고농도 단일 분자 현미경 검사용 제로 모드 파도가이드 제조

제로 모드 도파관 제작을 위해 여기에 제시된 나노스피어 리소그래피 프로토콜은 특수 제작 도구나 시설이 필요하지 않은 접근 가능하고 저렴한 방법입니다. 이 방법은 단일 분자 생물 물리학에 유용하며 더 많은 연구자가 생물학적으로 관련된 형광 시약 농도에서 단일 분자 실험을 수행할 수 있도록 합니다. 콜로이드 입자의 증발 증착을 위한 깨끗한 표면을 만들려면 Coplin 유리 염색 용기의 홈이 있는 삽입물에 광학 붕규산 유리 커버슬립을 배치합니다.

커버 슬립을 덮고 항아리를 덮을 수 있도록 충분한 아세톤으로 염색 용기를 채웁니다. 항아리를 섭씨 40도에서 10분 동안 초음파 처리합니다. 아세톤을 붓고 증류수로 커버슬립을 세 번 헹굽니다.

초음파 처리와 아세톤을 반복 한 후 커버 슬립을 덮을 수산화 칼륨을 충분히 항아리에 채 웁니다. 뚜껑을 덮고 항아리를 섭씨 40도에서 20분 동안 다시 초음파 처리합니다. 커버 슬립을 증류수로 6 번 헹군 다음 에탄올에 10 섭씨 40 분에서 40 분 동안 초음파 처리합니다.

증류수로 커버슬립을 세 번 씻은 후 집게를 사용하여 가장자리에서 각 커버슬립을 부드럽게 집습니다. 각 커버슬립을 질소 가스로 건조시키고 깨끗하고 건조한 커버슬립과 자체 페트리 접시를 각각 놓습니다. 1 미크론 비기능성 폴리스티렌 비드의 50 마이크로 리터 원심 분리기.

상층액을 버리고 가능한 한 적은 물을 남깁니다. 비드를 50마이크로리터의 용매에 재현탁시킨 다음 피펫팅으로 철저히 혼합합니다. 증착을 위한 습도 챔버를 설정하려면 6개의 페트리 접시를 한 줄로 배열합니다.

각 페트리 접시에 하나의 커버슬립을 놓고 커버슬립이 환경에 노출되도록 뚜껑을 약간 열어 둡니다. 습도계와 작은 선풍기를 페트리 접시 뒤의 중앙에 놓고 실험실의 상대 습도를 기록합니다. 약 섭씨 200도에서 150-200밀리리터의 물을 200밀리리터 비커에 채우고 팬 뒤에 비커를 놓습니다.

선풍기를 켠 다음 페트리 접시, 선풍기, 비커, 습도계를 뒤집힌 투명 플라스틱 보관 용기로 덮습니다. 상대 습도가 70-75%에 도달하면 플라스틱 보관 용기를 약간 들어 올리고 페트리 접시의 뚜껑을 빠르게 닫아 커버 슬립이 과도하게 젖는 것을 방지합니다. 챔버의 상대 습도가 85%에 도달하면 비드 현탁액의 5마이크로리터가 각 커버슬립의 중앙에 놓입니다.

증언 직후 각 페트리 접시를 덮고 증언 사이에 모든 것을 덮은 보관 용기에 보관하십시오. 비드 증착은 습도 손실을 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 완료되어야 합니다. 증착이 너무 건조하거나 젖어 있는 경우 챔버 습도는 최적화해야 할 가장 중요한 변수입니다.

6개의 증착이 모두 완료되면 챔버의 상대 습도를 기록하고 비드 방울을 퍼뜨리고 5분 동안 건조시킵니다. 폴리스티렌 비드의 어닐링을 위한 균일한 온도 표면을 제공하려면 표준 세라믹 핫 플레이트 위에 평평하고 밀링된 알루미늄 플레이트를 놓고 핫 플레이트의 온도를 폴리스티렌의 유리 전이 온도인 섭씨 107도로 설정합니다. 뜨거운 알루미늄 플레이트에 비드 템플릿이 들어 있는 커버슬립을 놓습니다.

20초 동안 어닐링한 후 알루미늄 판에서 커버슬립을 제거하고 즉시 실온의 알루미늄 표면에 올려 냉각시킵니다. 열 증발 증착을 사용하여 비드 템플릿이 포함된 커버슬립 위에 초당 2옹스트롬의 속도로 300나노미터의 구리를 증착합니다. 이렇게 하면 구슬 사이의 틈새에 포스트가 생성됩니다.

비드에서 여분의 구리를 제거하려면 테이프 조각을 표면에 부드럽게 누른 다음 테이프를 천천히 떼어냅니다. 폴리스티렌 비드를 톨레운에 커버슬립을 넣고 밤새 그대로 두어 녹입니다. 커버 슬립을 조심스럽게 다루고 클로로포름으로 한 번, 에탄올로 두 번 헹굽니다.

질소로 템플릿을 건조시킵니다. 산소 플라즈마 세정제에 30분 동안 넣어 잔류 폴리머와 오염 물질을 제거합니다. 열 증발 증착을 사용하여 초당 1옹스트롬의 속도로 3나노미터의 티타늄 접착층을 증착한 다음 구리 기둥 주위와 위에 초당 4옹스트롬의 속도로 100-150나노미터의 알루미늄을 증착합니다.

일부 증착 장치에서 자동으로 수행되는 것처럼 증착 중에 샘플이 회전하지 않는지 확인하십시오. 구리 포스트를 용해하려면 커버 슬립을 구리 에칭액에 2 시간 동안 담그십시오. 커버슬립을 증류수로 헹군 후 질소로 건조시킨 다음 렌즈 페이퍼로 표면을 부드럽게 닦아 클래딩으로 덮여 있는 포스트를 노출시킵니다.

커버슬립을 구리 에칭액에 2시간 더 담근 다음 증류수로 다시 헹구고 질소로 건조시킵니다. 표면 패시베이션 후, 제로 모드 도파관 커버슬립은 양면 접착 테이프를 사용하여 석영 슬라이드와 쌍을 이루어 단일 분자 이미징을 위한 미세유체 흐름 챔버를 만들 수 있습니다. 콜로이드 템플릿 자체 조립의 성공 여부는 상대 습도에 따라 크게 달라집니다.

잘 형성된 템플릿에서 구슬 영역은 불투명한 다층 고리로 정의된 테두리가 있는 원형입니다. 잘 구성된 템플릿에서 대부분의 템플릿에는 육각형으로 밀집된 비드가 포함되어야 합니다. 증발 침강 중 걸림으로 인해 입자 사이에 약간의 결함이 있을 것입니다.

폴리스티렌 비드의 구리 증착 및 용해 후 구리 포스트는 직경이 150나노미터 미만이어야 합니다. 300나노미터 구리 증착 깊이의 경우 기둥 높이는 약 250나노미터입니다. 알루미늄 클래딩을 증착하고 구리 포스트를 용해한 후 도파관은 원자력 현미경으로 볼 수 있어야 하며 약 550나노미터 떨어져 있어야 합니다.

폴리스티렌 템플릿을 20초 동안 어닐링하면 직경 118나노미터의 알루미늄 도파관이 생성되었으며, 이는 가시광선의 전파를 차단하기에 충분히 작습니다. 이미징을 위한 ZMW의 일반적인 필드에는 40 x 80 미크론 시야에 3, 000개의 도파관이 포함되어 있습니다. ZMW 기능을 테스트하기 위해 단일 분자 FRET를 수행했습니다.

단일 분자 FRET 흔적은 테스트된 주변 Cy5 형광의 모든 농도에서 검출될 수 있었습니다. 이에 비해 단일 분자는 피코몰에서 낮은 나노몰 농도의 TERF 조명에서만 검출할 수 있습니다. 제로 모드 도파관 제작 후, 장치는 단일 분자 이미징 중 비특이적 상호 작용을 줄이기 위해 폴리머로 부동태화될 수 있습니다.

제로 모드 도파관의 유리 바닥은 단일 분자 방출을 향상시키기 위해 약간 에칭할 수도 있습니다. 전반적으로 이 새로운 제로 모드 도파관 제조 방법을 통해 연구원들은 세포 내의 농도와 속도에 더 가까운 농도와 속도로 전사 또는 번역과 같은 동적 생화학적 과정을 보다 쉽게 조사할 수 있습니다.