Name: דגמי כבד תלת-ממדיים מתקדמים לבדיקות גנוטוקסיות במבחנה בעקבות חשיפה ננו-חומרית לטווח ארוך (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: למדו להעריך גנוטוקסיות בחשיפה ארוכת טווח לננו-חומרים באמצעות מודל תלת-ממדי של ספירואידים Hep G2. שיטה זו מסייעת בהפחתת ניסויים בבעלי חיים ובהערכת נזק DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להכיר בכך שמחקר זה קיבל מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי לפרויקט PATROLS, במסגרת הסכם מענק מס' 760813

<ol><li>Geiser, M., Kreyling, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deposition+and+biokinetics+of+inhaled+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Particle+and+Fibre+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Deposition and biokinetics of inhaled nanoparticles.</a> Particle and Fibre Toxicology. 7, 2(2010).</li>
<li>Modrzynska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicological+effects+of+nanoparticle+deposition+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Kgs.+Lyngby%2C+Denmark%3A+Technical+University+of+Denmark%22%5BJournal%5D)">Toxicological effects of nanoparticle deposition in the liver.</a> Kgs. Lyngby, Denmark: Technical University of Denmark. , (2018).</li>
<li>Elje, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+applied+to+HepG2+liver+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The comet assay applied to HepG2 liver spheroids.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033(2019).</li>
<li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture%3A+the+missing+link+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).</li>
<li>Shah, U. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+in+vitro+HepG2+cells+liver+spheroid+model+for+genotoxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional in vitro HepG2 cells liver spheroid model for genotoxicity studies.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 51-58 (2018).</li>
<li>Lauschke, V. M., Hendriks, D. F. G., Bell, C. C., Andersson, T. B., Ingelman-Sundberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+3D+Culture+Systems+for+Studies+of+Human+Liver+Function+and+Assessments+of+the+Hepatotoxicity+of+Drugs+and+Drug+Candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Novel 3D Culture Systems for Studies of Human Liver Function and Assessments of the Hepatotoxicity of Drugs and Drug Candidates.</a> Chemical Research in Toxicology. 29, 1936-1955 (2016).</li>
<li>van Grunsven, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+in+vitro+models+of+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">3D in vitro models of liver fibrosis.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 121, 133-146 (2017).</li>
<li>Corvi, R., Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+genotoxicity+testing+-+can+the+performance+be+enhanced%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">In vitro genotoxicity testing - can the performance be enhanced.</a> Food and Chemical Toxicology. 106, 600-608 (2017).</li>
<li>Doak, S. H., Manshian, B., Jenkins, G. J. S., Singh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+genotoxicity+testing+strategy+for+nanomaterials+and+the+adaptation+of+current+OECD+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro genotoxicity testing strategy for nanomaterials and the adaptation of current OECD guidelines.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 745, 104-111 (2012).</li>
<li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).</li>
<li>OECD. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guidelines.+Test+489%3A+In+vivo+Mammalian+Alkaline+Comet+Assay%22">OECD Guidelines. Test 489: In vivo Mammalian Alkaline Comet Assay</a>. , (2016).</li>
<li>Gerets, H. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+human+hepatocytes%2C+HepG2+cells%2C+and+HepaRG+cells+at+the+mRNA+level+and+CYP+activity+in+response+to+inducers+and+their+predictivity+for+the+detection+of+human+hepatotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins.</a> Cell Biology and Toxicology. 28, 69-87 (2012).</li>
<li>Sison-Young, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicenter+assessment+of+single-cell+models+aligned+to+standard+measures+of+cell+health+for+prediction+of+acute+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">A multicenter assessment of single-cell models aligned to standard measures of cell health for prediction of acute hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. 91, 1385-1400 (2017).</li>
<li>European Guidelines 2019. European Agency for Safety and Health at Work. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines">https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines</a> (2019).</li>
<li>Jensen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NANOGENOTOX+Dispersion+Protocol+for+NANoREG%5BTitle%5D)+AND+%22European+Union+Grant+Agreement+n%C2%B0+2009%22%5BJournal%5D)">The NANOGENOTOX Dispersion Protocol for NANoREG.</a> European Union Grant Agreement n° 2009. 21, 01(2014).</li>
<li>Marchese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aflatoxin+B1+and+M1%3A+Biological+Properties+and+Their+Involvement+in+Cancer+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Aflatoxin B1 and M1: Biological Properties and Their Involvement in Cancer Development.</a> Toxins. 10, 214(2018).</li>
<li>Rushing, B. R., Selim, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aflatoxin+B1%3A+A+review+on+metabolism%2C+toxicity%2C+occurrence+in+food%2C+occupational+exposure%2C+and+detoxification+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Aflatoxin B1: A review on metabolism, toxicity, occurrence in food, occupational exposure, and detoxification methods.</a> Food and Chemical Toxicology. 124, 81-100 (2019).</li>
<li>Kermanizadeh, A., Brown, D. M., Moritz, W., Stone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+inter-individual+Kupffer+cell+variability+in+the+governance+of+hepatic+toxicity+in+a+3D+primary+human+liver+microtissue+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The importance of inter-individual Kupffer cell variability in the governance of hepatic toxicity in a 3D primary human liver microtissue model.</a> Scientific Reports. 9, 7295(2019).</li>
<li>Berger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Liver+Cell+Models+Using+the+Basel+Phenotyping+Cocktail%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Comparison of Liver Cell Models Using the Basel Phenotyping Cocktail.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 443(2016).</li>
<li>Ramaiahgari, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+in+vitro+model+of+differentiated+HepG2+cell+spheroids+with+improved+liver-like+properties+for+repeated+dose+high-throughput+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">A 3D in vitro model of differentiated HepG2 cell spheroids with improved liver-like properties for repeated dose high-throughput toxicity studies.</a> Archives of Toxicology. , (2014).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+in+vitro+micronucleus+assay+for+evaluation+of+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the in vitro micronucleus assay for evaluation of nanomaterials.</a> Mutagenesis. 32 (1), 151-159 (2016).</li>
<li>Kirkland, D., Reeve, L., Gatehouse, D., Vanparys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+core+in+vitro+genotoxicity+battery+comprising+the+Ames+test+plus+the+in+vitro+micronucleus+test+is+sufficient+to+detect+rodent+carcinogens+and+in+vivo+genotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">A core in vitro genotoxicity battery comprising the Ames test plus the in vitro micronucleus test is sufficient to detect rodent carcinogens and in vivo genotoxins.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 721 (1), 27-73 (2011).</li>
<li>Curcio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+transfer+and+metabolic+reactions+in+hepatocyte+spheroids+cultured+in+rotating+wall+gas-permeable+membrane+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system.</a> Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).</li>
<li>Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mass+transfer+in+hepatocyte+spheroids+via+cell+viability%2C+spheroid+size%2C+and+hepatocellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86, 672-680 (2004).</li>
<li>Asthana, A., Kisaalita, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtissue+size+and+hypoxia+in+HTS+with+3D+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Microtissue size and hypoxia in HTS with 3D cultures.</a> Drug Discovery Today. 17, 810-817 (2012).</li>
<li>Gaskell, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+functional+C3A+liver+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of a functional C3A liver spheroid model.</a> Toxicology Research. 5, 1053-1065 (2016).</li>
<li>Cho, E. C., Zhang, Q., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+sedimentation+and+diffusion+on+cellular+uptake+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">The effect of sedimentation and diffusion on cellular uptake of gold nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 6, 385-391 (2011).</li>
<li>Hinderliter, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISDD%3A+A+computational+model+of+particle+sedimentation%2C+diffusion+and+target+cell+dosimetry+for+in+vitro+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Particle+and+Fiber+Toxicology%22%5BJournal%5D)">ISDD: A computational model of particle sedimentation, diffusion and target cell dosimetry for in vitro toxicity studies.</a> Particle and Fiber Toxicology. 7, 36(2010).</li>
<li>Kramer, N. I., di Consiglio, E., Blaauboer, B. J., Testai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biokinetics+in+repeated-dosing+in+vitro+drug+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+vitro%22%5BJournal%5D)">Biokinetics in repeated-dosing in vitro drug toxicity studies.</a> Toxicology in vitro. 30, 217-224 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

יישומים עבור דגמי הכבד 3D להשתנות במידה ניכרת בהתאם לנקודת הקצה הביוכימית מסוימת או מסלול תוצאה שלילית להיות ממוקד. לכל דגם יש את היתרונות והמגבלות שלו, החל מווריאציות בין-תאיות במודלים ראשוניים של הפטוציטים אנושיים (PHH) וכלה בפעילות ציטוכרום p450 מופחתת במודלים מבוססי קו תא, אך כולם בעלי ערך בזכות עצמם6,12,18,19. בעת הערכת genotoxicity יש מגבלות בתאימות מודלים עם נקודות קצה שאושרו רגולטורית כגון במבחנה micronucleus assay, כמו התפשטות פעילה נדרשת. זה הכרחי, כמו הערכת genotoxicity דורש כימות של נזק DNA קבוע כדי להיות מוערך לאחר חלוקת התא כאשר יש הזדמנות לתיקון DNA לתקן נגעים חולפים. למרבה הצער, hepatocyte מובחן מאוד (כלומר, HepaRG) מבוסס ספרואידים או microtissues PHH, אשר נחשבים להפגין את המאפיינים הרלוונטיים ביותר מבחינה פיזיולוגית דמויי כבד טופס סטטי (לא שגשוג) מודלים12,19,20. כתוצאה מכך, דגם הכדוריד 3D HepG2 המוצג כאן מספק מודל מתאים ואלטרנטיבי המסוגל לתמוך בבדיקות גנוטוקסיות. Spheroids מבוססי קו התא HepG2 יש מספיק תאים מפרידים באופן פעיל על פני השטח החיצוניים של spheroids תוך שמירה על מאפיינים בסיסיים דמויי כבד, כגון ייצור אלבומין אוריאה וכמה פעילות CYP4505,12,19. בעיקר מודל זה בכבד במבחנה פותחה כדי להשלים את הבדיקה micronucleus, שכן זהו אחד משני מבחני במבחנה מומלץ בסוללה לבדיקת genotoxicity8,10,11,21. עם זאת, המודל יכול להיות מיושם בקלות על ניתוח רצף DNA וטכנולוגיות ביטוי גנים (RNA), בעוד שיש לו פוטנציאל להיות מותאם עוד יותר מנוצל עבור נקודות קצה אחרות נזק DNA, כגון שביט assay. עם זאת, חשוב לקחת בחשבון את התפקיד שהפרעות ENM ממלאות בניתוחים מסוימים של נקודות קצה. לדוגמה, ניתוחים מבוססי cytometry זרימה לא יכול להיות מתאים להערכת genotoxicity ENM במיוחד עקב הפרעה חלקיקים22.
גורם מגביל אחד של מודלים ספרואידיים שעוברים באופן פעיל חלוקת תאים הוא גודלם. אופטימיזציה של צפיפות הזריעה היא קריטית מכיוון שצריכים להיות מספיק תאים המאפשרים למודל להמשיך להתרבות; אבל לא מספר תא גבוה מדי, מה שמוביל לכך שהספרויד הופך לקומפקטי מדי, מה שמוביל לליבה נמקית מוגברת. הגורם לנמק זה הוא האמין להיות מוגבל חמצן ופיזור מים מזינים, כמו הגבול של דיפוזיה זו נחשבת כ 100 – 150 מיקרומטר של רקמה23,24. עם זאת, הדבר תלוי בסוג התא, מספר התא, אינטראקציות הפיגומים ותנאי התרבות25. מאז, הוכח כי כ 700 קוטר מיקרומטר הוא הגבול למניעת התפרצות מוקדמת של נמק במרכז כדורי C3A, זריעת 4000 תאי HepG2 לכל ספרואיד מבטיח את קוטר הדגם בזמן החשיפה הוא ≤500 מיקרומטר26. יתר על כן, Shah et al. קבע כי תאי HepG2 זרעים מעל 5000 תאים לכל ספרואיד הציג ירידה של 25% בכדאיות לאחר 7 ימים בתרבות, אשר יכול לכלול את הקוטר הממוצע של 680 מיקרומטר וזמינות מוגבלת של חומרים מזינים בירידה תלויה 20 μL5. כדי להתגבר על כך, המודל שהומצא בפרוטוקול הנוכחי עובר שלב קריטי שבו הטיפה התלויה מועברת לבארות מצופות אגרוז לאחר היווצרות ראשונית של הספרואיד. זה מבטיח נפח גדול יותר של מדיום תרבות קיים כדי לקיים את המספר ההולך וגדל של תאים בתוך spheroids. כתוצאה מכך, המודל הכדורי HepG2 נשאר מעל 70% קיימא לאחר 10 ימים בתרבות והוא יכול להיות מנוצל להערכת סכנה לטווח ארוך במבחנה. 
בעוד המודל הכדורי HepG2 יכול לתמוך הן משטרי חשיפה חריפה וארוכת טווח, מרענן את תרבות התא בינוני במהלך תקופות תרבות מורחבת מוגבל עבור מודל זה כמו החלפה מלאה של המדיום לא מומלץ בשל אובדן פוטנציאלי של spheroids. יש להניח כי עם חשיפות ENM, הנטייה לפיזור ENM הומוגנית כדי agglomerate ומשקעים הוא גבוה. עם זאת, ראוי לציין כי הקצב שבו משקעי ENM יכולים להשתנות בהתאם לפרמטרים החלקיקים (למשל, גודל, צורה וצפיפות) וניתן לקבוע באופן תיאורטי באמצעות משקעים במבחנה, דיפוזיה ודוזימטריה (ISDD), או נגזרות האחרונות שלה, המכונה לעתים קרובות כאשר לגבי ENM (השעיה) חשיפה מתקרב27,28. עם זאת הוא המוח, ההנחה היא כי אם רק 50% של מדיום תרבות התא מוסר בזהירות מפני השטח של תרבות התא, ההפרעה והסרה לאחר מכן של מינון ENM צריך בתיאוריה להיות מינימלי. עם זאת, עם תנועה בראונית במשחק, זה לא יכול להיות המקרה בקפדנות ועבודה נוספת לתוך התצהיר ואת משקעים של כל ENM מסוים להיבדק צריך להתבצע כדי להבטיח את הדוזימטריה הנכונה נשמרת לאורך כל משטר החשיפה לטווח ארוך27. בעיקר זוהי מגבלה פוטנציאלית שיש לקחת בחשבון בעת ביצוע משטרי מנון חוזרים ונשנים שכן זה יכול להיות קריטי לריכוז הסופי, המצטבר. חשיפות מבוססות כימית מצד שני, אמנם לא בלי המגבלות שלהם לשקול, מציעים גישה פשטנית יותר בכך חומרים כימיים נוטים להישאר בתמיסה ובכך החלפה ישירה של הריכוז הכימי המקורי בנוסף לריכוז החדש שנוסף מבטיח כי כל כימיקל שאבד במהלך כיבוד התקשורת מוחלף בהתאם29. יישומים עתידיים יכללו הערכת ההתאמה של המודל למשטרי חשיפה חוזרים ונשנים לאורך תקופות תרבות ארוכות טווח, שכן אסטרטגיות מינון חוזרות ונשנות חשובות ביותר להערכת היכולת של מערכת איברים מסוימת לשפר או להתגבר על ההשפעות השליליות, אם בכלל, הנגרמות על ידי ביואקומולציה של חומר קסנוביוטי.
לסיכום, מודל זה 3D במבחנה הכבד יש את היכולת להיות מנוצל להערכת מגוון של תרחישי חשיפה מציאותיים, ובכך לספק גישה במבחנה בעתיד כדי לתמוך טוב יותר הן ENM והערכת סכנה כימית באופן שגרתי ונגיש בקלות.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section was updated.
Figure 6 in the Representative Results section was updated from:
<img alt="Cell culture analysis; graph of cell viability and bar charts of albumin, urea over time in days." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 6">
to:
<img alt="Cell viability, albumin, and urea levels over 14 days in culture; graphs of cell culture analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 6">
The fourth paragraph in the Representative Results section was updated from:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &gt;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the ≥14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be ≥0.06 mg/mL whilst urea production should be ≥0.4 ng/µL before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.
to:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &gt;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the ≥14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be ≥50.0 ng/μL whilst urea production should be ≥0.25 ng/µL before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.

Erratum: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

בשל ההתפתחות המהירה והיישום של מגוון רחב של ננו-חומרים מהונדסים (ENM) על פני שפע של יישומים מבוססי אדם (למשל, מזון, קוסמטיקה, ביגוד, ציוד ספורט, אלקטרוניקה, תחבורה ורפואה), זה בלתי נמנע כי בני אדם ייחשפו ENM על בסיס קבוע. עם זאת, ישנם חששות מוגברים כי הרומן, גודל ספציפי פיזיותרפיה מאפיינים כימיים המ סבורים חומרים אלה יתרון ביישומים רבים עלול לגרום להשפעות שליליות על בריאות האדם ועל הסביבה בו זמנית. כיום פעילויות בינלאומיות רבות נמצאות במקום כדי לשקף באופן פעיל חשיפות רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית ENM אלה ולהעריך את הרעילות הפוטנציאלית של חומרים אלה על פני תרחישי חשיפה חריפים, ארוכי טווח, חוזרים ונשנים במינון נמוך.
טוקסיקולוגיה בכבד היא המפתח כאשר בוחנים חשיפה ENM, כפי שהוא ידוע כי הכבד הוא אתר מרכזי של הצטברות ENM לאחר חשיפה1,2. יתר על כן, הכבד הוא מערכת האיברים העיקרית לחילוף חומרים וניקוי רעלים של חומרים הנכנסים למחזור המערכתי3. בהתבסס על ההבנה המקובלת כי מודלים 2D hepatocyte אינם מחקים במדויק את המורכבות של אינטראקציות רב תאיות מורכבות או מייצגים כראוי פעילות מטבולית שנצפתה vivo, התמקדות גדולה יותר לפתח חזק רלוונטי מבחינה פיזיולוגית במבחנה 3D מודלים הכבד עבור טכנולוגיות תחליף in vivo הוקמה4,5. שימוש בטכנולוגיות תרבות תלת-ממדיות מתקדמות משפר את תוחלת החיים של דגמי הכבד במבחנה ומאפשר לחקור משטרי חשיפה ארוכי טווח וחוזרים ונשנים. בנוסף, פורמט תרבות מתקדם זה מקדם היווצרות של תכונות פיזיולוגיות משופרת, organotypic כגון canaliculi מרה, תהליכי טרנספורטר פעיל ויכולות חילוף חומרים תרופתיות משופרות CYP450, ובכך לשפר את החיזוי של הדגמים6. מודלים נוכחיים של 3D במבחנה בכבד המורכבים מתרבויות מונו (hepatocytes בלבד) או תרבויות משותפות (hepatocytes עם תאים שאינם פרנצ'יליים) קיימים במספר פורמטים, החל microtissues או spheroids בלוחות הידבקות אולטרה, ספירואידים טיפה תלויים, תאים מוטבע מטריצות ו / או פיגומים פלטפורמות תרבות תאים מיקרופלואידיים, כולם נחשבים יעילים מתקדם במבחנה מודלים להערכת רעילות בכבד6,7. עם זאת, רוב מערכות מודל אלה הן תחזוקה גבוהה, דורשים ציוד מיוחד והם יקרים. יתר על כן, מודלים אלה הם לעתים קרובות סטטיים (כלומר, מודלים תאים שאינם מחולקים) המונע את השימוש בהם להערכת נקודות קצה סיכון, כגון בדיקות genotoxicity ניצול שיטות לכמת נזק DNA קבוע. Genotoxicity הוא תנאי מוקדם ליבה בטוקסיקולוגיה רגולטורית, וזה מרכיב חיוני של הערכת הסיכון של כל רעיל8. אין מבחנים בודדים שניתן ליישם כדי לכמת את כל צורות הנזק לדנ"א שעלולות להתעורר בעקבות חשיפה לסוכן אקסוגני. עם זאת, מרכיב הליבה של הסוללה בדיקות genotoxicity במבחנה הוא הבדיקה micronucleus, שהיא טכניקה אמינה ורבת פנים המודדת נזק כרומוזומלי ברוטו9. זוהי טכניקה סטנדרטית זהב המתוארת על ידי ה-OECD מבחן קו מנחה 487, להערכת נזק DNA במבחנה genotoxicity והוא חלק הדרישה סוללת הבדיקה להערכת סיכון רגולטורי10,11.
קו התא קרצינומה hepatocellular האנושי, HepG2, נמצא בשימוש נרחב עבור הקרנת הערכת סכנה ראשונית כמו התאים זמינים, זול יחסית למקור, פשוט לתרבות נוח להקרנת תפוקה גבוהה12,13. כאשר מתורבתים לתוך מבנים כדוריים 3D, הם הוכחו recapitulate את הכבד microenvironment היטב ולהציע מודל כבד עם יכולות שגשוג מספיק כדי לתמוך micronucleus assay3. פיתוח נוסף של מודלים כדוריים HepG2 הוקמה כדי לשפר את תוחלת החיים ואת הפונקציונליות דמוית הכבד של המודל על מנת לתמוך הערכת סכנת genotoxicity על פני משטרי חשיפה ארוכי טווח, חוזרים ונשנים (≤14 ימים). לכן, בהתאם לעקרונות של 3Rs להחליף, להפחית ולמקד ניסויים בבעלי חיים, הפרוטוקול הנוכחי הוקם כדי לספק מודל מתקדם 3D במבחנה הכבד מסוגל להעריך באופן אמין נקודות קצה טוקסיקולוגיות מרובות (למשל, פונקציונליות הכבד, (פרו)סמנים דלקתיים, cytotoxicity ו genotoxicity) בעקבות חשיפות כימיות ו- ENM חריפה, ארוכת טווח וחוזרת על עצמה בשגרה
כאן, אנו מציגים שיטה להקים קו תאים 3D hepatocyte רלוונטי מבחינה פיזיולוגית מבוסס במערכת מודל במבחנה להערכת סכנת genotoxicity בעקבות חשיפות ENM חריפה או ארוכת טווח, חוזרות ונשנות. ניתן לחלק את הפרוטוקול ל-6 שלבים מרכזיים: תאי HepG2 קריאופרדים; הכנת ספרואיד HepG2; העברת ספרואיד HepG2 מירידה תלויה להשעיה agarose; קציר כדורי HepG2; micronucleus מבחנים וניקוד; וניתוח נתונים.

<table><tbody><tr><td>אפלוטוקסין B1</td><td>סיגמא אולדריץ', בריטניה</td><td>A6636-5MG</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>סיגמא אולדריץ', בריטניה</td><td>A9539-50G</td><td></td></tr><tr><td>קלטת</td><td></td><td></td><td></td>חיטוי</tr><tr><td>BCG בדיקת אלבומין</td><td>סיגמא אולדריץ', בריטניה</td><td>MAK124</td><td></td></tr><tr><td>אבקת אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא אולדריץ', בריטניה</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>סיוע להקפאת תאים</td><td>תרמו פישר Scientific, UK</td><td>5100-0001 - Mr Frosty</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Merck, UK</td><td>250233</td><td></td></tr><tr><td>Cytology Metal Clips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 4 צנטריפוגה</td><td>ThermoFisher Scientific, UK</td><td>CM00730202</td><td></td></tr><tr><td>DMEM עם 4.5 גרם/ליטר D-גלוקוז, L-גלוטמין</td><td>GIBCO, פייזלי, בריטניה</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, ללא פנול אדום עם 4.5 גרם/ליטר D-גלוקוז, L-גלוטמין עם Hepes</td><td>GIBCO, פייזלי, בריטניה</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>DPX הרכבה בינונית</td><td>FisherScientific, UK</td><td>D/5330/05</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10048291</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>כרטיסי סינון עבור Shandon Cytospin</td><td>FisherScientific, בריטניה</td><td>15995742</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות זכוכית חלבית</td><td>ThermoFisher Scientific, בריטניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת R66 משופרת לכתמים של Giemsa, Gurr</td><td>VWR Chemicals, בריטניה</td><td>MFCD00081642</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית (24 x 60)</td> <td>Deckglaser, VWR</td><td>ECN631-1575</td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר ושמן טבילה Coverslip</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>עבור מיקרוסקופ</td><td>זייס, בריטניה</td><td>518F, ISO8034</td><td></td></tr><tr><td>מכסה המנוע למינארי Class II תרבית רקמות</td><td>Scanlaf מיקרוסקופ אור מאדים</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss, בריטניה</td><td>Axiovert 40C</td><td></td></tr><tr><td>חנקן</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוזלי מתנול</td><td>FisherScientific, בריטניה</td><td>10284580</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוגל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>לא מסונן, סטרילי 200&מיקרו; l ו-1000&micro; l קצות פיפטות</td><td>Greiner-Bio-One, בריטניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NuncMicroWell 96-Well Microplates</td><td>ThermoFisher Scientific, דנמרק</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופיפטות</td><td></td><td></td><td></td>P1000 ו-P200</tr><tr><td>P300 ו-P50 פיפטות</td><td></td><td></td><td></td>רב-ערוציות</tr><tr><td>PBS pH 7.4 1X, MgCl2 ו-CaCl2 חינם</td><td>GIBCO, פייזלי, בריטניה</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Pen / Strep</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>15140-122, פניצילין / סטרפיוצין 100X או 10,000U / ml</td><td></td></tr><tr><td>טבליות חיץ פוספטאז</td><td>GIBCO, פייזלי, בריטניה</td><td>10582-013</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Boy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific CytoSep משפכים עבור שנדון ציטוספין 4 צנטריפוגות</td><td>FisherScientific, UK</td><td>11690581</td><td></td></tr><tr><td>סוניפייר SFX 550 240V CE 1/2" - Probe</td><td>Branson, ארה"ב</td><td>101-063-971R</td><td></td></tr><tr><td>T-25 ו-T-75 בקבוק תרבית רקמות</td><td>Greiner-Bio-One, בריטניה</td><td>T-25 (690175) ו-T-75 (660175)</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>T8154-100mL</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת אוריאה</td><td>סיגמא אולדריץ', בריטניה</td><td>MAK006</td><td></td></tr><tr><td>Virkon חיטוי</td><td>דופונט, בריטניה</td><td>Reli+On Virkon</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים (37? ג)</td> <td>גרנט JBNova 18</td><td></td><td></td></tr><tr><td>איזון</td><td></td><td></td><td></td>שקילה</tr><tr><td>קסילן</td><td>פישרסיינטיפיק, בריטניה</td><td>10588070</td><td></td></tr><tr><td>0.05% טריפסין-EDTA</td><td>GIBCO, פייזלי, בריטניה</td><td>5300-054</td><td></td></tr><tr><td>0.2 מ"ל ו-1.0 מ"ל צינורות אפנדורף</td><td>גריינר-ביו-וואן, בריטניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 ומיקרו; m יחידת סינון</td><td>Millex HA, MF-Millipore, בריטניה</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>מזרק BD</td><td>Plastipak, FisherScientific, בריטניה</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני זכוכית מנצנצים 20 מ"ל LS, 22-400 מכסי PP מרופדים בנייר כסף</td><td>DWK Life Sciences GmbH, גרמניה</td><td>WHEA986581</td><td></td></tr><tr><td>37? C ו-5% CO2 ISO Class 5 חממת מסנן Hepa</td><td>NUAIRE DHD Autoflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 מ"ל פסטר פיפטה</td><td>Greiner-Bio-One, בריטניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות בז חרוטי</td><td>Greiner-Bio-One, בריטניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל או 100 מ"ל בקבוקי</td><td></td><td></td><td></td>זכוכית</tr><tr><td>50 מ"ל צינורות בז חצאית</td><td>Greiner-Bio-One, בריטניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל, 10 מ"ל ופיפטות 25 מ"ל</td><td>Greiner-Bio-One, בריטניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9.4 ס"מ מרובע, Petri Dish</td><td>Greiner-Bio-One, בריטניה</td><td>688161</td><td></td></tr></tbody></table>

דגמי כבד תלת-ממדיים מתקדמים לבדיקות גנוטוקסיות במבחנה בעקבות חשיפה ננו-חומרית לטווח ארוך

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

בשל ההתפתחות המהירה והיישום של מגוון רחב של ננו-חומרים מהונדסים (ENM), חשיפה ל- ENM היא בלתי נמנעת ופיתוח מערכות בדיקה במבחנה חזקות וחיזוי הוא חיוני. טוקסיקולוגיה בכבד היא המפתח כאשר בוחנים חשיפה ENM, כמו הכבד משמש תפקיד חיוני הומאוסטזיס מטבולית דטוקסיפיקציה, כמו גם להיות אתר מרכזי של הצטברות ENM לאחר חשיפה. בהתבסס על זה ועל ההבנה המקובלת כי מודלים hepatocyte 2D אינם מחקים במדויק את המורכבות של אינטראקציות רב תאיות מורכבות ופעילות מטבולית שנצפו vivo, יש דגש גדול יותר על התפתחות של מודלים כבד 3D רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית המותאמים למטרות הערכת סיכון ENM במבחנה. בהתאם לעקרונות של 3Rs להחליף, להפחית ולמקד ניסויים בבעלי חיים, מודל כבד מבוסס קו התא 3D HepG2 פותחה, שהיא ידידותית למשתמש, מערכת חסכונית שיכולה לתמוך הן משטרי חשיפה ENM מורחבים וחוזרים על עצמם (≤14 ימים). מודלים ספירואידיים אלה (קוטר ≥500 מיקרומטר) שומרים על יכולתם המשגשגת (כלומר, חלוקת מודלים של תאים) המאפשרת להם להיות משולבים עם בדיקת מיקרונוקלאוס 'תקן זהב' כדי להעריך ביעילות את הגנוטוקסיות במבחנה. היכולת שלהם לדווח על מגוון של נקודות קצה טוקסיקולוגיות (למשל, תפקודי כבד, (פרו)תגובה דלקתית, cytotoxicity ו genotoxicity) התאפיינה באמצעות מספר ENMs על פני שני אקוטי (24 שעות) ו לטווח ארוך (120 h) משטרי חשיפה. מודל זה 3D במבחנה הכבד יש את היכולת להיות מנוצל להערכת חשיפות ENM מציאותי יותר, ובכך לספק גישה במבחנה בעתיד כדי לתמוך טוב יותר הערכת סכנה ENM באופן שגרתי ונגיש בקלות.

ההתאמה של מודל ספירואיד כבד תלת-ממדי מבוסס קו תאים זה לתרבות ארוכת טווח והערכת סכנה גנוטוקסית הוערכה על ידי ביצוע אפיון בסיסי כדי לקבוע את הכדאיות ואת הפונקציונליות דמוית הכבד של המודל לאורך משך 14 ימים בתרבות, כמו גם את הישימות שלה עבור מבחני מיקרונוקלוס.
אפיון בסיסי של דגם כדורי כבד HepG2 תלת-ממדי לפני כל הערכה טוקסיקולוגית במבחנה, חשוב לבדוק כי כדורי HepG2 3D נוצרו כראוי לפני ביצוע העברת agarose או טיפול כימי / ENM. כדורי HepG2 המיוצרים בשיטת הירידה התלויה לוקחים בדרך כלל 2 - 3 ימים לאחר זריעה (4000 תאים / ספרואיד) כדי ליצור ספירואידים קומפקטיים בצורת כדורית בקוטר ממוצע של 495.52 מיקרומטר W x 482.69 מיקרומטר H כפי שמוצג באיור 5A-5C. כדורי HepG2 שנוצרו כראוי והם מקובלים לשמש להערכה טוקסיקולוגית במבחנה חייב להיות מבנה קומפקטי, כדורי בצורת עם משטח חלק ללא הקרנות חזותיות. איור 5 מספק דוגמאות לאיכות טובה (איור 5D-F)וספרואידים באיכות ירודה (איור 5G-I). האחרון שבהם צריך להיות מושלך. בדרך כלל, 90-95% של spheroids נוצר לכל צלחת תיווצר כראוי להיות קיימא לניסויים נוספים.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig5.jpg"> איור 5: תמונות מיקרוסקופיות קלות המציגות את המורפולוגיה הטבעית של הספרואידים HepG2 שנוצרו באמצעות שיטת הטיפה התלויה. (A-C) להראות יום 2 ו (D-I) יום 4 HepG2 כבד spheroids פוסט זריעה. (D-F)הם דוגמאות של ספירואידים HepG2 באיכות טובה בעוד (G-I) מראה ספרואידים בצורה גרועה. כל התמונות צולמו במטרה X20 באמצעות מיקרוסקופ. סרגל קנה המידה מייצג 20 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig5large.jpg" target="_blank">מיקרומטר.</a>
כדי לאשר עוד יותר את הכדאיות הכדורית HepG2, אלבומין ירוק ברומוקרסול צבעוני בסיסי (BCG) Assay או Urea Assay יכול להתבצע כדי להעריך את הפונקציונליות דמוית הכבד שלהם. פונקציונליות דמוית כבד הוערכה בהתאם לכדאיות באמצעות מבחני ההדרה הכחולים של Trypan במשך 14 יום כדי לקבוע את תוחלת החיים של מודל הכדוריד בכבד ולקבוע אם הוא יכול לתמוך בהערכת סיכונים מבוססת ENM/כימית לטווח ארוך או חוזרת ונשנית (איור 6). ריכוז האלבומין נותר עקבי לאורך תקופת התרבות. ייצור אוריאה מציג עלייה בריכוז של אוריאה המיוצר ספרואיד במשך שבוע בתרבות לפני שהגיע לרמה ביום 7. חשוב לציין כי רמות אלבומין ואאוריאה המיוצרים בספרואידים 3D HepG2 גבוהות משמעותית מזו שנצפו באותו קו תאים בתרבית בפורמט דו-ממדי. ואכן, תרבויות דו-מימדיות של תאי HepG2, שיא אלבומין ורמות אוריאה היו 0.001 מ"ג/מ"ל ו-0.010 ננוגרם/μL בהתאמה. יתר על כן, בעבודה קודמת שפורסמה על ידי שאה ואח 'באמצעות מערכת כדורית HepG2 כמעט זהה, המחברים מדגישים שיפור ניכר בפעילות מטבולית (CYP1A1 ו CYP1A2) במערכות מודל 3D HepG2 במבחנה בהשוואה לתאי HepG2 בתרבית דו-ממדית5.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg"> איור 6: נתוני אפיון בסיסי ל-14 יום עבור ספירואידי כבד HepG2. לאחר ההעברה מירידהתלויה,( A ) מדגיש את הכדאיות של דגם הכדורואיד HepG2 על פני תקופה של 14 יום בעוד (B) ו -( C) להדגיש את פונקציונליות אלבומין דמוי כבד אוריאה בהתאמה. נתונים ממוצעים ± SEM שהוצגו, n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
עם ההתפתחות הבלתי נמנעת של ליבה נמקית, מגבלה ידועה של תרביות ספירואיד כבד 3D, הכדאיות של מודל זה מבוסס HepG2 היה צריך להיות הוקמה כדי להדגים שהוא היה מסוגל לקיים לטווח ארוך (5-10 יום) משטרי חשיפה תוך שמירה על יכולת התפשטות הנדרשת כדי לתמוך micronucleus assay5. ואכן, מודל זה כדורי כבד 3D הוכח לשמור על &gt;70% הכדאיות על פני 10 ימים בתרבות. בהתבסס על זה בשילוב עם פונקציונליות דמוית כבד מתמשכת שנצפתה במהלך תקופת התרבות ≥14 יום, מודל זה של כבד 3D spheroids יכול ובכך לתמוך לטווח ארוך, משטרי חשיפה חוזרת ונשנית ENM עד 10 ימים (כלומר, לפני הכדאיות של spheroids לרדת מתחת 70%). לעיון, מומלץ כי רמות אלבומין עבור כדורי HepG2 זרעים ב 4000 תאים / ספרואיד צריך להיות ≥20.0 ng/μL בעוד ייצור אוריאה צריך להיות ≥0.25 ng/μL לפני ביצוע הערכה טוקסיקולוגית במבחנה עם מודל זה.
הערכת גנוטוקסיות של ננו-חומרים מהונדסים להערכת genotoxicity, assay micronucleus שימש כדי לקבוע את נוכחותו של micronuclei בעקבות חשיפות אקוטיות (24 שעות) ו לטווח ארוך (120 שעות) ENM. Aflatoxin B1 הוא מסרטן כבד ידוע16,17 והוא שליטה חיובית מומלצת עבור בדיקת micronucleus. ניסויי אופטימיזציה הראו כי 0.1 מיקרומטר של אלפאטוקסין B1 גורם חיובי משמעותית (עלייה ≥2.0 קיפול) תגובה genotoxic ב 3D HepG2 כבד spheroids ולכן משמש בכל micronucleus assay שנערך עם מודל זה. כדי להבטיח את תוקפם של תוצאות בדיקת המיקרו-נוקלוס באמצעות דגם הכדורית HepG2, תדר המיקרו-נוקלוס ברקע לתאי HepG2 המשמשים במודל זה של 3D במבחנה צריך להיות בטווח של 0.6% – 1.2%. כתוצאה מכך, Alfatoxin B1 צריך לגרום לתגובה genotoxic של לפחות פי שניים גבוה יותר מזה שנראה עם שליטה שלילית; לכן, 0.1 מיקרומטר של אלפאטוקסין B1 צריך לגרום לתדר micronuclei בין 1.5% – 3.0%. באמצעות פרמטרי בקרה אלה, ניתן להעריך באופן מהימן את genotoxicity המשויך ל- ENM במבחנה. בהתבסס על הנחיות הבדיקה של ה-OECD 487, חשוב לציין כי בעת בדיקת ENM או כימיקל, הריכוזים שנבחרו לא צריכים לגרום ליותר מ -55% ± 5% ציטוקסיות (המצוין על ידי ירידה בערכי CPBI או RVCC ביחס לשליטה השלילית)11. איור 7 ממחיש את הנתונים שנוצרו כאשר Aflatoxin B1 ושני ENMs (טיטניום דו-חמצני (TiO2)ורסיס (Ag)) הוערכו בעקבות חשיפות חריפות וארוכות טווח בספרואידים של HepG2, והפוטנציאל הגנוטוקסי הבא נותח באמצעות מבחני המיקרו-נוקלוס. שני ENMs העריכו נבדקו במינון לא ציטוקסי, נמוך של 5.00 מיקרוגרם / מ"ל על חשיפה חריפה (24 שעות) ומשטר חשיפה לטווח ארוך (120 שעות). מגמה דומה עבור genotoxicity על פני שני TiO2 ו Ag ENMs ניתן לראות, לפיה תגובת genotoxicity מוגבהת שהביאה לאחר חשיפה 24 שעות לא היה ניכר לאחר חשיפה לטווח ארוך 5 ימים. זאת למרות גנוטוקסיות מתמשכת הנגרמת על ידי השליטה החיובית Aflatoxin B1 בשתי נקודות הזמן.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig7.jpg"> איור 7: הערכת Genotoxicity בעקבות חשיפה TiO2 ו Ag ENM על כדורי כבד HepG2. הערכת Genotoxicity (תדר מיקרונוקלוס) באמצעות הפוסט micronucleus assay (A) חריפה (24 שעות) ו -( B) לטווח ארוך (120 שעות) חשיפה ל 5.00 מיקרוגרם / מ"ל של TiO2 ו Ag ENM. שליטה שלילית היא מדיה בלבד, בעוד השליטה החיובית היא 0.1 מיקרומטר של Aflatoxin B1. נתונים ממוצעים (n = 2) שהוצגו ± SD. Significance מצוין ביחס לבקרה השלילית: * = p≤ 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig7large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

הליך זה הוקם כדי לשמש לפיתוח תרבויות חזה 3D מתקדמות במבחנה, אשר יכול לספק הערכה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית של הסיכונים genotoxic הקשורים חשיפות ננו חומריים על פני משטרי מינון חריפה או ארוכת טווח, חוזרים ונשנים.

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

מודל Hep G2 זה מספק אלטרנטיבה רלוונטית למערכת בדיקות מבחנה כדי להעריך בצורה מהימנה יותר את האינדוקציה הפוטנציאלית של נזק קבוע ל-DNA בעקבות חשיפה ארוכת טווח לננו-חומר במטרה למזער את הצורך בניסוי בבעלי חיים. למודל הספרואיד Hep G2 יש את היכולת להישאר בר-קיימא ותפקודי לאורך תקופה של 14 יום, כמו גם לשמור על רמת התפשטות מתאימה. זה תומך בבדיקה של מגוון נקודות קצה ביוכימיות וגנוטוקסיות, כולל בדיקת המיקרו-גרעין.לפני שתנסה את הפרוטוקול הזה, אני מציע לך לעשות כמה ריצות תרגול קודם. היזהר בעת זריעת תאים או החלפת מדיה, מכיוון שאלה דורשים גישה עדינה. התחל בהוספת 100 מיקרוליטר PBS סטרילי בטמפרטורת החדר לבארות של צלחת תרבית 96 בארות.הפוך את מכסה הצלחת ופיפטה בזהירות 20 טיפות מיקרוליטר של מתלה התא למרכז כל חריץ באר של המכסה. השתמש בפיפטה רב-ערוצית, הוסף שתיים עד ארבע טיפות בכל פעם, כדי להבטיח דיוק במיקום. זרע רק ארבעה סטרואידים בכל פעם וודא שכל קצות הפיפטה מיושרים לפני שמתחילים.הזווית שבה אתה מחזיק את הרב-ערוצי תעשה את ההבדל באופן היווצרות הספרואידים. וודאו שהטיפות מרוכזות בתוך חריצי הבארות שעל המכסה, ולאחר מכן הפכו בעדינות את המכסה על גבי הצלחת כך שהטיפות יתלו מעל הבארות בעזרת PBS. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני במשך שלושה ימים לפני העברת הכדור לאגרוז.לאחר הדגירה, הסר את הצלחת מהחממה והרם בזהירות את המכסה מהצלחת, השליך את ה-PBS, הקש על הצלחת כדי להסיר שאריות נוזל, ואפשר לצלחות להתייבש באוויר במשך שתיים-שלוש דקות. לאחר המסת האגרוז, סובבו אותה בעדינות כדי להסיר בועות והוסיפו 50 מיקרוליטר לבסיס כל באר. השאירו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות, ואז הוסיפו 100 מיקרוליטר של DMEM מחומם מראש על גבי שכבת האגרוז המוצקה בכל באר.הנח את המכסה עם טיפות הכדור הזה בחזרה על גבי הצלחת כך שהספרואידים שוב תלויים, ואז צנטריפוגה את הצלחת למשך שלוש דקות ב-200 פעמים G כדי להעביר את הספרואידים לבארות הבודדות של הצלחת. דגרו את הצלחת למשך 24 שעות נוספות כדי לאפשר לספרואידים להתייצב. לאחר פיזור הננו-חומרים המהונדסים, או ENMs, יש לדלל אותם לריכוז הרצוי הסופי עם DMEM מחומם מראש.שאפו 50 מיקרוליטר בינוני מכל באר עם הספרואידים והחליפו אותו ב-50 מיקרוליטר מדיום עם ה-ENM. כדי לקצור את הספרואידים, השתמש בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לשאוב את 100 המיקרוליטר של מדיום תרבית התאים עם הרקמה הספרואידית מכל באר, תוך הקפדה על הימנעות ממגע עם האגרוז. אוספים את הספרואידים בצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מיליליטר.צנטריפוגה את התרחיף הספרואיד ב-230 פעמים G למשך חמש דקות, ואז הסר את הסופרנטנט ואחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף. שטפו את כדור הכדורים במיליליטר אחד של PBS סטרילי בטמפרטורת החדר, ואז צנטריפוגה אותם ב-230 פעמים G למשך שלוש דקות והשליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את הספרואידים ב-500 מיקרוליטר של תמיסת 0.05% טריפסין-EDTA ודגרו אותם במשך שש עד שמונה דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.לאחר הדגירה, פיפטה בעדינות את תאי ה-Hep G2 הטריפסינזים למעלה ולמטה כדי להתנתק לחלוטין ולהשעות אותם מחדש לפני נטרול עם מיליליטר אחד של DMEM. צנטריפוגה של תרחיף התא ב-230 פעמים G למשך חמש דקות, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא בשני מיליליטר של PBS. כדי ליצור משפך קובטה, הנח את שקופית המיקרוסקופ המוכנה לתוך תומך המתכת, הנח כרטיס סינון על גבי השקופית, ולאחר מכן אבטח את משפך הקובט למעלה.מסדרים את משפכי הקובט בציטו-צנטריפוגה כשהמשפך פונה כלפי מעלה כך שניתן להוסיף ישירות 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל אחד מהם. לאחר מכן המשך בתיקון השקופיות לפי הוראות כתב היד. הכן תמיסת צביעה של 20% Giemsa מדוללת במאגר פוספטאז.פיפטה בעדינות את התמיסה למעלה ולמטה כדי לערבב אותה, ואז לסנן אותה עם נייר סינון מקופל במשפך. השתמש בפיפטה של פסטר כדי להוסיף שלוש עד חמש טיפות של תמיסת Giemsa מסוננת לציטודוט בכל שקופית והשאיר אותה למשך שמונה עד 10 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את השקופיות בשתי שטיפות חיץ פוספטאז רצופות.לאחר מכן שטפו אותם בקצרה תחת מים קרים כדי להסיר כתם עודף והשאירו אותם לייבוש באוויר. לפני כל הערכה טוקסיקולוגית במבחנה, חשוב לבדוק שהספרואידים התלת-ממדיים HepG2 נוצרו כראוי. ארבעה ימים לאחר הזריעה, אמורים להיווצר ספרואידים קומפקטיים בצורת כדור עם משטח חלק וללא הקרנות חזותיות.ספרואידים באיכות טובה ובאיכות ירודה ארבעה ימים לאחר הזריעה מודגמים כאן. בדרך כלל, 90 עד 95% מהספרואידים שנוצרו בכל צלחת ייווצרו כהלכה ויהיו ברי קיימא לניסויים נוספים. הכדאיות והתפקוד דמוי הכבד הוערכו על פני תקופת תרבית של 14 יום כדי לקבוע את אורך החיים של מודל הספרואידים בכבד ולקבוע אם הוא יכול לתמוך ב-ENM ארוך טווח או בהערכת סיכונים מבוססת כימיקלים.ריכוז האלבומין נשאר עקבי לאורך תקופת התרבית, בעוד שייצור האוריאה לכדור גדל לפני שהחל לרדת ביום ה-14. להערכת גנוטוקסיות, נעשה שימוש בבדיקת המיקרו-גרעין כדי לקבוע את נוכחותם של מיקרו-גרעינים לאחר חשיפות חריפות וארוכות טווח ל-ENM. הספרואידים נחשפו לשני ENMs, טיטניום דו חמצני וכסף.מגמה דומה של גנוטוקסיות נצפתה לאחר חשיפה חריפה לשני ה-ENMs, אך התגובה הגנוטוקסית המוגברת לא ניכרה לאחר חשיפה ארוכת טווח של חמישה ימים. בעקבות שיטה זו, ניתן לקצור גם את הסופרנטנט וגם את הספרואידים עבור מספר רב של נקודות קצה ביוכימיות. אלה כוללים כדאיות תאים, בדיקות תפקודי כבד, ניתוח SID 450, סמנים דלקתיים גרועים וביטוי גנים.טכניקה זו נבדקת כעת במספר מעבדות מחקר שרוצות ליישם אותה בבדיקות גיאוטוקסיות שגרתיות של כימיקלים וננו-חומרים. יש לכך פוטנציאל להפחית את ההסתמכות על גישות בדיקה in vivo.

advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מציגים מודל תלת מימדי (תלת מימדי) של סרטן ריאות המבוסס על פיגום קולגן ביולוגי כדי לחקור את הרגישות לטיפולים ממוקדי תאים לא קטנים-סרטן-ריאות (NSCLC). אנו מדגימים טכניקות קריאה שונות לקביעת מדד ההתפשטות, האפופטוזיס ומצב המעבר האפיתלי-מזנכימלי (EMT). הנתונים שנאספו משולבים במודל סיליקו לחיזוי רגישות לתרופות.

רקמת 3D משולב תכנון הנדסי<em&gt; במבחנה</em&gt; /<em&gt; סיליקו</em&gt; דגם גידול ריאות לניבוי יעילות טיפול תרופתי רקעים מוטציוני ספציפיים

אנו מתארים שיטה ליצירת מודל חייתי של פיברוזיס בכבד בחולדה, ומעריכים את מידת הפיברוזיס על ידי בדיקה היסטולוגית של הכבד. המודל יכול לשמש לחקר התפתחות מחלות כבד וכן לבדיקת יעילותם של חומרים אנטי-פיברוטיים פוטנציאליים.

מודל הפיברוזיס Dimethylnitrosamine מושרה בחולדה

המטריצה החוץ-תאית של כבד חולדה נטול תאים יכולה לשמש כמודל ex vivo תלת מימדי אנושי כדי לחקור את התפוצה והביטוי הטרנסגני של נגיף או וקטור ויראלי.

לחקר ויראלי וקטורים בתוך אוכלס מחדש תלת מימדי הכבד דגם עם הקו Cell Carcinoma Hepatocellular האדם HepG2

פרוטוקול זה מתאר את הזיוף של microcryogels אלסטית macroporous תלת-ממד על-ידי שילוב מיקרו-מלאכותית עם טכנולוגיית cryogelation. בעת טעינת עם תאים, נוצרים 3D microtissues, אשר יכול להיות מוזרק בקלות בתוך vivo כדי להקל על הטיפול משובי או לצרפן מערכים להקרנה תפוקה גבוהה סמים ' במבחנה .

Microtissues תלת-ממד עבור טיפול בזריקות רגנרטיבית ותפוקה גבוהה והתרופות הקרנה

פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה ואמינה לייצור פרוסות כבד בר קיימא לחתוך מפני עכברים. Vivo דגימות רקמות לשעבר יכול להישמר תחת רקמת המעבדה התנאים התרבות במשך ימים מרובים, מתן מודל גמיש לבחון פתוביולוגיה בכבד.

מורנה דיוק-גזור פרוסות הכבד כמודל Vivo Ex של ביולוגיה של הכבד

פרוטוקול זה מציג מודל ביומימטי תלת מימדי עם תא סטרומה פיברוטית נלווית. מוכן עם הידרוג'לים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ביחסים המחקים את התכונות הביו-פיזיקליות של המטריצה החוץ-תאית הסטרומלית, מתווך פעיל של אינטראקציות תאיות, צמיחת גידולים וגרורות.

מודל ביומימטי לסרטן הכבד לחקר אינטראקציות גידול-סטרומה בסביבה תלת מימדית עם תכונות ביו-פיזיקליות מתכווננות

טומגוגרפיה מיקרו-ממוחשבת עם שרף כפול מאפשרת הדמיה, דיגיטציה וסגמנטציה של שתי מערכות צינוריות בו זמנית כדי להקל על ניתוח תלת-ממדי של ארכיטקטורת איברים. DUCT משלב הזרקת ex vivo של שני שרפים radiopaque ואחריו סריקת טומוגרפיה מיקרו ממוחשבת פילוח של הנתונים טומוגרפיים.

צינור: יציקת שרף כפול ואחריו טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת לניתוח כבד תלת-ממדי

פרוטוקולים אלה יסייעו למשתמשים לחקור את חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית בספרואידים שמקורם בתאי סרטן תלת-ממדיים באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי של סוסון ים.

חקר חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית של כדוריות מיקרוטיסו תלת-ממדיות בודדות באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי

פגיעה בכבד הנגרמת על-ידי תרופות (DILI) היא הגורם העיקרי לכשל תרופתי. פותח פרוטוקול לחיזוי מדויק של אחריות DILI של תרכובת באמצעות מערכת מיקרופיזיולוגית של הכבד (MPS). מודל הכבד משתמש בקוקולטורה של תאי כבד ראשוניים ובנקודות קצה רלוונטיות לתרגום כדי להעריך את תגובות התאים לטיפול.

מערכת מיקרופיזיולוגית של הכבד האנושי להערכת רעילות כבד הנגרמת על ידי תרופות במבחנה

כאן אנו מציגים שיטה לא גנטית ליצירת ספרואידים אוטולוגיים אנושיים בכבד באמצעות תאים חד-גרעיניים שבודדו מדם היקפי במצב יציב.

ספרואידים של כבד אנושי מדם היקפי למחקרי מחלות כבד

למדו להעריך גנוטוקסיות בחשיפה ארוכת טווח לננו-חומרים באמצעות מודל תלת-ממדי של ספירואידים Hep G2. שיטה זו מסייעת בהפחתת ניסויים בבעלי חיים ובהערכת נזק DNA.

דגמי כבד תלת-ממדיים מתקדמים לבדיקות גנוטוקסיות במבחנה בעקבות חשיפה ננו-חומרית לטווח ארוך

גלה סרטונים נוספים