Name: 이중 마커를 이용한 모자이크 분석을 이용한 대뇌 피질 개발의 계보 추적 및 클론 분석(MADM) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 배우세요 MADM 기술을 이용한 대뇌 피질 개발의 단일세포 수준 계보 추적 및 유전자 기능 분석 방법입니다. 이 프로토콜은 마우스 모델에서 전구세포 증식 행동과 세계열 관계를 정량적으로 측정하여 발달생물학 연구에 활용됩니다.

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우리는 기술 지원을 위해 IST 오스트리아의 히펜마이어 실험실, 바이오 이미징 시설, 생명 과학 시설 및 사전 임상 시설에 대한 모든 회원들에게 감사드립니다. 이 작품은 IST 오스트리아 기관 기금에 의해 지원되었다; R.B.는 오스트리아 과학 기금(FWF) 리세-마이트너 프로그램(M 2416)의 지원을 받았습니다. N.A는 오스트리아 과학 기금 (FWF) Firnberg-Programm (T 1031)로부터 지원을 받았습니다. GC는 ISTplus 박사 후 동료로 마리 Skłodowska-Curie 보조금 계약 번호 754411에 따라 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 지원을 받았다; A.H.는 ÖAW DOC(오스트리아 과학 아카데미 박사 펠로우십)의 지원을 받았습니다. 이 연구는 또한 유럽 연합 (EU)의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램 (보조금 계약 번호 725780 LinPro)에 따라 유럽 연구 위원회 (ERC)에 의해 지원되었다 S.H.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

개발 중인 신피질에서 생체내에서 개별 RGPs의 세포 혈통을 추적하기 위해 MADM을 사용하는 방법이 설명되어 있다. TM 유도 형 CreERT2와결합하면 MADM 이벤트가 정확하게 시간 조정 될 수 있으므로 단일 셀 수준에서 줄기 세포 분열 패턴의 질적 및 정량적 시각적 판독을 제공합니다. 전달된 TM의 용량을 적정함으로써, 이상적인 상황에서 피질 반구당 1개 미만의 클론의 평균을 얻을 수 있으며, 개별 클론을 명확하게 구별하기 위한 적절한 공간 분리를 제공한다. 조직 무결성을 유지함으로써,이 방법은 또한 위치, 형태학 및 절대 세포 수에 관한 필수 정보를 캡처합니다. MADM 카세트는 Chr. 117,11,,,12,,46,,56,,57,Chr. 751, Rosa2647,53, 59의,59 오리지널 MADM이 MADM 클론 분석 연구에 사용되었습니다., 개별 세포의 고해상도는 딸 세포의 형태학 그리고 복제 관계에 전례없는 통찰력을 제공하고 증식 줄기 세포와 신흥 클론46,,52의살아있는 이미징을 허용합니다.
제왕 절개 및 산후 시점에서 클론의 분석을위한 새끼의 육성은 프로토콜에 필요하고 중요한 단계입니다. TM 치료 임신 댐의 건강 상태에 따라 제왕 절개를 수행 할 필요가 없을 수 있습니다. 그러나 TM 치료 어머니가 수유에 어려움을 겪을 수 있기 때문에 수양 어머니와 함께 새끼를 키우는 것은 여전히 필요합니다. 다른 CreERT2 드라이버로 육성할 필요성에 차이가 관찰되지 않았습니다. MADM 라인과 수양 모친은 모두 근친 CD-1 배경에서 유지됩니다. 제왕 절개가 필요하지 않은 경우 실험용 새끼를 생성하는 데 사용되는 TM 처리 임신 댐은 3R원칙에 따라 추가 실험 사육을 위해 재사용할 수 있습니다(동물 실험 라이센스가 이 관행을 승인하는 경우에만 이 작업을 수행할 수 있음). 수양 어머니는 출산 후 2 일 이내에 새끼를 양육하는 데 사용할 수 있지만, 양육해야 하는 실험 마우스와 같은 날에 출산 할 때 더 높은 성공률이 관찰되었습니다. 따라서, 1.1 단계에서 실험 짝짓기와 병행하여 수양 어머니를 위한 시간 조정된 짝짓기를 설정하는 것이 중요합니다. 원래 수양 어머니의 쓰레기와 유사한 쓰레기 수를 유지하는 것은 양육 새끼의 생존율을 향상시킬 수 있으므로 원래의 모든 쓰레기에 일부를 제거해야합니다. 육성을 개선할 수 있는 추가 단계는 실험자의 장갑을 쓰레기와 음식으로 문지르는 것을 포함합니다(장갑의 향기를 제거하기 위해); 제왕 절개 후 새끼를 수양 어머니의 더러운 쓰레기와 둥지 조각으로 부드럽게 문지르는; 그리고 위탁 마우스 케이지에 배치하기 전에 수양 어머니의 새끼와 밀접한 접촉에 새끼의 배치.
다른 리포터 기반 리니지 추적 방법과 마찬가지로 MADM 복제 실험에 적합한 CreERT2 드라이버를 선택할 때주의 해야 합니다. 첫째, 사용되는 프로모터는 관심있는 선조 인구에서 현세적으로 그리고 공간적으로 재조합을 표현해야합니다. 일부 프로모터는 표현 패턴을 변경하거나 다양한 개발 단계에서 침묵할 수 있기 때문에 이 프로모터를 찾는 것은 어려울 수 있습니다. 세포 형 특이성을 향상시키기 위해 다중 부위 별 재조합, 각각 별도의 프로모터에 의해 구동, 사용되었습니다. 하나 또는 둘 다 재조합이 동일한 세포에서 발현될 때, 이것은 형광 기자74,75,,,76,,77로세포및 그것의 자손을 표지합니다. 요약하면 분석중인 선조의 인구에 특정한 CreERT2 드라이버를 선택하는 것이 중요합니다.
이 방법에서 가장 중요한 단계는 모든 셀이 단일 재결합 이벤트(단계 8.1)에서 명확하게 파생되어야 하기 때문에 클론을 식별하는 것입니다. TM 농도의 적정은 뇌 반구 당 적색/녹색 세포의 1개 미만의 클러스터를 보장하고 단일 클론(단계 2.2)7,,11을분석할 확률을 최대화한다. 클론은 인접한 셀 클러스터가 관심 있는 클론의 500 μm 이내에 발생하는 경우 폐기해야 합니다. 따라서 복제본이 출현하기 전과 후에 여러 섹션을 검사하여 근처에 추가 재조합 이벤트가 없는지 확인하는 것이 중요합니다. 형광의 약한 신호로 인해 배아 클론에서 eGFP 및 tdT에 대한 면역 히스토케를 수행해야합니다 (섹션 6 참조). 이것은 추가 항원이 공동 표지될 경우에 성인 클론에서만 추천됩니다. 클론을 이미징할 때 클론이 있는 피질의 전체 너비(즉, 피알 표면에서 코퍼스 캘로섬까지, 8.4단계를 참조)를 캡처하여 세포를 놓치지 않는 것이 중요합니다. 또한 이미지 처리(섹션 9)에서 이미지 정렬을 용이하게 합니다. 프로토콜의 섹션 8은 반전된 공초점 현미경을 요구하지만 사용 가능한 현미경 설정에 따라 적응될 수 있습니다. 상피 현미경 검사는 사용할 수 있지만, 공초점 현미경 검사는 초점 평면 외부에서 빛 오염의 감소로 이어질 수 있기 때문에 권장됩니다. 또한 레이저 강도와 게인이 조정되어 녹색, 빨간색 및 황색 세포를 명확하게 식별할 수 있도록 하는 것도 중요합니다. 설정에 관계없이, 밀접하게 배치 된 세포의 전체 공간 분리를 보장하기 위해 적어도 20 배의 목표를 사용하는 것이 좋습니다. 클론이 있는 모든 세포의 피질 깊이(Step 8.6)를 기록하는 것 외에도, 알렌 브레인 아틀라스 또는 기타 스테레오탁스 좌표 맵과 같은 뇌 아틀라스를 사용하여 클론이 있는 피질 영역을 식별해야 한다. 파일 명명 패러다임도 채택하여 복제 이미지를 쉽게 식별할 수 있도록 해야 합니다. 파일 명명에 고유한 이미지 ID, 날짜 이미지가 촬영, 동물의 유전자형, 유도 연령, 분석 연령, 이미지 번호 와 같은 복제본의 나머지 이미지와 관련된 이미지 번호 : 다음 정보는 파일 명명에 포함 될 수 있습니다.
하나의 MADM 카세트에 돌연변이 해스의 도입은 특유의 유전모자이크(71)의 생성을 허용하고 복제 레벨7,11,,46,,62에서계보 및 세포형 다양성의 분자 조절기의 해부를 허용한다., MADM을 가진 유전 모자이크를 생성하기 위하여는, MADM 카세트는 관심있는 유전자와 같은 염색체에 메이오트로 연결되어야 합니다 (번식 계획에 대한 그림 2 참조). 이는 MADM을 가진 현재 클로날 분석을 Chr. 751,Chr. 1146,Chr. 1251 Rosa26 및 Chr. 6 단면에 위치한 유전자로제한합니다. 향후 연구는 어떤 염색체든을 표적으로 한 MADM 카세트를 사용하여 복제 수준에서 마우스 게놈의 거의 모든 유전자의 모자이크 분석을 허용합니다.
마지막으로, MADM은 개발 중인 신피질에서 선구 세포의 분석에 국한되지 않는다. 많은 줄기 세포 틈새 틈새의 연구는 복제 관련 세포의 현면 배열을 해결하는 기능에서 혜택을 누릴 수 있습니다. 뇌의 다른 부위에 MADM을 적용하, 질환 상태(예를 들어, 암), 또는 다른조직에서47,,50,,51,,52,,53,,54,,55,56,,57,,58,,59,연구 결과는 선조 및 줄기 세포의 다양한 클래스에서 파생된 클론의 혈통 관계를 밝혔다(현재 MADM 연구 목록은 표 1 참조)., MADM의 또 다른 흥미로운 미래 응용 프로그램은 클론에서 획득 할 수있는 정보의 정도를 증가시킬 것이다 추가 기능 또는 세포 외 기자와 결합하는 것입니다.

대뇌 피질은 6개의 뚜렷한 층으로 구성된 고도로 조직된 구조물입니다. 피질은 기능성 신경 회로를 형성하기 위하여 상호 작용하는 신경과 glia를 포함하여 세포 모형의 다양한 배열을 포함합니다. 대부분의 경우, 전부는 아니지만, 피질 흥분 성 프로젝션 뉴런및 신경아는 방사형 신경교선 전구체 (RGPs),1,2,23로알려진 신경 줄기 세포 (NSCs)의 일반적인 풀에서 파생된다. RGPs 자체는 초기 배아 신경상피성 구성 신경상피성 줄기 세포 (NESCs)에서 파생됩니다. 마우스에서 배아일 9 (E9)에 의해, NESCs는 RGPs4로전환하기 시작합니다. RGP 혈통 진행은 정확한 측두및 공간 조절을 필요로 하고, 이 과정이 방해될 때, megalencephaly, microcephaly, lissencephaly, 또는 정신 분열증과 자폐증과 같은 손상과 같은 가혹한 신경 장애는5,,6귀착될 수 있습니다. E10에서 대부분의 RGPs는 대칭 증식 부문을 거치며 신경 전조 풀4,,7의확장이 발생합니다. RGPs는 결국 비대칭으로 분할하기 시작하여 일시적으로 정의된 방식으로 피질 프로젝션 뉴런을 생성합니다. 신경 발생의 연속파를 통해 신생아 뉴런은 피상층8,,9,,10에거주하는 깊은 층과 늦게 태어난 뉴런을 차지하는 초기 태어난 뉴런을 차지하는 피질 라미네이트를 형성하는 피질 판으로 이동한다. 복제관련 피라미드뉴런은 접선 분산이 거의 없는 피질로 방사되어 이동하기 때문에, 딸 세포는4,11,12,,13의신경방사형유닛이라고불리는 컬럼 또는 콘 모양의 구조를 형성하는 경향이 있다., E17에 의해, 배아 신경 발생 팽창은 마우스(14)에서완료된다. RGPs는 또한 상층세포 및 올리고원드로시테,1,,,15,16,17,,18,,19를포함하는 일부 종류의 glia를 생성할 수 있다. RGPs의 잠재력은 뉴런과 성상세포를 모두 발생시키는 것으로 보이며, 신경성 RGPs의 약 1/6은 또한 glia11을생산하는 모든 피질영역(18)에걸쳐 일관된 것으로 보인다.
현재, 그것의 혈통을 따라 줄기 세포의 측두진행을 통제하는 유전 및 후성 유전학 요인은 대부분 알려지지 않습니다. 유전자 발현의 시간적 패턴은 RGPs20,21,,,22,,23,,24에서혈통 결정에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 측두와 공간 패터닝 사이의 이 단단히 뜨개질 관계가 피질 부위를 가로 질러 성인 신경 유형의 분자 다양성으로 이어지는 방법은 알려져 있지 않습니다. 마찬가지로, 개별 줄기 세포 잠재력과 세포 출력이 세포 및 분자 수준에서 변조되는 방법은 중요한 대답없는 질문입니다. 향후 연구는 이러한 질문 중 일부를 잘해결하여 궁극적으로 기능성 피질 회로 형성에 대한 이해를 확대할 것입니다.
발달 신경생물학은 두뇌에 있는 세포가 서로 공유하는 혈통 관계를 이해하기 위하여 노력합니다. 처음에는 연구 도구가 거의 제공되지 않았으며, 많은 초기 연구는 Caenorhabditis elegans25와같은 투명한 유기체에서 분열 패턴의 시각적 관찰에 의존했습니다. 최근 수십 년 동안사용가능한 기술의 수와 정교함이 급격한 증가,,26,,27,,28,,29. CRISPR-Cas9 게놈 편집 시스템의 출현은 진화하는 DNA 바코드를 도입하여 세포 혈통 관계의 합성 재구성을 가능하게한다 27,,30. 바코드 전략의 2개의 최근 예는 CRISPR-Cas9를 특정 DNA 바코드 로시 또는 니코아제 Cas9와 융합한 시티딘 데아미나아제로 지시하는 호밍 가이드 RNA의 사용을 포함하여 내인성 산재반복영역(31,,32)을표적으로 한다. 이러한 기술은 시간이 지남에 따라 고유한 돌연변이를 점진적으로 안정적으로 축적하는 바코드도입을 통해 매우 멀티플렉스화된 접근 방식을 제공합니다. 게놈 편집 접근법은 이러한 바코드의 공유 상속에 기초하여 두 세포 사이의 관계를 소급 분석할 수 있기 때문에 매우 유용합니다. 그러나, 개별 적인 세포에 있는 바코드를 읽으려면, 조직은 일반적으로 중단되어야 하고, 따라서 개별 선조에서 위치, 형태학 및 절대 세포 수에 관하여 정보가 분실됩니다.
조합 라벨링 패러다임은 공간 정보를 보존하고 원칙적으로 밀접하게 지역화되거나 겹치는클론(33,34)의34구별을 허용한다. 계보 추적 방법을 유익하게 하려면 개별 선조와 자손에 희소하고 지울 수 없는 방식으로 라벨을 부착해야 합니다. 특히, Brainbow35 및 색종이36,,37 접근법은 단일 궤적에서 형광 단백질의 조합을 표현하는 확률다색 Cre 재조합 기자를 사용합니다. 생체 내에서 달성 할 수있는 동시 색상 조합의 광범위한 수는 피질 RGP 클론과 성상 세포34를추적 할 때이 강력한 도구를 합니다. 형광 기자를 코딩하는 트랜스게놈의 안정적인 게놈 통합을 제공하는 트랜스포손 기반 시스템 및 피질 전조자의 시야도 추적 허용도33,,38,,39,,40,,41을개발했다. 트랜스포슨 계시스템은 리포터가 게놈에 안정적으로 통합하여 라인 관련 딸 세포를 안정적으로 라벨화한다는 점에서 추가적인 이점이 있다. 특히 성상세포 혈통을 추적하기 위해, 스타 트랙을포함한 돼지박 트랜스포가스의 전기포지를 포함하는 여러 가지 방법이 개발되었으며, 이는 상이한 형광단백질40,,42를코딩하는 구조의 조합을 이용하여 한다. 또 다른 접근 법, MAGIC 마커,트랜스 포지셔닝 트랜스 유전자로 Brainbow 벡터를 소개합니다. 이것은 성공적으로 배아 신경 및 성상세포 선조34,,43을추적하는 데 사용되었습니다. 최근에는 이중 재조합 카세트 교환(MADR)에 의한 모자이크 분석은 정확하게 정의된 염색체로시(44)로부터형질원원소를 발현하는 돌연변이 세포를 안정적으로 라벨링하는 것으로 나타났다. 이러한 강력한 생체 내 결합 라벨링 기술은 전구 세포의 계보 역학에 대한 수많은 통찰력을 제공했습니다. 그러나 이러한 분석은 고정 된 조직에서 수행되며 정의 된 발달 단계에서 개별 클론의 스냅 샷을 제공합니다. 시간이 지남에 따라 단일 클론의 계보 역학의 변화를 관찰하기 위해, 성인 덴테이트 자이러스에서 수행된 것과 유사한 만성 생체 내 이미징 방법은45를적용할 필요가 있다.
이중 마커(MADM)를 이용한 모자이크 분석은마우스(46,,47)에서개별 전구 세포의 생체 혈통 추적을 가능하게 하는 강력한 이중 색 라벨링 방법입니다. MADM 라벨링 이벤트가 발생하려면 두 가지 구성 요소가 필요합니다: 첫째, MADM 카세트는 동종 염색체에 동일한 로시를 대상으로 해야합니다. 카세트는 2개의 키메라 형광 기자 유전자, eGFP (녹색, [G]) 및 탠덤 디머 토마토 (빨간색, tdT[T])로 구성됩니다. GT 카세트에는 eGFP의 N 종단과 tdT의 C-종단이 포함되어 있으며, 록스P 부위를 포함하는 인트론으로 구분됩니다. TG 카세트는 TdT의 N 종점과 eGFP의 C-종점으로 반비례하여 구성됩니다. 둘째, 표적 MADM 카세트를 포함하는 동일한 세포에서 Cre 재조합의 발현이 필수적이다. Cre가없는 경우, 키메라 카세트는 코딩 서열이 중단되기 때문에 기능성 eGFP 또는 tdT를 표현하지 않습니다. loxP 사이트는 Cre 매개 인터크로모솜 재조합의 대상역할을 하므로 두 식 카세트의 재구성이 동시에 수행됩니다. X 분리 (G2-X)에 선행된 세포 주기의 G2 단계 도중 재조합이 생기는 경우에, 2개의 딸 세포는 각각 2개의 형광 단백질 의 한을 발현할 것입니다. 타목시펜(TM)을 이용한 CreERT2 활동의 시간적 조절은 MADM 클론의 생년월일과 자손의 분할 패턴에 대한 정확한 정보를제공한다(도 1A)29,,46,,47.
MADM은 잠재적으로 체계적으로 골기 염색 같은 전통적이지만 비특이적이고 힘든 방법과 유사한 마우스 뇌에서 높은 단일 세포 해상도로 개별 클론을 라벨 수있습니다 48 또는 염료 충전49. CreERT2를 운전하는 프로모터만이 클로날 MADM 라벨링의 세포형 특이성을 결정하기 때문에, MADM은 원칙적으로 모든 뮤린 장기 및,조직(47,50, 51,51,52)에걸쳐 클론 계보 추적을 위해 적용될 수 있다., 실제로, 연구는 이미 다양한 조직에서 파생 된 클론의 혈통 관계를 밝히기 위해 MADM을 사용하여47,,50,,51,52,,53,,54,,55,,56,,,57,,58,,59. MADM 실험 패러다임은 개발 중인 신생아7,,11, 12,,,46,,60, 61,,,61,62,,63,64, 64,,65에서피질 프로젝션 뉴런, glia 및 산후 줄기 세포에서 계보를 연구하기 위해 적용되었다.62 MADM은 또한 성인 성축 자이러스, 시상, 소뇌 과립 세포 및 클로날 수준에서 간 뉴런 (전체 목록에 대한 표 1 참조)47,53,,,54,,56,,57,,66에서세포 계보를 연구하는 데 사용되었습니다.
MADM의 독특한 특징은 한 MADM 카세트에 돌연변이를 유전적으로 연결하여 유전 모자이크(도1B 및 도 2)를생성하는 능력입니다. 이로 인해 1개의 형광 마커(도 1B의tdT)와 다른 균질 돌연변이 형제(도 1B의eGFP)로 표지되지 않은 이종수구 환경에서 표시되지 않은 딸 세포가 생성됩니다. MADM은 대조군 및 돌연변이 서브클론의 비교 분석이 생체 내동일한 조직 환경에서 수행될 수 있다는 점에서 독특하다. 원래 MADM 카세트는 Rosa26 궤적(47)으로표적으로 삼았지만, 유전자 기능의 MADM 분석은 궤적에 대한 유전자 에 대한 종량제로 제한되었다. 이러한 한계를 극복하고 MADM 기반 유전자 분석가능성을 확대하기 위해 MADM 카세트는 Chr. 751,Chr. 1146,Chr. 1251의센트로메레스에 가깝게 두드렸다. MADM 카세트로 19개의 마우스 자가를 대상으로 하는 것이 진행 중이며, 기능성 유전 분석과 결합하여 발달 계보 관계 연구를 위한 비교할 수 없는 플랫폼을 제공함으로써, 미래에 거의 모든 유전자를 연구할 수 있게 될 것이다.

<table><tbody><tr><td>1mL 투베르쿨린 주사기(Omnifix Luer Lock)</td><td>Braun</td><td>9204512N</td><td></td></tr><tr><td>1,4-디아자비사이클로옥탄(DABCO)</td><td>Roth</td><td>0718.2</td><td></td></tr><tr><td>10mL 주사기(Omnifix Luer Lock)</td><td>Braun</td><td>8508429N</td><td></td></tr><tr><td>15mL 원추형 원심분리기</td><td>Sarstedt</td><td>65.554.502</td><td></td></tr><tr><td>24 멀티웰 접시</td><td>Roth/Greiner Bio-one</td><td>CE56.1</td><td></td></tr><tr><td>27- 게이지 x 3/4 바늘 (Sterican)</td><td>Braun</td><td>16010256E</td><td></td></tr><tr><td>옥수수 기름</td><td>Sigma</td><td>C8267-500ML</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립 (24 x 60 mm # 1)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Menzel)</td><td>15747592</td><td></td></tr><tr><td>저온 유지 장치 Cryostar NX70</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>957000H</td><td></td></tr><tr><td>Dako 펜 (왁스 마커)</td><td>Agilent</td><td>S200230-2</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>일회용 마이크로톰 블레이드(MX35 Ultra)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>705830</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps (Dumont #5)</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Glass anti-roll plate</td><td>Histocom</td><td>M 449980</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>LSM 800 Confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마운팅 매체</td><td></td><td></td><td>25 mg/mL DAPCO, 6 g 글리세롤, 2.4 g Mowiol 4-88, 6 mL dH2O, 12 mL 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5)</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Roth</td><td>0713.2</td><td></td></tr><tr><td>노멀 당나귀 혈청</td><td>혁신적인 연구</td><td>IGDNSER100ML</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마</td><td>441244-1KG</td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프 323E/D 400RPM</td><td>왓슨말로우</td><td>036.3124.00A</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마</td><td>S8501-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost 플러스 유리 슬라이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J1800AMNT</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>조직 임베딩 몰드 T-12 (22mm square)</td><td>Polysciences Inc.</td><td>18986-1</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>93363</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P9416-100ML</td><td></td></tr><tr><td>소프트웨어 및 플러그인:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>1.52p</td><td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">Fiji</a></td><td></td></tr><tr><td>MultiStackReg</td><td>1.45</td><td><a href="http://bradbusse.net/sciencedownloads.html" target="_blank">다운로드 링크</a></td><td></td></tr><tr><td>TurboReg</td><td></td><td><a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/" target="_blank">EPFL Bioimaging</a></td><td></td></tr><tr><td>Zen Blue</td><td>2.6</td><td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_us/products/microscope-software/zen.html#introduction" target="_blank">Zeiss</a></td><td></td></tr><tr><td>실험 모델: Organisms/Strains:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse: Emx1-CreER</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>JAX:027784</td><td></td></tr><tr><td>마우스: MADM-11-GT</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>JAX:013749</td><td></td></tr><tr><td>마우스: MADM-11-TG</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>JAX:013751</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-GFP 1:500</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-tdTomato 1:500</td><td>Sicgen 항체와 관련상품</td><td>AB8181-200</td><td></td></tr><tr><td>토끼 안티 RFP 1:500</td><td>MBL</td><td>PM005</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibodies:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Chicken Alexa Fluor 488 1:500</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>715-475-150</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Goat Cy3 1:500</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>705-165-147</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Rabbit Cy3 1:500</td><td>잭슨 면역연구소</td><td>711-165-152</td><td></td></tr></tbody></table>

이중 마커를 이용한 모자이크 분석을 이용한 대뇌 피질 개발의 계보 추적 및 클론 분석(madm)

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers (MADM)

전구의 제한된 풀에서 시작, 포유류 대뇌 피질은 고도로 조직 된 기능성 신경 회로를 형성한다. 그러나, 신경 줄기 세포의 혈통 전이를 조절 하는 기본 세포 및 분자 메커니즘 (NSC) 그리고 개발 신경 에피테륨에서 신경 세포와 glia의 최종 생산 불분명 남아. NSC 분할 패턴을 추적하고 복제 관련 셀의 계보를 매핑하는 방법이 극적으로 진행되었습니다. 그러나, 많은 현대 혈통 추적 기술은 선천성 세포 분열 패턴을 해독하기 위해 필수적인 자손 세포 운명의 세포 해상도의 부족때문에 손해를 입습니다. 제시된 것은 생체 내 복제 분석에서 수행하기 위해 이중 마커(MADM)를 이용한 모자이크 분석을 사용하는 프로토콜이다. MADM은 개별 전구 세포를 수반적으로 조작하고 전례없는 단일 세포 해상도에서 정확한 분할 패턴 및 계보 진행을 시각화합니다. MADM 기반 의 상호 염색체 재조합 이벤트 동안 미토시스의 G2-X 단계 동안, 과도하게 유도 CreERT2와함께, 클론의 생년월일과 그 분할 패턴에 대한 정확한 정보를 제공합니다. 따라서, MADM 계보 추적은 단일 세포 수준에서 줄기 세포 전조자의 증식 모드의 전례 없는 질적 및 정량적 광학 판독을 제공한다. MADM은 또한 NSC 혈통 진행에서 후보 유전자의 메커니즘 및 기능적 요구 사항을 검사할 수 있습니다. 이 방법은 대조군 및 돌연변이 서브클론의 비교 분석이 생체 내의 동일한 조직 환경에서 수행될 수 있다는 점에서 독특하다. 여기서, 프로토콜은 상세히 기술되고, 개발 중인 대뇌 피질에서 클로날 분석 및 혈통 추적을 위해 MADM을 사용하는 실험 패러다임이 입증된다. 중요하게도, 이 프로토콜은 CreERT2 드라이버가 존재하는 한, 어떤 뮤린 줄기 세포 틈새 시장에서 MADM 클로날 분석을 수행하기 위하여 적응될 수 있다.

이중 마커(MADM)를 이용한 모자이크 분석을 이용하여 단일 세포 수준에서 후보 유전자의 계보 추적 및 기능성 유전자 분석을 수행하는 프로토콜이 제시된다. MADM 클로날 분석은 개별 전조자와 그들의 딸 세포의 증식 행동, 세포 출력 및 혈통 관계를 측정하는 정량적인 틀을 제공합니다.

이중 마커를 이용한 모자이크 분석을 이용한 대뇌 피질 개발의 계보 추적 및 클론 분석(MADM)

Beginning from a limited pool of progenitors, the mammalian cerebral cortex forms highly organized functional neural circuits. However, the underlying ...

이중 마커 기술을 이용한 모자이크 분석은 개인 줄기 세포의 증식 거동 및 저장고 출력에 대한 고정량적 정보를 제공할 수 있는 강력한 방법입니다. 이 기술의 독특한 특징은 단일 세포 수준에서 후보 유전자의 혈통 추적 및 기능적 유전 분석을 허용한다는 것입니다.절차에 악마화, 카르멘 Streicher, 기술자, 니콜 앰버지, 포스트 닥터, 기젤 청, 포스트 닥터와 앤디 한센, 내 실험실에서 박사 과정 학생. 실험마우스에서 MADM 재결합 이벤트를 유도하려면 25게이지 바늘을 장착한 1ml 주사기를 사용하여 임신 한 댐에 맞춰 타목시펜 인트라페리토날의 단일 주사를 전달한다. MADM 클로날 분석부터 산후 시간 점에 이르기까지. 배아 일 18 받는 일 18 받는 날, 수핀 위치에 임신 한 마우스를 배치 하 고 70%에탄올모피를 소독. 자궁 위의 하복부에 있는 피부에 있는 작은 절개를 하고 복막을 드러내기 위하여 근육과 복부 근육 벽을 통해 두 번째 절개를 합니다. 가위를 사용하여 자궁을 주변 조직으로부터 분리하고 온수 자궁을 따뜻한 물로 장갑에 넣습니다. 그런 다음 미세 팁 가위와 손가락을 사용하여 자궁 벽을 조심스럽게 열어 배아를 방출합니다. 새끼를 부드럽게 누르고 수시로 호흡을 시작한 후 산전 동물을 위탁 모에게 옮기십시오. 신경 MADM 클론 티슈를 수집하기 위해 관류 수술 트레이에 수핀 위치에 마취 된 동물을 배치하고 70 %의 에탄올로 모피를 소독합니다. 가위와 집게를 사용하여 피부를 통해 하나의 절개와 근육 층을 통해 하나의 절개를합니다. 흉부 구멍이 보이면, 냄새를 맡고 다이어프램을 들어 올려 심장을 드러내고 조심스럽게 갈비뼈를 수술 트레이에 고정합니다.PBS로 채워진 연설 펌프 튜브에 연결된 바늘을 심장의 왼쪽 아래 심실로 삽입하고 작은 아이리스 가위를 사용하여 오른쪽 의 후방 끝에 절개를 합니다. PBS와 심장 혈관 시스템을 perfuse 즉시 PBS에서 갓 준비 얼음 차가운 4 % 파라 포름알데히드와 관류에 의해 다음. 관류가 완료되면 신중한 해부를 통해 뇌를 제거하고 수확 한 장기를 신선한 4 %의 뇌 부피의 적어도 5 배에 배치합니다 4

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

바이러스 기반 Cre 호텔의 재조합을 사용하여 출생 후의 마우스 두뇌 개발의 유전자 기능의 모자이크 분석

신경 전구 세포의 유사 분열은 신경의 중요한 매개 변수입니다. 신경 전구 세포의 유사 분열에 대한 우리의 이해의 대부분은 고정 된 조직의 분석을 기반으로합니다. 배아 뇌 조각의 라이브 영상은 통제 된 환경에서 높은 공간적 해상도로 유사 분열을 평가하기 위해 다양한 기술입니다.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

뇌 결 heterotopia (PNH) 성인에서 대뇌 피 질의 개발 (MCD)의 기형의 가장 일반적인 형태는 그러나 그것의 유전으로 가장 산발적 인 경우 알 수 없는 남아 있다. 우리는 최근 MCDs에 대 한 비 발한 후보자 유전자를 식별 하 고 직접 그들의 원인이 역할 비보를 확인 하는 전략을 개발 했습니다.

배열 CGH, 전체 exome 시퀀싱과 설치류에 Utero에서 Electroporation 뇌 기형에 대 한 원인 유전자를 식별 하는 새로운 전략

여기서 우리는 두 가지 색상으로 일반 전구 세포에서 파생 된 신경 세포의 시각화를 허용하는 모자이크 라벨 기술에 대한 프로토콜을 제시한다. 이것은 다른 사람의 동일한 뉴런에서 출생 데이트 개별 뉴런의 기능과 공부 유전자 기능과 신경 계통 분석을 용이하게한다.

쌍둥이 자리 MARCM를 사용하여 세포 계보 분석 및 유전자 기능 연구

라이브 영상 실시간에 세포 행동을 공부 하는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 시간 경과 비디오-현미경 기본 대뇌 피 질 세포의 차별화 된 뉴런을 명과 기본 신경 줄기 세포에서 혈통 진행 동안 제정 단계의 상세한 검사를 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다.

2D 문화 시스템을 사용 하 여 기본 대뇌 피 질 세포의 영상 라이브

뒤에 소프트웨어 기반 후 처리 시간 경과 비디오 현미경에 의해 신경 인구를 모니터링 하는 강력한 프로토콜 설명 되어 있습니다. 이 메서드는 선택 된 인구 라이브 이미징 실험 동안에 생물 학적 이벤트를 식별 하는 강력한 도구를 나타냅니다.

영상 모니터 세포 생물학과 여러 신경 인구의 계보 진행을 추적 하는 단일 셀 다음 라이브

두뇌에 있는 유전자의 세포 자치 기능 손실을 유도 하 여 공부 될 수 있다 또는 셀의 스파스 인구에 있는 기능을 얻을. 여기, Cre recombinase 함수 비보의 손실에 floxed 유전자와 대뇌 피 질의 뉴런 개발의 부족 인구에 제공 electroporation utero에서 설명 합니다.

Cre lox 재결합 Electroporation Utero에 통해 마우스 대뇌 피 질에서 유도

이 방법은 R26R-Confetti (Confetti) 마우스 모델을 사용하여 광물화된 조직을 연구하고 번식 전략에서 이미지 획득에 이르는 모든 단계를 포괄하는 방법을 설명합니다. 모든 연조직에 적용될 수 있는 일반적인 프로토콜과 광물화된 조직에 적용될 수 있는 변형된 프로토콜이 포함된다.

광물화된 조직을 연구하기 위해 색종이 마우스를 사용한 클로날 유전자 추적

성상 세포는 대뇌 피질을 균일하게 타일로 만들어 세포 수준에서 복잡한 형태에 대한 분석을 어렵게 만듭니다. 여기에 제공된 프로토콜은 자궁 전기포레이션을 기반으로 하는 다색 라벨을 사용하여 피질 성상신구를 선별하고 사용자 친화적인 이미지 분석 파이프라인을 사용하여 볼륨 및 형태를 분석합니다.

피질 마우스 성상세포를 개별화하기 위해 다각형 게놈 통합 색상(MAGIC) 마커의 자궁 전기포게에서

유도성 트랜스제닉 계보 추적 마우스 라인을 사용하여 줄기 세포 및 그의 자손을 형광단으로 영구적으로 표시하는 능력은 생체내에서 활성화, 증식, 이동 및/또는 분화의 공간적 및 시간적 분석을 가능하게 한다. 계보 추적은 혈통 헌신, 개입에 대한 반응 및 다능성에 대한 새로운 정보를 나타낼 수 있습니다.

성인 마우스 뇌에서 유도성 형광 표지 줄기 세포의 계보 추적

이 프로토콜은 iDISCO+를 사용하여 온전한 마우스 뇌의 자기 공명 영상, 제거 및 면역 표지를 수행하는 방법을 설명한 다음, 라이트 시트 현미경을 사용한 이미징 및 NuMorph를 사용한 다운스트림 분석에 대한 자세한 설명을 설명합니다.

MRI, 조직 투명화 및 라이트 시트 현미경을 사용한 온전한 신생아 마우스 뇌의 전뇌 단일 세포 이미징 및 분석

배우세요 MADM 기술을 이용한 대뇌 피질 개발의 단일세포 수준 계보 추적 및 유전자 기능 분석 방법입니다. 이 프로토콜은 마우스 모델에서 전구세포 증식 행동과 세계열 관계를 정량적으로 측정하여 발달생물학 연구에 활용됩니다.

이중 마커를 이용한 모자이크 분석을 이용한 대뇌 피질 개발의 계보 추적 및 클론 분석(MADM)

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