효소 특성화에서 고처리량 스크리닝까지 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제에 대한 클릭 화학 기반 형광 분석

이 프로토콜은 두 가지 중요한 측면, 즉 필수 통합막의 특성화, 박테리아의 아포지단백 아실전이효소, 효소 억제제를 스크리닝하기 위한 HDS 형식의 분석 개발을 다룹니다. 이 방법은 매우 민감하며 스크리닝 목적에 적합합니다. 이는 잠재적인 새로운 항생제 개발에 기여할 수 있습니다.

이 비디오는 비균질성 지질 및 계면활성제를 함유한 현탁액으로 작업하는 동안 mixing, vortexing, sonicating과 같은 이 프로토콜의 중요한 단계를 강조하는 데 도움이 됩니다. 절차를 시연하는 사람은 Karine Nozeret, Aurelia Pernin이며, 둘 다 제 그룹의 동료입니다. 먼저 아포지단백질(apolipoprotein) 및 아실전이효소(acyltransferase) 또는 LNT 분석을 위한 시약 혼합물을 준비합니다.

알킨 POPE 및 FSL-1-비오틴을 1.5 밀리리터 튜브에 LNT 반응 버퍼와 혼합하여 최종 부피 18 마이크로리터로 만듭니다. 테스트된 모든 조건에 대해 3중 시약 혼합물을 준비합니다. 초음파 수조에서 3분 동안 시약 혼합물을 초음파 처리하고, 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다.

그런 다음 활성 또는 비활성 LNT를 마이크로리터당 1나노그램의 최종 농도에 첨가하고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 가열된 뚜껑이 있는 열 혼합기에서 섭씨 37도에서 16시간 동안 반응을 배양합니다. 한편, 밀리리터 스트렙타비딘당 2밀리그램의 원액을 준비합니다.

그리고 밀리리터당 10마이크로그램으로 희석하여 작동하는 솔루션을 만듭니다. 100 웰 플레이트의 각 웰에 96 마이크로리터의 용액을 추가합니다. 그런 다음 뚜껑 없이 섭씨 37도에서 플레이트를 배양하여 밤새 우물을 자연 건조합니다.

다음 날에는 5 밀리몰 Azido-FAM, 50 밀리몰 TCEP, 2 밀리몰 TBTA 및 50 밀리몰 구리 황산염 5수화물의 원액을 준비합니다. 1.5ml LNT 반응 튜브에 0.2μlit의 stock Azido-FAM, 0.4μl의 stock TCEP 및 0.2μl의 stock TBTA를 첨가하여 클릭 화학을 수행합니다. 5초 동안 용액을 소용돌이치십시오.

그런 다음 0.4 마이크로 리터의 황산 구리를 첨가하십시오. 또 다른 5초 동안 소용돌이를 일으키고 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 반응을 배양합니다. 클릭 화학 혼합물이 배양되는 동안 200마이크로리터의 PBST1로 streptavidin 코팅된 플레이트의 웰을 세 번 세척합니다.

18마이크로리터의 클릭 화학 혼합물을 스트렙타비딘이 코팅된 웰로 옮기고 100마이크로리터의 PBST1을 첨가하여 N-아실-FSL-1-비오틴 FAM 생성물을 플레이트에 결합합니다. 비오틴 플루오레세인(biotin fluorescein)을 스트렙타비딘 결합 및 형광 판독을 위한 양성 대조군으로 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 300RPM으로 흔들면서 어두운 곳에서 1시간 동안 실온에서 플레이트를 배양합니다.

배양 후 다중 채널 전자 피펫을 사용하여 200 마이크로 리터의 PBST2로 플레이트를 수동으로 6 번 세척합니다. 피펫으로 세 번 씻어냅니다. 200마이크로리터의 PBS로 세 번 세척하고 세 번 더 세척합니다.

각 웰에 200마이크로리터의 PBS를 추가하고 마이크로플레이트 리더에서 520나노미터에서 형광을 검출합니다. 모든 결과를 스프레드시트에 저장한 다음 각 반응에 대한 표준 편차와 짝을 이루지 않은 T 테스트로 음성 대조군 및 양성 샘플에 대한 P-값을 계산합니다. 여기에 설명된 시험관 내 LNT 분석은 알킨 지방산과 FSL-1-비오틴을 기질로 함유하는 인지질을 사용하여 알킨 FSL-1-비오틴을 형성합니다.

Azido-FAM과의 클릭 화학 반응 시, 이 제품은 형광 표지되고 형광 분광법으로 검출할 수 있게 됩니다. 반응 조건은 520 나노미터에서 최대 형광 판독값을 위해 최적화되었습니다. 음성 대조군에는 효소가 없는 반응, 효소의 비활성 변이체 또는 티올 특이적 억제제인 MTSES와의 반응이 포함되었습니다.

비오틴 플루오레세인은 최대 형광 신호를 위한 내부 대조군으로 사용되었습니다. 고처리량 스크리닝 분석을 개발하기 위해 384개의 웰 플레이트에서 직접 반응을 수행했습니다. 세척 단계를 자동화하고 시약의 양을 줄였습니다.

반응은 민감하고 재현 가능했으며 음성 대조군과 활성 효소 사이의 형광 신호에서 상당한 차이가 있었습니다. 고처리량 스크리닝의 경우 Z 프라임 팩터는 분석의 반응이 스크리닝 목적으로 충분히 큰지 여부를 결정합니다. 384 웰 형식으로 수행된 LNT 분석에 대한 평균 Z 프라임 팩터는 0.6 이상이었으며, 이는 이것이 탁월함을 시사합니다.

이 비디오의 튜브 분석은 HDS와 호환되는 다중 플레이트 형식으로 개발되었습니다. 다양한 유기체로부터 다른 아실전이효소를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.