고처리량 전기화학발광 7-Plex 분석으로 제1형 당뇨병 및 다발성 자가면역질환 동시 스크리닝
2020년 5월 29일
7개의 자가항체 분석을 함께 결합하는 간단한 멀티플렉스 ECL 분석을 모델링합니다. 이 분석은 체강 질병,자가 면역 갑상선 질환 및자가 면역 다선 증후군 1을 포함하여 T1D 및 여러 다른자가 면역 질환을 동시에 스크리닝 할 수 있습니다.
전기화학발광 분석법은 제1형 당뇨병과 자가면역 냉동병, 셀리악병, 자가면역 다발선 증후군-1을 포함한 기타 관련 자가면역 질환을 동시에 스크리닝할 수 있습니다. 매우 복잡한 ECR 분석은 단일 웰에 최대 10개의 다중 항체 분석을 결합하여 처리량이 높고 라이브러리가 적으며 광범위한 부피가 덜 필요한 분석 비용이 저렴합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 게시물 인 Xiaofan Jia가 될 것입니다.
혼합 링커 결합 항원 용액을 준비하려면 먼저 바둑판 분석을 기반으로 각 항원에 대한 최적 농도를 선택하고 비오틴 및 루테늄 표지 항원을 합리적인 작업 농도로 희석합니다. 고유한 비오틴화된 항원 각각에 서로 다른 링커를 결합하기 위해 96웰 분석 1회에서 적절한 스트렙타비딘 접합 링커 240마이크로리터를 관심 비오틴화 단백질 4마이크로리터와 혼합했습니다. 그런 다음 튜브당 156마이크로리터의 1%BSA를 추가하고 혼합물을 실온에서 30분 동안 배양합니다.
배양이 끝나면 각 튜브에 160마이크로리터의 정지 용액을 추가하고 실온에서 추가로 30분 동안 튜브를 배양합니다. 배양이 끝나면 각 튜브에서 400마이크로리터의 링커 결합 항원을 제거하고 7개의 항원 현탁액을 모두 단일 튜브로 당깁니다. 그런 다음 정지 용액 1.2ml와 Ru sulfo-NHS 표지 GAD65, TPO, tTg, ThG, Proinsulin 인터페론-알파 및 IA-2 항원 4마이크로리터를 혼합물에 추가합니다.
라벨링된 항원 혼합물로 혈청 샘플을 배양하기 전에 96웰 PCR 플레이트의 웰당 15마이크로리터의 혈청을 추가하고 18마이크로리터의 0.5몰산성 혈청을 각 웰과 혼합하여 실온에서 45분 동안 배양합니다. 배양하는 동안 새로운 96-well PCR 플레이트의 웰당 35마이크로리터의 항원과 13마이크로리터의 1몰 트리스 완충액을 추가합니다. 배양이 끝나면 즉시 25마이크로리터의 산 처리된 혈청을 항원 플레이트의 각 웰로 옮깁니다.
접시를 PCR 천장 호일로 덮고 접시를 셰이커에 올려 실온에서 1시간 동안 저속으로 놓습니다. 배양이 끝나면 접시를 섭씨 4도에서 18-24시간 동안 놓습니다. 냉장고에서 접시를 꺼내 실온에 두십시오.
그런 다음 각 웰에 150마이크로리터의 3% 차단제 A-버퍼를 추가합니다. 모든 우물이 처리되면 접시를 천장 호일로 덮고 접시를 섭씨 4도의 냉장고에 밤새 넣습니다. 다음 날 아침, 플레이트를 거꾸로 뒤집고 세척당 웰당 150마이크로리터의 PBS-T로 샘플을 세 번 세척합니다.
웰에 완충액이 남아 있지 않을 때까지 플레이트를 두드려줍니다. 각 웰에 30마이크로리터의 혈청 항원 배양을 추가합니다. 모든 배양액이 추가되면 플레이트를 호일로 덮고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 저속으로 셰이커에 놓습니다.
배양이 끝나면 시연된 바와 같이 웰당 150마이크로리터의 PBS-T로 웰을 튕겨 인큐베이트를 제거하고 세척합니다. 마지막 세척 후 각 웰에 150마이크로리터의 판독 버퍼를 추가하고 플레이트 리더에서 초당 카운트 단위로 플레이트를 읽습니다. 새로 진단된 1형 당뇨병 환자 1,026명의 대규모 샘플 코호트를 분석한 결과, 7개 이상의 전기 발광 분석의 자가항체 수준을 각각의 확립된 단일 전기 발광 분석 및 각 해당 단일 표준 무선 결합 분석 및 ELISA의 수준과 비교했습니다.
분석 특이도는 95번째 백분위수가 사용된 갑상선 자가항체를 제외한 모든 자가항체 분석에 대해 99번째 백분위수에서 동일했습니다. 7개의 자가항체 각각에 대한 소수의 불일치 샘플이 각 분석에 대한 컷오프의 경계선 주변에서 발견되었습니다. 여기서, 각 분석에 대한 1022개의 건강한 대조군에 대한 해당 데이터를 관찰할 수 있습니다.
기억해야 할 가장 중요한 점은 고유한 비오틴화 항원 각각에 대해 다른 linker를 찾고, 각 항원을 conjugated linker를 제공하는 특성과 혼합하는 것입니다. 이 분석 기술을 통해 연구자들은 대규모 인구 집단에서 여러 자가면역 질환에 대한 선별 검사를 동시에 계획할 수 있으며 클리닉에서 1형 당뇨병이 있는 여러 관련 질병을 쉽게 선별할 수 있습니다.
개요
본 연구에서는 제1형 당뇨병 및 다양한 자가면역 질환을 동시에 스크리닝할 수 있는 다중 정량 전기화학발광(ECL) 분석법을 제시합니다. 이 분석법은 여러 가지 자가항체 검사를 단일 웰(well)에서 결합하여 효율성을 높이고 비용을 절감합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 자가면역
- 진단
- 전기화학발광 분석법
배경
- 제1형 당뇨병(T1D)은 종종 다른 자가면역 질환과 동반됩니다.
- 전통적인 분석법은 여러 번의 검사가 필요할 수 있어 시간과 비용이 증가합니다.
- 다중 분석법(Multiplexed assays)을 통해 진단 과정을 효율화할 수 있습니다.
- 전기화학발광법(Electrochemiluminescence)은 높은 민감도와 특이도를 제공합니다.
연구 목적
- T1D 및 관련 자가면역 질환의 스크리닝을 위한 다중 ECL 분석법을 개발한다.
- 다중 분석법의 성능을 기존의 단일 분석법과 비교한다.
- 임상 현장에서의 대규모 스크리닝을 용이하게 한다.
사용된 방법
- 혼합 링커 결합 항원 용액의 준비.
- 표지된 항원과 혈청 샘플의 반응.
- 고속 대량 스크리닝을 위한 96-웰 플레이트 형식의 사용.
- T1D 환자와 건강한 대조군 간의 자가항체 수준 비교.
주요 결과
- 다중 분석법은 단일 분석법과 유사한 특이도를 나타냈습니다.
- 컷오프 임계값 근처에서 소수의 불일치 샘플을 확인했습니다.
- 새롭게 진단된 T1D 환자의 대규모 코호트 데이터를 제공했습니다.
- 여러 자가면역 질환에 대한 효율적인 스크리닝을 가능하게 했습니다.
결론
- 다중 ECL 분석법은 동시 스크리닝을 위한 유용한 도구입니다.
- 이 방법은 임상 실무에서 진단 효율성을 높일 수 있습니다.
- 더 많은 인구 집단을 대상으로 한 추가 검증이 권장됩니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
단일 웰 내에서 여러 자가항체를 동시에 검출함으로써 대규모 자가면역 질환 스크리닝의 결정적인 병목 현상을 해결하고, 분석의 복잡성과 자원 소모를 줄일 수 있습니다. 이러한 다중 분석 전기화학발광 방식은 제1형 당뇨병 및 동반된 자가면역 상태 전반에 걸쳐 상관관계가 있는 바이오마커 판독값을 제공함으로써 조기 질환 진단의 예측 신뢰도를 높입니다. 이 분석법은 다중 자가항체 프로필을 기반으로 효율적인 환자 층화를 가능하게 하여, 면역 요법 개발 과정에서 포트폴리오 분류 및 메커니즘적 리스크 제거를 지원합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 전임상 모델에서 자가항체 클러스터와 질병 엔도타입(endotype)의 상관관계를 분석하여 치료 가설의 검증을 가능하게 함.
- 운영적 가치: 질병 관련 시스템에서 항원 특이적 면역 반응의 기능적 검증을 통해 생물학적 리스크 감소(de-risking)를 지원함.
- 예측적 가치: 수렴된 자가항체 시그니처를 가진 환자군을 식별함으로써 타겟 선정의 신뢰도를 높임.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 높은 재현성이 요구되는 하위 스크리닝 캠페인을 위해 표준화된 정량적 바이오마커 패널을 준비합니다.
- 운영적 가치: 웰 전반에 걸쳐 일관된 액상 결합을 보장하는 고정화 항원-링커 복합체를 통해 분석 준비도를 제공합니다.
- 확장성: 웰당 최대 10개의 자가항체를 스크리닝하기 위한 플랫폼 재사용을 용이하게 하여, 재구성 없이 처리량을 증가시킵니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개적 연속성: 제1형 당뇨병 및 동반 자가면역 질환의 임상적 진행과 연관된 자가항체를 검출함으로써 질병 관련 시스템과 일치시킵니다.
- 위험 조정 기반 진전: 다장기 자가면역을 예측하는 고침투성 자가항체 프로파일을 가진 환자를 식별하여 go/no-go 결정(진행 여부 결정)을 지원합니다.
- 기전적 위험 감소: 섬, 갑상선, 장 및 인터페론 경로 자가항체의 동시 측정을 통해 면역 기전 해석의 모호함을 줄입니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
이 분석법은 발견 단계에서 중개 단계로 넘어가는 가교 역할을 하며, 다중 자가항체 프로파일링을 통해 리드 화합물 발굴 및 전임상 검증 단계에 기초가 되는 초기 면역 표현형 분석을 가능하게 합니다.
- 발견 생물학: 자가항체 공동 발현 패턴을 자가면역 병인 기전의 병리 경로와 연결하여 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 처리 조건이나 유전적 배경에 따른 면역 반응 비교가 가능한 정량적이고 재현성 있는 결과물을 제공합니다.
- 분석: 환자군과 대조군 간의 자가항체 수준을 통계적으로 비교할 수 있도록 초당 읽기 수(counts per second)의 정규화된 판독값을 제공합니다.
- 중개 연구: 질환 관련 면역 조절 장애를 반영하는 인체 시료 내 바이오마커 패널을 검증함으로써 전임상 연속성을 확보합니다.
- 기업적 재사용: 초기 7-plex 구성을 넘어 다른 자가면역 또는 염증성 질환 패널에도 적용 가능한 재사용 가능한 면역 분석 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 동시 자가항체 측정을 통해 위음성을 줄임으로써 타겟 검증의 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운용적 가치: 고정화된 항원 제시를 통해 웰 간 변동성을 제거하여 표준화 및 재현성을 향상시킵니다.
- 전략적 가치: 7가지 진단 테스트를 단일 워크플로 단계로 통합하여 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 바이오마커로 정의된 환자군을 기반으로 치료 후보 물질의 위험 조정 우선순위 결정을 가능하게 합니다.
구현 시 고려 사항
- 항원 고정화를 위한 면역 분석 설계 및 링커 화학에 관한 전문 지식이 필요함.
- 96-웰 형식의 전기화학발광 검출이 가능한 플레이트 리더가 필요함.
- 다기관 연구의 경우, 기관 간 블로킹 및 세척 프로토콜의 표준화가 필요함.
- 기존 7가지 외에 새로운 자가항체 표적으로 확장할 때 항원 농도 조절이 필요함.
- 멀티플렉스 형식에서 교차 반응을 방지하기 위해 최적화된 링커-항원 쌍이 필요하다는 제약이 있음.
