Name: 고농도 단일 분자 현미경 검사용 제로 모드 파도가이드 제조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 배우세요 단일 분자 현미경 검사용 제로 모드 파도가이드를 저비용으로 제조하는 방법입니다. 콜로이드 자기조립 기술을 활용하여 생물학적 농도에서 형광 시약을 관찰할 수 있습니다.

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이 작품은 NIH 보조금 R01GM080376, R35GM118139 및 NSF 엔지니어링 메카노생물학 CMMI 센터: 15-48571에서 Y.E.G.에, 그리고 NIAID 전 박사 NRSA 펠로우십 F30AI114187에서 Rj.j..M.

참고: 모든 단계는 일반 실험실 공간에서 완료할 수 있습니다.
1. 유리 커버 슬립 청소
<ol><li>콜로이드 입자의 증발 증착을 위한 깨끗한 표면을 제공하기 위해 24 x 30mm 광학 보로실리케이트 유리 커버립(0.16-0.19 mm 두께)을 세척용 코플린 유리 스테닝 항아리의 홈 인서트 내에 배치합니다. 참고: 커버립이 똑바로 서 있고 잘 분리되어 있는지 확인하여 청소 과정에서 모든 표면이 명확하게 노출되도록 합니다.</li>
	<li>염색 항아리에 충분한 아세톤을 부어 커버를 덮고 커버를 배치하고 40 °C에서 10 분 동안 초음파 처리하십시오.</li>
	<li>아세톤을 붓고 염색 된 항아리를 증류 한 H2O로 채우고 물을 부어 커버스립을 헹구습니다. 2회 더 반복합니다.</li>
	<li>아세톤 초음파 처리(1.2 단계 및 1.3 단계)를 다시 한 번 반복합니다.</li>
	<li>40°C에서 20분 동안 커버립을 커버하고 초음파 처리하여 항아리에 충분히 200mM KOH를 붓습니다. 참고 : KOH는 유리를 약간 등점합니다.</li>
	<li>증류된 H2O 6번으로 커버립을 헹구습니다.</li>
	<li>에탄올을 추가하여 커버립을 덮고 뚜껑을 추가하고 40°C에서 10분 동안 초음파 처리합니다.</li>
	<li>증류된 H2O 3번으로 커버립을 헹구습니다.</li>
	<li>부드러운 집게를 사용하여 가장자리의 각 커버슬립을 선택하고 N2 가스로 커버립을 건조시다. 커버슬립의 가장자리만 터치합니다. 말린 청소 커버립을 각각 개별 깨끗한 페트리 접시에 놓습니다.</li>
</ol>2. 폴리스티렌 구슬의 증발 증착
<ol><li>ZMW 어레이에 대한 콜로이드 크리스탈 마스크를 생성하기 위해, 1 μm 직경의 원심분리기 50 μL, 비기능성 폴리스티렌 구슬(물 2.5% w/v)에서 15,000 x g,25°C에서 5분 동안. 참고: 구슬을 파이프팅하기 전에 구슬이 병 바닥에 정착한 경우 주식 솔루션이 잠시 소용돌이쳐야 합니다.</li>
	<li>상체를 버리고 가능한 한 적은 물을 남깁니다. 참고: 잔류물은 에탄올재서스펜션(39)의증발 특성을 변경할 수 있으므로, 모든 물을 제거하기 위해 소량의 구슬을 제거할 수 있다.</li>
	<li>1:400 TritonX-100:에탄올 용매의 50 μL에서 2.2 단계에서 구슬을 재차질한다. 파이펫을 여러 번 위아래로 사용하여 구슬을 용매와 철저히 혼합합니다. 참고: TritonX-100:에탄올 용매는 사용 후 파라핀 필름으로 밀봉하고 한 달에 한 번 신선하게 준비해야 합니다. 구슬은 마이크로 센세이퍼튜브와 같은 플라스틱 용기의 측면을 고수하는 경향이 있으므로 측면을 따라 파이펫을 사용하여 모든 구슬이 재주중단되도록 합니다.</li>
	<li>증착을 위한 습도 챔버를 설치하려면 뚜껑이 약간 남아 있는 벤치에 뚜껑이 있는 6개의 페트리 접시를 뚜껑이 있는 벤치에 놓습니다. 각 접시에서 커버슬립을 열린 영역으로 이동하여 다음 단계에서 습도가 증가할 때 커버립이 환경에 노출되도록 합니다.</li>
	<li>페트리 접시 뒤에 는 히그로미터와 작은 전기 팬을 배치합니다.</li>
	<li>실험실에서 시작 상대 습도(RH)를 기록합니다. 200mL 비커를 150-200mL의 ~75°C 물로 채우고 팬 뒤에 놓습니다.</li>
	<li>팬을 켜고 페트리 접시, 팬, 비커 및 히그로미터를 뒤집고 투명한 플라스틱 저장 용기(66cm x 46cm x 38cm)로 덮습니다.</li>
	<li>챔버의 RH가 일반적으로 5-10 분 소요 70-75 %로 상승하자. 참고: 주변 실험실 RH가 낮으면(~50% 미만)인 경우, 증착 시 습도 의 손실을 보상하기 위해 챔버가 더 높은 RH에 도달하지만 80 % 이상은 없습니다 (아래 참조).</li>
	<li>RH가 70-75%에 도달하면 RH를 기록하고 플라스틱 저장 용기를 약간 들어 올려 페트리 접시에 커버를 빠르게 배치하여 커버립의 과도하게 젖은 것을 방지합니다. 참고: 챔버의 온도는 가습의 결과로 실온, 전형적으로 25-26°C보다 약간 따뜻할 것입니다. 커버립에 습기가 보이면 유리 표면이 너무 젖습니다. 상용 장갑 상자는 프로토콜의 이 부분을 단순화할 수 있습니다.</li>
	<li>챔버의 RH가 계속 상승하여 85%로 상승하게 하십시오. 그 시점에서, 습도 챔버와 피펫 5 μL의 각 커버슬립의 중앙에 RH를 기록한다.</li>
	<li>각 증착 후 챔버와 페트리 접시를 닫아 습도의 손실을 최소화하십시오. 2분 이내에 6개의 기탁을 모두 완료하는 것을 목표로 합니다.</li>
	<li>증착 후 챔버에 RH를 기록합니다. 참고: 증착 후 RH는 증착 중에 습도가 얼마나 빨리 손실되었는지 측정하는 데 도움이 되며, 이는 주변 실험실 조건에 따라 달라집니다. 일반적인 성공적인 실행을 위해, 챔버는 증착 하기 전에 85% RH에서 시작하고 증착 후 70-75% RH에서 끝납니다.</li>
	<li>비드 방울을 5분 동안 퍼지고 건조시키십시오. 참고: 콜로이드 결정이 많은 구멍 이나 다층 영역이 있는 경우, 챔버는 각각 너무 습하거나 건조 가능성이 있었다. 페트리 접시를 닫고 기탁을 시작하는 상대 습도를 조정합니다(최적화에 대한 추가 논의를 위한 결과 섹션 참조).</li>
</ol>3. 콜로이드 크리스탈 템플릿에서 모공 크기를 줄이기위한 비드 어닐링
<ol><li>비드 간 interstices를 좁히고 interstices의 모서리를 반올림 폴리스티렌 구슬의 어닐링에 대한 균일 한 온도 표면을 제공하기 위해, 표준 세라믹 핫 플레이트 위에 평평하고 밀링 알루미늄 접시를 배치합니다.</li>
	<li>핫 플레이트의 온도를 107°C로 설정하이고,폴리스티렌(40)의유리 전이 온도. 참고: 안정적이고 정확한 온도를 얻기 위해 열전대 프로브는 알루미늄 플레이트에 2-3mm 너비와 4-5mm 깊이 구멍으로 고정되었습니다.</li>
	<li>뜨거운 알루미늄 판에 비드 템플릿이 들어 있는 커버슬립과 20s의 음막을 놓습니다(용융 시간에 대한 설명을 위한 토론 섹션 참조).</li>
	<li>가열 후 알루미늄 플레이트에서 덮개 슬립을 제거하고 신속하게 다른 실온 알루미늄 표면에 배치하여 냉각시하십시오. 참고: 커버립이 플레이트 의 가장자리에 약간 걸려 있거나 얕은 채널(첨부 된 비디오 참조)을 접시에 넣고 커버립을 쉽게 픽업하는 것이 도움이됩니다.</li>
</ol>4. 콜로이드 크리스탈 템플릿을 사용하여 알루미늄 제로 모드 도파관의 나노 제작
<ol><li>열 또는 전자 빔 증발 증착을 사용하여, 구슬 사이의 interstices에서 게시물을 생성하기 위해 콜로이드 결정 템플릿 위에 2 Å /s에 구리 의 300 nm를 예금.</li>
	<li>테이프로 표면을 부드럽게 눌러 구슬 위에 과도한 금속을 제거합니다. 테이프를 천천히 벗겨 금속을 벗깁니다. 참고: 테이프를 당긴 후에도 반사 과잉 금속의 일부 작은 패치가 남아 있을 수 있으며, 이는 종종N2 가스의 스트림에 의해 제거될 수 있다. 테이프 당김 후 반사 과잉 금속의 상당한 패치가 남아 있는 경우, 폴리스티렌 구슬을 부분적으로 용해하기 위해 2 시간 동안 톨루엔에 템플릿을 담그십시오. 커버립을 증류수로 씻고 N2로말리고 테이프 풀을 반복합니다. 비드가 테이프를 당기는 동안 기둥을 손상으로부터 보호하는 데 도움이 되기 때문에 비드를 완전히 녹여서는 안 됩니다.</li>
	<li>폴리스티렌 구슬을 녹이려면 비드 템플릿을 톨루엔에 놓고 하룻밤 동안 담가 둡니다. 주의: 톨루엔 연기는 독성이 있을 수 있습니다. 통풍이 잘 되는 후드 아래에서 톨루엔과 함께 작업하고 장갑, 안전 안경 및 실험실 코트를 포함한 개인 보호 장비를 착용하십시오. Toluene은 인화성 액체로 지정된 통풍 캐비닛에 보관해야 합니다.</li>
	<li>톨루엔 인큐베이션 후, 클로로폼으로 한 번, 에탄올로 두 번 템플릿을 헹구는 다. 섬세한 200-300 nm 높이의 금속 기둥이 노출되어 있기 때문에 핸들립은 이 시점에서 조심스럽게 커버합니다. N2로 템플릿을 건조하고 산소 플라즈마 클리너에서 잔류 폴리머 및 오염 물질을 30 분 동안 제거하십시오. 주의: 클로로폼 연기가 독성이 있을 수 있습니다. 통풍이 잘 되는 후드 아래에서 클로로폼을 착용하고 장갑, 안전 안경 및 실험실 코트를 포함한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 클로로폼은 다른 인화성 용매에서 멀리 떨어진 통풍 캐비닛에 보관해야 합니다.</li>
	<li>열 또는 전자 빔 증발 증착을 사용하여 티타늄 접착 층의 3 nm를 1 Å/s로 입금한 다음 구리 기둥 의 4 Å/s 주위와 상단에 100-150 nm의 알루미늄을 보관하십시오. 참고: 두꺼운 클래딩을 사용하여 더 깊은 가이드와 배경 형광의 감쇠를 얻을 수 있지만 다음 단계에서 게시물을 노출하고 용해한 후 수율이 감소합니다(토론 섹션 참조).</li>
	<li>금속 기둥을 용해하려면, 구리 에탄 (구연산 기반)에 커버립을 담그십시오. 재료 의 표) 2 시간 동안. 주의: 금속 에티트는 피부 화상을 일으킬 수 있습니다. 통풍이 잘 되는 후드 아래에서 에트와 함께 작업하고 보호 장비를 착용하십시오. 취급 후 손을 철저히 씻으십시오. 금속 에트트는 부식성 액체로 지정된 통풍 캐비닛에 보관해야 합니다.</li>
	<li>커버립을 증류수로 헹구고N2로말리고, 금속 클래딩 표면을 렌즈 페이퍼로 부드럽게 강화하여 클래딩으로 덮여 있는 게시물을 노출시합니다. 커버립을 구리 에트챈트에 다시 넣고 2h를 더 한 다음 증류수로 다시 헹구고 N2로건조시다. 참고: ZMW 슬라이드는 오염 물질이 없도록 커버되고 깨끗한 페트리 접시에 보관해야 합니다.</li>
</ol>5. 콜로이드 크리스탈 템플릿을 사용하여 금 제로 모드 파도파장의 나노 제작
참고: 알루미늄 ZMW를 제조하는 프로토콜을 반영하는 골드 ZMWs(보충도 1)를제조하는 방법이 이 섹션에서 제공됩니다.
<ol><li>열 또는 전자 빔 증발 증착을 사용하여 티타늄 접착 층의 3 nm를 1 Å/s로 입금한 다음 4 Å/s에서 300nm의 알루미늄을 보관하십시오.</li>
	<li>테이프로 표면을 부드럽게 눌러 구슬 위에 과도한 금속을 제거합니다. 테이프를 천천히 벗겨 금속을 벗깁니다.</li>
	<li>폴리스티렌 구슬을 녹이려면 비드 템플릿을 톨루엔에 놓고 하룻밤 동안 담가 둡니다.</li>
	<li>톨루엔 인큐베이션 후, 클로로폼으로 한 번, 에탄올로 두 번 템플릿을 헹구는 다. N2로 템플릿을 건조하고 산소 플라즈마 클리너에서 잔류 폴리머 오염 물질을 30 분 동안 제거하십시오.</li>
	<li>열 또는 전자 빔 증발 증착을 사용하여 알루미늄 기둥 의 주위에 5 Å / s 주위에 금 100-150 nm를 입금하십시오.</li>
	<li>금속 기둥을 용해하려면 알루미늄 에탕트(인산 계)에 커버립을 담그십시오. 재료 의 표) 1 시간 동안.</li>
	<li>커버립을 증류수로 헹구고N2로말리고, 금속 클래딩 표면을 렌즈 페이퍼로 부드럽게 강화하여 클래딩으로 덮여 있는 게시물을 노출시합니다. 커버립을 알루미늄 에트챈트에 1시간 동안 다시 넣고 증류수로 다시 헹구고 N2로건조시다. 참고: ZMW 슬라이드는 덮여 깨끗한 페트리 접시에 보관해야합니다.</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

콜로이드 자체 조립(프로토콜 섹션 2)의 경우, 서스펜션 용매가 증발 공정을 가속화함에 따라 물 대신 에탄올을 사용하여 이전방법(48,49)과마찬가지로 1-2h가 아닌 증착 후 2-3분 안에 템플릿을 준비한다. 여기에 제시된 증발 침전 프로토콜은 또한서스펜션(49,50,51)의표면 기울기, 온도 및 공기 부피를 제어해야 하는 이전 침전 프로토콜보다 더 간단하다. 이 프로토콜에 사용되는 입자 부피 분수는 2.4%로, 이전퇴적방법(48)에사용된 0.2-0.5%보다 높으며, 이는 훨씬 더 긴 침전 시간 스케일을 위해 수량 글리세롤 혼합물에서 콜로이드를 재장중단하였다. 그러나, 기탁의 품질은 입자 부피 분획의 변화에 견고하며...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.
Figure 3 was updated from:
<img alt="Colloidal crystal patterns, optical micrographs, grain structure, diffraction patterns, scale bars." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Colloidal crystal diffraction patterns and SEM images; microscopy analysis of photonic structures." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.

Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

단일 분자 형광 공명 에너지 전달(smFRET) 또는 단일 분자 형광 상관 분광법(FCS)과 같은 단일 분자 기술은 분자 생물물리학을 위한 강력한 도구로,전사1,2,3,번역4,5,6,기타 7, 기타 7과 같은 공정에서 개별 생체 분자의 동적 움직임, 적합성 및 상호 작용의 연구를 가능하게한다. smFRET의 경우, 많은 테더드 분자가 시간이 지남에 따라 추적될 수 있기 때문에 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경 검사는 일반적인 방법이며, TIR에 의해 생성된 에반센드 파는 커버슬립8에인접한 100-200 nm 영역으로 제한된다. 그러나, 이러한 포주 부피에 대한 제한에도 불구하고, 배경 형광9위의 단일 분자 신호를 검출하기 위해서는 여전히 pM 또는 nM 범위로 희석되어야 한다. 세포 효소의 Michaelis-Menten 상수는 전형적으로 mM 범위10에μM에 있기 때문에, 단일 분자 연구에서 생화확적인 반응은 일반적으로 세포에 있는 것보다 훨씬 느립니다. 예를 들어, 단백질 합성은 대장균11,12에서초당 15-20 아미노산에서 발생하며, 대부분의 대장균 리보솜은 스모트 실험에서 초당 0.1-1아미노산으로 변환된다 13. 단백질 합성에서, 정체된 리보좀에 대한 결정 구조 및 smFRET는 tRNA-mRNA 전좌 단계14,15이전에 '하이브리드'와 '고전적인' 상태 사이에서 전송 RNA(tRNAs)가 변동하는 것으로 나타났다. 그러나, 전좌 GTPase 인자, EF-G의 생리적 농도가 존재했을 때, 하이브리드와 고전 국가 사이의 상이한 형태, 중간, smFRET6에서관찰되었다. 세포에 있는 것과 유사한 비율 그리고 농도에 동적 분자 프로세스를 공부하는 것은 중요합니다, 그러나 기술적인 도전남아 있습니다.
형광 기판 농도를 증가시키는 전략은 제로 모드 파도어(ZMWs)라고 불리는 금속 계의 가시파장 조리개를 사용하여 조리개 내에서 국소화된 생체 분자를 선택적으로 자극하는 제한된 흥분 장을 생성하는 것이다(그림1). 조리개는 일반적으로 직경 100-200 nm, 깊이17에서100-150 nm입니다. 우물의 크기 및 형상과 관련된 컷오프 파장(λc≈ 유전체매체(18)로물을 가진 원형 도파관의 직경은 2.3배≈) 전파 모드가 도파관에 허용되지 않으므로, 따라서 용어 제로 모드 파도가이드. 그러나 진동하는 전자기장은 에반센드 파라고 불리는, 강도가 기하급수적으로 부패하면서도파선(18,19)으로짧은 거리를 터널링한다. TIR 에반센센트 파도와 유사하지만, ZMW 에반센센트 파도는 부패 상수를 가지며, 그 결과 도파관 내에서 10-30 nm 유효 여기 영역이 생성됩니다. 형광 으로 표지된 리간드의 미세 몰라 농도에서, 단지 하나 또는 몇몇 분자는 흥분 지역 안에 동시에 존재합니다. 흥분 부피의 이 제한 및 배경 형광의 결과적인 감소는 생물학으로 관련있는 농도에서 단 하나 분자의 형광 화상 진찰을 가능하게 합니다. 이는 단일 단백질확산(21)의FCS 측정, 저친화성 리간드단백질(22)및 단백질 단백질상호작용(23)의 단일 분자 FRET 측정, 단일 분자 회전율이벤트(24)의분광-전기화학적 측정을 포함한 많은 시스템에 적용되었다.
ZMW는 이온 빔 밀링25,26 또는 전자 빔 리소그래피(EBL)를 사용하여 금속 층을 직접 패터닝한 다음 플라즈마 에칭16,27로생산되었다. 이러한 마스크리스소그래피 방법은 일련의 파관을 생성하고 일반적으로 ZMW 기술의 광범위한 채택을 방지하여 특수 나노 제조 시설에 대한 액세스가 필요합니다. 또 다른 방법, 자외선 나노 임프린트 리소그래피 리프트 오프(28)는석영 슬라이드 금형을 사용하여 스탬프와 같은 저항 필름에 역 ZMW 템플릿을 누릅니다. 이 방법은 더 간소화되어 있지만 석영 금형을 제작하기 위해서는 EBL이 필요합니다. 이 문서에서는 EBL 또는 이온 빔 밀링을 필요로 하지 않으며 소각 마스크를 형성하기 위해 나노스피어의 밀착 포장을 기반으로 하는 간단하고 저렴한 템플릿 제작 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다.
1982년 Deckman과 Dunsmuir29,30에의해 처음 제안된 나노스피어 또는 "천연" 리소그래피는 수십 나노미터에서 수십 마이크로미터31에이르는 모노분산 콜로이드 입자의 자체 조립을 사용하여 에칭 및/또는 재료의 증착을 통한 표면 패터닝을 위한 템플릿을 만듭니다. 콜로이드 결정이라고 불리는 콜로이드 입자의 2차원(2D) 또는 3차원(3D) 확장된 주기적인 배열은 산란 및배절(32)으로부터의밝은 무지개빛 물질을 특징으로 한다. 전자 빔이나 포토리스그래피보다 덜 널리 사용되지만 이 마스킹 방법론은 간단하고 저렴한 비용으로 쉽게 축소되어 100 nm 미만의 피처 크기를 만듭니다.
콜로이드 입자의 자체 조립을 지시하는 것은 곡성 결정을 표면 패터닝을 위한 마스크로 사용하는 성공을 결정합니다. 입자의 크기와 모양이 균일한 경우, 콜로이드 입자는 엔트로피고갈기(33)에 의해 구동되는 육각형포장으로 쉽게 자체 조립될 수 있다. 낙하 코팅 후 의 수분 증발은 콜로이드 입자를 침전하는 효과적인 경로이지만, 다른 방법은 딥 코팅(34,스핀 코팅35,전기 지질 증착36)및 공기 물 인터페이스(37)에서통합을 포함한다. 아래에 제시된 프로토콜은 가장 간단한 증발 침전 방법을 기반으로 합니다. 삼각형은 희생 금속을 플레이트하는 개구부를 형성하여 구멍을 형성하는 개구부를 형성한다(그림2 및 보충 도 1). 이 단계 전에 구슬의 간략한 어닐링은 이러한 게시물의 모양과 직경을 조정합니다. 구슬이 제거되고 최종 금속 층이 게시물 주위에 증착된 다음 게시물이 제거됩니다. 콜로이드 나노 마스크에 두 개의 금속 증착 단계 후, 중간 기둥의 제거, 통과 및 테더링을위한 표면 화학 수정, ZMW 어레이는 단일 분자 이미징에 사용할 준비가되어 있습니다. 제조 후 ZMW 광학 특성의 보다 광범위한 특성화는 함께 제공되는 제38에서찾을 수 있다. 금속의 증기 증착을 위한 열 증발기 외에 특수 공구가 필요하지 않습니다.

<table><tbody><tr><td><강한>1. Glass Coverslip Cleaning</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>32201</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Coplin 유리 염색 용기</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-817</td><td>8개의 홈과 성형 유리 덮개가 있는 염색 용기</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>VWR</td><td>48404-467</td><td>24 mm x 30 mm (No.1&frac12;, 직사각형)</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>1 L</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>30603</td><td>수산화칼</td></tr>륨 <tr><td>페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>R80115TS 직경 100mm, 깊이 15mm</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>Z245143</td><td>탁상용 초음파 세척기, 5510</td></tr><tr><td>2. 폴리스티렌 비드의 증발 증착</강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>투명 저장 용기</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-110-8222</td><td>26 x 18 x 15 인치.</td></tr><tr><td>탁상용 선풍기</td><td>O2Cool</td><td>FD05001A</td><td>작은 책상(~5인치) 선풍기가 작동합니다</td></tr><tr><td>유리 비커</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-555-25B</td><td>250mL</td></tr><tr><td>습도계</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-661-19</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-402-903</td><td>1.5mL</td></tr><tr><td>폴리스티렌 미세</td><td>구 Polysciences</td><td>18602-15</td><td>1.00 & 마이크로; m 직경, 비기능화</td></tr><tr><td>Triton X-100 deturgent</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>3. 콜로이드 결정 템플릿의 기공 크기를 줄이기 위한 비드 어닐링</강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA11062RY</td><td>14cm x 14cm 세라믹 핫플레이트로 사내에서 맞춤 제작</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>HP88857100</td><td>13 x 8.2 x 3.8인치.</td></tr><tr><td>온도 컨트롤러</td><td>McMaster-Carr</td><td>38615K71</td><td>열전대 프로브로 온도 읽기</td></tr><tr><td>열전대 프로브</td><td>McMaster-Carr</td><td>9251T93</td><td>Type K, 표면 프로브</td></tr><tr><td><강>4/5. 콜로이드 결정 템플릿을 사용한 제로 모드 도파관의 나노 제작</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 에칭</td><td>Transene</td><td>Type A</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 펠릿</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>EVMAL40QXHB</td><td>전자빔 증착용</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마</td><td>288306</td><td>1 L</td></tr><tr><td>구리 에칭</td><td>트란센</td><td>49-1</td><td></td></tr><tr><td>구리 펠릿</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>EVMCU40QXQA</td><td>전자빔 증착용</td></tr><tr><td>금 펠릿</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>EVMAUXX40G</td><td>전자빔 증착용</td></tr><tr><td>렌즈 종이</td><td>Thorlabs</td><td>MC-5</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>스카치 테이프</td><td>스테이플</td><td>MMM119</td><td></td></tr><tr><td>박막 증착 시스템</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>PVD-75</td><td>탁상용 열 증착 시스템도 작동합니다</td></tr><tr><td>티타늄 펠릿</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>EVMTI45QXQA</td><td>전자빔 증착용</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Sigma</td><td>244511</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Representative Results</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>COMSOL Multiphysics Modeling Software</td><td>COMSOL, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>듀얼 뷰 스펙트럼 스플리터</td><td>Photometrics, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

고농도 단일 분자 현미경 검사용 제로 모드 파도가이드 제조

Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

단일 분자 형광 효소학에서, 용액에 표지된 기판에서 배경 형광은 수시로 피코- 나노 몰라 범위에 형광포 농도를 제한하고, 많은 생리적인 리간드 농도 보다는 크기의 몇몇 순서. 알루미늄이나 금과 같은 얇은 전도 금속으로 제작된 직경 100-200 nm의 제로 모드 도파관(ZMWs)이라고 불리는 광학 나노 구조는 가시광선 내분을 제프토리터 유효 볼륨에 국한하여 형광 농도의 미세 모름 농도에서 개별 분자의 이미징을 허용합니다. 그러나, 고가의 특수 나노 제조 장비에 대한 필요성은 ZMWs의 광범위한 사용을 배제하고있다. 여기서, 콜로이드, 또는 나노권, 리소그래피는 와도파 제작을 위한 나노미터 규모의 마스크를 만드는 대안 전략으로 이용됩니다. 이 보고서는 각 단계에 대한 실질적인 고려 사항과 함께 접근 방식을 자세히 설명합니다. 이 방법을 통해 수천 개의 알루미늄 또는 골드 ZMW를 병렬로 만들 수 있으며 최종 파도어 직경과 깊이는 100-200 nm입니다. 금속 증착을 위한 일반적인 실험실 장비와 열 증발기만 필요합니다. ZMWs가 생화학 적 커뮤니티에 더 쉽게 접근 할 수 있도록함으로써,이 방법은 세포 농도 및 비율에 분자 과정의 연구를 용이하게 할 수 있습니다.

증발 침전(steps 2.1−2.13)을 통한 폴리스티렌 콜로이드 입자의 자체 조립은 용매 증발속도를 제어해야 하기 때문에 다양한 결과를 생성할 수 있다. 그러나 기탁이 빠르기 때문에(라운드당 10-15분), 절차는 다양한 주변 실험실 조건에 맞게 신속하게 최적화될 수 있습니다. 도 3A증착 및 증발 후 잘 형성된 콜로이드 템플릿을 나타낸다. 매크로, 구슬의 영역은 원형, 비드의 불투명다층 링에 의해 정의 된 테두리와. 이미지의 반투명하지만 흰색 영역은 원하는 단층 영역입니다. 도 3B는 지나치게 습한 환경에서 포장된 콜로이드 템플릿을 나타낸다(페트리 접시가 닫혔을 때 80% RH). 이러한 템플릿은 깨끗한 원형 경계를 가지고 있지 않고 바깥쪽으로 확장되는 다층 tendrils가 있는 경향이 있습니다. 증착은 허용 가능하고 후속 단계에서 사용될 수 있지만 격자의 구멍은 단일 분자 이미징을 위한 사용 가능한 ZMW 어레이 영...

여기에 설명된 나노피어 리소그래피 방법은 형광구의 나노-마이크로몰라 농도에서 단일 분자 이미징을 위한 금속 입은 유리 현미경 커버슬립에서 나노 개구체의 배열인 제로 모드 파휘도의 병렬 제작을 위한 나노스피어 리소그래피 방법입니다. 이 방법은 콜로이드 크리스탈 자체 어셈블리를 활용하여 도파관 템플릿을 만듭니다.

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...

제로 모드 도파관 제작을 위해 여기에 제시된 나노스피어 리소그래피 프로토콜은 특수 제작 도구나 시설이 필요하지 않은 접근 가능하고 저렴한 방법입니다. 이 방법은 단일 분자 생물 물리학에 유용하며 더 많은 연구자가 생물학적으로 관련된 형광 시약 농도에서 단일 분자 실험을 수행할 수 있도록 합니다. 콜로이드 입자의 증발 증착을 위한 깨끗한 표면을 만들려면 Coplin 유리 염색 용기의 홈이 있는 삽입물에 광학 붕규산 유리 커버슬립을 배치합니다.커버 슬립을 덮고 항아리를 덮을 수 있도록 충분한 아세톤으로 염색 용기를 채웁니다. 항아리를 섭씨 40도에서 10분 동안 초음파 처리합니다. 아세톤을 붓고 증류수로 커버슬립을 세 번 헹굽니다.초음파 처리와 아세톤을 반복 한 후 커버 슬립을 덮을 수산화 칼륨을 충분히 항아리에 채 웁니다. 뚜껑을 덮고 항아리를 섭씨 40도에서 20분 동안 다시 초음파 처리합니다. 커버 슬립을 증류수로 6 번 헹군 다음 에탄올에 10 섭씨 40 분에서 40 분 동안 초음파 처리합니다.증류수로 커버슬립을 세 번 씻은 후 집게를 사용하여 가장자리에서 각 커버슬립을 부드럽게 집습니다. 각 커버슬립을 질소 가스로 건조시키고 깨끗하고 건조한 커버슬립과 자체 페트리 접시를 각각 놓습니다. 1 미크론 비기능성 폴리스티렌 비드의 50 마이크로 리터 원심 분리기.상층액을 버리고 가능한 한 적은 물을 남깁니다. 비드를 50마이크로리터의 용매에 재현탁시킨 다음 피펫팅으로 철저히 혼합합니다. 증착을 위한 습도 챔버를 설정하려면 6개의 페트리 접시를 한 줄로 배열합니다.각 페트리 접시에 하나의 커버슬립을 놓고 커버슬립이 환경에 노출되도록 뚜껑을 약간 열어 둡니다. 습도계와 작은 선풍기를 페트리 접시 뒤의 중앙에 놓고 실험실의 상대 습도를 기록합니다. 약 섭씨 200도에서 150-200밀리리터의 물을 200밀리리터 비커에 채우고 팬 뒤에 비커를 놓습니다.선풍기를 켠 다음 페트리 접시, 선풍기, 비커, 습도계를 뒤집힌 투명 플라스틱 보관 용기로 덮습니다. 상대 습도가 70-75%에 도달하면 플라스틱 보관 용기를 약간 들어 올리고 페트리 접시의 뚜껑을 빠르게 닫아 커버 슬립이 과도하게 젖는 것을 방지합니다. 챔버의 상대 습도가 85%에 도달하면 비드 현탁액의 5마이크로리터가 각 커버슬립의 중앙에 놓입니다.증언 직후 각 페트리 접시를 덮고 증언 사이에 모든 것을 덮은 보관 용기에 보관하십시오. 비드 증착은 습도 손실을 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 완료되어야 합니다. 증착이 너무 건조하거나 젖어 있는 경우 챔버 습도는 최적화해야 할 가장 중요한 변수입니다.6개의 증착이 모두 완료되면 챔버의 상대 습도를 기록하고 비드 방울을 퍼뜨리고 5분 동안 건조시킵니다. 폴리스티렌 비드의 어닐링을 위한 균일한 온도 표면을 제공하려면 표준 세라믹 핫 플레이트 위에 평평하고 밀링된 알루미늄 플레이트를 놓고 핫 플레이트의 온도를 폴리스티렌의 유리 전이 온도인 섭씨 107도로 설정합니다. 뜨거운 알루미늄 플레이트에 비드 템플릿이 들어 있는 커버슬립을 놓습니다.20초 동안 어닐링한 후 알루미늄 판에서 커버슬립을 제거하고 즉시 실온의 알루미늄 표면에 올려 냉각시킵니다. 열 증발 증착을 사용하여 비드 템플릿이 포함된 커버슬립 위에 초당 2옹스트롬의 속도로 300나노미터의 구리를 증착합니다. 이렇게 하면 구슬 사이의 틈새에 포스트가 생성됩니다.비드에서 여분의 구리를 제거하려면 테이프 조각을 표면에 부드럽게 누른 다음 테이프를 천천히 떼어냅니다. 폴리스티렌 비드를 톨레운에 커버슬립을 넣고 밤새 그대로 두어 녹입니다. 커버 슬립을 조심스럽게 다루고 클로로포름으로 한 번, 에탄올로 두 번 헹굽니다.질소로 템플릿을 건조시킵니다. 산소 플라즈마 세정제에 30분 동안 넣어 잔류 폴리머와 오염 물질을 제거합니다. 열 증발 증착을 사용하여 초당 1옹스트롬의 속도로 3나노미터의 티타늄 접착층을 증착한 다음 구리 기둥 주위와 위에 초당 4옹스트롬의 속도로 100-150나노미터의 알루미늄을 증착합니다.일부 증착 장치에서 자동으로 수행되는 것처럼 증착 중에 샘플이 회전하지 않는지 확인하십시오. 구리 포스트를 용해하려면 커버 슬립을 구리 에칭액에 2 시간 동안 담그십시오. 커버슬립을 증류수로 헹군 후 질소로 건조시킨 다음 렌즈 페이퍼로 표면을 부드럽게 닦아 클래딩으로 덮여 있는 포스트를 노출시킵니다.커버슬립을 구리 에칭액에 2시간 더 담근 다음 증류수로 다시 헹구고 질소로 건조시킵니다. 표면 패시베이션 후, 제로 모드 도파관 커버슬립은 양면 접착 테이프를 사용하여 석영 슬라이드와 쌍을 이루어 단일 분자 이미징을 위한 미세유체 흐름 챔버를 만들 수 있습니다. 콜로이드 템플릿 자체 조립의 성공 여부는 상대 습도에 따라 크게 달라집니다.잘 형성된 템플릿에서 구슬 영역은 불투명한 다층 고리로 정의된 테두리가 있는 원형입니다. 잘 구성된 템플릿에서 대부분의 템플릿에는 육각형으로 밀집된 비드가 포함되어야 합니다. 증발 침강 중 걸림으로 인해 입자 사이에 약간의 결함이 있을 것입니다.폴리스티렌 비드의 구리 증착 및 용해 후 구리 포스트는 직경이 150나노미터 미만이어야 합니다. 300나노미터 구리 증착 깊이의 경우 기둥 높이는 약 250나노미터입니다. 알루미늄 클래딩을 증착하고 구리 포스트를 용해한 후 도파관은 원자력 현미경으로 볼 수 있어야 하며 약 550나노미터 떨어져 있어야 합니다.폴리스티렌 템플릿을 20초 동안 어닐링하면 직경 118나노미터의 알루미늄 도파관이 생성되었으며, 이는 가시광선의 전파를 차단하기에 충분히 작습니다. 이미징을 위한 ZMW의 일반적인 필드에는 40 x 80 미크론 시야에 3, 000개의 도파관이 포함되어 있습니다. ZMW 기능을 테스트하기 위해 단일 분자 FRET를 수행했습니다.단일 분자 FRET 흔적은 테스트된 주변 Cy5 형광의 모든 농도에서 검출될 수 있었습니다. 이에 비해 단일 분자는 피코몰에서 낮은 나노몰 농도의 TERF 조명에서만 검출할 수 있습니다. 제로 모드 도파관 제작 후, 장치는 단일 분자 이미징 중 비특이적 상호 작용을 줄이기 위해 폴리머로 부동태화될 수 있습니다.제로 모드 도파관의 유리 바닥은 단일 분자 방출을 향상시키기 위해 약간 에칭할 수도 있습니다. 전반적으로 이 새로운 제로 모드 도파관 제조 방법을 통해 연구원들은 세포 내의 농도와 속도에 더 가까운 농도와 속도로 전사 또는 번역과 같은 동적 생화학적 과정을 보다 쉽게 조사할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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