Name: 효소 특성화에서 고처리량 스크리닝까지 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제에 대한 클릭 화학 기반 형광 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 학습하세요 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제 활성 분석을 위한 클릭 화학 기반 형광 분석법을. 고처리량 스크리닝에 적합한 이 민감한 방법은 새로운 항생제 개발에 기여합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

파리시 파스퇴르 연구소의 기술 자원 및 연구 센터(C2RT)의 화학유전체 및 생물학적 스크리닝 플랫폼의 Fabrice Agou와 Alix Boucharlat에게 프로토콜에 대한 유용한 제안, 지원 및 과학적 토론을 위한 BGPB 부서의 모든 구성원, 원고를 비판적으로 읽어준 Simon Legood에게 감사드립니다. 작업은 Carnot 전염병 연구소와 Carnot 미생물 및 건강 연구소의 Global Care Initiatives (15 CARN 0017-01 및 16 CARN 0023-01)의 자금 지원을 받았습니다.

1. 효소 및 기질 준비
<ol><li>효소의 정제
	<ol><li>앞서 설명한 대로 세제 가용화된 막으로부터 Lnt 효소를 생산하고 정제합니다 4,8. 간단히 말해서, 37°C에서 16시간 동안 무수 테트라사이클린(200ng/mL)으로 0.6의 OD600에서 C-말단 스트렙 태그로 Lnt를 암호화하는 lnt-연쇄상 구균 유전자의 발현을 유도합니다.</li>
		<li>4,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수확하고 상청액을 버린다.</li>
		<li>세포 펠렛을 mL당 100 OD600 유닛으로 완충액 WA (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA) 중에 재현탁시킨다.</li>
		<li>10,000 psi에서 프렌치 압력 셀 프레스를 통해 2계대로 세포를 분해한다.</li>
		<li>13,000 x g 에서 20분 동안 원심분리하여 끊어지지 않은 세포와 파편을 제거합니다. 상청액을 보관하고 펠릿을 폐기하십시오.</li>
		<li>상청액을 120,000 x g 에서 60분 동안 원심분리하고 막 소포(반투명 갈색 컬러 펠릿)를 수집한다. 상청액을 폐기하십시오.</li>
		<li>막 펠릿의 통합 막 단백질을 완충액 WA의 1%(w/v) n-도데실 β-D-말토사이드(DDM)로 실온(RT)에서 30분 동안 가용화합니다. 원심분리하고 불용화된 물질을 120,000 x g 에서 30분 동안 제거합니다. 정제를 위해 상청액 분획을 사용하십시오.</li>
		<li>Nozeret et al.8에 설명된 대로 친화성 크로마토그래피 컬럼(재료 표 참조) 및 S400 겔 여과 컬럼(재료 표 참조)에서 Lnt-연쇄상 구균을 정제합니다.</li>
		<li>정제된 효소를 -80°C에서 0.05% DDM 및 10% 글리세롤을 함유하는 완충액 WA에 저장한다. 알림: 효소는 5 년 이상 안정적입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>알킨-인지질 및 비오티닐화 섬유아세포 자극 리간드(FSL-1-비오틴) 기질의 제조
	<ol><li>100 μL의 맞춤 합성 알킨-POPE (1- 헥사 덱 -15- 이노일 -2- 올레 오일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 에탄올 아민, 재료 표 참조)를 클로로포름에 1.5mL 튜브에 가용화했습니다.</li>
		<li>주사기로 튜브를 관통하고 RT에서 2 시간 동안 속도 진공에서 클로로포름을 증발시킵니다. 건조 인지질 샘플을 -20°C에서 보관한다.</li>
		<li>사용하기 전에 500 μM에서 0.1% 트리톤 X-100에 알킨-POPE를 용해시킵니다. 필요한 경우 알킨-POPE를 가용화하기 위해 RT의 초음파 수조에서 3분 초음파 처리 단계를 추가합니다.</li>
		<li>FSL-1-비오틴을 445μM의 물에 재현탁합니다. 알림: 두 용액 모두 -20°C에서 최소 2개월 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 튜브 분석
참고: 1일째에 Lnt 반응을 1.5mL 튜브에 설정하고(2.1단계) 96웰 플레이트를 스트렙타비딘으로 코팅합니다(2.2단계).
<ol><li>시약 혼합물의 제조 및 효소 반응
	<ol><li>표준 Lnt 분석의 경우, Lnt 반응 완충액(50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 1% BSA를 함유하는 0.1% 트리톤 X-100)에 알킨-POPE (50 μM 스톡으로부터 최종 50 μM) 및 FSL-1-비오틴 (445 μM 스톡으로부터 50 μM의 최종 농도)을 1.5 mL 튜브에서 18 μL의 최종 부피로 혼합한다. 모든 조건을 세 번 수행하십시오.</li>
		<li>기질 혼합물 (단계 2.1.1에서 제조)을 초음파 수조에서 3 분 동안 초음파 처리하고 Lnt 효소 (단계 2.1.3)를 첨가하기 전에 37 °C에서 5 분 동안 배양한다. 참고: 티올 특이적 시약인 MTSES(나트륨(2-설포나토에틸)메탄티오설포네이트)는 Lnt8을 억제합니다. 음성 대조군 샘플로 사용할 반응 튜브(단계 2.1.1)에 10mM MTSE(100% DMSO 중 100mM 스톡 용액)를 추가합니다. 총 부피가 18 μL가 되도록 Lnt 반응 완충액의 부피를 조정합니다.</li>
		<li>활성(1ng/μL, 17.2nM에 해당) 또는 비활성 Lnt(C387S)(0.05% DDM을 포함하는 버퍼 WA에 10ng/μL 스톡 2μL)를 추가하고 위아래로 피펫팅하여 기질과 혼합합니다(단계 2.1.2).</li>
		<li>반응물을 가열된 뚜껑이 있는 써모믹서에서 16시간 동안 37°C에서 인큐베이션합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>96웰 플레이트의 스트렙타비딘 코팅
	<ol><li>H2O에서 2 mg / mL의 스트렙 타비딘 저장 용액을 준비하십시오. 알림: 이 용액은 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>스톡 용액에서 작업 용액으로 물에 10μg/mL 스트렙타비딘을 준비합니다. 100 μL의 용액을 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 스트렙타비딘을 뚜껑 없이 밤새 37°C에서 인큐베이션하여 플레이트에 결합시켜 웰을 공기 건조시켰다.</li>
	</ol></li>
</ol>참고: 2일째에 클릭 화학(2.3단계)을 수행하고 Lnt 반응 혼합물을 스트렙타비딘 코팅 플레이트에 결합하고(2.4단계) 형광을 검출하고 결과를 분석합니다(단계 2.5).
<ol start="3"><li>클릭-화학 반응
	<ol><li>아지도-FAM (DMSO 중 5 mM), TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드; 물에서 제조된 50 mM), TBTA(트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]아민; 2 mM 중 tert-부탄올:DMSO (4:1)), 및 CuSO4∙5H2O (H2O에서 신선하게 제조된50mM)의 원액을 준비한다.</li>
		<li>단계 2.1.4에서 제조된 Lnt 반응 혼합물을 포함하는 1.5 mL 튜브에, 다음 순서로 시약을 첨가하여 클릭 화학을 수행한다: 0.2 μL 스톡 아지도-FAM (최종 농도 50 μM), 0.4 μL 스톡 TCEP (최종 농도 1 mM), 0.2 μL 스톡 TBTA (최종 농도 0.02 mM).</li>
		<li>용액을 5 초 동안 소용돌이. 이어서 0.4 μL의 스톡CuSO4 (최종 농도 1 mM)를 첨가한다. 5 초 동안 다시 소용돌이. 샘플을 RT의 어둠 속에서 1 시간 동안 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Lnt 반응 혼합물을 스트렙타비딘 코팅 플레이트에 결합
	<ol><li>2.2.2 단계로부터 밤새 배양한 후 스트렙타비딘 코팅된 플레이트의 웰을 200 μL의 PBS-T1(0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS)로 3x 세척한다. 알림: 스트렙타비딘 플레이트는 즉시 사용하거나 4°C에서 건조한 상태로 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>단계 2.3.3의 클릭 화학 혼합물에서 18μL를 96웰 스트렙타비딘 코팅 플레이트의 웰로 옮기고 100μL의 PBS-T1을 추가하여 N-아실-FSL-1-비오틴-FAM 생성물을 스트렙타비딘 플레이트에 결합시킵니다.</li>
		<li>비오틴-플루오레세인(DMSO의 3.1mM 스톡에서 0.26μM)을 스트렙타비딘 결합 및 형광 판독을 위한 양성 대조군으로 사용합니다.</li>
		<li>플레이트를 RT에서 열혼합기의 어둠 속에서 1시간 동안 배양하고 300rpm으로 흔들어줍니다.</li>
		<li>다음과 같이 다채널 전동 피펫으로 96웰 플레이트의 수동 세척 단계를 수행합니다: 200μL의 PBS-T2(1% Tween-20을 포함하는 PBS)로 6회 세척, 피펫으로 3회 세척, 200μL의 PBS로 3회 세척, 피펫으로 3회 세척.</li>
	</ol></li>
	<li>형광 검출 및 분석
	<ol><li>200 μL의 PBS를 첨가하고 형광 마이크로플레이트 리더에서 520 nm에서의 형광을 기록하였다. 스프레드시트 소프트웨어에 결과를 저장합니다. 참고: 비오틴-플루오레세인은 520nm에서 스트렙타비딘 결합 및 형광 검출을 위한 양성 대조군으로 사용됩니다. 0.26 μM 비오틴-플루오레세인으로 30,000–40,000 AU의 재현 가능한 판독값이 예상됩니다. 모든 샘플은 대조군을 포함하여 삼중으로 분석됩니다.</li>
		<li>각 반응에 대한 표준 편차를 계산하고 통계 소프트웨어를 사용하여 쌍을 이루지 않은 t-검정을 사용하여 음성 대조군과 양성 표본에 대한 P-값을 계산합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 멀티웰 플레이트 분석
참고: 1일째에 384웰 플레이트(단계 3.1)에서 Lnt 반응을 설정하고 384웰 플레이트를 스트렙타비딘으로 코팅합니다(단계 3.2).
<ol><li>시약 혼합물의 제조 및 효소 반응 참고: 시약과 효소의 양은 튜브 분석에 비해 감소하고 Lnt 반응은 384웰 플레이트에서 직접 수행됩니다. 이를 통해 재료를 덜 사용하고 추가로 자동화 할 수있는 단계를 줄일 수 있습니다.<ol><li>기질을 다음과 같이 혼합한다: Lnt 반응 완충액(50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 1% BSA를 함유하는 0.1% 트리톤 X-100) 중 알킨-POPE (500 μM 스톡으로부터 최종 농도 50 μM) 및 FSL-1-비오틴 (500 μM 스톡으로부터 최종 50 μM) 및 384 웰 플레이트 형식으로 웰당 반응당 13.5 μL의 부피로. 모든 조건을 세 번 수행하십시오. 수행할 반응 수에 필요한 시약의 총량을 계산합니다(즉, 384웰 플레이트 1개에 대해 5,184μL).</li>
		<li>초음파 수조에서 3 분 동안 기질 혼합물을 초음파 처리하십시오.</li>
		<li>384 웰 플레이트에서 웰당 기질 혼합물의 13.5 μL를 분취한다. 참고: 음성 대조군으로 웰당 10mM의 MTSES(100% DMSO 중 625mM 스톡 용액)를 추가할 수 있습니다. Lnt 완충액의 부피(단계 3.1.1)를 조정하여 최종 반응 부피 13.5μL에 도달합니다.</li>
		<li>Lnt 효소를 첨가하기 전에 37°C에서 5분 동안 배양한다(단계 3.1.5).</li>
		<li>Lnt 반응 완충액(50mM Tris-HCl pH 7.2, 150mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 1% BSA)에 0.5ng/μL(8.6nM에 해당) 활성 Lnt 효소 또는 불활성 변이체(C387S)(0.05% DDM을 포함하는 완충액 WA의 5ng/μL 재고에서 1.5μL)를 단계 3.1.3의 반응 혼합물을 포함하는 각 웰에 추가합니다. 위아래로 피펫팅하여 시약을 혼합합니다. 총 반응 부피는 15 μL이다.</li>
		<li>멀티웰 플레이트용 플라스틱 호일로 플레이트를 밀봉합니다.</li>
		<li>가열된 뚜껑이 있는 써모믹서에서 37°C에서 16시간 동안 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>스트렙타비딘 코팅 384웰 플레이트<ol><li>2.2.2단계의 스트렙타비딘 75μL(H2O중 10μg/mL)를 사용하여 384웰 플레이트의 웰을 코팅합니다. 스트렙타비딘을 뚜껑 없이 밤새 37°C에서 배양하여 플레이트에 결합시켜 웰을 자연 건조시킨다.</li>
	</ol></li>
</ol>참고: 2일째에 클릭 화학(3.3단계)을 수행하고 Lnt 반응 혼합물을 스트렙타비딘 코팅 플레이트에 결합하고(3.4단계), 형광을 감지하고 결과를 분석합니다(단계 3.5).
<ol start="3"><li>클릭-화학 반응<ol><li>아지도-FAM (DMSO 중 1.2 mM), TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드; H2O에서 제조된 24 mM), TBTA(트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]아민; 3급-부탄올에서 0.48 mM:DMSO (4:1)) 및 CuSO4∙5H2O (H2O에서 신선하게 제조된 24mM)의 스톡 용액을 준비한다.</li>
		<li>Azido-FAM(최종 농도 50μM), TCEP(최종 1mM) 및 TBTA(최종 0.02mM)의 혼합물인 Azido-FAM(최종 농도 50μM), 웰당 최종 부피 2.25μL에서 각각 0.75μL의 혼합물의 세 가지 클릭 화학 시약을 결합합니다. 384 웰 플레이트 당 필요한 부피를 계산합니다 (즉, 384 웰 플레이트의 모든 웰이 사용되는 경우 864 μL 사용). 격렬하게 섞는다.</li>
		<li>웰당 2.25 μL의 시약 용액을 3.1.7 단계에서 완료된 384 웰 플레이트의 Lnt 반응에 직접 추가합니다.</li>
		<li>멀티채널 전동 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.</li>
		<li>CuSO4(1mM 최종 농도에 대해 24mM 스톡에서 0.75μL)를 추가하고 멀티채널 전동 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.</li>
		<li>어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 배양하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>Lnt 반응 혼합물을 스트렙타비딘 코팅된 384웰 플레이트에 결합
	<ol><li>1x 단계로부터 밤새 배양한 후 스트렙타비딘 코팅된 플레이트의 웰을 85 μL PBS-T1로 1x 세척한다.</li>
		<li>11μL의 클릭-화학 반응을 단계 3.3.6의 인큐베이션 플레이트의 각 웰로부터 단계 3.4.1로부터의 스트렙타비딘-코팅된 플레이트로 옮겨 N-아실-FSL-1-비오틴-FAM 생성물을 스트렙타비딘 플레이트에 결합시킨다.</li>
		<li>64 μL의 버퍼 PBS-T1을 추가합니다.</li>
		<li>스트렙타비딘-코팅된 웰에 결합하기 위한 대조군으로서 비오틴-플루오레세인(DMSO 내의 3.1 mM 스톡으로부터 0.19 μM)을 포함한다.</li>
		<li>384웰 플레이트를 RT에서 1시간 동안 열혼합기에서 300rpm으로 진탕하면서 배양합니다.</li>
		<li>다음과 같이 자동 플레이트 세척기를 사용하여 플레이트를 세척하십시오 : 85 μL PBS-T2로 10 회 세척, 세척 사이에 플레이트를 흔들어줍니다. 85 μL PBS로 5회 세척하고, 세척 사이에 플레이트를 진탕한다.</li>
	</ol></li>
	<li>형광 검출 및 분석
	<ol><li>PBS(85μL)를 추가하고 535nm의 형광 마이크로플레이트 리더에 형광을 기록합니다.</li>
		<li>설명된 대로 데이터를 분석합니다(2.5.2단계).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanism+of+bacterial+lipoprotein+modification--how%2C+when+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why.</a> FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).</li>
<li>Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoproteins+of+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Lipoproteins of bacterial pathogens.</a> Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).</li>
<li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+fatty+acids+from+the+1-position+of+phosphatidylethanolamine+to+the+major+outer+membrane+lipoprotein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).</li>
<li>Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+phospholipid+specificity+of+apolipoprotein+N-acyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).</li>
<li>Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Visualization+and+Large-Scale+Profiling+of+Bacterial+Lipoproteins+with+Chemical+Reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters.</a> Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).</li>
<li>Thiele, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+fatty+acid+metabolism+by+click-chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry.</a> ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).</li>
<li>Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click-Chemistry+Based+High+Throughput+Screening+Platform+for+Modulators+of+Ras+Palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation.</a> Science Reports. 7, 41147(2017).</li>
<li>Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+fluorescence-based+assay+to+monitor+enzymatic+activity+of+the+essential+integral+membrane+protein+Apolipoprotein+N-acyltransferase+%28Lnt%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt).</a> Science Reports. 9 (1), 15978(2019).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecules+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Mao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+E.+coli+lipoprotein+diacylglyceryl+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase.</a> Nature Communication. 7, 10198(2016).</li>
<li>Vogeley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+lipoprotein+signal+peptidase+II+action+and+inhibition+by+the+antibiotic+globomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin.</a> Science. 351 (6275), 876-880 (2016).</li>
<li>Wiktor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+mechanism+of+the+membrane+integral+N-acyltransferase+step+in+bacterial+lipoprotein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis.</a> Nature Communication. 8, 15952(2017).</li>
<li>Noland, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+lipoprotein+N-acylation+by+Escherichia+coli+apolipoprotein+N-acyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).</li>
<li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+E.+coli+apolipoprotein+N-acyl+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase.</a> Nature Communication. 8, 15948(2017).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기에 설명된 Lnt 분석을 위한 프로토콜은 트리아실화된 생성물의 형광 검출을 기반으로 민감하고 재현 가능합니다. 비오틴과 스트렙타비딘의 특이적이고 효율적인 결합은 분석의 핵심 요소입니다. Lnt 반응 완료 후 남은 알킨-POPE 기질은 또한 FAM으로 형광 표지되지만 여러 세척 단계에 의해 스트렙타비딘 플레이트 상에 결합한 후 효율적으로 제거된다. 또한, DMSO의 첨가는 Lnt 활성에 영향을 미치지 않으며, 분석에 영향을 미치지 않는다. 기질과 효소는 모두 친유성이 높으며 혼합 미셀에서 반응 조건이 필요합니다. 형광 분극을 포함하여 생성물 검출을 위해 가용성 효소 및 기질에 의존하는 기술은 적용되지 않습니다8. 분석의 유일한 한계는 효소와 알킨 기질의 상용성인데, 이는 클릭-화학 반응이이 화학 그룹에 의존하기 때문입니다.
겔 이동 분석은 Lnt 활성을 분석하고 기질 특이성을 결정하기 위해 이전 연구에서보고되었습니다<sup class=...

박테리아 지단백질은 아미노 말단에서 공유 결합 지방산이 특징이며,이를 통해 막 1,2에 고정됩니다. 단백질의 성숙한 부분은 구조와 기능이 매우 다양하여 박테리아 세포 외피의 다양한 생물학적 과정에서 지단백질의 역할을 설명합니다.
지단백질은 세포질 막에 삽입 된 후 인지질 유래 지방산에 의해 변형됩니다. 프로리포단백질은 시그니처 모티프인 리포박스(lipobox)를 함유하고 있으며, 리포박스는 아실화되는 불변 시스테인 잔기와 성숙 단백질의 첫 번째 아미노산을 포함합니다. 이 경로의 첫 번째 단계는 프로리포단백질 포스파티딜글리세롤::d이아실글리세릴 트랜스퍼라제(Lgt)에 의해 촉매되며, 이는 디아실글리세릴과 시스테인 사이의 티오에테르 연결을 통해 포스파티딜글리세롤에서 프롤리포단백질로 디아실글리세릴 그룹을 전달합니다. 신호 펩티다아제 II(Lsp)는 디아실글리세릴 프로리포단백질로부터 신호 펩티드를 절단하여, 디아실글리세릴 부분을 통해 막에 고정된 아포지단타인을 생성한다. 세 번째이자 마지막 단계는 인지질의 sn-1 위치에서 지방산을 아포지단백질에 추가하여 삼아실화된 성숙한 지단백질을 생성하는 아포지단백 N-아실트랜스퍼라제(Lnt)에 의해 촉매됩니다(그림 1)3. Lnt 반응은 안정한 티오에스테르 아실 효소 중간체가 형성되는 2단계 탁구 반응입니다. 리소포지질 부산물은 반응의 제2 단계에서 아포지단백질 기질의 아실화 전에 방출된다.
인지질 기질 특이성은 높은 비율의 트리스-트리신 우레아 SDS-PAGE4에 대한 N-아실 디아실글리세릴 펩티드의 이동성 이동에 기초한 Lnt 분석에서 결정된다. 포화 [sn-1] 및 불포화 [sn-2]의 작은 극성 헤드 그룹을 갖는 인지질이 바람직한 기질4이었다. 겔 이동 분석은 아포지 단백질 N- 아실 트랜스퍼 라제의 광범위한 동역학 연구 나 HTS가 억제 분자를 식별하는 데 적합하지 않습니다. 알킨 지방산을 사용한 클릭 화학은 박테리아5 의 지단백질 변형과 진핵 생물6의 지방산 대사를 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 최근에, 라스 팔미토일화의 시험관내 분석이 억제제7을 확인하기 위해 보고되었다.
여기에 설명된 방법에서, 세제 중 정제된 활성 Lnt는 혼합 미셀 내의 기질과 함께 인큐베이션되어 알킨-트리아실화된 펩티드를 형성하고, 이 펩타이드는 후속적으로 형광 분광법에 의해 검출된다.

<table><tbody><tr><td>&오믈; kta Purifier FPLC 시스템</td><td>GE Healthcare</td><td>NA</td><td>순도: NA Lnt 정제</td></tr><tr><td>alkyne-POPE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>900414P</td><td>순도: >99% Lnt substrate</td></tr><tr><td>Azido-FAM</td><td>Lumiprobe</td><td>A4130</td><td>순도: 100%(순수) Click 시약</td></tr><tr><td>BioPhotometer Plus</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>순도: NA OD 600 nm</td></tr><tr><td>BioTek ELX 405 Select plate washer</td><td>BioTek</td><td>N&deg; serie 115800, n&deg; materiel 405 Select</td><td>Purity: NA Wash steps</td></tr><tr><td>biotin-fluorescein</td><td>Sigma</td><td>53608</td><td>순도: &ge; 90% 형광 통제</td></tr><tr><td>구리(II) 황산염 5수화물</td><td>시그마</td><td>C3036</td><td>순도: &ge; 98% 누르기 시약</td></tr><tr><td>DDM</td><td>Anatrace</td><td>D310A</td><td>순수성: &ge; 99% &beta;+&α;; < 15% & 알파; Lnt 정제용 세제</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Invitrogen</td><td>D12435</td><td>순도: 무수 용해 클릭 시약</td></tr><tr><td>전자 피펫 Voyager 8 채널 0.5-12.5 uL</td><td>INTEGRA</td><td>4721</td><td>순도: NA 시약 처리</td></tr><tr><td>프렌치 압력 셀</td><td>N/A</td><td>N/</td><td>A 순도: NA 세포 파괴</td></tr><tr><td>FSL-1-비오틴</td><td>EMC microcollections</td><td>L7030</td><td>순도: NA Lnt 기판</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One 384웰 표준 CELLSTAR 폴리스티렌 마이크로플레이트</td><td>Greiner</td><td>781091</td><td>순도: NA 투명한 바닥이 있는 검은색(위쪽 또는 아래쪽 판독값)</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One 96웰 멸균 폴리스티렌 플레이트, 높은 바인딩</td><td>Greiner</td><td>655097</td><td>순도: NA 투명한 바닥이 있는 검은색(위쪽 또는 아래쪽 판독값)</td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더 Infinite M1000 pro</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>순도: NA 형광 검출</td></tr><tr><td>MTSES(나트륨(2-설포나토에틸)메탄에티오설포네이트)</td><td>Anatrace</td><td>S110MT</td><td>순도: ~100% 티올 특이적 억제제</td></tr><tr><td>광학적으로 투명한 접착 밀봉 시트</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1170</td><td>순도: NA 다중 웰 플레이트를 밀봉하는 호일</td></tr><tr><td>Sephacryl S400 HR 16/60 젤 여과 칼럼</td><td>GE 헬스케어</td><td>GE28-9356-04</td><td>순도: NA Lnt 정제</td></tr><tr><td>스트렙택틴 세파로스 50 %</td><td>IBA 생명공학</td><td>2-1201-010</td><td>순도: NA Lnt 정제</td></tr><tr><td>스트렙타비딘</td><td>시그마</td><td>S4762-1MG</td><td>순도: &ge; 13 units/mg 단백질 비오틴 결합</td></tr><tr><td>TBTA (트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]아민</td><td>시그마</td><td>678937</td><td>순도: 97% 클릭 시약</td></tr><tr><td>TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드</td><td>시그마</td><td>75259</td><td>순도: &ge; 98% Click 시약</td></tr><tr><td>TECAN Infinite F500</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>순도: NA 형광 검출</td></tr><tr><td>TECAN Infinite M1000 pro</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>순도: NA 형광 검출</td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>순도: NA 가열식 뚜껑</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td>순도: H2O 중 10% Lnt 반응 버퍼</td></tr><tr><td>울트라 원심분리기</td><td>Beckman LC</td><td>N/A</td><td>순도: NA 세포 분획</td></tr></tbody></table>

효소 특성화에서 고처리량 스크리닝까지 아포지단백질 n-아실트랜스퍼라제에 대한 클릭 화학 기반 형광 분석

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

프로테오박테리아의 지단백질은 3개의 통합 막 효소의 작용에 의해 막 인지질에서 파생된 지방산에 의해 번역 후 변형되어 트리아실화 단백질을 생성합니다. 지단백질 변형 경로의 첫 번째 단계는 포스파티딜글리세롤에서 프롤리포단백질로 디아실글리세릴기를 전달하여 디아실글리세릴 프롤리포단백질을 생성하는 것입니다. 두 번째 단계에서, 프롤리포 단백질의 신호 펩티드는 절단되어 아포지 단백질을 형성하고, 이는 차례로 인지질로부터 유래 된 제 3 지방산에 의해 변형된다. 이 마지막 단계는 아포지 단백질 N- 아실 트랜스퍼 라제 (Lnt)에 의해 촉매됩니다. 지단백질 변형 경로는 대부분의 γ-프로테오박테리아에서 필수적이므로 새로운 항균제 개발을 위한 잠재적인 표적이 됩니다. 여기에 설명된 것은 작은 억제 분자의 고처리량 스크리닝과 호환되는 Lnt에 대한 민감한 분석입니다. 효소와 기질은 막에 매립된 분자입니다. 따라서 체외 테스트의 개발은 간단하지 않습니다. 여기에는 세제의 존재 하에서 활성 효소의 정제, 알킨-인지질 및 디아실글리세릴 펩티드 기질의 가용성, 혼합 미셀에서의 반응 조건이 포함됩니다. 또한, 고처리량 스크리닝(HTS) 설정에서 활성 테스트를 사용하려면 결합 효소 반응보다 반응 생성물의 직접 판독이 선호됩니다. 이 형광 효소 분석에서 알킨-트리아실화 펩타이드 생성물은 클릭-화학 반응을 통해 형광으로 렌더링되고 멀티웰 플레이트 형식으로 검출됩니다. 이 방법은 인지질 및 아실 -CoA를 포함한 지방산 함유 기질을 사용하는 다른 아실 트랜스퍼 라제에 적용 할 수 있습니다.

Lnt 반응에서 인지질의 sn-1 지방산은 디아실글리세릴 펩티드로 옮겨져 성숙한 트리아실화 펩티드8을 생성합니다. 여기에 설명된 시험관 내 Lnt 분석은 알킨 지방산(알킨-POPE) 및 FSL-1-비오틴을 기질로 함유하는 인지질을 사용하여 알킨-FSL-1-비오틴을 형성하도록 설계되었습니다. azido-FAM과의 클릭 화학 반응 시 이 제품은 형광 표지를 거쳐 형광 분광법으로 검출되어야 합니다(그림 2).
반응 조건은 플레이트 리더에서 520nm에서 최대 형광 판독을 위해 최적화되었습니다. 1 ng / μL 효소에서 FSL-1- 비오틴의 완전한 전환이 관찰되었습니다(그림 3). 음성 대조군에는 효소가 없는 반응, 효소의 비활성 변이체(활성 부위 돌연변이 C387S) 또는 낮은...

여기에 제시된 것은 클릭 화학을 통해 디아실글리세릴 펩타이드와 알킨-인지질을 기질로 사용하여 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제 활성을 모니터링하기 위한 민감한 형광 분석입니다.

효소 특성화에서 고처리량 스크리닝까지 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제에 대한 클릭 화학 기반 형광 분석

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

이 프로토콜은 두 가지 중요한 측면, 즉 필수 통합막의 특성화, 박테리아의 아포지단백 아실전이효소, 효소 억제제를 스크리닝하기 위한 HDS 형식의 분석 개발을 다룹니다. 이 방법은 매우 민감하며 스크리닝 목적에 적합합니다. 이는 잠재적인 새로운 항생제 개발에 기여할 수 있습니다.이 비디오는 비균질성 지질 및 계면활성제를 함유한 현탁액으로 작업하는 동안 mixing, vortexing, sonicating과 같은 이 프로토콜의 중요한 단계를 강조하는 데 도움이 됩니다. 절차를 시연하는 사람은 Karine Nozeret, Aurelia Pernin이며, 둘 다 제 그룹의 동료입니다. 먼저 아포지단백질(apolipoprotein) 및 아실전이효소(acyltransferase) 또는 LNT 분석을 위한 시약 혼합물을 준비합니다.알킨 POPE 및 FSL-1-비오틴을 1.5 밀리리터 튜브에 LNT 반응 버퍼와 혼합하여 최종 부피 18 마이크로리터로 만듭니다. 테스트된 모든 조건에 대해 3중 시약 혼합물을 준비합니다. 초음파 수조에서 3분 동안 시약 혼합물을 초음파 처리하고, 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다.그런 다음 활성 또는 비활성 LNT를 마이크로리터당 1나노그램의 최종 농도에 첨가하고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 가열된 뚜껑이 있는 열 혼합기에서 섭씨 37도에서 16시간 동안 반응을 배양합니다. 한편, 밀리리터 스트렙타비딘당 2밀리그램의 원액을 준비합니다.그리고 밀리리터당 10마이크로그램으로 희석하여 작동하는 솔루션을 만듭니다. 100 웰 플레이트의 각 웰에 96 마이크로리터의 용액을 추가합니다. 그런 다음 뚜껑 없이 섭씨 37도에서 플레이트를 배양하여 밤새 우물을 자연 건조합니다.다음 날에는 5 밀리몰 Azido-FAM, 50 밀리몰 TCEP, 2 밀리몰 TBTA 및 50 밀리몰 구리 황산염 5수화물의 원액을 준비합니다. 1.5ml LNT 반응 튜브에 0.2μlit의 stock Azido-FAM, 0.4μl의 stock TCEP 및 0.2μl의 stock TBTA를 첨가하여 클릭 화학을 수행합니다. 5초 동안 용액을 소용돌이치십시오.그런 다음 0.4 마이크로 리터의 황산 구리를 첨가하십시오. 또 다른 5초 동안 소용돌이를 일으키고 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 반응을 배양합니다. 클릭 화학 혼합물이 배양되는 동안 200마이크로리터의 PBST1로 streptavidin 코팅된 플레이트의 웰을 세 번 세척합니다.18마이크로리터의 클릭 화학 혼합물을 스트렙타비딘이 코팅된 웰로 옮기고 100마이크로리터의 PBST1을 첨가하여 N-아실-FSL-1-비오틴 FAM 생성물을 플레이트에 결합합니다. 비오틴 플루오레세인(biotin fluorescein)을 스트렙타비딘 결합 및 형광 판독을 위한 양성 대조군으로 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 300RPM으로 흔들면서 어두운 곳에서 1시간 동안 실온에서 플레이트를 배양합니다.배양 후 다중 채널 전자 피펫을 사용하여 200 마이크로 리터의 PBST2로 플레이트를 수동으로 6 번 세척합니다. 피펫으로 세 번 씻어냅니다. 200마이크로리터의 PBS로 세 번 세척하고 세 번 더 세척합니다.각 웰에 200마이크로리터의 PBS를 추가하고 마이크로플레이트 리더에서 520나노미터에서 형광을 검출합니다. 모든 결과를 스프레드시트에 저장한 다음 각 반응에 대한 표준 편차와 짝을 이루지 않은 T 테스트로 음성 대조군 및 양성 샘플에 대한 P-값을 계산합니다. 여기에 설명된 시험관 내 LNT 분석은 알킨 지방산과 FSL-1-비오틴을 기질로 함유하는 인지질을 사용하여 알킨 FSL-1-비오틴을 형성합니다.Azido-FAM과의 클릭 화학 반응 시, 이 제품은 형광 표지되고 형광 분광법으로 검출할 수 있게 됩니다. 반응 조건은 520 나노미터에서 최대 형광 판독값을 위해 최적화되었습니다. 음성 대조군에는 효소가 없는 반응, 효소의 비활성 변이체 또는 티올 특이적 억제제인 MTSES와의 반응이 포함되었습니다.비오틴 플루오레세인은 최대 형광 신호를 위한 내부 대조군으로 사용되었습니다. 고처리량 스크리닝 분석을 개발하기 위해 384개의 웰 플레이트에서 직접 반응을 수행했습니다. 세척 단계를 자동화하고 시약의 양을 줄였습니다.반응은 민감하고 재현 가능했으며 음성 대조군과 활성 효소 사이의 형광 신호에서 상당한 차이가 있었습니다. 고처리량 스크리닝의 경우 Z 프라임 팩터는 분석의 반응이 스크리닝 목적으로 충분히 큰지 여부를 결정합니다. 384 웰 형식으로 수행된 LNT 분석에 대한 평균 Z 프라임 팩터는 0.6 이상이었으며, 이는 이것이 탁월함을 시사합니다.이 비디오의 튜브 분석은 HDS와 호환되는 다중 플레이트 형식으로 개발되었습니다. 다양한 유기체로부터 다른 아실전이효소를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

click-chemistry-based-fluorometric-assay-for-apolipoprotein-n

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

약물 적재 단백질을 주형으로 사용하는 초소형 형광 금 나노클러스터(Au NC)의 현장 합성을 기반으로 하는 소분자 약물 스크리닝을 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 방법은 단백질 템플릿 Au NC에서 방출되는 가시적인 형광 신호에 의해 표적 단백질에 대한 약물의 결합 친화도를 간단하게 결정할 수 있습니다.

단백질 표적 소분자 약물 검사를위한 신속하고 정량적적인 형광 방법

본 연구는 200개 이상의 효소에 이론적으로 적용할 수 있는 보편적인 유전 효소 스크리닝 시스템을 이용한 고처리량 스크리닝 방법을 제시합니다. 여기서 단일 스크리닝 시스템은 사용된 기질(p-니트로페닐 아세테이트, p-니트로페닐-β-D-셀로비오시드 및 페닐 포스페이트)을 간단히 변경하여 세 가지 다른 효소(리파아제, 셀룰라아제 및 알칼리성 인산가수분해효소)를 식별합니다.

멀티 효소 높은 처리량 유전자 효소 검사 시스템을 사용하여 상영

우리는 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 기초 판독하여 단백질 상호 작용을 분석 자동화 형광 수명 이미징 (FLIM)을 이용하는 오픈 소스 고 함량 분석 (HCA) 기기를 제시한다. 이 openFLIM-HCA 기기에 대한 데이터 수집은 소프트웨어 μManager 작성 및 데이터 분석 FLIMfit에 착수에 의해 제어된다.

자동 형광 수명 이미징 현미경을 활용하여 오픈 소스 높은 콘텐츠 분석

우리는 현재의 연구에서 형질 전환 마우스에서 파생 된 림프구를 사용하여 새로운 형광 기반의 분석을 제시한다. 이 분석은 억제 또는 림프구의 활성을 촉진하거나 용량을 부여 소분자의 고 처리량 스크리닝 (HTS)에 적합하다.

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

여기 HDL-지질 과산화의 결정에 대 한 fluorometric 셀 무료 생화학 분석 결과 설명합니다. 이 신속 하 고 재현성 분석 결과 대규모 연구에서 HDL 함수를 확인 하는 데 사용 수 고 인간의 질병에 HDL 함수에 대 한 우리의 이해에 기여할 수 있다.

고밀도 지단백에 지질 과산화의 높은 처리량 측정을 위한 생 화 확 적인 세포-무료 Fluorometric 효소 분석 결과

혈 청 또는 대 식 세포 세포 모델에서 플라즈마를 생체 외에서 콜레스테롤 경과 용량 측정은 동맥 경화에 대 한 biomarker로 유망한 도구입니다. 현재 연구에서 우리 최적화 및 형광 NBD 콜레스테롤 경과 방법을 표준화 하 고 96 잘 접시를 사용 하 여 높은 처리량 분석을 개발.

높은 처리량 Nitrobenzoxadiazole 표시 된 콜레스테롤 경과 분석 결과

니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)-결합 된 ATPase 분석제는 소분자 미오신 억제제의 반고 처리량 스크리닝에 적응되었다. 이 운동 분석은 384웰 마이크로플레이트 형식으로 실행되며 총 반응량은 웰당 20 μL에 불과합니다. 이 플랫폼은 거의 모든 ADP 생산 효소에 적용되어야 합니다.

소분자 억제제 스크리닝을 위한 NADH 결합 ATPase 분석의 반 높은 처리량 적응

이 프로토콜은 세포 환경에서 실시간으로 수용체에 대한 아데닌 뉴클레오티드 결합을 측정하는 방법을 제시합니다. 결합은 트리니트로페닐 뉴클레오티드 유도체와 비표준 형광 아미노산으로 표지된 단백질 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)로 측정됩니다.

온전한 기능성 막 단백질에 대한 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 측정

표적단백질(즉,열시프트 분석, TSA)의 용융 온도의 변화를 모니터링하는 것은 수백 개의 화합물의 단편 라이브러리를 선별하는 효율적인 방법입니다. 당사는 본질적인 트립토판 형광 및 단편 스크리닝을 위한 가벼운 백 산란을 모니터링하기 위한 로봇 보조 나노 차분 스캐닝 플루오리미터(나노 DSF)를 구현하는 TSA 프로토콜을 제시합니다.

단편 기반 리드 디스커버리에서 스크리닝을 위한 나노 차분 스캔 형광

DNA 메틸트랜스퍼라제는 잠재적인 항암제 표적입니다. 여기에서, DNA 메틸 트랜스퍼 라제 억제에 대한 소분자를 평가하기위한 프로토콜이 제시된다. 이 분석은 엔도뉴클레아제를 활용하여 DNA 메틸화를 형광 생성에 결합하고 효소 활성을 실시간으로 모니터링할 수 있도록 합니다.

DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

특정 억제제를 스크리닝하기 위한 빠르고 정확한 화학 분석은 약물 개발 무기고에서 중요한 도구입니다. 여기에서는 HAT1 아세틸화 활성의 억제를 측정하기 위한 확장 가능한 아세틸 클릭 화학 분석을 제시합니다.

히스톤 아세틸전이효소 1 아세틸화를 측정하기 위한 아세틸 클릭 화학 분석

학습하세요 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제 활성 분석을 위한 클릭 화학 기반 형광 분석법을. 고처리량 스크리닝에 적합한 이 민감한 방법은 새로운 항생제 개발에 기여합니다.

효소 특성화에서 고처리량 스크리닝까지 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제에 대한 클릭 화학 기반 형광 분석

더 많은 동영상 탐색