장기 나노 물질 노출 다음 체외 물질 독성 테스트를 위한 고급 3D 간 모델

이 Hep G2 모델은 동물 실험의 필요성을 최소화하기 위해 나노 물질에 장기간 노출된 후 고정된 DNA 손상의 잠재적 유도를 보다 신뢰성 있게 평가할 수 있는 관련 대안 체외 테스트 시스템을 제공합니다. G2 간염 스페로이드 모델은 14일 동안 생존 및 기능을 유지할 수 있을 뿐만 아니라 적절한 수준의 증식을 유지할 수 있는 능력을 가지고 있습니다. 이는 소핵 분석을 포함한 다양한 생화학적 및 유전독성 종말점의 테스트를 지원합니다.

이 프로토콜을 시도하기 전에 먼저 몇 가지 연습을 하는 것이 좋습니다. 세포 파종(cell seeding) 또는 배지 변경 시에는 섬세한 접근이 필요하므로 주의하십시오. 먼저 100마이크로리터의 멸균 실온 PBS를 96웰 배양 플레이트의 웰에 추가합니다.

플레이트의 뚜껑을 뒤집고 세포 현탁액의 20마이크로리터 방울을 뚜껑의 각 웰 홈 중앙에 조심스럽게 피펫으로 넣습니다. 다채널 피펫을 사용하여 한 번에 2-4방울을 추가하여 정확한 배치를 보장합니다. 한 번에 4개의 스테로이드만 씨딩하고 시작하기 전에 피펫 팁이 모두 정렬되었는지 확인하십시오.

다중 채널을 유지하는 각도는 스페로이드가 형성되는 방식에 차이를 만듭니다. 방울이 뚜껑에 있는 웰의 홈 중앙에 있는지 확인한 다음 플레이트 상단의 뚜껑을 부드럽게 뒤집어 방울이 PBS가 있는 웰 위에 매달리도록 합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 배양한 후 3일 동안 스페로이드를 아가로스로 옮깁니다.

배양 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 플레이트에서 뚜껑을 조심스럽게 들어 올리고 PBS를 버리고 플레이트를 두드려 잔류 액체를 제거한 다음 플레이트를 2-3분 동안 자연 건조시킵니다. 아가로스를 녹인 후 부드럽게 휘젓아 거품을 제거하고 각 웰의 바닥에 50마이크로리터를 추가합니다. 플레이트를 실온에 2분 동안 그대로 둔 다음 각 웰의 고체 아가로스 층 위에 예열된 DMEM 100마이크로리터를 추가합니다.

이 스페로이드 방울이 있는 뚜껑을 플레이트 위에 다시 놓고 스페로이드가 다시 매달리도록 한 다음 플레이트를 200배 G로 3분 동안 원심분리하여 스페로이드를 플레이트의 개별 웰로 이동합니다. 스페로이드가 가라앉을 수 있도록 플레이트를 24시간 더 배양합니다. 엔지니어링된 나노 물질 또는 ENM을 분산시킨 후 사전 예열된 DMEM을 사용하여 원하는 최종 농도로 희석합니다.

스페로이드를 사용하여 각 웰에서 50마이크로리터의 배지를 흡입하고 ENM을 사용하여 50마이크로리터의 배지로 교체합니다. 스페로이드를 수확하려면 200마이크로리터 피펫을 사용하여 100마이크로리터의 세포 배양 배지를 각 웰의 스페로이드 조직과 함께 흡인하고 아가로스와 접촉하지 않도록 주의합니다. 멸균 15ml 원심분리기 튜브에 스페로이드를 수집합니다.

스페로이드 현탁액을 230배 G에서 5분 동안 원심분리한 다음 상등액을 제거하고 추가 분석이 있을 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 스페로이드 펠릿을 1ml의 멸균 실온 PBS로 세척한 다음 230배 G에서 3분 동안 원심분리하고 상등액을 버립니다. 500마이크로리터의 0.05% 트립신-EDTA 용액에 스페로이드를 재현탁시키고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 6-8분 동안 배양합니다.

배양 후, 트립시진즈된 Hep G2 세포를 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 완전히 해리하고 재현탁시킨 후 1ml의 DMEM으로 중화시킵니다. 세포 현탁액을 230배 G에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 버리고, 세포 펠릿을 PBS 2밀리리터에 재현탁합니다. 큐벳 깔때기 설정을 만들려면 준비된 현미경 슬라이드를 금속 지지대에 놓고 슬라이드 위에 필터 카드를 놓은 다음 큐벳 깔때기를 맨 위에 고정합니다.

세포 원심분리기에 큐벳 깔때기를 깔때기가 위를 향하도록 배열하여 100마이크로리터의 세포 현탁액을 각각에 직접 추가할 수 있습니다. 그런 다음 원고 지시에 따라 슬라이드 수정을 진행합니다. 인산가수분해효소 완충액에 희석된 20%Giemsa 염색 용액을 준비합니다.

용액을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합한 다음 깔때기에 접힌 여과지로 걸러냅니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 여과된 Giemsa 용액 3-5방울을 각 슬라이드의 사이토도트에 넣고 실온에서 8-10분 동안 그대로 둡니다. 슬라이드를 두 번의 연속 포스파타제 완충액 세척으로 세척합니다.

그런 다음 찬물에 짧게 헹구어 과도한 얼룩을 제거하고 자연 건조시킵니다. 체외 독성 평가에 앞서 3D HepG2 스페로이드가 제대로 형성되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 파종 후 4일 후, 표면이 매끄럽고 시각적 돌출부가 없는 컴팩트한 구형 스페로이드가 형성되어서는 안 됩니다.

파종 4일 후 좋은 품질과 낮은 품질의 스페로이드가 여기에 시연되어 있습니다. 일반적으로 플레이트당 형성된 스페로이드의 90-95%가 올바르게 형성되고 추가 실험에 사용할 수 있습니다. 간 스페로이드 모델의 수명을 결정하고 장기 ENM 또는 화학 기반 위험 평가를 지원할 수 있는지 확인하기 위해 14일의 배양 기간에 걸쳐 생존력 및 간 유사 기능을 평가했습니다.

알부민 농도는 배양 기간 동안 일정하게 유지된 반면, 스페로이드당 요소 생산량은 14일째에 떨어지기 시작하기 전에 증가했습니다. 유전독성 평가를 위해 소핵 분석법을 사용하여 급성 및 장기 ENM 노출 후 소핵의 존재를 확인했습니다. 스페로이드는 이산화티타늄과 은의 두 가지 ENM에 노출되었습니다.

두 ENM에 급성 노출된 후 유전독성에 대한 유사한 경향이 관찰되었지만, 5일간의 장기 노출 후에는 유전독성 반응 증가가 뚜렷하지 않았습니다. 이 방법에 따라 상등액과 스페로이드를 모두 수확하여 다양한 생화학적 종말점을 얻을 수 있습니다. 여기에는 세포 생존율, 간 기능 분석, SID 450 분석, 불량한 염증 마커 및 유전자 발현이 포함됩니다.

이 기술은 현재 화학 물질과 나노 물질의 일상적인 지구 독성 테스트에 적용하고자 하는 여러 위탁 연구 실험실에서 테스트되고 있습니다. 이는 생체 내 테스트 접근 방식에 대한 의존도를 줄일 수 있는 잠재력이 있습니다.