 의해 건설되었다26.</li>
	<li>멸균 절차를 사용하여, 12-well, 40mm 및 6-well 또는 60mm NGM RNAi 플레이트에 박테리아의 종자 75, 150 또는 250 μL, 각각. 명확하게 플레이트에 대상 유전자의 이름을 표시합니다. 박테리아는 천 표면의 30-50 %를 커버해야하며 접시의 가장자리를 만지지 않아야합니다.</li>
	<li>플레이트가 실온에서 벤치에서 적어도 2일 동안 건조하여 접시를 덮어 두십시오. 참고 : 플레이트는 하룻밤 사이에 37 °C에서 배양 할 수 있습니다. 플레이트를 사용하거나 보관하기 전에 내부 우물이 건조한지 확인하십시오. 모든 장기적인 목적(즉, 건조 또는 보관)을 위해 플레이트를 어둠 속에서 유지합니다. 건조, 종자 플레이트는 최대 한 달 동안 4 °C에서 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 배아의 스트레스가 없는 동기화
<ol><li>웜 픽을 사용하여 동기화되지 않은 웜 플레이트에서 새로 시드된 NGM 플레이트로 약 100개의 달걀을 이동합니다.</li>
	<li>15°C에서 5일 동안, 20°C에서 3.5일 또는 25°C에서 2.5일 동안 동물을 재배한다. 동물은 계란 누워의 첫 날에 도달해야합니다. 참고: 벌레는 일반적으로 20°C에서 재배됩니다. 그러나, 상이한 보호자 돌연변이 균주는 특정 재배 온도를 요구할 수 있다. 예를 들어, 많은 온도 에 민감한 균주는 15 °C에서 재배되지만 표현형을 노출하기 위해 25 °C로 이동합니다.</li>
	<li>세균 잔디에서 천천히 멀리 M9 버퍼(표 1)의1 mL을 추가합니다. 버퍼가 플레이트를 완전히 덮도록 플레이트를 회전합니다. 그런 다음 한쪽으로 기울어 접시에서 액체를 제거하고 접시에서 동물을 씻어. 참고: 온도에 민감한 동물 이나 보호자 돌연변이를 사용 하는 경우, 동물의 재배 온도에서 프로토콜에 사용 되는 버퍼를 유지 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>3.3을 세 번 반복하거나 모든 동물이 접시에서 씻겨 나갈 때까지 반복하십시오.</li>
	<li>표준 플라스틱 팁을 사용하여 계란이 농축된 세척된 접시에서 한정된 천을 자르고 새로 시드된 NGM 플레이트에 한천 조각을 놓습니다. 참고 : ~ 200 계란은 충분한 계란 누워 동물을 생산하는 데 필요합니다; 너무 많은 동물이 너무 빨리 박테리아를 소비합니다. 낮은 식품 수준은프로테오스타증(27)에영향을 줄 수 있다.</li>
	<li>15°C에서 5일 동안, 20°C에서 3.5일 또는 25°C에서 2.5일 동안 동물을 재배한다. 이 시점에서 플레이트는 동기화된 계란으로 덮여 있어야 합니다. 참고: 동물을 더 엄격한 동기화를 위해 짧은 기간 동안 새 접시로 이동할 수 있습니다. 그러나, 동물이 동기화에 영향을 미치는 그들의 자궁에 있는 계란을 유지할 수 있기 때문에 계란 누워의 초기 단계에서 만 성인을 사용하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>세균 잔디에서 천천히 멀리 M9 버퍼의 1 mL을 추가합니다.</li>
	<li>버퍼가 플레이트를 완전히 덮도록 플레이트를 회전합니다. 그런 다음 한쪽으로 기울어 접시에서 액체를 제거하고 접시에서 동물을 씻어.</li>
	<li>3.7을 세 번 반복하거나 모든 동물이 접시에서 씻겨 나갈 때까지 반복하십시오.</li>
	<li>M9 버퍼 1mL을 추가하고 셀 스크레이퍼를 사용하여 접시에서 계란을 방출합니다.</li>
	<li>플레이트에서 계란을 포함하는 M9 버퍼를 수집합니다.</li>
	<li>2 분 동안 3,000 x g에서 계란을 포함하는 M9 버퍼 원심 분리.</li>
	<li>상체를 제거하고 M9 버퍼를 추가하여 1mL의 부피에 도달합니다.</li>
	<li>계란과 박테리아의 어떤 덩어리를 방해 하기 위해 계란을 다시 중단.</li>
	<li>3.11-3.13 단계에 설명된 세척 절차를 5회 반복한다. 달걀 펠릿은 흰색으로 표시되어야 합니다. 노란색/갈색이면 흰색 펠릿이 얻을 때까지 세척을 반복합니다. 참고: 계란에 남아 있는 박테리아는 dsRNA 표현 박테리아를 오염시킬 수 있습니다.</li>
	<li>대부분의 상체를 제거하여 약 200 μL을 남기고 RNAi 화면에 동기화된 계란을 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 일반적인 표형 에세이
<ol><li>실험 중 동물의 재배<ol>
<li>각 RNAi 시드 접시에 세균 잔디에 가까운 ~ 30 계란의 방울을 놓습니다. 참고로, 빈 벡터 함유(L4440) 박테리아로 시드된 접시에 ~30개의 알을 놓습니다.</li>
		<li>NGM RNAi 시드 플레이트에서 연령 동기화 동물을 육성합니다. 실험의 기간은 동물을 모니터링하는 단계와 재배 온도에 따라 달라집니다. 온도에 민감한 돌연변이 동물을 사용할 때 재배 온도를 조정합니다. 발달 지연 된 돌연변이 동물을 사용할 때 재배 기간을 조정합니다. 참고: 시기는 다를 수 있지만, 동물이 성인기에 도달하면 계란 누워 (그리고 그 결과로 급속한 음식 소비), 뿐만 아니라 연령에 따라 달라 둔 proteostsis 붕괴28,결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 계란 누워의 발병 전에 동물을 득점하는 것이 좋습니다 (성인의 일 1 일). 야생형 동물은 15°C에서 4.5일, 20°C에서 3일 또는 25°C에서 2일 후에 이 단계에 도달한다.</li>
		<li>사용된 반복의 수는 검토된 유전자 세트의 크기에 따라 달라집니다. 샤페론 라이브러리(97유전자)의 경우 실험을 적어도 4번 반복한다. 채우기의 크기는 사용되는 분석에 따라 다릅니다. 여기에서 논의된 행동 적 소에서, 각 반복에서 실험 조건 당 >15 동물을 점수. 데이터 및 통계 분석은 또한 사용되는 분석의 유형에 크게 의존합니다. 여기에 설명된 분석서의 데이터는 SEM을 ± 수단으로 제시될 수 있습니다.</li>
		<li>RNAi 및 빈 벡터 제어 처리 동물을 독립적인 인구로 비교합니다. P 값은 검사된 변경 사항, 즉 단독으로 또는 둘 다를 악화또는 완화하는 변경 사항에 따라 단방향 또는 양방향 ANOVA를 사용하여 계산할 수 있습니다. 단일 RNAi 처리 대 대조군을 검사할 때, P 값은 단방향 또는 양방향 Mann-Whitney 랭크 합계 시험을 사용하여 계산될 수 있습니다. 통계적 유의 이외에 표현형에 미치는 영향 정도에 따라 안타에 대한 임계값을 고려하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>발달 체포/지연<ol>
<li>빈 벡터 함유 대조군 박테리아에서 자란 동물이 성인기에 도달할 때까지 4.1 단계와 같이 나이 동기화 된 동물을 육성하지만 계란 누워가 시작되기 전에.</li>
		<li>스테레오 현미경을 사용하여 동물을 모니터링하고 애벌레와 성인의 수를 계산하여 발달 지연 된 동물의 백분율을 계산합니다. 참고로, 빈 벡터 함유 대조군 박테리아에서 자란 돌연변이 동물과 비교하십시오. hsp-1 또는 hsp-90 RNAi 치료는 야생 형 동물의 발달 체포를 초래하고 긍정적 인 제어로 사용될 수있다.</li>
		<li>시간이 지남에 따라 발달 지연 동물의 퍼센트를 득점하려면 4.2.2 단계를 반복하십시오. 참고: 접시에 계란 누워 성인이 있는 경우, 자손과의 혼동을 피하기 위해 동일한 표적 유전자에 표지된 새로운 NGM-RNAi 플레이트로 발달 지연된 동물을 이송합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>멸균 또는 계란 누워 결함<ol>
<li>빈 벡터 대조균에서 자란 동물이 알을 낳기 시작할 때까지 4.1 단계에서와 같이 노화 동기화 된 동물을 육성합니다.</li>
		<li>스테레오 현미경을 사용하여 동물을 모니터링하고 자궁에 눈에 보이는 계란이없는 동물의 퍼센트를 점수. 참고로 빈 벡터 제어 박테리아에서 자란 돌연변이 동물과 비교하십시오.</li>
		<li>또는, 스테레오 현미경을 사용하여 동물을 모니터링하고 EGg 누워 결함 (Egl-d) 표현형(29)으로정의 계란의 전체 자궁을 가진 동물의 퍼센트를 점수.</li>
	</ol></li>
	<li>배아 치사<ol>
<li>동물이 알을 낳기 시작할 때까지 4.1 단계에서와 같이 나이 동기화 된 동물을 육성합니다.</li>
		<li>~100개의 달걀을 빈 접시에 옮기습니다. 계란을 행으로 펴서 계산을 단순화합니다.</li>
		<li>24-48 시간 후에 접시에 해치지 않은 계란의 백분율을 점수. 참고로, 빈 벡터 대조균으로 치료된 동물의 알과 비교하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>마비 분석<ol>
<li>1일째 성인의 경우, 빈 벡터 대조균에서 자란 동물이 성기에 도달할 때까지 4.1단계와 같이 연령과 동기화된 동물을 육성하지만 계란 누워가 시작되기 전에 재배합니다.</li>
		<li>미세 마커를 사용하여 일반 NGM 한천 플레이트 뒷면에 선을 그립니다.</li>
		<li>표시된 줄에 5-10 마리의 동물을 배치합니다.</li>
		<li>타이머를 설정하고 10 분 기다립니다.</li>
		<li>마비 된 벌레로 라인에 남아있는 동물의 퍼센트를 점수. 참고로 빈 벡터 제어 박테리아에서 자란 돌연변이 동물과 비교하십시오. unc-45 RNAi로 처리된 야생형 동물은 심각한 마비 표현형을 나타내며 양성 대조군으로 사용될 수 있다. 참고 : 이 분석은 중증 마비에 중간을 보여주는 동물을 강조합니다. 이러한 동물들은 보통 일반적인 곡선 모양을 제시하기보다는 접시에 똑바로 놓여 있습니다. 또한, 마비 된 벌레의 머리 주위에 박테리아의 삭제 패치가 볼 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>스래싱 분석<ol>
<li>빈 벡터 대조균에서 자란 동물이 성인기에 도달할 때까지 4.1 단계와 같이 나이 동기화 된 동물을 육성하지만 계란 누워가 시작되기 전에.</li>
		<li>동물의 재배 온도에서 M9 버퍼의 파이프 100 μL을 96 웰 플레이트로 넣습니다.</li>
		<li>M9 버퍼 함유 우물에 잘 1개씩 - 15개의 웜을 배치합니다.</li>
		<li>동물이 5 분 동안 조정하자.</li>
		<li>스테레오 현미경아래 각 동물을 검사하고, 타이머가 15초 카운트다운되고, 각 동물이 해당 기간에 수행하는 신체 굴곡 수를 계산합니다. 계산된 값은 분당 바디 굽힘에 정규화할 수 있습니다. 참고로 빈 벡터 제어 박테리아에서 자란 돌연변이 동물과 비교하십시오. 참고 : 이 운동성 분석은 매우 민감하며 치료 사이의 매우 가벼운 차이를 감지 할 수 있습니다. 그러나, 액체의 운동성과 한천에 운동성 다를 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 단백질 녹다운 의 검증
<ol><li>관련 dsRNA-표현 또는 빈 벡터 함유(L4440) 박테리아와 시드된 60mm NGM-RNAi 플레이트에 250-300개의 동기화된 계란을 놓습니다. 참고: RNAi 녹다운은 배아의 비정상적인 축적, 배아 부족 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 발달 체포의 결과를 초래할 수 있습니다. 이것은 검사될 동물의 나이를 결정할 때 고려되어야 합니다.</li>
	<li>1일성인의 경우, 15°C에서 4.5일, 20°C에서 3일 또는 25°C에서 2일 동안 동물을 재배한다.</li>
	<li>총 200마리의 젊은 성인 동물을 1.5mL 튜브 의 캡에 PBS-T 200 μL로 선택하고 옮기. 참고: 온도에 민감한 동물 이나 보호자 돌연변이를 사용 하는 경우, 동물의 재배 온도에서 프로토콜에 사용 되는 버퍼를 유지 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>캡을 조심스럽게 닫고 원심분리기를 1,000 x g에서 1분 간 닫습니다.</li>
	<li>PBS-T(표1)및 원심분리기 800μL을 1분 동안 1,000 x g에 추가합니다.</li>
	<li>조심스럽게 상단 900 μL을 제거합니다.</li>
	<li>5.4-5.6 단계를 세 번 반복합니다.</li>
	<li>900 μL을 제거하여 200개의 웜을 포함하는 100μL의 용액을 남깁니다.</li>
	<li>5배 샘플버퍼(표 1)의25μL을 추가합니다.</li>
	<li>샘플을 92°C에서 10분 동안 가열하고 1000 rpm에서 흔들어 보입니다. 그런 다음 샘플을 동결하고 -20 °C로 보관 할 수 있습니다.</li>
	<li>각 샘플의 20 μL을 로드하고 SDS 페이지 젤에서 실행합니다.</li>
	<li>단백질의 상대적 안정성을 결정하기 위해 적절한 항체를 사용하여 서양 얼룩 분석을 수행합니다.</li>
	<li>자유롭게 사용할 수 있는 ImageJ 젤 모듈과 같은 밀도 측정 소프트웨어를 사용하여 대역의 강도를 결정합니다. 모든 값을 제어 샘플에서 측정된 값으로 정규화합니다. 참고: 우리의 화면에 RNAi 녹다운의 목표는 특정 보호자/ 공동 보호자의 단백질 수준을 낮추는 것입니다. 따라서, RNAi 녹다운의 효율을 평가하는 가장 좋은 방법은 서부 블롯 분석에 의한 것입니다. 이것은 특정 항체를 요구합니다. 또는 qPCR을 사용하여 mRNA 수준을 정량화할 수 있습니다.</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

프로테오스타증 네트워크의 통합 된 그림은 어떻게 조직되고 다른 대사 세포및 조직에서 기능이 부족한지 반영합니다. 이러한 단점을 해결하기 위해서는 분자 보호자와 같은 이 네트워크의 다양한 구성 요소의 상호 작용에 대한 구체적인 정보가 개발 및 노화 과정에서 특정 조직에서 필요합니다. 여기에서, 우리는 조직 특정 동요의 사용이 주어진 조직에서 chaperone 네트워크를 검토하는 가능하게 하는 방법을 보여주었습니다. 조직 별 보호자 유전 상호 작용을 탐구하기 위해, 세 가지 다른 접근 방식을 고려했다. 첫 번째 접근법에서, UNC-45, 근육 세포에서 높게 표현되는 chaperone는, 먹이-RNAi25를통해 보호자 상호 작용을 위해 스크린하기 위하여 이용되었다. 전문 적인 chaperone의 사용은 안목 조직 특이성을 허용 하는 동안, 그것은 단지 기여 하는 고도로 초점을 맞춘 하위 네트워크에 보고할 수 있습니다. 대부분의 C. elegans 뉴런은 공급 기반 RNAi<s...

세포는 손상된 단백질1,2를수리, 격리 또는 제거하는 품질 관리 기계를 사용하여 단백질 손상에 대처한다. 단백질 복합체의 접이식 및 조립은 분자 보호자에 의해 지원되며, 손상된 단백질을 수리하거나 격리할 수 있는 다양한 보존된 단백질군3,4,5,6,7이지원된다. 손상된 단백질의 제거는 유비퀴틴-프로테솜 시스템(UPS)8 또는자가기계(9)에 의해 중재되어 샤페론10,11,12와공동으로 처리된다. 단백질 항상성(proteostasis)은, 따라서 접기 및 분해 기계로 구성된 품질 관리 네트워크에 의해 유지된다3,13. 그러나 생체 내에서 프로테오스타증 네트워크의 다양한 구성 요소 간의 상호 작용을 이해하는 것이 주요 과제입니다. 단백질 단백질 상호 작용 스크린은 물리적 상호 작용 및 보호자 복합체14,15에중요한 정보를 기여하는 동안, 생체 내의 조직 및 보상 메커니즘을 이해하는 것은 부족합니다.
유전 상호 작용은 종종 공통 또는 보상 생물학적 경로16,17,18에관여하는 유전자의 쌍 사이의 관계를 검사하는 강력한 도구로 사용됩니다. 이러한 관계는 돌연변이 쌍을 결합하고 제2유전자(16)의돌연변이에 의한 현상증 중증도에 대한 한 유전자의 돌연변이의 영향을 정량화함으로써 측정될 수 있다. 대부분의 이러한 조합은 표현형의 관점에서 어떤 효력도 보여주지 않지만, 몇몇 유전 상호 작용은 측정된 표현형의 엄격을 악화시키거나 완화할 수 있습니다. 이중 결실 돌연변이의 표현형이 단일 삭제 돌연변이를 결합할 때 볼 수 있는 예상 표현형보다 더 심각할 때, 두 유전자가 병렬 경로에서 기능한다는 것을 암시하는 경우, 함께 주어진 기능에 영향을 미치는 돌연변이가 관찰된다. 대조적으로, 이중 결실 돌연변이의 표현형이 단일 결실 돌연변이체로 보인 표현형보다 덜 심각할 때, 두 유전자가 복합체로 함께 작용하거나 동일한경로(16,18)에참여한다는 것을 암시하는 경우, 경감 돌연변이가 관찰된다. 이에 따라, 치사, 성장률 및 무리 크기와 같은 광범위한 표현형을 포함하여 정량화될 수 있는 다양한 표현형뿐만 아니라 전사 기자와 같은 특정 표현형이 유전적 상호 작용을 식별하는 데 사용되어 왔다. 예를 들어, Jonikas 등은 ER 스트레스 리포터에 의존하여 쌍방향 유전자 삭제 분석을 이용한 Saccharomyces cerevisiae ER 전개 단백질 반응 프로테오스타시스 네트워크의 상호 작용을검사한다.
유전 상호 작용 스크린은 이중돌연변이20의포괄적인 세트를 생성하기 위하여 체계적으로 쌍으로 삭제 돌연변이를 교차하는 관련시킵니다. 그러나 동물 모델, 특히 C. elegans에서는이 대규모 접근 방식이 실현 가능하지 않습니다. 대신, 돌연변이 균주는 RNA 간섭(RNAi)21을사용하여 유전자 발현을 다운 조절함으로써 그들의 유전 상호 작용 패턴을 위해 시험될 수 있다. C. elegans는 RNAi22,23을기반으로 한 스크린을 위한 강력한 시스템입니다. C. elegans에서,이중 좌초 RNA (dsRNA) 납품은 수많은 조직에 dsRNA 분자의 퍼짐으로 이끌어 내는 세균성 공급에 의해 달성됩니다. 이러한 방식으로, 도입된 dsRNA 분자는 신속하고 간단한절차(21)를통해 동물에 영향을 미친다. RNAi를 이용한 유전 상호 작용 스크린은, 그러므로, RNAi 도서관24를사용하여 유전자 또는 대부분의 C. elegans 코딩 유전자의 세트를 아래로 조절의 충격을 밝힐 수 있습니다. 이러한 화면에서, 관심있는 돌연변이의 동작에 영향을 미치지만 야생 형 변형은 모니터링되는 표현형의 잠재적 인 수정자(25)입니다. 여기서, 우리는 C. elegans에서조직 별 보호자 상호 작용을 체계적으로 매핑하기 위해 돌연변이와 RNAi 스크리닝의 조합을 적용합니다.

<table><tbody><tr><td>12웰 플레이트</td>, <td>SPL</td><td>BA3D16B</td><td></td></tr><tr><td>40mm 플레이트</td>, <td>Greiner Bio-one</td><td>627160</td><td></td></tr>, <tr><td>60mm 플레이트</td>, <td>Greiner Bio-one</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>, Thermo Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>96웰, 2mL, 128.0/85mm</td>, <td>Greiner Bio-one</td><td>780278</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Formedium</td><td>AGA03</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Formedium</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue</td><td>Sigma</td><td>BO126-25G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>1.02382.0500</td><td></td></tr><tr><td>카메라</td><td>Qimaging</td><td>q30548</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>Amresco</td><td>0433-250G</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼</td><td>라이카</td><td>DM5500</td><td></td></tr><tr><td>필터(0.22 &마이크로; m)</td> <td>시그마</td><td>SCGPUO2RE</td><td></td></tr><tr><td>형광 실체 현미경</td><td>Leica</td><td>MZ165FC</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Frutarom</td><td>2355519000024</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Formedium</td><td>367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>1.04873.1000</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Bio-Lab</td><td>001649029100</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher</td><td>22189-08-8</td><td>모리모토 연구소의 선물</td></tr><tr><td>Myosin MHC A (MYO-3) 항체</td><td>Hybridoma Bank</td><td>5-6</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 7H2O</td><td>Sigma</td><td>s-0751</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio-Lab</td><td>001903029100</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Merck</td><td>61930705001730</td><td></td></tr><tr><td>Plate 주입 펌프</td><td>Integra</td><td>does it p920</td><td></td></tr><tr><td>RNAi Chaperone library</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>VWR Life Science</td><td>0837-500</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;- 메르캅토에탄올</td><td>Bio world</td><td>41300000-1</td><td></td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>64-75-5</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Bio-Lab</td><td>002009239100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

조직별 샤페론 상호 작용을 위해 검사하기 위해 caenorhabditis elegans를 사용

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

단백질과 단백질 복합체의 올바른 접이식 및 조립은 세포 기능에 필수적입니다. 세포는 건강한 프로테오아질을 유지하기 위해 손상된 단백질을 정확하거나 격리하거나 제거하는 품질 관리 경로를 사용하여 세포 프로테오스타증을 보장하고 추가 단백질 손상을 방지합니다. 프로테오스타증 네트워크 내의 중복 기능으로 인해 다세포 유기체 인코딩 유전자에서 녹다운 또는 돌연변이를 사용하여 검출 가능한 표현형을 선별하면 대부분의 경우 사소한 또는 표현형이 검출되지 않습니다. 우리는 특정 기능에 필요한 보호자를 식별하고 따라서 표현형과 기능 사이의 격차를 해소하기 위한 표적 선별 전략을 개발했습니다. 특히, 우리는 RNAi 합성 상호 작용 스크린을 사용하여 새로운 보호자 상호 작용을 모니터링, 다운 다운 샤페론 발현, 한 번에 하나의 보호자, 보호자 - 인코딩 유전자에 돌연변이를 운반하거나 관심의 보호자를 과발 현현동물에서. 개별적으로 총 표현형이 없는 두 개의 보호자를 방해함으로써, 우리는 둘 다 혼란할 때 특정 표현형을 악화하거나 노출시키는 보호자를 식별할 수 있습니다. 우리는 이 접근법이 주어진 표현형과 관련되었던 단백질 또는 단백질 복합체의 접기를 조절하기 위하여 함께 작동하는 chaperones의 특정 세트를 확인할 수 있다는 것을 보여줍니다.

UNC-45의 온도 에 민감한 돌연변이를 사용하여 허용 또는 제한 적인 조건에서 상호 작용을 악화또는 완화하기 위해 각각 검사합니다. 근육 조립 및 유지 보수는 조직 별 보호자 상호 작용을 연구하는 효과적인 시스템을 제공합니다. 수축 근육의 기능적 단위인 사컴레는 구조 및 조절 단백질의 결정과 같은 배열을 제공합니다. 모터 단백질 미오신의 안정성과 수축 근육 사혜성의 두꺼운 필라멘트에 의한 은 샤페론및 UPS성분(30)의협력에 달려 있다. 이러한 보호자 중 하나의 예는 주로 체벽 근육31,32,33,34, 35로발현되는 보존 및 전문 묘신 샤페론UNC-45이다. ...

샤페론-샤페론과 샤페론 기판 상호 작용을 연구하기 위해, 우리는 온화한 돌연변이와 결합된 RNA 간섭을 사용하여 Caenorhabditis elegans에 있는 합성 상호 작용 스크린을 능력을 발휘하고 chaperones의 과잉 발현및 유기체 수준에서 조직 특정 단백질 기능 장애를 감시합니다.

조직별 샤페론 상호 작용을 위해 검사하기 위해 Caenorhabditis elegans를 사용

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

유전적으로 추적 가능한 설계에 대한 다음 실험의 전반적인 목표는 Caenorhabditis elegans를 식별하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 Golan AI 피팅과 같은 사용하기 쉬운 분석과 행동 판독을 결합하여 새로운 조직 특이적 상호 작용을 드러낸다는 것입니다. 스트레스가 없는 배아 동기화를 위해 지렁이 픽을 사용하여 동기화되지 않은 웜 플레이트에서 새로 장착된 NGM 플레이트로 약 100개의 난자를 옮기고 적절한 실험 일정에 따라 동물을 배양합니다.동물이 알을 낳는 첫날이 되면 박테리아 잔디밭에서 멀리 떨어진 접시에 1ml의 M9 완충액을 천천히 추가하고 완충액이 접시를 완전히 덮도록 접시를 회전시킵니다. 접시를 한쪽으로 기울여 액체를 제거하고 접시에서 동물을 씻습니다. 플레이트에서 모든 벌레를 씻어낸 후 표준 플라스틱 피펫 팁을 사용하여 알이 집중된 곳 주위를 사각형으로 자르고 한천 조각을 새로 장착된 NGM 플레이트에 놓습니다.동일한 배양 조건에서 계란을 재배하십시오. 부화가 끝나면 접시는 동기화 된 난자로 덮여야합니다. 방금 시연한 것처럼 접시에서 모든 동물을 씻은 후 1ml의 새 M9 완충액을 넣고 세포 스크레이퍼를 사용하여 접시에서 계란을 꺼냅니다.모든 계란이 분리되면 원심분리를 위해 플레이트의 전체 완충액을 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 튜브를 원심분리하고 상층액을 버립니다. 상층액을 제거한 후 플레이트와 피펫에 최대 1ml의 신선한 M9 완충액을 추가하여 난자를 다시 현탁시킵니다.방금 시연한 대로 계란을 다섯 번 더 씻습니다. 마지막 세척 후 계란 펠릿이 흰색으로 나타나야 하며 마지막 200마이크로리터의 상등액을 제외한 모든 것을 제거할 수 있습니다. 실험을 위해 동기화된 선충을 배양하려면 약 30개의 알 한 방울을 박테리아 잔디밭과 각 간섭 RNA 시트 플레이트 가까이에 놓고 약 30개의 알 약 30개의 알을 박테리아가 포함된 빈 벡터가 있는 플레이트에 놓습니다.그런 다음 실험 프로토콜에 따라 적절한 배양 조건에서 동물을 배양합니다. 동기화된 동물의 배아 치사율을 평가하기 위해 동물이 알을 낳기 시작할 때 약 100개의 알을 빈 접시에 옮기고 알을 줄로 펼쳐 계산을 단순화합니다. 24시간에서 48시간 후에 부화하지 않은 알의 비율을 점수화합니다.참고로, 실험용 동물의 난자를 빈 매개체 대조 박테리아로 처리한 동물의 난자와 비교하십시오. 마비 분석을 설정하려면 동물이 성체가 될 때까지 알을 낳기 시작하기 전에 빈 벡터 제어 박테리아에서 연령 동기화 동물을 배양합니다. 미세한 마커를 사용하여 일반 NGM 한천 접시 뒷면에 선을 긋고 표시된 선에 5-10마리의 동물을 놓습니다.타이머를 10분으로 설정하고 라인에 남아 있는 동물의 백분율을 마비된 벌레로 평가합니다. 참고로, 이 데이터를 빈 매개체 대조 박테리아에서 자란 돌연변이 동물의 비율과 비교하십시오. 단백질 녹다운(Knockdown) 검증을 위해 250-300개의 동기화된 난자를 관련 이중 가닥 RNA 발현 또는 박테리아가 포함된 빈 벡터가 있는 60mm NGM 간섭 RNA 플레이트에 놓고 적절한 실험 기간 동안 난자를 배양합니다.배양이 끝나면 총 200마리의 어린 성인 동물을 동물 배양 온도에서 유지되는 200마이크로리터의 PBST가 들어 있는 1.5ml 튜브의 캡으로 옮깁니다. 뚜껑을 조심스럽게 닫고 동물을 1000배 G로 1분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 800마이크로리터의 새 PBST를 튜브에 넣고 웜을 다시 원심분리합니다.상층액의 상단 900마이크로리터를 조심스럽게 제거하고 방금 설명한 것처럼 신선한 PBST에서 선충을 3번 더 세척합니다. 마지막 세척 후 상층액의 마지막 100마이크로리터를 제외한 모든 것을 제거하고 25마이크로리터의 5X 샘플 버퍼를 동물에 추가합니다. 샘플을 섭씨 92도에서 분당 1000회 회전으로 10분 동안 가열한 후 각 샘플 20마이크로리터를 SDS 페이지 젤에 로드합니다.그런 다음 적절한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 관심 단백질의 상대적 안정성을 측정하고 농도 측정 소프트웨어를 사용하여 금지 강도를 결정합니다. 발달 과정에서 쓰러진 HSP6는 야생형 동물에서 강력한 발달 정지를 초래합니다. 동시에, 근육 조직에서 야생형 RDE1을 발현하는 근육 특이적 간섭 RNA 균주에서 녹다운된 HSP6는 발달 정지를 일으키지 않습니다.HSP6는 장 세포에서 야생형 RDE1을 발현하는 장 특이적 RNAI 균주를 무너뜨렸지만, 강력한 발달 정지 및 표현형을 초래했습니다. 따라서 경미한 성장 지연을 유발하는 HSP6 MG585의 돌연변이는 돌연변이된 유전자를 운반하는 균주를 장 특이적 간섭 RNA 균주로 교차시키고 샤페론 간섭 RNA 라이브러리를 스크리닝하여 샤페론 상호작용을 악화시키거나 완화하는 스크리닝에 사용할 수 있습니다. STI1 AHSA1 또는 DAF41 간섭 RNA로 처리된 Myosin 조직 및 UNC45 돌연변이 동물은 네 번째 유충 단계에서 야생형 벌레와 유사합니다.돌연변이체는 성인이 된 후 교란된 육종을 나타냅니다. 대조적으로, 빈 매개체 대조군으로 처리된 UNC45 돌연변이 동물과 야생형 동물 모두 영향을 받지 않았습니다. 유전적 상호작용은 신체적 상호작용을 나타내지 않습니다.따라서 확인된 상호 작용의 특성을 검증하고 직접 조사하기 위해 유전적 상호 작용 스크리닝을 사용한 후속 실험을 수행해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

의 액체 기반 culturing 및 분배를위한...

형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스

우리의 단백질 표현 및 현지화의 postembryonic 규제를 식별할 수 sensitized 방법을...

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans</em

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

단백질 항상성, 스트레스 및 노화 사이의 관계를 연구하기 위해 유전적으로 다루기 쉬운 후생동물인 Caenorhabditis elegans를 모델 시스템으로 사용하여 단백질 기능 장애, 세포 내 단백질 국소화 및 유기체, 세포 및 단백질 수준에서의 단백질 안정성을 추적하여 단백질 접힘의 변화를 모니터링했습니다.

사용 예쁜 꼬마 선충 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

단백질 응집체의 프리온과 같은 증식은 최근 많은 신경 퇴행성 질환과 관련이 있는 것으로 부상했습니다. 이 프로토콜의 목표는 선충 C. elegans를 모델 시스템으로 사용하여 단백질 확산을 모니터링하고 프리온과 유사한 현상을 조사하는 방법을 설명하는 것입니다.

후생 동물 모델 생물을 사용하여 확산 및 독성 프리온 같은 단백질을 조사<em&gt; C. 엘레</em

전립선성 감소는 노화의 특징입니다, 신경 퇴행성 질환의 발병을 촉진. 우리는 형광 기자에게 융합 된 폴리 글루타민 반복의 이종 발현을 통해 두 가지 다른 Caenorhabditis elegans 조직에서 프로테오스타시스를 정량적으로 측정하는 프로토콜을 설명합니다. 이 모델은 프로테오스타증의 생체 내 유전 적 분석을 빠르게 허용합니다.

Caenorhabditis 예인단에서 조직 특정 전립선 성 감소를 정량화

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카노르하비티스 예르간에서 단백질 추출물 제제 및 공동 면역 침전

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Caenorhabditis elegans를 사용하여 EGFR 및 RAS 억제제의 식별

여기에서, 우리는 폴리글루타민 응집, 뉴런 사멸 및 화학 회피 거동뿐만 아니라 다중 표현형의 예시적인 통합을 포함하는 예쁜꼬마선충에서 시험 화합물의 신경 보호 활성을 평가하기 위한 프로토콜을 제시한다.

Caenorhabditis elegans는 Polyglutamine-mediated Neurotoxicity에 대한 생리 활성 화합물을 발견하기위한 모델 시스템으로서의

장내 미생물은 특정 또는 보존 메커니즘을 통해 숙주의 건강에 긍정적 또는 부정적 영향을 미칠 수 있습니다. Caenorhabditis elegans 는 그러한 미생물을 스크리닝하는 편리한 플랫폼입니다. 본 프로토콜은 웜 건강의 대용으로 사용되는 선충 스트레스 저항성에 미치는 영향에 대한 48개의 박테리아 분리주의 고처리량 스크리닝을 설명합니다.

Caenorhabditis elegans 건강에 영향을 미치는 미생물 분리물의 고처리량 스크리닝

여기서는 30 μL 벌레 펠릿만을 사용하여 L4 단계 Caenorhabditis elegans 전체충에 구현할 수 있는 빠르고 간단한 ATAC-seq 프로토콜을 제시합니다.

Caenorhabditis Elegans L4 유충 전체에서의 염색질 접근성 프로파일링

배우세요 Caenorhabditis elegans를 이용한 조직 특이적 샤페론 상호작용 검사 방법을 통해 단백질 기능 장애를 모니터링하는 기술입니다. 이 연구는 유전자 기능과 단백질 안정성 이해에 중요한 통찰을 제공합니다.

조직별 샤페론 상호 작용을 위해 검사하기 위해 Caenorhabditis elegans를 사용

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