Name: 장기 나노 물질 노출 다음 체외 물질 독성 테스트를 위한 고급 3D 간 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 학습하세요 3D Hep G2 스페로이드 모델을 활용한 나노물질 유전독성 평가 방법을. 14일간 생존성을 유지하며 미소핵 분석으로 DNA 손상을 검출하고 동물 실험을 대체하는 체외 간 독성 테스트 시스템을 구축합니다.

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저자는이 연구가 보조금 계약에 따라, 순찰 프로젝트에 대한 유럽 연합 (EU)의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 자금을 받은 것을 인정하고 싶습니다.

<ol><li>Geiser, M., Kreyling, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deposition+and+biokinetics+of+inhaled+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Particle+and+Fibre+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Deposition and biokinetics of inhaled nanoparticles.</a> Particle and Fibre Toxicology. 7, 2(2010).</li>
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<li>Kramer, N. I., di Consiglio, E., Blaauboer, B. J., Testai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biokinetics+in+repeated-dosing+in+vitro+drug+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+vitro%22%5BJournal%5D)">Biokinetics in repeated-dosing in vitro drug toxicity studies.</a> Toxicology in vitro. 30, 217-224 (2015).</li>
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저자는 공개 할 것이 없습니다.

3D 간 모형을 위한 응용은 표적으로 되는 특정 생화확적인 끝점 또는 불리한 결과 통로에 따라 상당히 변화합니다. 각 모델은 1차 인간 간세포(PHH) 모델의 인터도어 변이에서 부터 세포선 기반 모델의 감소된 사이토크롬 p450 활성에 이르기까지 그 장점과 한계를 가지고 있지만, 모두 자신의 권리6,12,18,19에서가치가 있다. geno독성을 평가할 때 활성 증식이 요구되기 때문에 체외 마이크로핵 분석과 같은 규제 승인 된 종점과의 모델 호환성에 제한이 있습니다. 이것은 유전자 독성 평가가 DNA 복구가 일시적인 병변을 정정할 기회가 있을 때 세포 분열을 평가하기 위하여 고정된 DNA 손상의 정량화를 요구하기 때문에 필요합니다. 불행하게도, 고도로 분화된 간세포(즉, HepaRG) 기반의 스페로이드 또는 PHH 마이크로티슈는 가장 생리적으로 관련이 있는 간 유사 특성을 나타내는 것으로 간주되며, 이는 정적(비증식)모델(12,19,20)을형성한다. 그 결과, 여기에 제시된 3D HepG2 스페로이드 모델은 genotoxicity 테스트를 지원할 수 있는 적합한 대체 모델을 제공한다. HepG2 세포주 기반 스페로이드는 알부민 및 우레아 생산 및 일부 CYP450 활성5,12,19와같은 기본적인 간 유사 특성을 유지하면서 스페로이드의 외부 표면에 세포를 충분히 적극적으로 분할합니다. 주로 이 체외간 모델은 마이크로핵 분석체를 보완하기 위해 개발되었으며, 이는 지독성 검사를 위해 배터리에 권장되는 두가지 시험관 내 분석제 중 하나이기 때문에8,10,11,21. 그러나, 모델은 DNA 염기서열 분석 및 유전자 발현(RNA) 기술에 용이하게 적용될 수 있으며, 혜성 분석과 같은 다른 DNA 손상 종점에 더 적응되고 활용될 가능성이 있다. 그럼에도 불구하고 일부 종점 분석에서는 ENM 간섭이 수행하는 역할을 고려하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 유동 세포측정기반 분석은 특히 입자간섭(22)으로인한 ENM 독독성 평가에 적합하지 않을 수 있다.
적극적으로 세포 분열을 겪는 스페로이드 모델의 한 제한 요소는 그들의 크기입니다. 모델의 확산을 계속할 수 있는 충분한 세포가 필요하기 때문에 시드 밀도의 최적화는 매우 중요합니다. 하지만 너무 높은 세포 수, 스페로이드 지나치게 컴팩트 되 고 결과, 증가 괴사 코어로 이어지는. 이 괴사의 원인은 산소및 영양확산이 제한되는 것으로 추정되며, 이 확산의 한계는 조직23,24의약 100 ~150 μm로 생각된다. 그러나, 이는 세포유형, 세포수, 스캐폴드 상호작용 및배양조건(25)에의존한다. 이후, 약 700 μm 직경이 C3A 스페로이드의 중심에서 괴사의 조기 발병을 피하기 위한 한계이며, 스페로이드 당 4000 HepG2 세포를 시드하면 노출 시 모델의 직경이 ≤500 μm26입니다. 더욱이, Shah et al.은 스페로이드 당 5000세포 이상 시드를 받은 HepG2 세포가 배양 7일 후 생존가능성을 25% 감소시켰으며, 이는 평균 직경 680 μm에 해당하며 20 μL 매달려 낙하5에서영양소의 가용성이 제한적일 수 있음을 확립하였다. 이를 극복하기 위해, 본 프로토콜에서 고안된 모델은 스페로이드의 초기 형성 에 따라 매달려 방울이 아가로즈 코팅 된 우물로 옮겨지는 중요한 단계를 거칩니다. 이것은 스페로이드 내의 세포의 계속 증가하는 수를 유지하기 위하여 배양 매체의 더 큰 양이 존재한다는 것을 보장합니다. 그 결과, HepG2 스페로이드 모델은 문화에서 10일 후에 70% 이상 실행 가능하며 시험관 내 장기 위험 평가를 위해 활용할 수있다.
HepG2 spheroid 모델은 급성 및 장기 노출 정권을 모두 지원할 수 있지만, 확장된 배양 기간 동안 의 상쾌한 세포 배양 배지는 스페로이드의 잠재적 손실로 인해 배지의 완전한 교체가 권장되지 않기 때문에 이 모델에 대해 제한된다. ENM 노출을 통해 동질적인 ENM 분산이 응집및 퇴적물을 증가시키는 경향이 높은 것으로 추정됩니다. 그러나 ENM 퇴적물(예를 들어, 크기, 형상 및 밀도)에 따라 ENM 퇴적물속도가 달라질 수 있으며, 이론적으로 시험관내 침전, 확산 및 도시성(ISDD) 모델 또는 ENM(서스펜션) 노출에 관한 경우 언급되는 최근 유도체를 사용하여 결정될 수 있는 비율이주목할만하다. 이를 염두에 두고, 세포 배양 배지의 50%만이 세포 배양의 표면에서 신중하게 제거된다면, ENM 용량의 중단 및 후속 제거는 이론적으로 최소화되어야 한다고 가정한다. 그러나, 브라우니아의 움직임을 통해, 이것은 엄격하게 경우가 아니며, 시험될 각 특정 ENM의 증착 및 퇴적에 대한 추가 작업이 장기 노출정권(27)에걸쳐 올바른 도시계가 유지되도록 해야 한다. 주로 이것은 최종, 축적 된 농도에 중요 할 수 있기 때문에 반복된 주체 정권을 수행 할 때 고려해야 할 잠재적 인 제한이다. 한편, 화학물질 기반 노출은 자체적인 제한없이는 고려해야 할 것이 아니라, 화학 물질이 용액에 남아 있는 경향이 있으며, 따라서 새로 추가된 농도 이외에 원래화학 농도의 직접적인 교체를 제공하여 미디어 다과 중에 손실된 화학물질이29에따라 대체되도록 한다. 향후 응용 분야에는 반복된 투약 전략이 특정 장기 시스템의 능력을 평가하여 특정 장기 시스템의 능력을 평가하여 xenobiotic 물질의 생체 축적에 의해 유도되는 부작용을 평가하는 데 매우 중요하므로 장기간 배양 기간에 반복적인 노출 정권에 대한 모델의 적합성평가가 포함됩니다.
결론적으로, 이 체외 간 모델은 다양한 사실적인 노출 시나리오를 평가하는 데 활용할 수 있는 능력을 가지며, 따라서 ENM 및 화학 적 위험 평가를 일상적이고 쉽게 접근 할 수있는 방식으로 더 나은 지원을위한 미래의 체외 접근 방식을 제공합니다.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section was updated.
Figure 6 in the Representative Results section was updated from:
<img alt="Cell culture analysis; graph of cell viability and bar charts of albumin, urea over time in days." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 6">
to:
<img alt="Cell viability, albumin, and urea levels over 14 days in culture; graphs of cell culture analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 6">
The fourth paragraph in the Representative Results section was updated from:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &gt;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the ≥14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be ≥0.06 mg/mL whilst urea production should be ≥0.4 ng/µL before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.
to:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &gt;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the ≥14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be ≥50.0 ng/μL whilst urea production should be ≥0.25 ng/µL before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.

Erratum: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

다양한 설계 나노 물질(ENM)의 급속한 발전과 구현으로 인해 다양한 인간 기반 응용 분야(예: 식품, 화장품, 의류, 스포츠 장비, 전자, 운송 및 의약품)에 걸쳐 인간이 정기적으로 ENM에 노출될 수밖에 없습니다. 이와 함께, 수많은 응용 프로그램에서 이러한 물질을 유리하게 간주 하는 새로운 크기 특정 생리 화학 특성 인간의 건강과 환경에 악영향을 일으킬 수 있습니다. 현재 많은 국제 활동은 이러한 ENM에 더 생리적으로 관련된 노출을 적극적으로 반영하고 급성, 장기 및 반복된 저용량 노출 시나리오를 통해 이러한 물질의 잠재적 독성을 평가하기 위해 마련되어 있습니다.
간 독성학은 ENM 노출을 고려할 때 핵심이며, 간은 ENM 축적 포스트 노출1,2의주요 부위로 널리 알려져 있기 때문에. 더욱이, 간은 전신 순환을 입력하는 물질의 신진 대사 및 해독을 위한 1차 기관시스템3. 2D 간세포 모델이 복잡한 다세포 상호 작용의 복잡성을 정확하게 모방하지 않거나 생체 내에서 관찰되는 대사 활성을 적절히 나타내지 않는다는 수용된 이해에 기초하여, 생체 내 대체 기술에 대한 시험관 3D 간 모델을 견고하고 생리적으로 관련시키는 개발에 더 중점을 두고4,5. 고급 3D 배양 기술을 활용하여 시험관 내 간 모델의 수명을 향상시켜 장기적인 반복노출 제도를 조사할 수 있습니다. 또한, 이러한 고급 배양 형식은 담즙 카날리큘리, 능동 수송 공정 및 개선된 CYP450 약물 대사 기능과 같은 향상된 생리적, 조직화 기능의 형성을 촉진하여 모델6의예측가능성을 향상시킨다. 모노 배양(간세포만) 또는 공동 배양(비파렌키말 세포를 가진 간세포)으로 구성된 현재 3D 체외 간 모델은 여러 형식으로 존재하며, 초저 유착 판의 미세 조직 또는 스페로이드, 매달려 드롭 스페로이드, 행렬 및 /또는 비계 및 미세 유체 세포 배양 플랫폼에 내장 된 세포에 이르기까지, 모두는 간 독성 평가6,7에대한 효과적인 시험관 내 모델로 간주됩니다. 그러나 이러한 모델 시스템의 대부분은 높은 유지 보수, 특수 장비를 필요로하고 비싸다. 더욱이, 이들 모델은 고정된 DNA 손상을 정량화하는 방법을 활용하는 지적 독성 검사와 같은 위험 종점의 평가에서 사용을 방지하는 정적(즉, 비분할 세포 모델)이다. 유독성은 규제 독성학의 핵심 전제 조건이며, 독성8의위험 평가의 중요한 구성 요소입니다. 외인성 에이전트에 노출된 후 발생할 수 있는 모든 형태의 DNA 손상을 정량화하기 위해 적용될 수 있는 단일 분석이 없습니다. 그러나, 체외 물질 독성 검사 전지의 핵심 성분은 미세핵 분석이며, 이는 총 염색체 손상을 측정하는 신뢰할 수 있고 다각적인 기술이다9. 시험관 내 DNA 손상 및 지독성을 평가하기 위한 OECD 테스트 가이드라인(487)에 의해 기술된 금표준 기술이며, 규제 위험평가(10,11)에대한 테스트 배터리 요구 사항의 일부이다.
인간 간세포 암종 세포주, HepG2는 세포가 쉽게 사용할 수 있고, 상대적으로 저렴하며, 배양에 간단하고 높은 처리량스크리닝(12,13)으로가능하기 때문에 초기 위험 평가 스크리닝에 널리 사용된다. 3D 구형 구조로 배양하면 간 미세 환경을 잘 재구성하고 미세 핵 분석3을지원하기에 충분한 증식 기능을 갖춘 간 모델을 제공하는 것으로 나타났습니다. HepG2 스페로이드 모델의 추가 개발은 장기적이고 반복적인 노출 정권(≤14일)에 걸쳐 물질독성 위험 평가를 지원하기 위해 모델의 장수 및 간과 같은 기능을 개선하기 위해 설립되었습니다. 따라서, 동물 실험을 대체, 감소 및 정제하는 3R의 원칙에 따라, 본 프로토콜은 급성, 장기 및 반복화학 적 및 ENM 루틴에 따라 여러 독성 학적 종점 (예를 들어, 간 기능성, (pro-)염증 성 마커, 세포 독성 및 독독성을 안정적으로 평가 할 수있는 시험관 내 간 모델의 고급 3D를 제공하기 위해 설립되었습니다.
여기서, 급성 또는 장기, 반복된 ENM 노출에 이어, 지독성 위험 평가를 위한 체외 모델 시스템을 기반으로 생리적으로 관련된 3D 간세포 세포주를 확립하는 방법을 제시한다. 프로토콜은 6 개의 주요 단계로 나눌 수 있습니다 : 냉동 보존 HepG2 세포를 배양; HepG2 스페로이드 제제; HepG2 스페로이드 전달 은 아가로즈 서스펜션에 매달려 드롭에서; 헵G2 스페로이드 수확; 미세 핵 분석 및 점수; 데이터 분석.

<table><tbody><tr><td>Aflotoxin B1</td><td>Sigma Aldrich, 영국</td><td>A6636-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich, 영국</td><td>A9539-50G</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브 테이프</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCG 알부민 분석</td><td>Sigma Aldrich, 영국</td><td>MAK124</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 분말</td><td>Sigma Aldrich, 영국</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>세포 동결 보조제</td><td>Thermo Fisher Scientific, UK</td><td>5100-0001 - Mr Frosty</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Merck, 영국</td><td>250233</td><td></td></tr><tr><td>세포학 금속 클립</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 4 원심분리기</td><td>ThermoFisher Scientific, 영국</td><td>CM00730202</td><td></td></tr><tr><td>DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 페놀-레드 프리, 4.5g/L D-글루코스, L-글루타민, Hepes</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>DPX 마운팅 배지</td><td>FisherScientific, UK</td><td>D/5330/05</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>FisherScientific, 영국</td><td>10048291</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytospin</td><td>용 필터 카드FisherScientific, 영국</td><td>15995742</td><td></td></tr><tr><td>젖빛 유리 슬라이드</td><td>ThermoFisher Scientific, 영국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa의 얼룩 개선 R66 솔루션, Gurr</td><td>VWR Chemicals, 영국</td><td>MFCD00081642</td><td></td></tr><tr><td>Glass Coverslips (24 x 60)</td><td>Deckglaser,</td><td>VWR ECN631-1575</td><td></td></tr><tr><td>혈구계 및 커버슬립</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>이멀젼 오일 현미경</td><td>Zeiss, 영국</td><td>518F, ISO8034</td><td></td></tr><tr><td>층류 II 조직 배양 후드</td><td>Scanlaf 화성</td><td></td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>Zeiss, 영국</td><td>Axiovert 40C</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>FisherScientific, 영국</td><td>10284580</td><td></td></tr><tr><td>마이크로파</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>필터링되지 않음, 멸균 200&micro; L 및 1000&micro; l 피펫 팁</td><td>Greiner-Bio-One, 영국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NuncMicroWell 96-Well 마이크로플레이트</td><td>ThermoFisher Scientific, 덴마크</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>P1000 및 P200 마이크로피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P300 및 P50 멀티 채널 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 1X, MgCl2 및 CaCl2 Free</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>15140-122, 페니실린/스트렙미오신 100X 또는 10,000U/ml</td><td></td></tr><tr><td>포스파타제 완충액 정제</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>10582-013</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Boy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges</td><td>FisherScientific, UK</td><td>11690581</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier SFX 550 240V CE 1/2" - Probe</td><td>Branson, 미국</td><td>101-063-971R</td><td></td></tr><tr><td>T-25 및 T-75 조직 배양 플라스크</td><td>Greiner-Bio-One, 영국</td><td>T-25 (690175) 및 T-75 (660175)</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Sigma Aldrich, 영국</td><td>T8154-100mL</td><td></td></tr><tr><td>요소 분석 키트</td><td>Sigma Aldrich, 영국</td><td>MAK006</td><td></td></tr><tr><td>Virkon 소독제</td><td>DuPont, 영국</td><td>Rely+On Virkon</td><td></td></tr><tr><td>수조 (37? C)</td> <td>Grant JBNova 18</td><td></td><td></td></tr><tr><td>계량 저울</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>FisherScientific, 영국</td><td>10588070</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>5300-054</td><td></td></tr><tr><td>0.2mL 및 1.0mL Eppendorf Tubes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45&micro; m 필터 유닛</td><td>Millex HA, MF-Millipore, 영국</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>1.0mL 주사기</td><td>BD Plastipak, FisherScientific, 영국</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>20mL LS 섬광 유리 바이알, 22-400 호일 라이닝 PP 캡</td><td>DWK Life Sciences GmbH, 독일</td><td>WHEA986581</td><td></td></tr><tr><td>37? C 및 5 % CO2 ISO 클래스 5 헤파 필터 인큐베이터</td><td>NUAIRE DHD 자동 흐름</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3mL 파스퇴르 피펫</td><td>Greiner-Bio-One, 영국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL 원뿔형 팔콘 튜브</td><td>Greiner-Bio-One, 영국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL 또는 100mL 유리병</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL 스커트 팔콘 튜브</td><td>Greiner-Bio-One, 영국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5mL, 10mL 및 25mL 피펫</td><td>Greiner-Bio-One, 영국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9.4cm 정사각형, 페트리 접시</td><td>Greiner-Bio-One, 영국</td><td>688161</td><td></td></tr></tbody></table>

장기 나노 물질 노출 다음 체외 물질 독성 테스트를 위한 고급 3d 간 모델

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

다양한 엔지니어링 나노 물질(ENM)의 급속한 개발과 구현으로 인해 ENM에 대한 노출이 불가피하며 견고하고 예측가능한 시험 시스템 개발이 필수적입니다. 간 독성은 ENM 노출을 고려할 때 중요합니다, 간은 신진 대사 항상성 및 해독에 중요한 역할을하고 뿐만 아니라 ENM 축적 포스트 노출의 주요 사이트인. 이를 바탕으로 2D 간세포 모델이 생체내에서 관찰되는 복잡한 다세포 상호 작용 및 대사 활동의 복잡성을 정확하게 모방하지 않는다는 것을 받아들인 이해에 기초하여, 체외에서 ENM 위험 평가 목적으로 맞춤화된 생리학적으로 관련된 3D 간 모델의 개발에 더 중점을 두고 있다. 동물 실험을 대체, 감소 및 정제하는 3R의 원칙에 따라, 3D HepG2 세포주 기반 간 모델이 개발되었으며, 이는 확장 및 반복ENM 노출 정권(≤14일)을 모두 지원할 수 있는 사용자 친화적이고 비용 효율적인 시스템입니다. 이러한 스페로이드 모델(직경 ≥500 μm)은 생체 외에서 게놈 독성을 효과적으로 평가하기 위해 '금본위제' 미세핵 분석과 결합될 수 있도록 증식 능력(즉, 셀 모델을 분할)을 유지합니다. 독성 종말의 범위에 보고하는 그들의 능력 (예를 들어, 간 기능, (pro-) 염증 반응, 세포 독성 및 지독 독성) 급성 (24 h) 및 장기 (120 h) 노출 정권에 걸쳐 여러 ENM을 사용 하 여 특징되었습니다. 이 체외 간 모델은 보다 사실적인 ENM 노출을 평가하는 데 활용할 수 있는 능력을 가지며, 따라서 일상적이고 쉽게 접근 할 수있는 방식으로 ENM 위험 평가를 더 잘 지원하기 위한 미래의 체외 접근 방식을 제공합니다.

장기 배양 및 유노독성 위험 평가를 위한 본 세포주 기반 3D 간 스페로이드 모델의 적합성은 배지 특성화를 수행하여 배양에서 14일 동안 모델의 생존가능성 및 간과 같은 기능을 결정하고 마이크로핵 분석에 대한 적용성을 평가하였다.
3D HepG2 간 스페로이드 모델의 기준특성화 시험관 내 독성 평가에 앞서, 아가로즈 전달 또는 화학/ENM 치료를 수행하기 전에 3D HepG2 스페로이드가 제대로 형성되어 있는지 확인하는 것이 중요하다. 매달려 있는 낙하 방법을 사용하여 생산된 HepG2 스페로이드는 일반적으로 2-3일 후 시드(4000세포/스페로이드)가 평균 직경 495.52 μm W x 482.69 μm H를 형성하는 데 걸린다. 체외 독성 평가에 올바르게 형성되고 허용되는 HepG2 구형구조는 매끄러운 표면과 시각적 프로젝션이 없는 컴팩트하고 구형 모양의 구조를 가져야 합니다. 도 5는 양질의예(도 5D-F)와품질 저하(그림5G-I)스페로이드의 예를 제공한다. 후자는 폐기해야 합니다. 전형적으로, 플레이트당 형성된 스페로이드의 90-95%가 올바르게 형성되고 추가 실험을 위해 실행 가능할 것이다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig5.jpg"> 그림 5: 매달려 드롭 방법을 통해 형성 된 HepG2 스페로이드의자연 형태를 나타내는 빛 현미경 이미지. (A-C)쇼 2 일 및(D-I)일 4 HepG2 간 스페로이드 포스트 시드. (D-F)는양질의 HepG2 스페로이드의 예이며(G-I)는 제대로 형성된 스페로이드를 나타낸다. 모든 이미지는 현미경을 사용하여 X20 목표에 촬영되었습니다. 배율 막대는 20 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig5large.jpg" target="_blank">μm을 나타냅니다.</a>
HepG2 스페로이드 생존가능성을 더욱 확인하기 위해 기본 색채 브로모브레솔 그린 알부민(BCG) 분석 또는 우레아 분석이 수행되어 간과 같은 기능을 평가할 수 있다. 간유사 기능은 14일 배양기간 동안 Trypan Blue 배제 분석기를 이용하여 생존가능성에 따라 평가되어 간 스페로이드 모델의 수명을 결정하고 장기 또는 반복된 ENM/화학 물질 기반 위험평가(그림 6)를지원할 수 있는지 를 확립하였다. 알부민 농도는 문화 기간 동안 일관되게 유지되었다. 우레아 생산은 7일째까지 고원에 도달하기 전에 문화에서 1주일 동안 스페로이드당 생산되는 우레아의 농도가 증가하는 것을 표시한다. 3D HepG2 스페로이드에서 생산되는 알부민과 우레아의 수준은 2D 형식으로 배양된 동일한 세포주에서 관찰된 것보다 실질적으로 높다는 점에 유의해야 한다. 실제로, HepG2 세포의 2D 배양, 피크 알부민 및 우레아 수준은 각각 0.001 mg/mL 및 0.010 ng/μL이었습니다. 더욱이, Shah 등에서 거의 동일한 HepG2 스페로이드 시스템을 사용하여 발표한 이전 작품에서, 저자는 2D 배양HepG2 세포5에비해 체외 모델 시스템에서 대사 활성(CYP1A1 및 CYP1A2)의 주목할 만한 개선을 강조한다.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg"> 그림 6: HepG2 간 스페로이드에 대한 14 일 기준 특성 데이터. 행딩 드롭에서 의한후(A)는14일 동안 HepG2 스페로이드 모델의 생존가능성을강조하고(B)및(C)는각각 간형 알부민 과 우레아 기능을 강조한다. 평균 데이터 ± SEM 제시, n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
3D 간 스페로이드 배양의 알려진 한계인 괴사 코어의 불가피한 발달로, 이 HepG2 기반 모델의 생존가능성은 미핵 분석5를지원하는 데 필요한 증식 능력을 유지하면서 장기(5-10일) 노출 체제를 유지할 수 있었다는 것을 입증하기 위해 확립되어야 했다. 실제로, 이 3D 간 스페로이드 모델은 문화에서 10 일 동안 &gt;70 % 생존력을 유지하는 것으로 나타났습니다. 이를 바탕으로 ≥14일 배양 기간 동안 관찰된 지속적인 간형 기능과 함께, 이 3D 간 스페로이드 모델은 따라서 최대 10일 길이의 장기 반복ENM 노출 정권(즉, 스페로이드의 생존 가능성이 70% 이하로 떨어지기 전에)을 지원할 수 있다. 참고로, 4000세포/스페로이드에서 시드된 HepG2 스페로이드의 알부민 수준은 ≥20.0 ng/μL이어야 하는 반면, 우레아 생산은 ≥0.25 ng/μL이어야 이 모델을 통해 체외 독성 평가를 실시하는 것이 좋습니다.
엔지니어링 나노 물질의 유전체 독성 평가 유독성 평가를 위해, 미세핵 분석은 급성(24h) 및 장기(120h) ENM 노출 에 따른 미세핵의 존재를 결정하는 데 사용되었다. 아플라톡신 B1은 공지된 간발암물질(16,17)이며 미세핵 분석에 권장되는 양성 대조군이다. 최적화 실험에 따르면 알파톡신 B1의 0.1 μM은 3D HepG2 간 스페로이드에서 유의한 양성(≥2.0배 증가) 게놈독성 반응을 유도하여 이 모델로 실시된 모든 미세핵 분석에서 사용된다. HepG2 스페로이드 모델을 사용하여 미세 핵 분석 결과의 유효성을 보장하기 위해, 이 3D 체외 모델에 사용되는 HepG2 세포에 대한 배경 미세 핵 주파수는 0.6% – 1.2%의 범위 내에 있어야 한다. 그 결과, 알파톡신 B1은 음의 대조군으로 본 것보다 적어도 2배 더 높은 물질독성 반응을 유도해야 한다. 따라서, 알파톡신 B1의 0.1 μM은 1.5% - 3.0% 사이의 미세 핵 주파수를 유도해야 한다. 이러한 제어 매개 변수를 사용하여, 시험관 내ENM 관련 게놈 독성은 그 때 안정적으로 평가될 수 있습니다. OECD 시험 가이드라인(487)에 기초하여, 선택된 농도는 55% 이상 ± 5% 사이토독성(음의 대조군과 관련하여 CPBI 또는 RVCC 값의 감소에 의해 표시됨)이상유도해서는 안 된다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 도 7은 아플라톡신 B1 및 2개의 ENM(티타늄 이산화티타늄(TiO2)및 슬라이버(Ag)가 HepG2 스페로이드에서 급성 및 장기 노출에 따라 평가되었을 때 생성된 데이터를 보여 주며, 후속 유전독성 전위는 마이크로핵 분석을 사용하여 분석하였다. 평가된 두 ENM은 급성(24시간) 노출 및 장기(120h) 노출 체제에 비해 5.00 μg/mL의 낮은 용량, 낮은 용량으로 시험하였다. TiO2 및 Ag ENM 모두에 걸쳐 게놈 독성에 대한 유사한 경향을 관찰할 수 있으며, 이로 인해 24시간 노출 이후 발생하는 높은 유독성 반응이 장기간 5일 노출 후에도 명확하지 않았다. 이것은 두 시간 지점에서 Aflatoxin B1 양성 제어에 의해 유도된 지속적인 게놈 독성에도 불구하고 이었습니다.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig7.jpg"> 그림 7: HepG2 간 스페로이드에 TiO2 및 Ag ENM 노출 에 따른 독독성 평가. 유전체 독성(micronucleus 주파수) 평가는 미세핵 분석포스트(A)급성(24시간) 및(B)장기(120시간) 노출을 TiO2 및 Ag ENM의 5.00 μg/mL에 노출한다. 음수 제어는 미디어 전용이며, 양수 제어는 Aflatoxin B1의 0.1 μM입니다. 평균 데이터(n=2)는 부정적인 제어와 관련하여 표시된 sD. 의미 ± 제시: * = p≤ 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 절차는 시험관 내에서 고급 3D 간 배양을 개발하는 데 사용되기 위해 설립되었으며, 급성 또는 장기, 반복 투여 요법 모두에 걸쳐 나노 물질 노출과 관련된 물질 독성 위험의 보다 생리적으로 관련 된 평가를 제공 할 수 있습니다.

장기 나노 물질 노출 다음 체외 물질 독성 테스트를 위한 고급 3D 간 모델

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

이 Hep G2 모델은 동물 실험의 필요성을 최소화하기 위해 나노 물질에 장기간 노출된 후 고정된 DNA 손상의 잠재적 유도를 보다 신뢰성 있게 평가할 수 있는 관련 대안 체외 테스트 시스템을 제공합니다. G2 간염 스페로이드 모델은 14일 동안 생존 및 기능을 유지할 수 있을 뿐만 아니라 적절한 수준의 증식을 유지할 수 있는 능력을 가지고 있습니다. 이는 소핵 분석을 포함한 다양한 생화학적 및 유전독성 종말점의 테스트를 지원합니다.이 프로토콜을 시도하기 전에 먼저 몇 가지 연습을 하는 것이 좋습니다. 세포 파종(cell seeding) 또는 배지 변경 시에는 섬세한 접근이 필요하므로 주의하십시오. 먼저 100마이크로리터의 멸균 실온 PBS를 96웰 배양 플레이트의 웰에 추가합니다.플레이트의 뚜껑을 뒤집고 세포 현탁액의 20마이크로리터 방울을 뚜껑의 각 웰 홈 중앙에 조심스럽게 피펫으로 넣습니다. 다채널 피펫을 사용하여 한 번에 2-4방울을 추가하여 정확한 배치를 보장합니다. 한 번에 4개의 스테로이드만 씨딩하고 시작하기 전에 피펫 팁이 모두 정렬되었는지 확인하십시오.다중 채널을 유지하는 각도는 스페로이드가 형성되는 방식에 차이를 만듭니다. 방울이 뚜껑에 있는 웰의 홈 중앙에 있는지 확인한 다음 플레이트 상단의 뚜껑을 부드럽게 뒤집어 방울이 PBS가 있는 웰 위에 매달리도록 합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 배양한 후 3일 동안 스페로이드를 아가로스로 옮깁니다.배양 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 플레이트에서 뚜껑을 조심스럽게 들어 올리고 PBS를 버리고 플레이트를 두드려 잔류 액체를 제거한 다음 플레이트를 2-3분 동안 자연 건조시킵니다. 아가로스를 녹인 후 부드럽게 휘젓아 거품을 제거하고 각 웰의 바닥에 50마이크로리터를 추가합니다. 플레이트를 실온에 2분 동안 그대로 둔 다음 각 웰의 고체 아가로스 층 위에 예열된 DMEM 100마이크로리터를 추가합니다.이 스페로이드 방울이 있는 뚜껑을 플레이트 위에 다시 놓고 스페로이드가 다시 매달리도록 한 다음 플레이트를 200배 G로 3분 동안 원심분리하여 스페로이드를 플레이트의 개별 웰로 이동합니다. 스페로이드가 가라앉을 수 있도록 플레이트를 24시간 더 배양합니다. 엔지니어링된 나노 물질 또는 ENM을 분산시킨 후 사전 예열된 DMEM을 사용하여 원하는 최종 농도로 희석합니다.스페로이드를 사용하여 각 웰에서 50마이크로리터의 배지를 흡입하고 ENM을 사용하여 50마이크로리터의 배지로 교체합니다. 스페로이드를 수확하려면 200마이크로리터 피펫을 사용하여 100마이크로리터의 세포 배양 배지를 각 웰의 스페로이드 조직과 함께 흡인하고 아가로스와 접촉하지 않도록 주의합니다. 멸균 15ml 원심분리기 튜브에 스페로이드를 수집합니다.스페로이드 현탁액을 230배 G에서 5분 동안 원심분리한 다음 상등액을 제거하고 추가 분석이 있을 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 스페로이드 펠릿을 1ml의 멸균 실온 PBS로 세척한 다음 230배 G에서 3분 동안 원심분리하고 상등액을 버립니다. 500마이크로리터의 0.05% 트립신-EDTA 용액에 스페로이드를 재현탁시키고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 6-8분 동안 배양합니다.배양 후, 트립시진즈된 Hep G2 세포를 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 완전히 해리하고 재현탁시킨 후 1ml의 DMEM으로 중화시킵니다. 세포 현탁액을 230배 G에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 버리고, 세포 펠릿을 PBS 2밀리리터에 재현탁합니다. 큐벳 깔때기 설정을 만들려면 준비된 현미경 슬라이드를 금속 지지대에 놓고 슬라이드 위에 필터 카드를 놓은 다음 큐벳 깔때기를 맨 위에 고정합니다.세포 원심분리기에 큐벳 깔때기를 깔때기가 위를 향하도록 배열하여 100마이크로리터의 세포 현탁액을 각각에 직접 추가할 수 있습니다. 그런 다음 원고 지시에 따라 슬라이드 수정을 진행합니다. 인산가수분해효소 완충액에 희석된 20%Giemsa 염색 용액을 준비합니다.용액을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합한 다음 깔때기에 접힌 여과지로 걸러냅니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 여과된 Giemsa 용액 3-5방울을 각 슬라이드의 사이토도트에 넣고 실온에서 8-10분 동안 그대로 둡니다. 슬라이드를 두 번의 연속 포스파타제 완충액 세척으로 세척합니다.그런 다음 찬물에 짧게 헹구어 과도한 얼룩을 제거하고 자연 건조시킵니다. 체외 독성 평가에 앞서 3D HepG2 스페로이드가 제대로 형성되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 파종 후 4일 후, 표면이 매끄럽고 시각적 돌출부가 없는 컴팩트한 구형 스페로이드가 형성되어서는 안 됩니다.파종 4일 후 좋은 품질과 낮은 품질의 스페로이드가 여기에 시연되어 있습니다. 일반적으로 플레이트당 형성된 스페로이드의 90-95%가 올바르게 형성되고 추가 실험에 사용할 수 있습니다. 간 스페로이드 모델의 수명을 결정하고 장기 ENM 또는 화학 기반 위험 평가를 지원할 수 있는지 확인하기 위해 14일의 배양 기간에 걸쳐 생존력 및 간 유사 기능을 평가했습니다.알부민 농도는 배양 기간 동안 일정하게 유지된 반면, 스페로이드당 요소 생산량은 14일째에 떨어지기 시작하기 전에 증가했습니다. 유전독성 평가를 위해 소핵 분석법을 사용하여 급성 및 장기 ENM 노출 후 소핵의 존재를 확인했습니다. 스페로이드는 이산화티타늄과 은의 두 가지 ENM에 노출되었습니다.두 ENM에 급성 노출된 후 유전독성에 대한 유사한 경향이 관찰되었지만, 5일간의 장기 노출 후에는 유전독성 반응 증가가 뚜렷하지 않았습니다. 이 방법에 따라 상등액과 스페로이드를 모두 수확하여 다양한 생화학적 종말점을 얻을 수 있습니다. 여기에는 세포 생존율, 간 기능 분석, SID 450 분석, 불량한 염증 마커 및 유전자 발현이 포함됩니다.이 기술은 현재 화학 물질과 나노 물질의 일상적인 지구 독성 테스트에 적용하고자 하는 여러 위탁 연구 실험실에서 테스트되고 있습니다. 이는 생체 내 테스트 접근 방식에 대한 의존도를 줄일 수 있는 잠재력이 있습니다.

advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

비소세포폐암(NSCLC) 표적 치료에 대한 민감도를 연구하기 위해 생물학적 콜라겐 골격을 기반으로 하는 3차원(3D) 폐암 모델을 제시합니다. 우리는 증식 지수, 세포사멸 및 상피-중간엽 전이(EMT) 상태를 결정하기 위해 다양한 판독 기술을 보여줍니다. 수집된 데이터는 약물 민감성 예측을 위해 인실리코(in silico) 모델에 통합됩니다.

결합 된 3 차원 조직은 엔지니어링<em&gt; 체외</em&gt; /<em&gt; 인 실리코</em특정 돌연변이 배경에서 약물의 효과를 예측&gt; 폐 종양 모델

쥐에서 간 섬유증의 동물 모델을 제작하는 방법을 설명하고, 간의 조직학적 검사를 통해 섬유화의 정도를 평가합니다. 이 모델은 간 질환의 발병을 연구하고 잠재적인 항섬유화제의 효능을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.

쥐에이 dimethylnitrosamine 유도 된 간 섬유화 모델

탈세포화된 쥐 간의 재세포화된 세포외 기질은 바이러스 또는 바이러스 벡터의 분포 및 전이유전자 발현을 연구하기 위해 인간화된 3차원 생체 외 모델로 사용할 수 있습니다.

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이 프로토콜 cryogelation 기술로 제작을 통합 하 여 탄력 있는 3D macroporous microcryogels의 제작을 설명 합니다. 재생 치료를 촉진 하기 위하여 쉽게 주입된 비보 수 또는 생체 외에서 높은 처리량 마약 검사에 대 한 배열로 조립 셀 로딩 시 3D microtissues 생성 됩니다.

주 사용 재생 치료와 높은 처리량 마약 검사에 대 한 3D Microtissues

이 프로토콜은 마우스에서 가능한 정밀 절단 간 조각의 생산을위한 간단하고 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. ex vivo 조직 샘플은 여러 날 동안 실험실 조직 배양 조건 하에서 유지될 수 있으며, 간 병리학을 검사하는 유연한 모델을 제공합니다.

뮤린 정밀 절단 간 슬라이스 간 생물학의 Ex Vivo 모델로

이 프로토콜은 섬유성 기질 구획을 동반한 3D 생체 모방 모델을 제공합니다. 생리학적으로 관련된 하이드로겔을 사용하여 기질 세포 외 매트릭스의 생체 물성 특성, 세포 상호 작용, 종양 성장 및 전이의 활성 중재자를 모방합니다.

튜닝 가능한 바이오 물속성과 3D 환경에서 종양-스트로마 상호 작용을 연구하는 간암을 위한 생체 모방 모형

이중 수지 주조 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영 또는 덕트(DUCT)는 두 관 시스템의 시각화, 디지털화 및 세분화를 동시에 통해 장기 아키텍처의 3D 분석을 용이하게 합니다. 덕트(DUCT)는 두 개의 방사성파크 수지의 전 생체 주입 을 결합한 다음, 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영 스캐닝 및 지형 데이터의 세분화를 결합합니다.

덕트: 3D 간 분석을 위한 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영 다음에 이중 수지 주조

이 프로토콜은 사용자가 Seahorse 세포외 플럭스 분석을 사용하여 3D 암 세포주 유래 구상체에서 미토콘드리아 에너지 대사를 조사하는 데 도움이됩니다.

세포외 플럭스 분석을 이용한 단일 3D 미세조직 구상체의 미토콘드리아 에너지 대사 탐구

약물 유발 간 손상 (DILI)은 약물 실패의 주요 원인입니다. 간 미세생리학적 시스템(MPS)을 사용하여 화합물의 DILI 책임을 정확하게 예측하기 위한 프로토콜이 개발되었습니다. 간 모델은 치료에 대한 세포 반응을 평가하기 위해 일차 간 세포와 번역 관련 종점의 공동 배양을 사용합니다.

시험관 내에서 약물 유발 간 독성 평가를위한 인간 간 미세 생리 학적 시스템

여기에서 우리는 정상 상태 말초 혈액에서 분리된 단핵 세포를 사용하여 인간 자가 간 스페로이드를 생성하는 비유전적 방법을 제시합니다.

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학습하세요 3D Hep G2 스페로이드 모델을 활용한 나노물질 유전독성 평가 방법을. 14일간 생존성을 유지하며 미소핵 분석으로 DNA 손상을 검출하고 동물 실험을 대체하는 체외 간 독성 테스트 시스템을 구축합니다.

장기 나노 물질 노출 다음 체외 물질 독성 테스트를 위한 고급 3D 간 모델

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